Abstract

Οι μεταλλάξεις στο μονοπάτι /βήτα-κατενίνης WNT είναι παρούσες στην πλειονότητα όλων των σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου (CRCs), και αναστολείς της αποακετυλάσης ιστόνης διεγείρουν απόπτωση σε κύτταρα CRC με τέτοιες μεταλλάξεις. Αυτή η απόπτωση εξουδετερώνεται από (1) την ετερογένεια σηματοδότησης του κυτταρικών πληθυσμών CRC, και (2) τα μονοπάτια επιβίωσης που επάγονται από μιτογόνα που εκκρίνονται από τα αποπτωτικά κύτταρα. Τα φαινόμενα της ετερογένειας σηματοδότησης και την απόπτωση που προκαλείται από την επιβίωση αποτελούν τα άμεσα μηχανισμοί αντοχής στους αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης, και πιθανώς άλλους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ερευνήσαμε τη στρατηγική του κυτταρικού θανάτου αυξάνοντας CRC με αναστολή όλων των οδών επιβίωσης που προκαλείται από το προ-αποπτωτικό παράγοντα LBH589, έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης: ΑΚΤ, JAK /STAT, και σηματοδότηση ERK. Η ικανότητα απόπτωση ενίσχυσης ενός κοκτέιλ συνθετικών αναστολέων του πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τις επιπτώσεις των πρόπολη φυσικού προϊόντος. Χρησιμοποιήσαμε ορθοκολικού αδενώματος, κύτταρα ορθοκολικού καρκινώματος ανθεκτικά σε φάρμακο φάρμακο ευαίσθητη και να αξιολογηθεί η αποπτωτική δυναμικό των θεραπειών συνδυασμού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μια αποτελεσματική προσέγγιση για CRC συνδυαστική θεραπεία είναι να συνδυάσει τα φάρμακα προκαλούν απόπτωση (π.χ., αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης, όπως LBH589) με παράγοντες που καταστέλλουν όλες τις αντισταθμιστικές οδών επιβίωσης που επάγεται κατά την διάρκεια της απόπτωσης (όπως το κοκτέιλ αναστολέων απόπτωση συνδέονται πολλαπλασιασμό). Το ίδιο παράδειγμα μπορεί να εφαρμοστεί σε μια προσέγγιση για την πρόληψη CRC, ως αποπτωτικό αποτέλεσμα βουτυρικό, ενός αναστολέα δεακετυλάσης ιστόνης δίαιτα που προέρχεται, αυξάνεται από άλλες διαιτητικές παράγοντες που ρυθμίζουν την επιβίωση οδούς (π.χ., πρόπολη και εκχύλισμα καφέ). Έτσι, τα συμπληρώματα διατροφής που αποτελείται από ζυμώσιμα ινών, πρόπολη και εκχύλισμα καφέ μπορεί να εξουδετερώσει αποτελεσματικά νεοπλασματική ανάπτυξη του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Bordonaro Μ, Drago Ε, Atamna W, Lazarova DL (2014) Πλήρη κατάργηση όλων των απόπτωση επαγόμενη διάδοσης Μονοπάτια ως Προτεινόμενη προσέγγιση για την πρόληψη του καρκίνου του παχέος και θεραπεία. PLoS ONE 9 (12): e115068. doi: 10.1371 /journal.pone.0115068

Επιμέλεια: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Ιταλία

Ελήφθη: 11, Ιούλη του 2014? Αποδεκτές: 18, Νοεμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 11η Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Bordonaro et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (1R15CA152852-01, Λαζάροβα). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Μ. Bordonaro, W. Atamna, και Ε Drago δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Νταρίνα L. Lazarova έχει λάβει χρηματοδότηση της έρευνας από Manuka Health New Zealand, Ltd, και αυτή είναι η συν-εφευρέτης του διπλώματος ευρεσιτεχνίας PCT /NZ2014 /000.060 που κατατέθηκε μέσω συνθήκη συνεργασίας ευρεσιτεχνίας για λογαριασμό της Manuka Health New Zealand, Ltd, «συνθέσεις Θεραπευτικής και χρήσεις αυτών «. Νταρίνα Λ Lazarova δεν έχει κανένα οικονομικό συμφέρον σε αυτή την αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Δεν υπάρχουν εταιρείες συμβούλων, απασχολήσεις, προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Οι δηλούμενες ανταγωνιστικά συμφέροντα δεν μεταβάλλουν την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η βελτίωση των αντικαρκινικών προληπτικών και θεραπευτικών στρατηγικών έχει μειωθεί καρκίνου που σχετίζονται με θανάτων κατά 20% τα τελευταία 20 χρόνια [1]. Επιπλέον, η έννοια της ογκογονιδίου εθισμού [2] ώθησε την ανάπτυξη μοριακά στοχευμένων θεραπειών. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις θεραπείες επεκτείνει τις ζωές των ασθενών με καρκίνο του μέσου κατά λίγους μήνες [3]. Ένας λόγος γι ‘αυτό το αποτέλεσμα είναι ότι τα νεοπλάσματα παρουσιάζουν μεταλλάξεις ανθεκτικότητας στα φάρμακα που είτε προϋπήρχαν σε ένα μικρό αριθμό καρκινικών κυττάρων πριν από τη θεραπεία, ή έχουν αποκτηθεί μετά τη χορήγηση του φαρμάκου [3]. Εν τη απουσία των μεταλλάξεων που προσδίδει αντίσταση, τα καρκινικά κύτταρα να προσαρμοστούν και για την επιλεκτική πίεση φαρμάκου με ρύθμιση των επιπέδων σηματοδότηση τους. Για παράδειγμα,

BRAF

μεταλλαγμένου κύτταρα μελανώματος που εκτίθενται σε vemurafenib αναπτύξουν αντίσταση στον παράγοντα με προς τα πάνω ρύθμιση έκφρασης BRAF τους [4]. Παρομοίως, EGFR-μεταλλαγμένο καρκινικά κύτταρα πνεύμονα έλαβαν αγωγή με αναστολέα EGFR ρυθμίζουν προς τα κάτω ΡΤΕΝ και αυξάνει την επιβίωση ΑΚΤ σηματοδότηση [5]. Ως εκ τούτου, ο σχεδιασμός των αντικαρκινικών θεραπειών θα πρέπει να λαμβάνει υπόψη όχι μόνον την μεταλλακτική τοπίο ενός νεοπλάσματος, αλλά και την κυτταρική σηματοδότηση ετερογένεια που υπάρχει ακόμα και μεταξύ γενετικά ταυτόσημων κυττάρων καρκίνου [6]. Η ετερογένεια σηματοδότησης είναι ένα συστατικό των άμεσων μηχανισμούς αντοχής (IMR):. Αυτές είναι οι αλλαγές σε καταρράκτες που συμβαίνουν μέσα σε 24 ώρες από τη θεραπεία και να επιτρέψει ένα κλάσμα του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων να επιζήσουν θεραπεία απεξάρτησης σηματοδότησης

κύτταρα CRC εκτεθεί σε αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACis) εμφανίζουν επίσης IMR. Έχουμε παρέχονται αποδεικτικά στοιχεία ότι HDACis επάγει απόπτωση των κυττάρων CRC εν μέρει μέσω της υπερδραστηριότητας της σηματοδότησης WNT /κατενίνης [7]. Ωστόσο, οι πληθυσμοί κυττάρων CRC είναι ετερογενείς όσον αφορά τα επίπεδα WNT /κατενίνης, και κύτταρα που δεν hyperinduce το μονοπάτι, να επιβιώσει η έκθεση σε HDACis [7], [8]. Η ετερογένεια σηματοδότησης των κυτταρικών πληθυσμών που δεν οφείλεται στην ύπαρξη των κυτταρικών υποπληθυσμών με προκαθορισμένα επίπεδα δραστικότητας /κατενίνης WNT. Έτσι, έχουμε κυτταρομετρία ροής-ταξινομημένα μεμονωμένα κύτταρα CRC με υψηλή WNT /κατενίνης επίπεδα σηματοδότησης, και διαπίστωσε ότι τα προκύπτοντα κλωνική πληθυσμοί είναι οι ετερογενείς στη σηματοδότηση Wnt επίπεδα ως μητρική πληθυσμού (στοιχεία δεν έχει δημοσιευθεί). Αυτή η ετερογένεια είναι πιθανό διατηρείται από πλευρική αναστολή [9], η υιοθέτηση μιας συγκεκριμένης μοίρα από λίγα κύτταρα από μια ομάδα ισοδύναμων κυττάρων [10]. Σε αυτή τη διαδικασία, οι στοχαστικές διακυμάνσεις στην έκφραση της εγκοπής υποδοχέα και συνδετήρες της στις παρακείμενες κυψέλες ενισχύονται μέσω κυττάρου-προς-κύτταρο αλληλεπιδράσεων. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των Notch και συνδέτες του να οδηγήσει στην απελευθέρωση των ενδοκυτταρικών περιοχών τους. Τα κύτταρα με υψηλότερα επίπεδα του Notch ενδοκυττάρια περιοχή καταστέλλουν WNT δραστηριότητα? λαμβάνοντας υπόψη ότι τα κύτταρα με υψηλότερα επίπεδα συνδέτες ΕΓΚΟΠΗ αυξήσει WNT δραστηριότητα [9]. Σε φυσιολογικά κύτταρα του εντέρου, πλευρική αναστολή συμβάλλει στην τελική διαφοροποίηση [11]? Ωστόσο, σε κύτταρα CRC, πλευρική αναστολή υποστηρίζει ετερογένεια σηματοδότησης χωρίς τερματική διαφοροποίηση. Παρόμοια ετερογένεια σηματοδότηση έχει παρατηρηθεί

in vivo

[12] – [15]

Το δεύτερο συστατικό του IMR είναι η απόπτωση που επάγεται πολλαπλασιασμού, ένα φαινόμενο που υποστηρίζονται από τα αποπτωτικά κύτταρα που εκκρίνουν. μιτογόνα. Αυτά τα μιτογόνα διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που επιβιώνουν σε κάθε αποπτωτικά πληθυσμό [16] – [21]. Βρήκαμε ότι σε κυτταρικούς πληθυσμούς CRC υποβάλλονται σε HDACi ενεργοποιούνται απόπτωση, υπάρχει αυξημένη έκφραση του μιτογόνα και επακόλουθη επαγωγή πολλών μονοπατιών σηματοδότησης επιβίωσης [9], [22]. Εδώ αναφέρουμε μια στρατηγική για να αναστείλει πλήρως όλες τις οδούς επιβίωσης, και να ενισχύσει την αποπτωτική απόκριση των κυττάρων CRC στα δύο συνθετικά και διατροφής που προέρχονται από HDACis (π.χ., LBH589 και βουτυρικό).

Υλικά και Μέθοδοι

1. Κυτταρική καλλιέργεια, ανασυνδυασμένα πλασμίδια, και τα χημικά προϊόντα

Η ανθρώπινη κυτταρική γραμμή CRC HCT-116 λήφθηκε από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). κυτταρική σειρά HCT-116 ήταν ο γονότυπος από σύντομη ανάλυση διαδοχική επανάληψη. Η ίδια ανάλυση κυττάρων HCT-R επιβεβαίωσαν ότι αυτά τα κύτταρα που σχετίζονται με τα γονικά κύτταρα ΗΟΤ-116. Η κυτταρική σειρά HCT-R προήλθε από HCT-116 με καλλιέργεια των γονικών κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις βουτυρικού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. κυτταρικές σειρές HCT-116 και HCT-R αναπτύχθηκαν σε μέσο α-ΜΕΜ με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Ανθρώπινα παχέος κύτταρα μικροαδένωμα LT 97 ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Β Marian (Institute of Cancer Research, Ιατρικό Πανεπιστήμιο της Βιέννης, Αυστρία). LT 97 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23], [24]. Οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε άλφα-ΜΕΜ με 10% FBS: ανθρώπινο μικροκυτταρικό καρκίνωμα επινεφριδίων /φλοιού κύτταρα SW13 (μείον φαινότυπο, απομονώνονται με κλωνοποίηση αραίωσης από ένα ετερογενές δείγμα ATCC CCL105 στο εργαστήριο του Δρ Ελίζαμπεθ Hull, Πανεπιστήμιο Midwestern , ΑΖ), ανθρώπινο νευρική ακρολοφία προερχόμενα μη νευρωνικά προγονικά κύτταρα LA1-5s (που παρέχεται από τον Dr. R. Ross, Πανεπιστήμιο Fordham, ΝΥ), φυσιολογικά ανθρώπινα εμβρυϊκά κύτταρα του κόλου CCD841CoN ((ATCC CRL-1790), ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά επιθηλιακά κύτταρα ΗΕΚ293Τ (ATCC CRL-1573), και το ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών CCL92 βουτυρικό (ATCC CCL-92). νάτριο ελήφθη από την Sigma, το καφεϊκό οξύ φαιναιθυλ εστέρας (CAPE) -Βελτιωμένη πρόπολη (πρόπολη με Cyclopower, με κάπα στα 6 mg /g ) από Manuka Health New Zealand Ltd, AZD6244, LBH589 και MK2206 από Σέλεκ Chemicals, πυριδόνη 6 από Santa Cruz Biotechnology, πάγωμα αποξηραμένα στιγμιαίο καφέ (Η Καθημερινή Chef, Σαμ West, Inc.). Όλα τα μέσα εκτός από βουτυρικού επαναιωρήθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο , και τα διαλύματα αποθέματος διατηρήθηκαν στους -80 ° C. Το βουτυρικό διαλύθηκε σε νερό και αποθηκεύεται ως 1.0 Μ απόθεμα σε 4 ° C. Mock θεραπεία περιλαμβάνονται διμεθυλοσουλφοξειδίου σε έναν όγκο ίσο με αυτό των θεραπειών με παράγοντες διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο.

2. αναλύσεις Western blot και αντισώματα

αναλύσεις

κηλίδα Western έγιναν όπως έχει ήδη αναφερθεί [25]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: ένα αντίσωμα προς φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) (# 4370, Cell Signaling Technology), ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει το φωσφο-Stat3 (Tyr705) (# 9145, Cell Signaling Technology ), αντι-Ser473-φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ (SC-7985, Santa Cruz Biotechnology), αντι-ΑΚΤ (SC-8312, Santa Cruz Biotechnology), αντι-βήτα ακτίνη (A5441, Sigma-Aldrich), αντι-ERK (# 9102, Τεχνολογία Σηματοδότησης κυττάρου), αντι-STAT3 (# 9139, Cell Signaling Technology), αντι-pcJUN και c-Jun (SC-16312-R και sc-45, Santa Cruz Biotechnology). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1,000 εργασίας, εκτός από το αντι-ακτίνης αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε σε 1:5,000 αραίωση. Τα προϊόντα λύσης λήφθηκαν μέσω δύο διαφορετικών μεθόδων: με τη χρησιμοποίηση ενός δωδεκυλοθειικού νατρίου που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και την ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης [25], ή με λύση ίσο αριθμό κυττάρων (10

6) άμεσα σε Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα. Συνήθως, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ημέρες πριν από τη θεραπεία, και εκτέθηκαν για 17 ή 20 ώρες με LBH589 (50 ηΜ), MK2206 (1 μΜ), AZD6244 (0,5 μΜ), πυριδόνη 6 (1 μΜ), το εκχύλισμα καφέ (1 mg /ml), πρόπολη (100 μg /ml), ή βουτυρικό (5 mM). Ποσοτικοποίηση των εικόνων κηλίδος Western έγινε με το λογισμικό ImageJ (δημόσιο τομέα λογισμικού που αναπτύχθηκε από την Ερευνητική Υπηρεσίες Υποκατάστημα του Εθνικού Ινστιτούτου Ψυχικής Υγείας, Bethesda, MD, USA).

3. Αποπτωτικών και κλωνική δοκιμασίες ανάπτυξης

κύτταρα CRC απλώθηκαν 24 ώρες πριν από την ανάλυση σε πλάκες 24-φρεατίων σε 70000 ανά φρεάτιο, και εκτέθηκαν σε θεραπείες για 24 ώρες (π.χ., LT97 και HCT-116 κύτταρα) ή 48 ώρες (κύτταρα HCT-R). Όλα τα κύτταρα (επιπλέοντα και επισυνάπτεται) συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν για αποπτωτικών και νεκρωτικών δείκτες με ΡΕ αννεξίνης V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Biosciences, # 559763). Η κυτταρομετρία ροής αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό ντίβα FACS Aria II και? αναλύσαμε συνολικά 50.000 περιστατικά ανά δείγμα. Η επί τοις εκατό απόπτωσης υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων από το συνολικό αριθμό των κυττάρων που αναλύθηκαν και πολλαπλασιάζοντας την αναλογία με το 100. Για κλωνική ανάπτυξη αναλύσεις, και μόνο τα κύτταρα απλώθηκαν σε 100-200 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια έξι-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ο παράγων (ες) για 24 ώρες. Οι αποικίες μετρήθηκαν σε 14 έως 20 ημέρες μετά την απομάκρυνση του παράγοντα (ες). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τέσσερις έως έξι φορές με δείγματα εις τριπλούν ανά πείραμα.

4. Στατιστικά

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση από τουλάχιστον τρία σύνολα των ανεξάρτητων πειραμάτων. Unpaired Student ανάλυση T-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία στατιστικές διαφορές. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε Ρ & lt? 0.05. Για κλωνική ανάπτυξη και αποπτωτικά αναλύσεις, στατιστικές διαφορές μεταξύ των μέσων ομάδα προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ανάλυση του κύκλου διακύμανσης (ANOVA) με GraphPad Prism 6 λογισμικό, και τους υπολογισμούς μετα-τεστ που χρησιμοποιήθηκε τη διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95 % εμπιστοσύνη.

Αποτελέσματα

1. Ανάπτυξη του αναστολέα της απόπτωσης κοκτέιλ-επαγόμενου πολλαπλασιασμού (ICAP)

Έχουμε αποδείξει ότι HDACis επάγουν απόπτωση κυττάρων CRC με μεταλλάξεις στο μονοπάτι Wnt /κατενίνης [7], και τα επίπεδα του κυτταρικού θανάτου επαυξημένης καταστέλλοντας η επαγωγή της ΑΚΤ σηματοδότησης [22], [26]. Για την ανάλυση όλων των οδών επιβίωσης που επάγεται σε αποπτωτικό κυτταρικούς πληθυσμούς CRC, χρησιμοποιήσαμε HCT-R κύτταρα που είναι σχετικά HDACi ανθεκτικά σε σύγκριση με τη γονική HCT-116 κύτταρα [8]. Προσδιορίσαμε την ικανότητα ενός αναστολέα κοκτέιλ της απόπτωσης που σχετίζεται με πολλαπλασιασμό (ICAP) για να αυξήσει την απόπτωση σε κυτταρικούς πληθυσμούς CRC εκτίθενται σε LBH589, ένα HDACi που βρίσκεται σε κλινικές δοκιμές. Για να εξακριβωθεί η κλινική σημασία των προηγούμενων ευρημάτων [22], [26], που απασχολούνται φαρμακολογικά σχετικές συγκεντρώσεις των LBH589 (50 nM) και οι αναστολείς των οδών επιβίωσης [27], [28]. ΗΟΤ-R κύτταρα που εκτίθενται σε LBH589 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα τριών οδών επιβίωσης που προκαλούνται από φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ, STAT3 και μόρια ERK1 /2 σηματοδότησης (Σχήμα 1Α). κύτταρα LBH589 επεξεργασμένα παρουσίασαν 15,5 ± 2,8% της απόπτωσης, και η προσθήκη του MK2206, ενός αναστολέα ρΑΚΤ, σχεδόν τριπλασιάστηκε τα επίπεδα απόπτωσης σε 42,5 ± 8,6%, Ρ = 0,007 (Σχήμα 1Β). Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις ότι η καταστολή ρΑΚΤ επίπεδα από MK2206 ή καφεϊκό φαιναιθυλ οξέος αυξάνει την απόπτωση στα κύτταρα CRC [22]. Η προσθήκη πυριδόνης 6, έναν αναστολέα /STAT JAK, και AZD6244, μια αδενοσίνη τριφωσφορική-μη ανταγωνιστικός αναστολέας της ΜΕΚ1 /2 [29], [30] αυξήθηκε περαιτέρω απόπτωση. Η έκθεση στο ICAP μόνος είχε σαν αποτέλεσμα την απόπτωση των 14,0 ± 4,0%, σε σύγκριση με 7,1 ± 2,0% απόπτωση που επάγεται από εικονικές θεραπεία. Τακτική μονόδρομη ANOVA έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ σημαίνει ομάδα, F (5,12) = 38.56, Ρ & lt? 0,0001. υπολογισμοί Μετα-test με διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95% εμπιστοσύνη υποδεικνύεται στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) στα αποπτωτικά επίπεδα μεταξύ mock θεραπεία και τις τρεις θεραπείες συνδυασμού με LBH589, καθώς και μεταξύ της θεραπείας LBH589 και τρεις συνδυασμός θεραπείες με LBH589. Δεν υπήρχαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των αποπτωτικών επιπέδων των ψευδώς, LBH589-, και ICAP – επεξεργασμένα κύτταρα. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην απόπτωση που επάγεται από LBH589 + MK2206 και τα άλλα δύο θεραπείες συνδυασμού LBH589, καθώς και μεταξύ LBH589 + MK2206 + pyridone6 και LBH589 + ICAP.

Α. κηλίδος Western αναλύσεις των κυττάρων HCT-R CRC που εκτίθενται σε κοροϊδεύει (C) κατεργασία, 50 ηΜ LBH589 (L), 1 μΜ MK2206 (Μ), 0,5 μΜ AZD6244 (Α), ή 1 μΜ πυριδόνης 6 (Ρ) για 20 ώρες. Ίδιος αριθμός των κυττάρων λύθηκαν απευθείας σε ρυθμιστικό Laemmli και αναλύθηκαν για τα επίπεδα έκφρασης του φωσφορυλιωμένου και συνολικά επίπεδα ΑΚΤ, ERK1 /2, και STAT3. B. αποπτωτικά αναλύσεις HCT-R κύτταρα εκτέθηκαν για 48 ώρες με τις επεξεργασίες που περιγράφονται στο (Α). Αστερίσκος υποδεικνύει στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) μεταξύ των αποπτωτικών επίπεδα. Οι επιπλέον στατιστικά σημαντικές διαφορές που αναφέρονται στο κείμενο.

Η

2. Η πρόπολη αυξάνει την απόπτωση που επάγεται από LBH589 ή 5-φθοροουρακίλη σε κύτταρα CRC

Η πρόπολη, ένα προϊόν μελισσών, αυξάνει την απόπτωση που επάγεται από τη δίαιτα που προέρχεται HDACi βουτυρικό μέσω μερική καταστολή της ΑΚΤ και JAK /STAT σηματοδότηση [26]. Ως εκ τούτου, εμείς αιτιολογημένη ότι η πρόπολη μπορεί να αυξήσει LBH589-επαγόμενη απόπτωση μέσω του ίδιου μηχανισμού. Για να συγκρίνουμε την ικανότητα της πρόπολης και της ICAP για την καταστολή οδών επιβίωσης απόπτωση που προκαλείται, εκθέσαμε HDACi-ανθεκτικά κύτταρα HCT-R να κοροϊδεύει τη θεραπεία, LBH589, LBH589 + πρόπολη, ή LBH589 + ICAP. Η προσθήκη της πρόπολης επαυξημένης LBH589 επαγόμενη απόπτωση από 16,5 ± 2,0% έως 30,1 ± 4,5%, Ρ = 0,013 (Σχήμα 2Α)? ενώ, η προσθήκη του ICAP ενισχυμένης LBH589 επαγόμενη απόπτωση από 16,5 ± 2,0% έως 60,0 ± 10,6%, Ρ = 0,004 (Σχήμα 2Α). Τακτική μονόδρομη ANOVA έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ νοείται το σύνολο της ομάδας, F (5,12) = 39.35, Ρ & lt? 0,0001. υπολογισμοί Μετα-test με διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95% εμπιστοσύνη αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα μεταξύ αποπτωτικών mock θεραπεία και των δύο αγωγών συνδυασμού LBH589, αλλά όχι LBH589 μόνο. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν επίσης για τα αποπτωτικά επίπεδα που προκαλούνται από LBH589 και LBH589 + ICAP, καθώς και από LBH589 + πρόπολη και LBH589 + ICAP. Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της απόπτωσης των κυττάρων που εκτίθενται σε κοροϊδεύει, πρόπολη, ή θεραπεία ICAP. Οι αναλύσεις στυπώματος Western αποκάλυψαν ότι σε LBH589-επεξεργασμένα κύτταρα HCT-R, συν-θεραπεία με πρόπολη μειωμένα επίπεδα pSTAT3 κατά έξι φορές και ρΑΚΤ επίπεδα κατά 1,7 φορές? ενώ, συν-θεραπεία με την ICAP οδήγησε σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα τόσο pSTAT3 και ρΑΚΤ (Σχήμα 2Β). Η πιο εντυπωσιακή διαφορά μεταξύ των δύο θεραπειών συνδυασμού με LBH589 ήταν ότι σε σύγκριση με την έκθεση μόνο σε LBH589, προσθήκη πρόπολης αύξησε τα επίπεδα pERK1 /2 κατά 20%? λαμβάνοντας υπόψη ότι η ICAP μειώθηκε pERK1 /2 επίπεδα με οκτώ φορές (2Β).

Α. HCT-R ή HCT-116 κύτταρα εκτέθηκαν για 48 ώρες ή 24 ώρες, αντίστοιχα, να κοροϊδεύει (Μ), 50 ηΜ LBH589 (L), LBH589 και 100 μg πρόπολη /ml (LP), LBH589 και η ICAP (LC), 100 μg /ml πρόπολη (Ρ), ή το ICAP μόνο (C). κύτταρα Β HCT-R εκτέθηκαν στις επεξεργασίες που περιγράφονται στο Α για 17 ώρες. και η συνολική κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. κύτταρα C. HCT-R και HCT-116 εκτέθηκαν για 48 ώρες ή 24 ώρες, αντίστοιχα, να κοροϊδεύει (Μ), 10 μΜ 5-fluorouracil (F), 5-φθοριοουρακίλη και 100 μg /ml πρόπολη (FP), 5- φθοριοουρακίλη και η ICAP (FC), πρόπολη (Ρ), ή η ICAP μόνο (C).

η

κύτταρα HCT-R είναι σχετικά ανθεκτικά στα αποπτωτικά αποτελέσματα του HDACis εν μέρει λόγω της προς τα πάνω ρυθμισμένη επιβίωσή τους σηματοδότηση ακόμη και σε απουσία της αγωγής [8], [22]. Για να αξιολογηθεί η σημασία των οδών επιβίωσης σε HDACi-ευαίσθητα κύτταρα CRC, χρησιμοποιήσαμε HCT-116 κύτταρα, από τα οποία προέρχονται τα κύτταρα HCT-R [8]. Σε HCT-116 κύτταρα, η θεραπεία με LBH589 μόνο, οδήγησε σε μια έξι-φορές αύξηση της απόπτωσης (mock αγωγή είχε ως αποτέλεσμα 10.4 ± 1.8% απόπτωση, και έκθεση LBH589 στους 50 ηΜ οδήγησε σε 64,2 ± 10,0% απόπτωση, Ρ = 0, το Σχ. 2Α). Η προσθήκη της πρόπολης ή την ICAP επαυξημένης περαιτέρω την αποπτωτική δράση του LBH589: την έκθεση σε LBH589 + πρόπολη είχε ως αποτέλεσμα 81.3 ± 6.3% απόπτωση (Ρ = 0,072), και LBH589 + ICAP οδήγησαν σε 96,0 ± 1,5% της απόπτωσης (Ρ = 0,006), Σχήμα 2Α. Η μονόδρομη ANOVA αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ ομάδα σημαίνει, F (5,12) = 162.1, Ρ & lt? 0,0001. υπολογισμοί μετα-τεστ Bonferroni με υποδεικνύεται στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα μεταξύ αποπτωτικών mock θεραπεία και τις τρεις θεραπείες που περιλαμβάνονται LBH589. Οι ίδιες σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν για τα αποπτωτικά επίπεδα που προκαλούνται από πρόπολη ή ICAP, και τις τρεις θεραπείες που περιλαμβάνονται LBH589. Δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των αποπτωτικών επίπεδα κυττάρων που εκτίθενται σε κοροϊδεύει, πρόπολη, ή θεραπεία ICAP

LBH589 είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων CRC με μεταλλάξεις στο μονοπάτι /κατενίνης WNT.? Ωστόσο, ο παράγοντας εξακολουθεί να είναι σε κλινικές δοκιμές. Ως εκ τούτου, ρωτήσαμε αν πρόπολη και η Επαυξημένης απόπτωση ICAP που προκαλείται από 5-φθοριοουρακίλη, μια σημαντική συνιστώσα της τρέχουσας αντι-CRC θεραπευτικές αγωγές. 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) προκαλεί χαμηλά επίπεδα απόπτωσης σε HCT-116 κυττάρων στο ακατόρθωτο

in vivo

συγκέντρωση 10 μΜ (mock κύτταρα εμφανίζουν 10,4 ± 1,8% της απόπτωσης, και 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα . – 33,1 ± 3,2% της απόπτωσης, Ρ = 0, Fig.2C στην ίδια συγκέντρωση ο παράγοντας δεν προκαλεί σημαντική απόπτωση σε κύτταρα ΗΟΤ-R: ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα εμφανίζουν 7,1 ± 1,8% της απόπτωσης, και 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα – 9,5 ± 1,3% της απόπτωσης, Ρ = 0,14, Fig.2C Η συνδυασμένη έκθεση του HCT-116 κύτταρα σε 5-FU πρόπολη + ή 5-FU + ICAP δεν αύξησε σημαντικά τα αποπτωτικά επίπεδα σε σχέση με τη θεραπεία με 5-FU. και μόνο: η έκθεση 5-FU κατέληξε σε 33,1 ± 3,2% της απόπτωσης, η θεραπεία πρόπολη 5-FU + οδήγησαν σε 33,2 ± 3,8% της απόπτωσης, και 5-FU + ICAP – σε 35,5 ± 9,0% απόπτωση (Fig.2C) Τακτική το ένα. τρόπος ANOVA έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ σημαίνει ομάδα, F (5,12) = 18.31, Ρ & lt?. 0.0001 υπολογισμούς Μετα-test με διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95% εμπιστοσύνη ανέφερε στατιστικά σημαντικές διαφορές (P & lt? 0.05) στην αποπτωτικών επίπεδα μεταξύ κοροϊδεύει τη θεραπεία και τις τρεις θεραπείες που περιλαμβάνονται 5-FU. Το ίδιο σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε για τα αποπτωτικά επίπεδα που επάγονται από πρόπολη ή ICAP σε σύγκριση με τις τρεις θεραπείες που περιλαμβάνονται 5-FU

Και οι δύο πρόπολη και ICAP διπλασίασε την αποπτωτική απόκριση των κυττάρων HCT-R σε 5-FU.: σε σύγκριση με μονοθεραπεία 5-FU, 5-FU κατεργασία πρόπολη + οδήγησε σε 23,1 ± 3,6% της απόπτωσης, Ρ = 0,003 και 5-FU + ICAP – 22,3 ± 2,2% της απόπτωσης, Ρ = 0,001, Fig.2C. Η μονόδρομη ANOVA αποπτωτικών επίπεδα HCT-R κύτταρα εκτίθενται σε θεραπείες συνδυασμό με 5-FU και ICAP ή πρόπολη αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας σημαίνει: F (5,12) = 28.81, Ρ & lt? 0,0001. υπολογισμοί Μετα-test με διόρθωση Bonferroni υποδεικνύεται στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) στα αποπτωτικά επίπεδα μεταξύ mock θεραπεία και 5-FU πρόπολη +, μεταξύ mock θεραπεία και 5-FU + ICAP, και μεταξύ 5-FU θεραπεία και τις θεραπείες συνδυασμού 5-FU πρόπολη + και 5-FU + ICAP. Δεν υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των αποπτωτικών επιπέδων mock και 5-FU κατεργασία.

3. Στόχευση απόπτωση σχετίζεται πολλαπλασιασμό ως καρκίνος του παχέος εντέρου προληπτική προσέγγιση

ότι η κλινική εφαρμογή της ICAP και ένα συμπλήρωμα πρόπολη για να αυξήσει αντικαρκινικές θεραπείες θα απαιτήσει επικύρωση μέσω τυχαιοποιημένων κλινικών δοκιμών, η εφαρμογή μιας δίαιτας με βάση το συμπλήρωμα στο CRC πρόληψη είναι πιο απτό. Βουτυρικό, ένα προϊόν ζύμωσης ινών στο κόλον και HDACi, προκαλεί απόπτωση στα περισσότερα CRC κυτταρικές γραμμές, και αυτή η δράση μπορεί να εξηγήσει εν μέρει τον προστατευτικό ρόλο της ίνας κατά CRC [31]. Παρόμοια με την απόπτωση που επάγεται από LBH589, η απόπτωση αρχίζει με βουτυρικό αντισταθμίζεται από σηματοδότηση επιβίωσης. Ως εκ τούτου, ένα CRC προληπτική προσέγγιση μπορεί να συνδυάζει βουτυρικό με αναστολείς των οδών επιβίωσης. Η πρόπολη ενισχύει βουτυρικό επαγόμενη απόπτωση με την καταστολή δύο οδών επιβίωσης: ΑΚΤ και JAK /STAT [26]? Ωστόσο, στις αναλύσεις μας LBH589 επεξεργασμένα κύτταρα CRC, πρόπολη όχι μόνο δεν καταστέλλει, αλλά στην πραγματικότητα, αύξησε τα επίπεδα pERK1 /2. Δεδομένου ότι η καταστολή της ERK σηματοδότησης από τον αναστολέα ΜΕΚ1 /2 AZD6244 ενίσχυσε την αποπτωτικό αποτέλεσμα LBH589 (Σχήμα 1Β), μπορούμε αιτιολογημένη ότι το βουτυρικό /απόπτωση πρόπολη επαγόμενη μπορούσε να αυξηθεί παρομοίως με τη στόχευση σηματοδότηση ERK με ενώσεις δίαιτα προέλευσης. Βασίζεται σε βιβλιογραφική έρευνα, που επικεντρώθηκε σε αρκετές αναφερθεί διατροφής που προέρχονται από 2 αναστολείς /ERK1, μεταξύ των οποίων ήταν ουρσολικό οξύ, η κουρκουμίνη, η σουλφοραφάνη, και καφέ. Από την διαλογή ενώσεων κανένας κατέστειλε pERK1 επίπεδα /2 σε βουτυρικό /πρόπολη-επεξεργασμένα κύτταρα CRC? Ωστόσο, η προσθήκη εκχυλίσματος καφέ ενισχυμένη απόπτωση των κυττάρων ΗΟΤ-R (Σχήμα 3Α). Μονόδρομη ANOVA έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας σημαίνει: F (7,25) = 50.96, Ρ & lt? 0,0001, (Σχήμα 3Α). Μετα-αναλύσεις με διόρθωση Bonferroni πραγματοποιήθηκαν για όλες τις οκτώ ομάδες των θεραπειών? Ωστόσο, έχουμε επικεντρωθεί στο κατά πόσον η προσθήκη εκχυλίσματος καφέ σε προηγουμένως χαρακτηριστεί και αναφερθεί από εμάς διαιτητικών παραγόντων επηρεάζεται αποπτωτικά επίπεδα των κυττάρων HCT-R. Έτσι, βρήκαμε ότι υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P & lt? 0,05) στα αποπτωτικά επίπεδα μεταξύ τις ακόλουθες επεξεργασίες: βουτυρικό έναντι βουτυρικό + καφέ, βουτυρικό + πρόπολης έναντι βουτυρικό + πρόπολη + καφέ, και πρόπολη σε σχέση με πρόπολη + καφέ. Τα δύο σχήματα που επάγεται τα υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης σε HCT-R κύτταρα, πρόπολη + καφέ και βουτυρικό + πρόπολη + καφέ, μείωσε το pSTAT3 σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα και τα επίπεδα ρΑΚΤ από τρεις φορές (Figs.3A και 3D).

Α-C. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κοροϊδεύει (Μ), 5 mM βουτυρικού (Β), 1 mg /ml εκχυλίσματος καβουρδισμένο καφέ (R), 100 μg /ml πρόπολη (Ρ), βουτυρικό και εκχύλισμα καφέ (BR), βουτυρικό και πρόπολη (ΒΡ) , πρόπολη και εκχύλισμα καφέ (PR), ή βουτυρικό, πρόπολη και εκχύλισμα καφέ (BPR). Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. D-F. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε θεραπείες, όπως περιγράφεται παραπάνω για 17 ώρες, και η συνολική κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Cells HCT-R πιθανόν αντιπροσωπεύουν τα τελευταία στάδια της νεοπλασματικής ανάπτυξης, όταν είναι εγκατεστημένος αντοχής φαρμάκου. Ωστόσο, είναι πιο σημαντικό να δοκιμάσει κάθε στρατηγική πρόληψης CRC σε κύτταρα που αντιπροσωπεύουν νωρίτερα νεοπλασματικών στάδια. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα αποτελέσματα παραγόντων διατροφής προερχόμενων στην κυτταρική γραμμή LT97 εγκατεστημένος από ένα ανθρώπινο κολονικό microadnoma [23], [24], και HCT-116 κύτταρα καρκινώματος κόλου που είναι ευαίσθητα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT-R, τόσο HCT-116 κυτταρικές γραμμές LT97 και είναι πιο ευαίσθητα σε βουτυρικό επαγόμενη απόπτωση? Ως εκ τούτου, μετρήθηκε η απόπτωση στις 24 ώρες μετά τη χορήγηση του διαφορετικά σχήματα. Σε HCT-116 κύτταρα, η θεραπεία βουτυρικό είχε ως αποτέλεσμα 36.8 ± 3.4% απόπτωσης σε σύγκριση με mock κύτταρα που εμφάνισαν 8.8 ± 0.4% απόπτωση (Σχήμα 3Β). Τα υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης επιτεύχθηκαν με τους συνδυασμούς των βουτυρικού + πρόπολη (46,0 ± 2,0%), βουτυρικό + καφέ (65,8 ± 3,5%), και βουτυρικό + πρόπολη + καφέ (73,9 ± 3,7%)? οι ίδιες συνδυασμοί παραγόντων κατέστειλε επίσης τα επίπεδα του pSTAT3 (Σχήμα 3Ε). Η μονόδρομη ANOVA για τα επίπεδα της απόπτωσης των HCT-116 κύτταρα εκτίθενται σε διαιτητικά παράγοντες αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ σημαίνει ότι η ομάδα: F (7,23) = 168.7, Ρ & lt? 0,0001. υπολογισμοί Μετα-test με διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95% εμπιστοσύνη υποδεικνύεται στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05) στα αποπτωτικά επίπεδα μεταξύ όλων των θεραπειών με εξαίρεση θεραπεία βουτυρικό σύγκριση με βουτυρικό + πρόπολη, θεραπεία βουτυρικό σύγκριση με πρόπολη + καφέ, και βουτυρικό + καφέ θεραπεία σε σύγκριση με βουτυρικό + καφέ + πρόπολη

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι τα κύτταρα LT97 είναι πολύ ευαίσθητα σε σηματοδότηση Wnt υπερδραστηριότητας και την ανάπτυξη των κυττάρων σύλληψη παρουσία βουτυρικού [32].? σε αυτά τα κύτταρα, ψευδο θεραπεία έχει σαν αποτέλεσμα 12.2 ± 0.7% απόπτωσης, και η έκθεση σε βουτυρικό 27,8 ± 5,0% της απόπτωσης. Η έκθεση των κυττάρων LT97 να πρόπολη + καφέ ή πρόπολη + βουτυρικό είχε ως αποτέλεσμα στατιστικά συγκρίσιμα επίπεδα απόπτωσης: 22,1 ± 4,7% και 25,6 ± 2,1%, αντίστοιχα. Τα υψηλότερα επίπεδα απόπτωσης επιτεύχθηκαν με το συνδυασμό θεραπειών βουτυρικό + καφέ (34,7 ± 5,7%) και + πρόπολη βουτυρικό + καφέ (47,9 ± 8,2%), και δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στα αποπτωτικά επίπεδα που επιτυγχάνονται από τις δύο αγωγές ( P = 0,08). One-Way ANOVA για τα επίπεδα της απόπτωσης των κυττάρων LT97 εκτεθειμένα σε διατροφικές ουσίες αποκάλυψε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ σημαίνει ότι η ομάδα: F (7,16) = 22,57, P & lt? 0,0001. Μετα-test αναλύσεις από τις θεραπείες που περιλαμβάνονται εκχύλισμα καφέ έδειξε ότι δεν υπήρχαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των αποπτωτικών επίπεδα κυττάρων που εκτίθενται σε βουτυρικό έναντι βουτυρικό + καφέ, και πρόπολη έναντι πρόπολη + καφέ? Ωστόσο, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της απόπτωσης που επάγεται από βουτυρικό + πρόπολη και βουτυρικό + πρόπολη + καφέ (Ρ & lt? 0,05). Κάτω από τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσουν τα επίπεδα pSTAT3 στα κύτταρα LT97? Ωστόσο, η έκθεση σε βουτυρικό + πρόπολη + καφέ εκχύλισμα αυξήθηκε pERK σε ανιχνεύσιμα επίπεδα σε σύγκριση με ψευδο-κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3F). Παρομοίως, η έκθεση των HCT-116 κυττάρων σε βουτυρικό + πρόπολη + καφέ εκχύλισμα αυξημένα επίπεδα pERK κατά δύο φορές? Ωστόσο, τέτοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα ΗΟΤ-R (Figs.3A, Β). Αναλύσαμε επίσης τα επίπεδα των pc-JUN, όπως αυτή οδός θα μπορούσε να επηρεάσει την απόπτωση και την κυτταρική επιβίωση. Σε όλα τα κύτταρα, τα συνολικά επίπεδα c-Jun αυξήθηκε με τις θεραπείες, και τα επίπεδα pc-Jun αντανακλάται στενά αυτή την αύξηση (Figs.3D, E, F).

Για να δοκιμαστεί η επίδραση του καφέ σε διάφορα επίπεδα, είμαστε εκτεθειμένοι HCT-116 κύτταρα σε 0,25, 0,5 και 1 mg εκχυλίσματος καφέ ανά μέσο χιλιοστόλιτρο. Η υψηλή δόση ενός χιλιοστόγραμμο ανά χιλιοστόλιτρο βασίστηκε μελέτες πρόσληψης καφέ με ειλεοστομία εθελοντές [33], και του μέσου όρου συνδυασμό του όγκου των υγρών στο στομάχι, το λεπτό έντερο, και του παχέος εντέρου [34]. Σε 1 mg /ml, το εκχύλισμα καφέ οδήγησε σε 23,7 ± 4,6% της απόπτωσης σε σύγκριση με ψευδο θεραπεία, 8.4 ± 0.4% απόπτωση (Ρ = 0,001), Σχήμα 4Α. Κατεργασία των κυττάρων με βουτυρικό + πρόπολη είχε ως αποτέλεσμα 39.3 ± 5.1% απόπτωση, και η προσθήκη 0,25, 0,5, ή 1,0 mg /ml εκχυλίσματος καφέ αυξημένη απόπτωση σε 51,8 ± 5,7% (Ρ = 0,017), 64,8 ± 3,2% (Ρ = 0), ή 77,4 ± 4,1% (P = 0), αντίστοιχα, Σχήμα 4Α.

Α. κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν για 24 ώρες για να κοροϊδεύει (Μ), 1 mg /ml ψητό εκχύλισμα καφέ (R), 5 mM βουτυρικού και πρόπολη 100 μg /ml (ΒΡ), ή βουτυρικό /πρόπολη και αυξανόμενες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος καφέ: 0,25, 0.5 ή 1.0 mg /ml. Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Β κύτταρα HCT-116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α) για 17 ώρες και συνολική κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. κύτταρα C. HCT-116 και ΕΤ 97 εκτέθηκαν για 20 ώρες, και HCT-R κύτταρα εκτέθηκαν για 42 ώρες για να κοροϊδεύει (Μ), 0,5 μΜ AZD6244 (Α), ο συνδυασμός? 5 mM βουτυρικό, 100 μg /πρόπολη ml, 1 mg /ml ψητό εκχύλισμα καφέ (BPR), ή BPR και 0,5 μΜ AZD6244 (BPR-Α). Η απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα αποπτωτικού σημειώνεται με αστερίσκους (Ρ & lt? 0,05). Δ δοκιμασίες κλωνική ανάπτυξη. Η επί τοις εκατό κλωνική ανάπτυξη υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό αποικιών των κυττάρων από τον αριθμό των κυττάρων επιστρώθηκαν, και πολλαπλασιάζοντας με 100. Οι αναλογίες των κλώνων ανάπτυξης υπολογίστηκαν διαιρώντας το ποσοστό κλωνική ανάπτυξη σε ψευδο-κατεργασμένα δείγματα από το ποσοστό κλωνική αύξηση των μάνατζερ επεξεργασμένα δείγματα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τέσσερις έως έξι φορές με δείγματα εις τριπλούν ανά πείραμα. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των κυτταρικών σειρών σε μέσοι λόγοι τους προσδιορίστηκαν με μονόδρομη ANOVA. Για τα κύτταρα που εκτίθενται σε βουτυρικό, F (6,31) = 10.26, Ρ & lt? 0,0001? για κύτταρα που εκτίθενται σε πρόπολη και εκχύλισμα καφέ, F (6,28) = 5,493, Ρ = 0.0007, και για κύτταρα που εκτίθενται σε βουτυρικό, πρόπολη και εκχύλισμα καφέ, F (6,26) = 10.56, Ρ & lt? 0,0001. Οι υπολογισμοί μετά τη δοκιμή χρησιμοποιήθηκε η διόρθωση Bonferroni για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις με 95% εμπιστοσύνη. Μεταξύ των κυττάρων που εκτίθενται σε βουτυρικό, στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,05, CI 95%) ανιχνεύθηκαν σε HCT116 εναντίον CCL92, HCT116 εναντίον ΗΕΚ293, HCT116 εναντίον SW13, HCT116 εναντίον LA1-5s, HCT116 έναντι HCT-R , CCD841CoN εναντίον ΗΕΚ293, και CCD841CoN έναντι κυττάρων ΗΟΤ-R.