Αφηρημένο

προστάτη επιθηλιακά κύτταρα από φυσιολογικούς και καρκινικούς ιστούς, που καλλιεργούνται σε τρισδιάστατη (3D) καλλιέργειας όπως σφαιροειδή, αντιπροσωπεύουν ελπιδοφόρα

in vitro

μοντέλα για τη μελέτη του φυσιολογικού και του καρκίνου-σχετικές μοτίβα των επιθηλιακών διαφοροποίησης. Έχουμε αναπτύξει την πιο ολοκληρωμένη ομάδα μικροσκοπικών μοντέλων κυττάρων του προστάτη καλλιέργεια σε 3D μέχρι σήμερα (n = 29), συμπεριλαμβανομένων και πολλών κυτταρικών σειρών μη-μετασχηματισμένα και τα περισσότερα διαθέσιμα σήμερα καρκίνος του προστάτη κλασικά (PRCA). Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αναλύσει μορφογενετικών ιδιότητες των μοντέλων PRCA σε 3D, να συγκρίνουν φαινοτύπους, η έκφραση των γονιδίων και του μεταβολισμού μεταξύ 2D και 3D πολιτισμούς, και να αξιολογήσει τη σημασία τους για προ-κλινικές ανακάλυψη φαρμάκων, μοντελοποίηση της νόσου και η βασική έρευνα. Πρωτογενείς και μη μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη, αλλά επίσης αρκετές γραμμές PRCA, σχηματίζονται καλά διαφοροποιημένο γύρο σφαιροειδή. Αυτές έδειξαν ισχυρές επαφές μεταξύ κυττάρων, επιθηλιακών πόλωση, ένα κοίλο αυλό και καλύπτονταν από ένα πλήρες βασικό πέταλο (BL). Πιο PRCA γραμμές, ωστόσο, σχηματίζονται μεγάλα, πενιχρά διαφοροποιημένο σφαιροειδή, ή επιθετικά εισβολής δομές. Στο PC-3 και τα κύτταρα PC-3M, καλά διαφοροποιημένο σφαιροειδή που σχηματίζονται, τα οποία στη συνέχεια αυθόρμητα μετατραπεί σε άκρως μεταστατικών κυττάρων. Αυτές οι κυτταρικές σειρές μπορεί να έχουν προηγουμένως υποβληθεί σε επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο προσωρινά καταστέλλεται υπέρ των επιθηλιακών ωρίμανση με σήματα από το εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM). Η επαγωγή του μεταβολισμού λιπιδίων και στεροειδών, επιγενετική επαναπρογραμματισμό και ECM αναδιαμόρφωση αντιπροσωπεύει μια γενική προσαρμογή σε 3D πολιτισμό, ανεξάρτητα από το μετασχηματισμό και φαινότυπο. Σε αντίθεση, ΡΙ3-κινάσης, AKT, STAT /ιντερφερόνη και ιντεγκρίνης σηματοδότηση μονοπατιών ήταν ιδιαίτερα ενεργοποιείται σε επεμβατικές κύτταρα. Ειδικοί αναστολείς μικρού μορίου που στοχεύουν ενάντια ΡΙ3-Κινάσης μπλοκαριστεί επεμβατική ανάπτυξη των κυττάρων πιο αποτελεσματικά από ό, τι σε 3D σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια, ή την αύξηση των φυσιολογικών κυττάρων. πίνακας μας μοντέλων κυττάρων, που εκτείνονται σε ένα ευρύ φάσμα φαινοτυπική πλαστικότητα, υποστηρίζει την έρευνα των διαφόρων τρόπων μετανάστευση των κυττάρων και του όγκου μορφολογίες, και θα είναι χρήσιμο για δοκιμών πρόβλεψης των αντι-καρκίνου και αντι-μεταστατικός ενώσεων.

Παράθεση: Härmä V, Virtanen J, Mäkelä R, Happonen Α, Mpindi JP, Knuuttila M, et al. (2010) Μια ολοκληρωμένη Πάνελ τρισδιάστατων μοντέλων Σπουδών του προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου, εισβολή και απαντήσεις για τα ναρκωτικά. PLoS ONE 5 (5): e10431. doi: 10.1371 /journal.pone.0010431

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Ιανουαρίου του 2010? Αποδεκτές: 31 Μαρτίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: May 3, 2010

Copyright: © 2010 Härmä et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση της φινλανδικής Ακαδημίας να MN (Νο 111597). Πρόσθετη χρηματοδότηση στο OK και ΚΕ δόθηκε από το 6ο και το 7ο ΠΠ ολοκληρωμένα έργα PRIMA και EPITRON της Ευρωπαϊκής Επιτροπής. Οι οργανισμοί χρηματοδότησης είχαν κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Δύο-διαστάσεων καλλιέργειες (2D) μονοστιβάδα κυττάρων αντιπροσωπεύουν εξαιρετικά απλουστευτική μοντέλα των επιθηλιακών κυττάρων και των επιθηλιακών καρκίνων, λόγω της απώλειας των φυσιολογικών εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) σε τεχνητές πλαστικές επιφάνειες, και οι υψηλές συγκεντρώσεις στον ορό. Κατά συνέπεια, τα κύτταρα χάνουν σχετικές ιδιότητες, όπως η διαφοροποίηση, η πόλωση, η επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου και εξωκυτταρικής μήτρας επαφές, ενώ επούλωσης τραύματος, φλεγμονώδεις διεργασίες, και υπερ-πολλαπλασιασμός προωθούνται τεχνητά. Σε καλλιέργεια μονοστιβάδας του καρκίνου του προστάτη (PRCA) γραμμές, την ομοιόσταση των αδιαφοροποίητων βλαστικών κυττάρων όγκου μέσω βασικής, ενίσχυσης-διακίνησης και τελικά διαφοροποιημένα, ορμόνη-ευαίσθητη αυλού κυττάρων εξαρτάται από τις συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας, του ασβεστίου και της συγκέντρωσης στον ορό [1], [2] , και μόνο ελάχιστα αντιπροσωπεύει βιολογίας των καρκινικών κυττάρων in vivo. Η έλλειψη ενός σχετικού βασικού υμένα (BL), ελαττωματικά εναπόθεση ECM, και λείπει στρωματικά ή μυοεπιθηλιακά συστατικά [3] συμβάλει περαιτέρω στην τεχνητή φύση. Ως αποτέλεσμα, οι πιο αποτελεσματικοί αναστολείς μικρού μορίου σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας είναι χημειοθεραπευτικά φάρμακα που στοχεύουν τον πολλαπλασιασμό και τη μίτωση. Αυτή η ανισορροπία συμβάλλει στην κακή προγνωστική αξία της ένωσης απόδοση των μεταξύ

in vitro

και

in vivo πειράματα

. δράσης για τα ναρκωτικά που σχετίζεται με την αλληλεπίδραση κυττάρου-κυττάρου, ωρίμανση, επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) και καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) είναι πιθανό να πάει απαρατήρητα. Τόσο 3D αρχιτεκτονική και η ECM ασκούν ισχυρές επιδράσεις σχετικά με την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου [4]. Αδενικά επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα προσαρμόζονται ταχύτατα σε διαφορετικές μικροπεριβάλλοντα και μπορεί δυναμικά εναλλαγή μεταξύ των εναλλακτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την επιβίωση.

Η ανάπτυξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα ή η αποτυχία να ανταποκριθούν σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα απαιτεί επίσης τα κατάλληλα μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας. αντοχή στα φάρμακα συχνά αποδίδεται στην υπόθεση του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC): αντι-μιτωτική φαρμάκων κατά του καρκίνου τα ανταλλακτικά η αργή πολλαπλασιαζόμενα, STEM-ή προγονικά κύτταρα του όγκου-αναγέννησης [5] – [7], η οποία τελικά εκ νέου αποτελούν την μάζα του όγκου. Αυτό μπορεί να είναι ταυτόχρονη με EMT [7] – [10] και την αύξηση μεταστατικού δυναμικού [8]. Η έρευνα για φάρμακα κατά του καρκίνου έχει εισέλθει σε μια νέα φάση στην οποία οι ερευνητές χρησιμοποιούν όλο και περισσότερο οργανοτυπικό συστήματα μοντέλο για να εξερευνήσουν πιο άμεσα τους στόχους του φαρμάκου σε πολυκύτταρους organoids, συχνά εμπλουτισμένη για βλαστικά κύτταρα [11]. Κατάλληλη

in vitro

πειραματικά μοντέλα κατάλληλα για την ανάλυση της ομοιόστασης CSC, EMT, εισβολή και μετάσταση, γίνονται όλο και πιο σημαντικές για την ανακάλυψη φαρμάκων για τον καρκίνο. Αυτά θα πρέπει, επίσης, να είναι οικονομικά αποδοτικές και να παρέχει επαρκή απόδοση για διαλογή υψηλής περιεκτικότητας.

Η καλλιέργεια του αδενικού επιθηλιακού (καρκίνος) κύτταρα σε καθαρό ECM, όπως το κολλαγόνο, υδροπηκτές ή Matrigel, ιδρύθηκε εδώ και πάνω από δύο δεκαετίες [12 ]. Matrigel αντιπροσωπεύει ένα ανασυσταθέν, λαμινίνη πλούσια βασική μεμβράνη, η οποία υποστηρίζει διεργασίες όπως κυτταρική πολικότητα, κύτταρο-κύτταρο και την αλληλεπίδραση κυττάρου-μήτρας, και την εκ νέου έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης ακόμη και σε μετασχηματισμένες γραμμές [13]. Μαστικού και επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη σχηματισμό σφαιροειδών, που αναφέρονται ως mammospheres [14] ή prostaspheres [15], αντίστοιχα. Κανονικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε καλά-πολωμένο κοίλα σφαιροειδή, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του λειτουργικού, αδενικών επιθηλιακών κυττάρων. Το ίδιο μικροπεριβάλλον υποστηρίζει επίσης την κυτταρική μετανάστευση, διακλάδωση και το σχηματισμό της χαρακτηριστικής acini [16], [17]. Σε αντίθεση, τα κύτταρα όγκου παρουσιάζουν συνήθως ένα ελαττωματικό πρόγραμμα διαφοροποίησης, και σχηματίζουν άτυπα σφαιροειδή με αποδιοργανωμένη αρχιτεκτονική, όπως αποδεικνύεται πιό κυρίως για καρκίνους του μαστού [18] – [20]. πρότυπα έκφρασης γονιδίων από σφαιροειδή αποδείχθηκε ότι συσχετίζονται με τις χαρακτηριστικές φαινοτύπους που σχηματίζονται σε 3D καλλιέργειες [19], [20] και τη συνολική διαφοροποίηση και επιθετικό δυναμικό των καρκίνων [21], [22]. Παρόμοια με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, κύτταρα PRCA μπορεί επίσης να εισβάλουν ενεργά τη γύρω matrigel, αν και από τον τρόπο της μετανάστευσης είναι διαφορετική από τις συνήθεις, τις συλλογικές μοτίβα φύλλο ή μετανάστευση σωλήνα παρατηρήθηκε σε διακλάδωση των φυσιολογικών κυττάρων. Ο φαινότυπος της εισβολής καρκίνου εξαρτάται από τη σύνθεση και την πυκνότητα του ECM, και μπορεί να ποικίλει από αμοιβαδοειδή διόγκωση, μεσεγχυματικά μοιάζουν με ινοβλάστες κινητικότητα και πολυκύτταρους ροής ή μετανάστευση αλυσίδα [23], [24]. Φυσικά, η επεμβατική δυναμικό εξαρτάται επίσης από την γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων PRCA και (συνήθως σε κίνδυνο) την ικανότητά τους να συμμετέχουν σε αυστηρό επιθηλιακά επαφές κυττάρου-κυττάρου. Μαστικού και άλλα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα σχηματίζουν κυλινδρικό, άτρακτος κυττάρων που μοιάζουν με τη δυνατότητα να συστέλλεται και να επιμηκύνονται, υποστηρίζοντας μετανάστευσης μέσω της γύρω mesh ECM. Πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με PRCA. Εισβολή υποβοηθείται με πρωτεολυτική διεργασίες και πρωτεάσες όπως καθεψίνες [25], μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs [24]), διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται από ινοβλάστες ή την παρουσία των ινοβλαστών ίδιοι [26], [27], και άλλους παράγοντες, όπως φιμπρονεκτίνη και οξειδάσες λυσυλ [26]. Από αυτή την άποψη, 3D μοντέλα καρκινικών κυττάρων εισβολής [28] αντιπροσωπεύουν κυτταρική δυναμική και την αρχιτεκτονική των όγκων πολύ καλύτερα από καλλιέργειες μονοστιβάδας 2D στην οποία τα κύτταρα απλώνονται και γλιστρούν σε όλη την πλαστική επιφάνεια. Το δυναμικό να υποβληθούν σε EMT και να αποκτήσει τρόπους μετανάστευση μεσεγχυματικά είναι μία άλλη παράμετρος υποτεθεί να συμβάλει στην μαστού-και PRCA εισβολή και την κινητικότητα [29].

Επιπλέον, είναι ασαφές εάν PRCA σφαιροειδή, ιδιαίτερα όταν καλλιεργείται σε lrECM , δείχνουν τον εμπλουτισμό πληθυσμών CSC (που συχνά συνδέεται με μια EMT), ή αναπτύσσουν αντίσταση ενάντια χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και ακτινοβολία ιονισμού [30], [31]. Τουλάχιστον, η συμμετοχή της CSC ή EMT αναμένεται να εμφανίσει μια πολύ διαφορετική δυναμική στη διαφοροποίηση 3D πολιτισμών στην LrECM, σε σύγκριση με κυμαινόμενο prostaspheres και προϋποθέσεις μονοστοιβάδα 2D [32]. Τελευταία αν μη τι άλλο, τα μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας για την εισβολή των καρκινικών κυττάρων επί του παρόντος περιορίζεται σε λίγες χρησιμοποιείται ευρέως, ενδεχομένως τεχνητό δοκιμασίες (επικοινωνούντα δοκιμασίες εισβολή? Δοκιμασίες μετανάστευσης μηδέν-τραύματος). Από την εισβολή είναι θεμελιωδώς διαφορετική υπό 3D συνθήκες, τυχόν εκπροσώπου μοντέλα 3D εισβολή αντιπροσωπεύουν μια πραγματική καινοτομία [26, 28, και 33].

Αναφέρουμε εδώ την ανάπτυξη και μορφολογικό χαρακτηρισμό των μικροσκοπικών συστημάτων 3D μοντέλο κυτταρικής καλλιέργειας, χρησιμοποιώντας ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών 29 του προστάτη. Μια επιλογή από τα πιο αντιπροσωπευτικά γραμμές στη συνέχεια περαιτέρω χαρακτηρίζεται από αναλύσεις του γονιδιώματος-ευρεία μεταγραφικό και τη συστημική βιολογία να προσδιοριστούν τα βασικά μονοπάτια, μόρια σηματοδότησης, δίκτυα γονιδίων, και υποθετικών φαρμακευτικών στόχων ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη και την εισβολή των κακοήθων κυττάρων PRCA. Επιπλέον, έχουν αναπτυχθεί εργαλείων βιοπληροφορικής ανάλυσης εικόνας για την ποσοτικοποίηση δυναμική φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως η επεμβατική δομές, σφαιροειδές σχήμα ή αντιδράσεις του φαρμάκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και μονοστρωματικές καλλιέργειες

οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC ή ζητηθεί από τα εργαστήρια παραγωγής αρχέτυπων (Πίνακας S1). Φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα και παράγωγα (PrEC, EP156T, RWPE-1, RWPE-2, RWPE-2 /W99, WPE1-NB14, PWR-1Ε, PZ-HPV-7 και ΟΑ-HPV-10) καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων Ορό Ελεύθερη Medium (KSFM, Gibco), συμπληρωμένο με 12,5 mg /l εκχύλισμα βόειας υπόφυσης και 1,25 μg /l EGF. Για 3D καλλιέργειες, προστέθηκαν 2% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Gibco). Περισσότερες γραμμές PRCA καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), συμπληρωμένο με 10% FBS. MDA-PCa-2b και ΝΟΙ-H660 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ham F12 (Gibco) με 20% FBS, 25 ng /ml τοξίνης χολέρας, 10 ng /ml EGF, 5 μΜ φωσφοαιθανολαμίνη, 0,1 ng /ml υδροκορτιζόνη, 45 ηΜ σεληνικού οξέος και 5 μg /ml ινσουλίνη (όλα από την SIGMA). Όλα τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε 37 ° C σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων (5% CO2, 95% υγρασία). Ταυτότητα του κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε από arrayCGH (συγκριτική γονιδιωματική υβριδισμού) για Agilent 244 k συστοιχίες ανθρώπινου γονιδιώματος, μετά από 10-15 δίοδοι κύτταρα διακόπηκαν.

την μικρογραφία 3D πολιτισμούς.

Τα κύτταρα ενσωματωμένη μεταξύ δύο στρώσεις του Matrigel επί μη επικαλυμμένων αγγειογένεση μ-slides (Ibidi Gmbh, Γερμανία): κάτω φρεάτια πληρώθηκαν με 10 μΙ Matrigel /μέσο καλλιέργειας (1:01? 50%) και πολυμερίζεται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια σπείρονται σε 20.000 κύτταρα /πυκνότητα ml (περίπου 1000 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά την προσκόλληση (1-2 ώρες στους 37 ° C), τα κύτταρα καλύφθηκαν με ένα δεύτερο στρώμα Matrigel /μέσου καλλιέργειας (1:04, 25%), αφέθηκε να πολυμεριστεί για όλη τη νύχτα στους 37 ° C. μέσο καλλιέργειας κυττάρων αλλάζονται κάθε δεύτερη μέρα.

πολιτισμών 3D χύμα για εξαγωγή RNA.

Prostaspheres καλλιεργήθηκαν σε Millicell κρέμονται καλλιέργεια κυττάρων εισάγει με 1,0 μm PET διαφανή μεμβράνες (Millipore) σε 6-καλά πλάκες (Costar). Οι μεμβράνες προ-επικαλυμμένες με Matrigel /μέσο (1:01) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα, για να αποφευχθεί προσκόλληση στη μεμβράνη. εναιώρημα κυττάρων αναμίχθηκε 1:04 με Matrigel, μεταφέρονται στην επικαλυμμένο καλά, και πολυμερίζεται επί μία νύκτα στους 37 ° C. Τα κύτταρα τροφοδοτήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα με φρέσκο ​​μέσο από κάτω.

στερέωση των κυττάρων, την επισήμανση ανοσοφθορισμού και απεικόνισης.

την μικρογραφία 3D καλλιέργειες σταθεροποιήθηκαν εντός μικροφρεάτια, χρησιμοποιώντας 4% παραφορμαλδεϋδη, συμπληρωμένο με 0.8% Triton Χ-100 (Sigma-Aldrich), 5 mM EGTA και 1 mM ΜαΟΙ

2 για 15-20 λεπτά σε RT. Σταθερή καλλιέργειες πλύθηκαν 3 φορές με PBS και αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 20% ορό αλόγου. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα (που αναφέρονται στον Πίνακα S2), πλύθηκαν με PBS, και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 4 ώρες με δευτερογενή αντισώματα και Hoechst πυρηνική χρώση (1:5000).

3D δομές χρωματίστηκαν με χρωστική ουσία ζωντανών κυττάρων Calcein ΑΜ (Invitrogen). Ομοεστιακή τρισδιάστατες εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση Zeiss Axiovert 200 M με περιστρεφόμενο δίσκο ομοεστιακό μονάδα Yokogawa CSU22 και Zeiss Plan-Neofluar 5 × στόχος. Ζ-στοίβες αποκτήθηκαν με ένα βήμα μέγεθος των 19 μm. προβλέψεις έντασης δημιουργήθηκαν από SlideBook 4.2.0.7 και ΝΙΗ ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/), αναλύθηκαν περαιτέρω με το λογισμικό VTT Acca (ευαισθησία 10? όριο 5, δομές λιγότερο από 500 pixels στην περιοχή /μέγεθος φιλτράρεται έξω). οικόπεδα κουτί έγιναν ορατά με το R. 20x αντίθεσης φάσης χρόνο εικόνες παρέλευση αποκτήθηκαν με Incucyte (μέσα του Έσσεν), προ-επεξεργασία με ImageJ και αναλύονται με VTT Acca (ευαισθησία 30? όριο 5, δομές λιγότερο από 1000 pixels στην περιοχή φιλτράρονται) .

εκχύλιση RNA και μικροσυστοιχίες.

καλλιέργειες χύδην 3D πλύθηκαν με παγωμένο PBS, οι μεμβράνες αποκόπηκαν με νυστέρι, και σφαιροειδή μεταφέρθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Οι πηκτές αναμίχθηκαν έντονα με 9 ml 5 mM EDTA σε PBS, μεταφέρθηκαν σε σωλήνες Falcon των 15 ml, και επωάστηκε σε ένα ταλαντωτή επιτραπέζια για 45 λεπτά για να αποσπαστεί από το Matrigel. Prostaspheres καταβυθίστηκαν με φυγοκέντρηση και λύθηκαν με ρυθμιστικό RLT (Qiagen). Τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε μονοστιβάδα λύθηκαν σε 90% συρροή, απ ‘ευθείας από 10 cm δίσκους κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιώντας RLT ρυθμιστικό. Ολικό RNA (από βιολογική επαναλήψεις) εκχυλίστηκε με RNeasy Mini Kit (Qiagen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 300 ng RNA ενισχύθηκε με το κιτ Illumina TotalPrep RNA Ενίσχυση Ambion του. αντίδραση IVT διεξήχθη όλη τη νύχτα (-16 ώρες) για να αποδώσει επαρκή βιοτινυλιωμένο cRNA. Οι συγκεντρώσεις RNA και cRNA μετρήθηκαν με nanodrop ND-1000, η ​​συνολική ποιότητα παρακολουθήθηκε με ηλεκτροφόρηση σταθμό Experion BioRad του. 750 ng cRNA υβριδίσθηκαν σε Illumina του Sentrix HumanRef-8 v3 BeadChips, στους 58 ° C για μια νύχτα. Υβριδοποιημένοι cRNA ανιχνεύθηκε με 1 mg /ml Cyanine3-στρεπταβιδίνης (GE Healthcare Biosciences), και συστοιχίες σαρώθηκαν με Illumina BeadArray Reader. Τα δεδομένα ελέγχθηκαν ποιότητας και εξάγεται με τη χρήση του λογισμικού Illumina GenomeStudio, χωρίς εξομάλυνση ή αφαίρεση του υποβάθρου.

ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών.

Πρώτες δεδομένων μικροσυστοιχιών ήταν ποσοστημόριο-κανονικοποιημένη, χρησιμοποιώντας το πακέτο R βιομεταβιβαστή «beadarray». Κανονικοποιημένα δεδομένα περαιτέρω επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διακύμανση και την ένταση. Στατιστική ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των limma και lumi πακέτα R /Bioconductor. Το όριο για διαφορική έκφραση ήταν Q & lt? 0.05 μετά Benjamini-Hochberg διόρθωση πολλαπλές δοκιμές. έχουν κανονικοποιημένα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης Illumina ολόκληρου του πίνακα των πειραμάτων έχουν υποβληθεί σε GEO (Gene Omnibus έκφραση) ως GSE19426 μελέτη

Τα δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια σε δύο διαφορετικούς τρόπους:. να αξιολογήσει σχετικές μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ 2D και 3D πειράματα, ή διαφορετικά χρονικά σημεία σε 3D πολιτισμό, σημαίνει κανονικοποιημένες τιμές σε 3D αφαιρέθηκαν από τις μέσες τιμές των επαναλήψεων σε 2D μονοστρωματική καλλιέργεια και οι αναλογίες υπολογίζονται. Log (2) μετασχηματίζεται αναλογίες 2D /3D στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για την ομαδοποίηση και την παραγωγή heatmap (Cluster 2.11 και TreeView 1.60, Stanford University), και ανάλυση γονιδίων οντολογίας (GO? DAVID, https://david.abcc.ncifcrf.gov/) . K-Means clustering χρησιμοποιήθηκε για να επιστήσει την εκπρόσωπο θερμικούς χάρτες με βάση τα στοιχεία αναλογία 2D /3D, δημιουργώντας 12 κόμβους (100 επαναλήψεις). Το πακέτο Gene Set Ανάλυσης (GSA) σε Ε χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει σημαντικά εμπλουτισμένη κατηγορίες γονιδίων, εδώ τα στατιστικά στοιχεία «Maxmean» χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί ο εμπλουτισμός βαθμολογίες και τιμές ρ μετάθεση βάση προήλθαν από 1.000 bootstrap αναπαράγει. Μια διόρθωση ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) επίσης εφαρμόστηκε ως μέτρο της ενδιαφέρον. σύνολα γονίδιο που χρησιμοποιείται για την ανάλυση ελήφθησαν από την Molecular υπογραφές Database (MSigDB, Broad Institute), συμπεριλαμβανομένης της θέσης, της γειτονιάς επιμέλεια, συν-έκφραση, GO, και εξελικτικά συντηρημένη στόχους μεταγραφή-παράγοντα.

Δεύτερον, κανονικοποιημένη αλλά κατά τα άλλα un-επεξεργασία των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν για να καθορίσουν γονίδιο υπογραφές που συσχετίζονται με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (στρογγυλό /κανονική, μάζα, φαινότυπος αστεροειδής). Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) και αποτύπωση των ενημερωτικών γονιδίων συσχετίζεται με σφαιροειδή μορφολογίες έγιναν με βάση την εξειδικευμένη σενάρια R. επιλέχθηκαν τα γονίδια που αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο ποσοστό της διακύμανσης με βάση την ANOVA.

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) και επιλογή ένωσης.

διαφορικά εκφραζόμενο γονίδιο clusters (2D /3D αναλογίες) έχουν ανεβάσει στο IPA στην εκτελέσει γονίδιο αναλύσεις του δικτύου και τον εντοπισμό ενδεχομένως ενημερωτικό κεντρική γονίδια «κόμβο». Ειδικοί αναστολείς μικρού μορίου εναντίον ορισμένων κόμβων ή γονίδια πλήμνη και μονοπατιών αποκτήθηκαν από TOCRIS και Sigma-Aldrich (βλέπε παρακάτω). Πρόσθετες και ανεξάρτητες πηγές του φαρμάκου /πληροφορίες στοχεύουν επίσης χρησιμοποιηθεί για τον ίδιο σκοπό (DrugBank? https://www.drugbank.ca? Matador https://matador.embl.de)

RT-PCR. επικύρωσης.

2 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα με ανάστροφη μεταγραφάση Superscript II Invitrogen σε 50 μλ. cDNAs αραιώθηκαν 1/10. QRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με τη γρήγορη διαδοχή 7900HT Detection System (Applied Biosystems) σε 96-φρεατίων ή σε μορφή πλάκας 384-φρεατίων, 8 μl /φρεάτιο. PCR εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν με βάση την Probe Βιβλιοθήκη Roche Universal, ολιγονουκλεοτίδια παραγγέλθηκαν από την Sigma-Aldrich. Οι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν σε 300 ηΜ, ανιχνευτές στα 100 ηΜ συγκέντρωση? με 2x TaqMan® Οικουμενική PCR Master Mix. τρέχει PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Applied Biosystems SDS Κατεβάστε

Πρωτεΐνη λύμα μικροσυστοιχίες (LMA)

Prostaspheres συλλέχθηκαν κατά τις ημέρες 3, 6, 8, 10 και 14..? σύμφωνα με το ακόλουθο πρωτόκολλο: μικροφρεάτια πλύθηκαν με PBS, Matrigel αναμιγνύεται με παγωμένο 5 mM EDTA σε PBS, μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων ν-πυθμένα (Greiner), και επωάστηκαν επί πάγου σε επιτραπέζια-αναδευτήρα για 30 λεπτά. Σφαίρες καθιζάνουν με φυγοκέντρηση και λύθηκαν σε LMA-ρυθμιστικό (0,2% SDS, 100 mM Tris, 10 mM DTT). κύτταρα μονόφυλλο συλλέχθηκαν σε LMA-ρυθμιστικό σε 90% συρροή σε πλάκες 10 cm. Για κάθε χρονικό σημείο, δύο βιολογικών αντίγραφα τυπώθηκαν σε μια ενιαία συστοιχία. Εκτύπωση, χρώση, σάρωση, αφαίρεση φόντο, κανονικοποίηση σε σχέση προς β-ακτίνη σήματος, και οι αναλύσεις των δεδομένων έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34].

κηλίδωση Western.

Τα δείγματα πρωτεΐνης από φρεάτια καλλιέργειας ήταν συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται από πλάκες μικροφρεατίων, και λύθηκαν σε WB-ρυθμιστικό διάλυμα (25 mM Hepes ρΗ 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA ρΗ 8,3, 0,5% Triton Χ-100, 20 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 100 μΜ ορθοβαναδικό, 0.5 mM PMSF και 1 mM DTT). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με δοκιμασία Bradford, και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE με προκατασκευασμένα πηκτώματα Pager (Lonza), μεταφέρθηκαν επί μεμβράνης μεταφοράς Protran νιτροκυτταρίνης (Whatman), και γίνεται αποτύπωμα με τα πρωτεύοντα αντισώματα που απαριθμούνται στον Πίνακα S3. Multiplex επώαση με τρία αντισώματα χρησιμοποιήθηκε για να φιλοξενήσει για το μικρό συνολικό ποσό των πρωτεϊνών που προέρχονται από καλλιέργειες σε μικρογραφία. Αντισώματα ανιχνεύθηκαν με Alexa υπέρυθρο χρωστική-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Invitrogen), και μεμβράνες σαρωθεί με το Infrared System Imaging Οδύσσεια (LI-COR).

θεραπείες φαρμάκων σε 3D.

ενώσεις διατάχθηκαν από SIGMA ή Tocris Inc., και διαλύθηκε στο κατάλληλο φορέα (DMSO, αιθανόλη, 1 χ PBS) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη χημειοκίνες, κυτοκίνες, και αντισώματα λειτουργία αποκλεισμού παραγγέλθηκαν από την Κ & amp? D Systems. Φάρμακα παρασκευάστηκαν ως διαλύματα αποθέματος 10 mM, αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Οι περισσότερες χημειοκίνες και πεπτίδια αραιώθηκαν σε 1 μl διαλύματα παρακαταθήκης μg /. Αραίωση σε διαλύματα εργασίας έγινε αμέσως πριν από τη θεραπεία. Φάρμακα προστέθηκαν μετά από μία περίοδο 4 ημερών, κατά την οποία αναπτύσσουν σφαιροειδή, και διατηρήθηκαν έως και 7 ημέρες. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου που επιλέγονται σύμφωνα με ημι-μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50), που είναι γνωστή για τις περισσότερες ενώσεις. Όλες οι κατεργασίες έγιναν εις τριπλούν. Σφαιροειδή παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο από το live-κυττάρων απεικόνισης (Incucyte, Έσσεν Όργανα? 10x στόχος), αποκτώντας 1 image /h

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού των κυττάρων

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 384-.. φρεατίων προστέθηκαν 24 ώρες πριν από τα φάρμακα. Μετά από 72 ώρες ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων αξιολογήθηκε με Δοκιμασία Βιωσιμότητας Κυττάρου CellTiter Blue® (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σήμα φθορισμού μετρήθηκε ποσοτικά με EnVision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer).

Αποτελέσματα

Κανονική επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη και PRCA γραμμές σχηματίζουν χαρακτηριστικές μορφολογίες σε Matrigel

Κανονική προστάτη και του καρκίνου του προστάτη (PRCA) κυτταρικές γραμμές αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν και να σχηματίσουν πολυκύτταρων δομών με καθαρά πλούσιου σε κολλαγόνο εξωκυτταρική μήτρα (Εικόνα S1). Σε κολλαγόνου, και οι δύο κανονικοποιημένο και καρκινικά κύτταρα σχηματίζονται μόνο χαλαρά συσσωματώματα, με κακή ή καθόλου επαφές κυττάρου-κυττάρου, συχνά εμφανίζοντας ένα ινοβλάστες σαν πρότυπο ανάπτυξης. Σε αντίθεση, Matrigel στηρίζει σθεναρά τόσο την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των φυσιολογικών και PRCA σφαιροειδή. Matrigel έχει βαθιές επιπτώσεις σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν και, με ελάχιστες εξαιρέσεις? σχηματισμός των σχετικών πολυκύτταρων δομών υποστηρίζεται. Σφαιροειδές σχηματισμό σε Matrigel τυπικά ξεκίνησε από μεμονωμένα κύτταρα. Τα σφαιρίδια που σχηματίζονται στο Matrigel γενικά έπεσαν σε τέσσερις μορφολογικές κατηγορίες, προσαρμοσμένο από [19], [35] (Σχήμα 1? Εικόνα S2).

Οι περισσότερες δομές έπεσε στις κατηγορίες γύρο, μάζα, αστεροειδής, ή γκρέιπφρουτ αρέσει. Ορισμένες κυτταρικές γραμμές απέτυχαν να σχηματίσουν σφαιροειδή σε Matrigel αλλά επέμεινε ως ενιαίο ζωντανά κύτταρα για μέχρι και δύο εβδομάδες (μονά φαινότυπος). Οι περισσότεροι σφαιροειδή απεικονίστηκαν στις ημέρες 9-10 μετά τον εμβολιασμό. PC-3 σφαιρίδια, εμφανίζεται ως γύρο φαινότυπο κατά την ημέρα 9, υποβάλλονται σε μια μεταμόρφωση σε επεμβατικές /φαινότυπο αστεροειδή την ημέρα 13. Το ίδιο συμβαίνει και με το PC-3M σε προγενέστερο χρονικό σημείο (ημέρα 5-8).

Η

διακλάδωσης /Round φαινότυπο.

φυσιολογικά επιθηλιακά πρωτογενή προστάτη (PRECs) και μη-μετασχηματισμένες σειρές όπως RWPE-1 και EP156T κύτταρα σχηματίζονται στρογγυλά σφαιροειδή μετά 6-10 ημέρες σε καλλιέργεια (Σχήμα 1). Κανονική PRECs και in-vitro αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές όπως RWPE-1 και τα κύτταρα PWR-1E ταυτοχρόνως σχηματίζεται διακλάδωσης acinar και στρογγυλά δομές σφαιροειδές, μεταναστεύουν ενεργά στην περιβάλλουσα ECM με τη μορφή μεγάλων συσσωματωμάτων κυττάρων (Σχήμα 2a-d). κύτταρα EP156T δεν έδειξε ή λίγες διακλαδώσεις δομές. δομές Γύρος αναπτύχθηκε γενικά ένα ισχυρό βασικό έλασμα (BL), ενθυλάκωση και τα δύο σφαιροειδή και δομών λοβιώδη (Σχήμα 2, Εικόνα S2, Σχήμα 3g-m). Παραδόξως, οι γραμμές όγκων DU145, PC-3 και τα κύτταρα PC-3M σχηματίζονται επίσης γύρο και καλά διαφοροποιημένο, πολωμένο σφαιροειδή (σχήμα 2Ε), που περιβάλλεται από μια πλήρη BL, και συχνά περιέχει ένα αυλό (PC-3? Σχήμα 3e + r) . Επιπλέον, PC-3 σφαιρίδια που περιέχονται συχνά μια εσωτερική κυτταρική μάζα που θυμίζει δομών δει στο PIN (νεοπλασίες ενδοεπιθηλιακή του προστάτη). Ανοσολογική χρώση για πρωτεΐνες σφιχτό διασταύρωση όπως ΖΟ-1 (δεν φαίνεται) και F-ακτίνης (Σχήμα 3a-c) έδειξε γενικά πολύ ισχυρή επαφές κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου πόλωση στο γύρο σφαιροειδή που σχηματίζονται από τα δύο φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα.

Α) Φάση εικόνα αντίθεσης διακλάδωσης δομές που σχηματίζονται από κύτταρα RWPE-1, Β) δομή που σχηματίζεται από κυψελοειδή RWPE-1 χρωματίζονται με ένα αντίσωμα έναντι λαμινίνη Β1. Γ) Διακλάδωση ή δομές που ομοιάζουν σύμπλεγμα που σχηματίζεται από τα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη πρωτογενή (PrEC). ΡΕ). Μικτή διακλάδωση και μαζική φαινότυπο δομές, που αποτελούνται από κύτταρα PWR-1Ε. Ε) δομές Round σχηματίζεται από PC-3 κύτταρα την ημέρα 9, ζωντανή χρώση των κυττάρων με καλσεϊνη. ΣΤ) Η μορφολογική μετατροπή του γύρου σφαιροειδή σε επεμβατικές δομές κατά την ημέρα 13. G) Φάση-αντίθεση της εικόνας της επεμβατικής PC-3 δομές γύρω από την ημέρα 13. Η). Χρώση PC-3 filopodia με ένα αντίσωμα ειδικό για τη δραστική μορφή του ιντεγκρίνης βήτα 1 (ITGB1), που απεικονίζει πυκνή διακόσμηση των δομών ατρακτοειδόμορφα κύτταρο.

Η

Alexa488 σημασμένο φαλλοειδίνη χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει F ακτίνη και η Hoechst λεκέ να επισημαίνουν πυρήνες (μπλε). RWPE1, DU145 και PC3 κύτταρα δείχνουν έκφραση του ΕΜΤ που σχετίζονται με δείκτες μεσεγχυματικών, ανεξάρτητα από φαινοτύπου (κύτταρα PC-3? Γύρο την ημέρα 9, αστεροειδή την ημέρα 14)

Η

φαινότυπο Mass

..

η πλειοψηφία των PRCA (LNCaP, 22rV1, MDA-PRCA 1, UM-SCP1, CWR-r1, LAPC-4) και δύο

in vitro

μετατραπεί γραμμές (PWR-1E, RWPE-2) δημιουργούνται μεγάλα, ακανόνιστα σφαιρίδια με συχνά ελλιπείς ή λείπει BL, επίσης λείπει ένα κοίλο αυλό (Σχήμα 3δ + k). PWR-1E ήταν η μόνη κυτταρική γραμμή μαζικής φαινότυπο ικανό διακλάδωσης /κυψελιδικά μορφογένεση (Σχήμα 2δ). Οι αυλού keratins KRT8 και KRT18 ήταν πάντα έντονα εκφράζεται (Πίνακας S3). Κυττάρου-κυττάρου επαφές, την ωρίμανση και την πόλωση ήταν γενικά λιγότερο έντονο, σε σύγκριση με το γύρο σφαιροειδή, αντικατοπτρίζονται στις συχνά σε σχήμα νεφρού ακανόνιστη σφαιροειδή (σχήμα 1). Μάζα δομές φαινότυπο έκαναν συνήθως δεν δείχνουν την εισβολή του lrECM? Ωστόσο, ο σχηματισμός του filopodia ή ψευδοπόδια παρατηρήθηκε με συνέπεια στην 22rV1 και περιστασιακά στις κυτταρικές γραμμές RWPE-2 LNCaP και. Σε LNCaP σφαιροειδή, τα κύτταρα παρατηρούνται συχνά να εγκαταλείψουν τις δομές σφαιροειδές σε περιοχές της ελλιπούς κάλυψης BL (Εικόνα S2).

Σταφύλι φαινότυπο.

Μόνο μία κυτταρική σειρά, 1013L, που σχηματίζεται με συνέπεια χαλαρά συστάδες κυττάρων με ιδιαίτερα χαμηλή επαφές κυττάρου-κυττάρου, στερούμενη BL. LAPC-4 κύτταρα που σχηματίζονται τόσο μαζική και σταφύλι-όπως δομές. Δεν επεμβατική ιδιότητες παρατηρήθηκαν σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

Αστεροειδή «επεμβατικές» φαινότυπο.

Οι in vitro μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές RWPE-2 /W99, WPE-1 /NB14, και τις γραμμές όγκου ALVA-31 και ALVA-41 διαμορφώνεται αστεροειδής ή επεμβατικές δομές, που χαρακτηρίζεται από ατρακτοειδόμορφα filopodia (Σχήμα 2G) και η ταχεία μετάβαση των αλυσίδων των κυττάρων μέσω της γύρω ECM. Επεμβατική δομές που σχηματίζονται ήταν σχεδόν αποκλειστικά πολυκύτταρους και έδειξε μια λειτουργία εισβολή αλυσίδα-όπως. Ινοβλαστών-όπως, μεσεγχυματικά εισβολή μεμονωμένων κυττάρων παρατηρήθηκε μόνο περιστασιακά. Η

in vitro

μετασχηματισμένες γραμμές RWPE-2, RWPE-2 /W99 και WPE1 /NB14 σχηματίζονται ταυτόχρονα αστεροειδή δομές και στρογγυλά σφαιροειδή, υποδεικνύοντας ετερογενής σύνθεση αυτών των κυτταρικών σειρών. Από αυτά, RWPE-2 /W99 αντιπροσώπευε την κυτταρική γραμμή με την πιο συνεπή φαινότυπο αστεροειδής, και επιλέχθηκε για περαιτέρω πειράματα. κύτταρα αθανατοποιημένες προστάτη στρωματικά (WPMY-1) και που προέρχονται από όγκους, κύτταρα πρωτογενή στρωματικά (δεν φαίνεται) που σχηματίζεται επίσης αστεροειδής-όπως δομές, ωστόσο στερείται ταχεία κινητικότητα και επεμβατική ιδιότητες.

Διηθητική διακόπτη.

Γύρος και καλά διαφοροποιημένο, πολωμένο σφαιροειδή σχηματίστηκαν από το PC-3 και τα κύτταρα PC-3M, αλλά υπέστη μια αυθόρμητη μετασχηματισμό προς την κατεύθυνση της εισβολής μορφολογία γύρω από 10-13 και 6-8 ημέρες σε 3D, αντίστοιχα (Σχήμα 2e + f, συμπληρωματικό Movie εισβολή S1). Η έναρξη της μορφολογικό μετασχηματισμό εντός του αστεροειδούς, επεμβατική φαινότυπος εξαρτιόταν από την κυτταρική πυκνότητα. Ο μετασχηματισμός θα μπορούσε να καθυστερήσει προσωρινά, ακόμη και εν μέρει επανήλθε κατά τη σίτιση φρέσκο ​​μέσο, ​​αλλά τελικά συνέχισε να προχωρήσει έως ότου όλες οι δομές καλά μεταμορφώνεται και μόνο αστεροειδή δομές παρέμειναν (Σχήμα 2G). Επεμβατική δομές και filopodia σχηματίζονται ακόμη και πριν από την εισβολή εξέφρασαν έντονα την δραστική μορφή του ιντεγκρίνης λαμινίνες-βήτα υποδοχέα 1, υποδεικνύοντας ισχυρά επαφές στην εξωκυττάρια μήτρα ως προϋπόθεση για διηθητική διεργασίες (Εικόνα 2h). Ταυτόχρονα, η BL των μεταμορφωμένων δομών γίνεται όλο και πιο ασαφής και αποσυντεθεί (Σχήμα 3m). Ισχυρή έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών βιμεντίνης VIM και φιμπρονεκτίνη FN1 (Σχήμα 3ο-y), που παρατηρείται σε μη επεμβατικές RWPE-1 (ετερογενής) και DU145, αλλά επίσης και σε κύτταρα PC-3, δεν συσχετίζονται με το φαινότυπο αστεροειδής. Επιπλέον, η έκφραση της VIM και FN1 δεν αυξήθηκαν μετά την επεμβατική μετασχηματισμό των κυττάρων PC-3 και PC-3M (Σχήμα 3s + y)

«Single» φαινότυπο.

Μερικές γραμμές καρκίνου ( vcap, DuCaP, NCI-H660 και 2β MDA-PCA) απέτυχε να σχηματίσει σφαιροειδή, αλλά παρέμεινε ως μεμονωμένα κύτταρα ( «single» ή «ενικό φαινότυπο») για έως 2 εβδομάδες. Είναι ενδιαφέρον ότι όλες αυτές οι κυτταρικές σειρές ήταν θετικές για συμβάντα σύντηξης παράγοντα ETS-μεταγραφής ή αναδιατάξεις (TMPRSS2-ERG σε H660, VCAP και DuCaP, μια ισορροπημένη ETV1 αναδιάταξη σε MDA-PCa 2β). Γονιδιακή έκφραση αναλύσεις των κυττάρων VCAP σε Matrigel έδειξε ότι τα κύτταρα μπορούν να υποστούν τελική διαφοροποίηση ή γήρανση όταν ενσωματώνονται σε Matrigel (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έκφραση του γονιδίου σύντηξης και διάδοση σχετικών γονιδίων TMPRSS2-ERG μειώθηκε σε Matrigel. Ωστόσο, η ανάπτυξη του Vcap και DuCaP δεν περιορίζεται σε πηκτώματα κολλαγόνου τύπου Ι? και τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης σε Col Ι περιορίστηκαν (δεν φαίνεται).

Δυναμική μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση προς Matrigel συσχετίζονται με κανονικό, μετασχηματίζονται και επεμβατική ιδιότητες

LrECM και το σχηματισμό των σφαιροειδών επάγουν θεμελιώδεις αλλαγές στην κυτταρική βιολογία, πρωτεΐνης και του γονιδίου έκφρασης του mRNA των κυττάρων PRCA. Περίπου 3400 mRNAs εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ 2D και 3D συνθήκες, όχι όμως με συνέπεια σε όλες τις κυτταρικές σειρές και όλα τα χρονικά σημεία. Τρεις γενικευμένες μορφές τροποποιημένης γονιδιακής έκφρασης παρατηρήθηκαν στα πάνελ των κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 4α + β). Η αλλαγμένη έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων ελέγχθηκε με qRT-PCR (Σχήμα 4γ). Παράγοντες της διαφορικής έκφρασης, όπως επιβεβαιώνεται από qRT-PCR, ήταν γενικά μεγαλύτερη σε σύγκριση με τα δεδομένα του πίνακα. GO αναλύσεις και GSEA αποκάλυψε εξαιρετικά σημαντική εμπλουτισμένο λειτουργικές κατηγορίες γονίδιο για τα περισσότερα από τα clusters (Πίνακες S4, S5 και S6).

Α) Heatmap, που απεικονίζουν 12 συμπλέγματα που δημιουργούνται από τον αλγόριθμο K-means. Clusters 1 + 2 αντιπροσωπεύουν γονίδια επηρεάζονται αποκλειστικά σε φυσιολογικά κύτταρα (PrEC, EP156T). Clusters 6-8 αντιπροσωπεύουν γονίδια ομοίως επάγεται ή καταστέλλεται σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε ανταπόκριση με τον πολιτισμό 3D κυττάρων σε Matrigel 3D, ανεξάρτητα από το φαινότυπο, ή μετατροπή. Clusters 9-12 περιέχουν γονίδια χαρακτηριστικό για τους /τύπου κυτταρικές σειρές αστεροειδής επεμβατική (ALVA31, PC3, PC3M, RWPE2 /W99), ή που προκαλούνται κατά τη διάρκεια της αυθόρμητης μετατροπή του γύρου στις δομές αστεροειδής (π.χ. PC3, ημέρα 13 και 15).