Αφηρημένο

Φυσικά προϊόντα αντιπροσωπεύουν μια πλούσια δεξαμενή των πιθανών μικρά χημικά μόρια που εμφανίζουν αντι-πολλαπλασιαστική και chemopreventive ιδιότητες. Εδώ, δείχνουμε ότι η θεραπεία των κυττάρων πόρου αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος (PDAC) (PANC-1, MiaPaCa-2) με το ισοκινολίνης αλκαλοειδές berberine (0,3 – 6 μΜ) ανέστειλαν τη σύνθεση του DNA και τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων και να καθυστερήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου τους στο G1. θεραπεία Βερβερίνη μείωσε επίσης (κατά 70%) την αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων MiaPaCa-2 όταν εμφυτεύονται στα πλευρά του ηυ ηυ /. Μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι berberine μειωμένη μιτοχονδριακή δυναμικού και ενδοκυτταρικά επίπεδα ΑΤΡ μεμβράνης και επάγεται ενεργοποίηση ισχυρός ΑΜΡΚ, όπως φαίνεται από φωσφορυλίωση AMPK α υπομονάδας στο Thr-172 και ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση (ACC) σε Ser

79. Επιπλέον, με δοσοεξαρτώμενο berberine ανέστειλε mTORC1 (φωσφορυλίωση S6K σε Thr

389 και S6 στο Ser

240/244) και την ενεργοποίηση της ERK σε κύτταρα PDAC διεγείρεται από την ινσουλίνη και νευροτενσίνη ή εμβρυϊκό βόειο ορό. Knockdown του α

1 και α

2 καταλυτική έκφραση υπομονάδα της ΑΜΡΚ αντιστραφεί το ανασταλτικό αποτέλεσμα που παράγεται με κατεργασία με χαμηλές συγκεντρώσεις berberine επί mTORC1, ERK και τη σύνθεση του DNA σε κύτταρα PDAC. Ωστόσο, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, berberine ανέστειλε μιτογονικής σηματοδότησης (mTORC1 και ERK) και τη σύνθεση του DNA μέσω ενός ΑΜΡΚ-ανεξάρτητο μηχανισμό. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με μετφορμίνη χρησιμοποιείται σε δόσεις που επάγεται είτε μέτρια ή έντονη μείωση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού ΑΤΡ, τα οποία ήταν σχεδόν ταυτόσημα με τα μειώσεις στα επίπεδα του ΑΤΡ που ελήφθη σε απόκριση προς berberine. Προτείνουμε ότι berberine και μετφορμίνη αναστέλλει την μιτογόνο σηματοδότηση σε PDAC κύτταρα μέσω ΑΜΡΚ-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη οδών δοσοεξαρτώμενη

Παράθεση:. Ming Μ, Σίνετ-Smith J, Wang J, Soares HP, Νέοι SH, Eibl G , et al. (2014) δοσοεξαρτώμενη ΑΜΡΚ-εξαρτημένων και ανεξάρτητων Μηχανισμοί Βερβερίνη και μετφορμίνη Αναστολή της mTORC1, ERK, DNA Σύνθεση και πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (12): e114573. doi: 10.1371 /journal.pone.0114573

Επιμέλεια: Richard Pearson, Peter MacCallum Κέντρο Καρκίνου, Αυστραλία

Ελήφθη: 1, Ιουλίου 2014? Αποδεκτές: 11, Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 10, Δεκεμβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Ming et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορηγήσεις P01 CA163200, Ρ30 DK4130, R01 DK100405, Department of Veterans υπόθεση Grant 1I01BX001473 και κεφάλαια από το προικισμένο Ronald S. Hirschberg πρόεδρος του παγκρέατος Cancer Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι μια καταστροφική ασθένεια, με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μόνο το 6% [1]. Η συχνότητα εμφάνισης της νόσου στις ΗΠΑ εκτιμάται ότι θα αυξηθεί σε περισσότερα από 44.000 νέα περιστατικά το 2014 και σήμερα είναι η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες [2]. Το σύνολο των θανάτων που οφείλονται σε PDAC προβλέπεται να αυξηθεί δραματικά για να γίνει η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται πριν από το 2030 [1] Όπως οι τρέχουσες θεραπείες προσφέρουν πολύ περιορισμένα οφέλη επιβίωσης, μυθιστόρημα στρατηγικές για τη θεραπεία και την πρόληψη αυτής της επιθετικής νόσου απαιτούνται επειγόντως [3 ].

G πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs) και συγγενή αγωνιστές τους όλο και περισσότερο εμπλέκονται ως αυτοκρινής /παρακρινής παράγοντες ανάπτυξης για πολλαπλούς συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου μικρών κυττάρων του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του προστάτη, του μαστού και του παγκρέατος [4] – [8]. Δείξαμε ότι παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές εκφράζουν πολλαπλές GPCRs [9] και μια ποικιλία αγωνιστών GPCR, συμπεριλαμβανομένων νευροτενσίνη, η αγγειοτενσίνη II και βραδυκινίνη, διεγείρεται σύνθεση του DNA σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των PANC-1 και MIAPaCa-2 [9] – [ ,,,0],12]. Επιπλέον, ένας ανταγωνιστής GPCR ευρέως φάσματος [13], [14], ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος είτε

in vitro

ή ξενομόσχευμα σε ηυ /ηυ ποντίκια [15]. Άλλες μελέτες έδειξαν αυξημένη έκφραση του GPCRs σε παγκρεατικά καρκινικούς ιστούς [16] – [19]. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε θετική αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των υποδοχέων ινσουλίνης /IGFI και σηματοδότησης GPCR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας σε mTORC1 σηματοδότηση και η ενεργοποίηση ERK, και συνεργιστική διέγερση της σύνθεσης του DNA και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [20] – [22]. Αυτά τα ευρήματα αποκτά μια πρόσθετη σημασία εν όψει του μεγάλου αριθμού των επιδημιολογικών μελετών που συνδέουν τύπου 2 σακχαρώδη μακροχρόνια διαβήτη (T2DM), η παχυσαρκία και το μεταβολικό σύνδρομο, το οποίο χαρακτηρίζεται από περιφερική αντίσταση στην ινσουλίνη και την αντισταθμιστική υπερπαραγωγή ινσουλίνης, με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου του παγκρέατος [23] – [32]

η διγουανίδη μετφορμίνη (υδροχλωρική 1,1-dimethylbiguanide) που προέρχεται από galegine, ένα φυτοχημικό από

Galega officinalis,

είναι το πιο ευρέως συνταγογραφούμενο φάρμακο για τη θεραπεία της. T2DM,

σε όλο τον κόσμο

[33], [34]. Συστημικά, η μετφορμίνη μειώνει τα επίπεδα της γλυκόζης στο αίμα μέσω της μείωσης της ηπατικής γλυκονεογένεσης, αυξάνει την πρόσληψη γλυκόζης σε σκελετικούς μυς και στο λιπώδη ιστό [34], [35] και μειώνει τα κυκλοφορούντα επίπεδα ινσουλίνης και IGF-1 [36], [37]. Σε κυτταρικό επίπεδο, η μετφορμίνη διεγείρει έμμεσα AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) ενεργοποίηση [38] μέσω αναστολής της μιτοχονδριακής λειτουργίας, αν και άλλοι μηχανισμοί δράσης μετφορμίνης έχουν επίσης προταθεί σε υψηλές δόσεις [39]. Σημαντικές κατάντη στόχοι της ΑΜΡΚ περιλαμβάνουν TSC2 και Raptor [40] – [43]. Η ΑΜΡΚ μεσολάβηση φωσφορυλίωση αυτών των στόχων αναστέλλει mTOR συμπλόκου 1 (mTORC1) δραστηριότητα σε μια ποικιλία κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων PDAC [44], [45] και διαταράσσει θετική αλληλοπαρεμβολών μεταξύ των υποδοχέων ινσουλίνης /IGFI και σηματοδότησης GPCR [21], [46]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένας αριθμός μελετών παρατήρησης υποδηλώνουν ότι η μετφορμίνη μειώνει την επίπτωση και βελτιωμένη πρόγνωση μιας ποικιλίας καρκίνων σε ασθενείς με T2DM [47], [48], αν και αυτό το συμπέρασμα αυτό είναι υπό έλεγχο [49]. Στον καθορισμό των PDAC, οι διαβητικοί ασθενείς που είχαν λάβει μετφορμίνη φαίνεται να έχουν μικρότερη επίπτωση προσαρμοσμένη και καλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους που δεν είχαν λάβει μετφορμίνη ή χρησιμοποιούνται άλλα αντι-διαβητικοί παράγοντες [47], [50] – [52]. Υποθέσαμε ότι άσχετα δομικά φυσικές ή συνθετικές ενώσεις οι οποίες παρεμβαίνουν στη σύνθεση ΑΤΡ μιτοχονδριακή μεσολάβηση και στόχος mTORC1 και ERK μονοπάτια, θα μπορούσε να παράσχει νέα αντι-PDAC.

Φυσικά προϊόντα αντιπροσωπεύουν μια πλούσια δεξαμενή των πιθανών μικρών χημικά μόρια που εμφανίζουν ποικίλες φαρμακολογικές ιδιότητες. Η ισοκινολίνη αλκαλοειδές berberine [53] – [55], ένα φυτοχημικό εκχυλίζεται από μια ποικιλία των φαρμακευτικών φυτών, συμπεριλαμβανομένων των φυτών του

Berberis

είδος επάγει πολλαπλές βιολογικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων των αντι-παχυσαρκίας, αντι-διαβητικό, αντι καρκίνο και θερμίδων-περιορισμού επιπτώσεων [55] – [62]. Ο κυτταρικός μηχανισμός (s) που συμμετέχουν, ωστόσο, παραμένει ατελώς κατανοητή. Βερβερίνη έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει τη μιτοχονδριακή λειτουργία και επάγουν την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ [63], αλλά άλλοι μηχανισμοί έχουν προταθεί δράση αυτού του αλκαλοειδούς όταν προστίθεται σε υψηλές συγκεντρώσεις [64], [65]. Παρά το δυναμικό κλινικές επιπτώσεις της, δεν υπάρχει κατανόηση του ακριβούς μηχανισμού (-ών) με την οποία berberine αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και δεν είναι γνωστό εάν αυτός ο παράγοντας έχει άμεσο αποτέλεσμα επί σηματοδότησης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PDAC φιλοξενούν

KRAS

μεταλλάξεις, χαρακτηριστικό του & gt?. 90% των καρκινωμάτων του παγκρέατος πόρου

σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι berberine αναστέλλει τη σύνθεση του DNA, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό σε PANC-1 και MIAPaCa-2 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα . Επιπλέον, η χορήγηση berberine αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων PDAC

in vivo

τόσο αποτελεσματικά όσο μετφορμίνη. Σε μηχανιστικές μελέτες, που αποδεικνύουν ότι η berberine, όπως η μετφορμίνη μειώνει το δυναμικό της μεμβράνης των μιτοχονδρίων και τα επίπεδα ΑΤΡ και ταυτόχρονα προκαλεί την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. Με βάση τα αποτελέσματα με τη χρήση siRNA μεσολάβηση knockdown του ΑΜΡΚ, προτείνουμε ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις της βερβερίνης και μετφορμίνης προκαλούνται μέσω ΑΜΡΚ-εξαρτώμενη και ΑΜΡΚ-ανεξάρτητες οδούς ανάλογα με τη δόση του κάθε παράγοντα. Το συμπέρασμα αυτό παρέχει μια πειστική εξήγηση για φαινομενικά αντιφατικές εκθέσεις σχετικά με το ρόλο της AMPK στον μηχανισμό δράσης των berberine και μετφορμίνης σε άλλα συστήματα μοντέλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) ελήφθη από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Νευροτενσίνη, ινσουλίνη, βερβερίνης και μετφορμίνη ελήφθησαν από τη Sigma Chemical (St. Louis, ΜΟ). Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Η υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο IgG αντι-κουνελιού και IgG αντι-ποντικού ήταν από GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια ήταν της υψηλότερης διαθέσιμης ποιότητας.

Cells και συνθήκες καλλιέργειας

Οι ανθρώπινες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές PANC-1 και MiaPaCa-2 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Αυτές οι κυτταρικές γραμμές επελέγησαν επειδή φιλοξενούν μεταλλάξεις τυπικό του ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου [66], συμπεριλαμβανομένων ενεργοποιώντας μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS, ΤΡ53 (που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη p53) και CDKN2A (επίσης γνωστή ως ρ16 ή p16INK4a). Πράγματι, υπάρχει μια εξαιρετική συσχέτιση μεταξύ των συχνοτήτων σημειακή μετάλλαξη σε PDAC κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς όγκους [67]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 1 mM Να-πυροσταφυλικό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 10% CO2 . Στα πειράματα, η συγκέντρωση της γλυκόζης σε ϋΜΕΜ ρυθμίστηκε σε 5 mM, ένα φυσιολογικό επίπεδο σε ανθρώπινο ορό.

[

3Η] -θυμιδίνης στο DNA

PANC-1 και MiaPaCa -2 κύτταρα (1 χ 10

5) τοποθετήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 3,5 cm για 5 ημέρες σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές και επωάστηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 1% FBS. Για να ξεκινήσει το πείραμα, φρέσκο ​​μέσο που περιείχε την καθορισμένη συγκέντρωση του αγωνιστή ή /και ο αναστολέας προστέθηκε μετά από έκπλυση δύο φορές με ϋΜΕΜ (4 καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται για κάθε συνθήκη), και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 17 ώρες και στη συνέχεια σε στιγμιαία σήμανση για 6 ώρες με [

3Η] -θυμιδίνης (0,25 μCi /ml). Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 5% τριχλωροοξικό οξύ και πλύθηκε δύο φορές με αιθανόλη. Αδιάλυτη σε οξέα πισίνες διαλύθηκαν σε 0.1 Ν ΝαΟΗ με 1% SDS και η ραδιενέργεια που ενσωματώνεται μετρήθηκε σε ένα μετρητή υγρού σπινθηρισμού.

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης

Το κύτταρο-διαπερατό JC-1 βαφή ( Invitrogen), το οποίο παρουσιάζει εν δυνάμει εξαρτώμενη συσσώρευση στα μιτοχόνδρια, χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Μετά τη θεραπεία, χωρίς ή με berberine ή μετφορμίνη, JC-1 προστέθηκε σε καλλιέργειες κυττάρων ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 ή σε 1 μg /ml για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, το μέσον ανταλλάχθηκε για Hanks Ρυθμιστικό Διάλυμα που περιέχει 5 mM γλυκόζη και τα κύτταρα αμέσως απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ροδαμίνη και φλουορεσκεΐνη οπτική. Εικόνες φυλάχθηκαν από διάφορα οπτικά πεδία. Το χαρακτηριστικό ανάλυση ιστόγραμμα του Photoshop (Adobe) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η μέση κόκκινο και πράσινο μέση ένταση φθορισμού από περίπου 50 κύτταρα σε ένα οπτικό πεδίο. Τουλάχιστον 5 ανεξάρτητα πεδία μετρήθηκαν σε κάθε κατάσταση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση αναλογία κόκκινο /πράσινο ένταση φθορισμού στο ίδιο οπτικό πεδίο (μέση ± SEM). Η αναλογία των κόκκινο /πράσινο ένταση φθορισμού δείχνει δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης με μειωμένο ποσοστό που δείχνει την απώλεια του δυναμικού.

ATP Προσδιορισμός

PANC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα (5 × 10

4) απλώθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 24 πλάκες καλλιέργειας καλά για 5 ημέρες σε DMEM και 10% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 1% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 17 ώρες απουσία ή παρουσία berberine ή μετφορμίνη. επίπεδα ΑΤΡ καθορίστηκαν με τη χρήση του λουσιφεράσης πυγολαμπίδας /D-λουσιφερίνης ΑΤΡ προσδιορισμός Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Technologies Grand Island, ΝΥ).

Knockdown των επιπέδων ΑΜΡΚ μέσω siRNA διαμόλυνση

Silencer Επιλογή siRNAs αγοράστηκαν από την Life Technologies (Grand Island, Νέα Υόρκη) και σχεδιασμένα να στοχεύουν είτε ανθρώπινη ΑΜΡΚ

α1 ή την ανθρώπινη ΑΜΡΚ

α2. Κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ανάστροφης διαμόλυνση. Είτε Silencer Επιλογή μη-στόχευση αρνητικού ελέγχου ή ένα μίγμα από 10 ηΜ ΑΜΡΚ

α1 και 10 ηΜ ΑΜΡΚ

α2 siRNA (AMPKα1, α2 siRNA) αναμίχθηκαν με Lipofectamine RNAi MAX (Life Technologies Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με τις πρωτοκόλλου και του κατασκευαστή προστίθενται σε 24 φρεατίων. κύτταρα PANC-1 στη συνέχεια επιστρώθηκαν πάνω από το συγκρότημα siRNA /Lipofectamine RNAiMAX σε πυκνότητα 10

5 κύτταρα /well.in DMEM που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 10% FBS. Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 1% FBS. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 17 ώρες απουσία ή παρουσία βερβερίνης ή μετφορμίνη και στη συνέχεια κατεργάζεται όπως περιγράφεται στα αντίστοιχα υπομνήματα φιγούρα.

κυτταρομετρίας ροής /κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η αναλογία των κυττάρων στο G

0 /G

1, S, G

2, και το Μ φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. κύτταρα PANC-1 (2 × 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν σε DMEM που περιείχε 2.5% FBS. Μετά από 24 ώρες οι καλλιέργειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με berberine σε μέσο που περιέχει 2,5% FBS για 3 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, φυγοκεντρήθηκε στα 1000

g

για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 10

6 κύτταρα /ml σε υποτονικό ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διάλυμα που περιέχει 0,1% κιτρικό νάτριο, 0,3 % Trixon-Χ 100, 0,01% ΡΙ και 0,002% ριβονουκλεάσης Α τα κύτταρα επωάστηκαν σε 4 ° C για 30 λεπτά και αναλύθηκαν σε FACScan (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CELLQuest. Εκατό χιλιάδες κύτταρα συλλέχθηκαν για κάθε δείγμα. Διέγερση συνέβη στα 488 nm και τα δεδομένα που συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας το κανάλι FL2 και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FCS ExpressV3.

Ανάλυση Western Blot

Συρρέουσες καλλιέργειες κυττάρων PANC-1 ή Mia PaCa-2 καλλιεργούνται σε 3,5 εκατοστά πιάτα πλύθηκαν και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 1% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό με την απουσία ή παρουσία berberine, μετφορμίνη ή A-769662, όπως περιγράφεται στα επιμέρους πειράματα. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια λύθηκαν άμεσα σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS-PAGE δείγματος [200 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2 mM EDTA, 0.1 Μ Να

3νο

4, 6% SDS, 10% γλυκερόλη, και 4% 2-μερκαπτοαιθανόλης], ακολουθούμενη από SDS-PAGE σε γέλες 10% και μεταφορά σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Billerica, ΜΑ). Western στυπώματα στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σε μεμβράνες επωάζονται όλη τη νύκτα με τις καθορισμένες αντισώματα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) που περιέχει 0,1% Tween-20. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια) αντιδραστηρίων (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται εντόπισε την φωσφορυλιωμένη κατάσταση S6K σε Thr

389, S6 σε Ser

240/244 και ERK1 /2 σε Thr

202 και Tyr

204, AMPKα σε Thr

172, ACC σε Ser

79 και Raptor σε Ser

792. Επιπλέον, το συνολικό επίπεδο αυτών των πρωτεϊνών αξιολογήθηκε επίσης. Συνήθως, οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται με τα φωσφο-ειδικά αντισώματα απομακρύνθηκαν και την εκ νέου στυπώθηκαν με τα αντισώματα τα οποία ανιχνεύουν το συνολικό επίπεδο της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Περιστασιακά, απογύμνωση και την εκ νέου κηλίδωση της ίδιας μεμβράνης δεν ήταν ικανοποιητική για την απόκτηση δύο ρυθμιστές φόρτωση και την έκφραση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, χρησιμοποιήσαμε ένα ξεχωριστό κηλίδα για την αξιολόγηση της συνολικής έκφρασης πρωτεΐνης και ανοσοστυπώθηκαν την αρχική μεμβράνη για άλλες πρωτεΐνες (π.χ. ακτίνη, S6K, S6, ERK), που μεταναστεύουν σε διαφορετική θέση στην αρχική γέλη για την επαλήθευση ίση φόρτωση.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

καλλιέργειες κυττάρων MiaPaCa-2 PANC-1 και 3-5 ημέρες μετά το πέρασμα, πλύθηκαν και εναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύονται με δύο διελεύσεις μέσω βελόνας 19-guage σε μονοκύτταρους ουσιαστικά εναιώρημα όπως κρίνεται με μικροσκοπία. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Coulter Counter, και 2 χ 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 35 mm σε DMEM που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης, το μέσο απομακρύνθηκε και οι καλλιέργειες μετατοπίζεται σε ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη χωρίς ή με 3% FBS. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια επωάζονται σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 10% CO

2 στους 37 ° C για 4 ημέρες και το συνολικό αριθμό των κυττάρων προσδιορίστηκε από το ελάχιστο των τεσσάρων πιάτων ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Coulter, μετά κύτταρο συσσωματώματα διαχωρίζονται από περνώντας το κυτταρικό εναιώρημα δέκα φορές μέσω ενός 19- και στη συνέχεια μια βελόνα 21-gauge.

Ποντίκια ξενομοσχευμάτων

Early-πέρασμα κύτταρα MiaPaCa-2 συλλέχθηκαν, και 2 × 10

6 κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε σωστές πλευρές του αρσενικού

ηυ /ηυ

ποντικούς. Το αρσενικό

nu /nu

ποντίκια διατηρήθηκαν σε ειδικές άνευ παθογόνου εγκατάσταση στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Λος Άντζελες (UCLA). Επιτροπής των ζώων Ερευνών του UCLA καγκελαρίου ενέκρινε το σύνολο των πειραμάτων σε ζώα. Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και αγωγής (10 ποντικοί ανά ομάδα) και τους δόθηκε διάτρητη ενώτια που επιτρέπουν την ταυτοποίηση. Η αγωγή άρχισε όταν οι όγκοι έφθασαν μία μέση διάμετρο 2 mm και την 1η ημέρα της θεραπείας σε αμφότερες τις περιπτώσεις ορίστηκε ως ημέρα 0. Για ένεση σε ζώα, μετφορμίνη (250 mg /Kg), berberine (5 mg /kg) ή όχημα (έλεγχος) δόθηκε ενδοπεριτοναϊκά μία φορά την ημέρα ενδοπεριτοναϊκώς (50 μL /ποντικό). Ο όγκος του όγκου (

V

) μετρήθηκε από εξωτερικούς δαγκάνα κάθε 4 ημέρες και υπολογίζεται ως

V

= 0,52 (μήκος Χ πλάτος

2). Στο τέλος του πειράματος, οι όγκοι αποκόπηκαν σταθμίζονται και μετρήθηκαν. Ο όγκος των αποκοπεί όγκων υπολογίστηκε ως

V

= 0,52 (μήκος Χ πλάτος Χ βάθος).

Η στατιστική ανάλυση

Οι τιμές είναι μέσοι όροι ± SE. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με το αταίριαστο του Student

t-test

.

Αποτελέσματα

Βερβερίνη αναστέλλει τη σύνθεση του DNA, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων PDAC

Αρχικά, προσδιορίσαμε την επίδραση της ισοκινολίνης αλκαλοειδές berberine επί της σύνθεσης DNA σε κύτταρα MiaPaCa-2, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα ως μοντέλα κυττάρων PDAC PANC-1 και. Οι καλλιέργειες αυτών των κυττάρων που αναπτύσσονται σε μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου πλύθηκαν και μεταφέρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μέσο που περιέχει μια φυσιολογική συγκέντρωση γλυκόζης (5 mM), αυξανόμενες δόσεις βερβερίνης και ένα συνδυασμό ινσουλίνης (10 ng /ml) και το νευροτενσίνη συναγωνιστή GPCR (5 nm) για να εκμαιεύσει ισχυρή μιτογόνο στιχομυθία σηματοδότηση [ ,,,0],20], [21], [46]. Η θεραπεία με berberine ανέστειλε την διέγερση της σύνθεσης του DNA σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο κύτταρα PANC-1 και MiaPaCa-2. Σε συγκέντρωση 3 μΜ, berberine ανέστειλε τη σύνθεση του DNA κατά 82% σε κύτταρα MiaPaCa-2 και κατά 76% σε κύτταρα PANC-1. Η ενσωμάτωση της [

3Η] -θυμιδίνης μπλοκαρίστηκε από 97% σε κύτταρα MiaPaCa-2 και κατά 94% σε PANC-1 κύτταρα σε απόκριση σε 6 μΜ berberine (Εικ. 1 Α).

Α , PaCa-2 ή PANC-1 κύτταρα Mia επωάζονται χωρίς (

ανοικτές μπάρες

) ή με 5 ηΜ νευροτενσίνη και 10 ng /ml ινσουλίνη (

κλειστές ράβδοι

) παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης του berberine για 17 ώρες στους 37 ° C πριν από την προσθήκη του [

3Η] -θυμιδίνης για 6 ώρες. Η ραδιενέργεια που ενσωματώθηκε οξύ αδιάλυτο πισίνες μετρήθηκε σε ένα μετρητή σπινθηρισμού, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές που παρουσιάζονται είναι η μέση τιμή ± SEM που ελήφθη στο 3 ανεξάρτητα πειράματα? Β, κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς (μάρτυρας) ή με berberine στο 1,5 μΜ ή 3 μΜ σε μέσο που περιέχει 2,5% FBS για 3 ημέρες (υποδεικνύεται με συν., FBS, FBS 1,5 Ber και FBS 3 Ber). του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με PI-χρώση και κυτταρομετρία ροής. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε 3 ανεξάρτητα πειράματα. C, Single-κυτταρικό αιώρημα ΜΙΑ PaCa-2 ή PANC-1 κύτταρα απλώθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας ιστού σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα ανά δίσκο. Μετά από 24 ώρες επώασης το μέσο απομακρύνθηκε και οι καλλιέργειες μετατοπίζεται σε μέσο χωρίς ή με 3% FBS σε απουσία (ανοικτές μπάρες) ή παρουσία (κλειστές ράβδοι) 3 μΜ berberine. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν επί 4 ημέρες όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». καταμέτρηση των κυττάρων προσδιορίστηκε από 4 έως 6 πλάκες επαναληπτικές ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας ένα Coulter Counter. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από 3 βιολογικής επαναλήψεις.

Η

Οι δοκιμασίες της [

3Η] -θυμιδίνης συμπληρώθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για να προσδιοριστεί η αναλογία των κυττάρων PDAC στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, η έκθεση των PANC-1 κύτταρα να berberine (1.5-3 μΜ) προκάλεσε μια αξιοσημείωτη αύξηση στην αναλογία των κυττάρων σε G

1 (από 61 ± 0,2% σε κύτταρα με FBS σε 79 ± 2% σε κύτταρα με FBS και βερβερίνης) και μια αντίστοιχη μείωση στην αναλογία των κυττάρων που ήταν σε S και G

2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου (από 36 ± 0,1% σε 19 ± 0,7%). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι berberine καθυστερεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου PDAC για G

1.

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της berberine επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα του είτε PANC-1 ή MiaPaCa-2 κύτταρα απλώθηκαν και επωάστηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με ή χωρίς 3% FBS απουσία ή παρουσία 3 μΜ berberine. Η θεραπεία με berberine αξιοσημείωτα ανέστειλε πολλαπλασιασμό σε αμφότερες τις PDAC κύτταρα (Σχ. 1C) χωρίς να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στις δόσεις που εξετάστηκαν (τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματα στο Σχ. 1 καταδεικνύουν ότι berberine αναστέλλει τη σύνθεση του DNA, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Βερβερίνη και μετφορμίνη αναστέλλει την ανάπτυξη ενός ξενομοσχεύματος PDAC σε γυμνούς ποντικούς

Δεδομένου αποτελέσματα μας δείχνουν ανασταλτικά αποτελέσματα του berberine στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC

in vitro

, έχουμε συνέχεια προσδιορίστηκε κατά πόσον αυτή η ένωση αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος

in vivo

χρησιμοποιώντας MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα όγκου σε γυμνούς ποντικούς. Τα ξενομοσχεύματα προήλθαν από την εμφύτευση των 2 × 10

6 κύτταρα στα δεξιά πλευρά των ανδρών

nu /nu

ποντίκια. Τα ζώα χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και βερβερίνης αγωγή (10 ποντικοί ανά ομάδα). Βερβερίνη δόθηκε μία φορά ημερησίως ενδοπεριτοναϊκώς σε 5 mg /kg για την διάρκεια του πειράματος. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, η χορήγηση του berberine μείωσε την ανάπτυξη του MIAPaCa-2 κύτταρα ξενομόσχευμα σε γυμνούς ποντικούς κατά 70%. Οι όγκοι του όγκου στο τέλος του πειράματος (ημέρα 29) ήταν 781 mm

3 στον έλεγχο και 240 mm

3 στην ομάδα θεραπείας berberine (ρ & lt? 0.001). Η δόση του berberine χρησιμοποιείται (5 mg /kg) είναι 12 φορές μικρότερη από ό, τι το LD

50, με βάση τις προκαταρκτικές μελέτες εύρεσης του εύρους και την προηγούμενη εργασία που δημοσιεύθηκε από άλλους [53], [68], [69]. Βερβερίνη ήταν καλά ανεκτή και δεν επηρέασε σημαντικά το βάρος των ποντικών κατά τη διάρκεια της θεραπείας (Εικ. 2, Β). Η ανασταλτική δράση του berberine ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που προκαλείται από μετφορμίνης στα 250 mg /kg (Σχ. 2), μια δόση η οποία προκαλεί μέγιστη ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου PDAC [70]. Πράγματι, οι καμπύλες που αντιστοιχούν στην αύξηση του MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη berberine ή ήταν ουσιαστικά υπερτιθέμενα κατά τις πρώτες 24 ημέρες (σχ. 2, Α). Την ημέρα 29, μετφορμίνη ήταν ελαφρώς πιο αποτελεσματικό από berberine όπως εκτιμάται από τον όγκο του όγκου (p & lt? 0,05), αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p & gt? 0.07), όταν σκόραρε κατά βάρος του όγκου (Σχήμα 2, Β.). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι berberine αναστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων ξενο-μεταμόσχευσις σε γυμνά ποντίκια με αποτελεσματικότητα συγκρίσιμη με εκείνη που επιτυγχάνεται με μια μέγιστη δόση μετφορμίνης.

ξενομοσχευμάτων MIAPaCa-2 δημιουργήθηκαν με εμφύτευση 2 χ 10

6 κύτταρα στα δεξιά πλευρά των ανδρών

nu /nu

ποντίκια. Όταν οι όγκοι έφτασαν μία μέση διάμετρο 2 mm, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες ελέγχου και αγωγής (10 ποντικοί ανά ομάδα). Βερβερίνη δόθηκε μία φορά ημερησίως ενδοπεριτοναϊκώς σε 5 mg /kg για την διάρκεια του πειράματος. Για σύγκριση, η μετφορμίνη δόθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε μια άλλη ομάδα ποντικών στα 250 mg /kg. Το 1

ης ημέρας της αγωγής ορίστηκε ως ημέρα 0. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν έναν ισοδύναμο όγκο φυσιολογικού ορού. Α, οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν κάθε 4 ημέρες, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Στο τέλος του πειράματος (ημέρα 29, οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίζεται και μετράται και οι όγκοι των όγκων εκτιμήθηκε ως

V

= 0,52 (μήκος Χ πλάτος Χ βάθος). Τα αποτελέσματα φαίνονται στον πίνακα Β (μέση ± . SEM) η αγωγή των ποντικών με berberine μείωσε σημαντικά τον όγκο και το βάρος των όγκων σε σύγκριση με τους όγκους από την ομάδα ελέγχου (ρ & lt?. 0.001), όπως υποδεικνύεται Μία παρόμοια αναστολή της ανάπτυξης του όγκου επιτεύχθηκε με την χορήγηση της μετφορμίνης (ρ & lt? .. 0.001) Οι καμπύλες που αντιστοιχούν στην αύξηση του MIAPaCa-2 ξενομοσχεύματα σε ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με berberine ή μετφορμίνη επιτιθέμενες κατά τις πρώτες 24 ημέρες σε ημέρες 29, μετφορμίνη ήταν ελαφρώς πιο αποτελεσματικό από berberine όπως αξιολογήθηκε από τον όγκο του όγκου (ρ & lt? 0,05) αλλά η διαφορά των αποτελεσμάτων μεταξύ αυτών των φαρμάκων δεν ήταν στατιστικά σημαντική (p & gt? 0,07). όταν σκόραρε από το βάρος του όγκου (Εικ. 2, Β) σε χρησιμοποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις, Βερβερίνη και μετφορμίνης ήταν καλά ανεκτή χωρίς εμφανή τοξικότητα με βάση το σωματικό αλλαγές βάρους.

η

Βερβερίνη προκαλεί μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης, μειώνει τα επίπεδα της ΑΤΡ και διεγείρει την AMPK σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Αφού διαπιστώθηκε ότι berberine αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC

in vitro

και

in vivo

, είμαστε δίπλα διερευνηθούν οι μηχανισμοί που εμπλέκονται. Σε άλλους τύπους κυττάρων, berberine πιστεύεται ότι αναστέλλει συμπλόκου Ι της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας [71], [72], με αποτέλεσμα τη μειωμένη σύνθεση ΑΤΡ και ταυτόχρονη αύξηση στην κυτταρική ΑΜΡ και ADP που είναι ισχυροί αλλοστερικοί ενεργοποιητές της ΑΜΡΚ [73] – [ ,,,0],75]. Επειδή δεν είναι γνωστό εάν berberine έχει οποιαδήποτε επίδραση στη λειτουργία των μιτοχονδρίων σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, αρχικά εξετάστηκε αν αυτό φυτοχημικό παρεμβαίνει με δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης σε αυτά τα κύτταρα. Καλλιέργειες MiaPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1 επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία 3 μΜ berberine ή 1 mM μετφορμίνη, συμπεριλαμβάνεται για σύγκριση. Στη συνέχεια, το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, ένα βασικό συστατικό οδήγηση σύνθεση ΑΤΡ, εκτιμήθηκε με τη χρήση της μιτοχονδριακής-ειδικό φθορίζοντα ανιχνευτή JC-1 [76]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3 Α, berberine προκάλεσε σημαντική πτώση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης σε MiaPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1. Το αποτέλεσμα ήταν συγκρίσιμη με εκείνη που προκαλείται από τη μετφορμίνη (Εικ. 3 Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι berberine, όπως η μετφορμίνη, στοχεύει μιτοχονδριακή λειτουργία σε κύτταρα PDAC. Κατά συνέπεια, η έκθεση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις berberine ή μετφορμίνη παρήγαγε μια αξιοσημείωτη εξαρτώμενη από τη δόση μείωση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού ΑΤΡ σε δύο κύτταρα PANC-1 και MiaPaCa- 2 (Σχ. 3 Β).

Α, καλλιέργειες PANC -1 και κύτταρα MIAPaCa-2 επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία του 3 berberine μΜ (Berb) ή 1 mM μετφορμίνη (Met) για 17 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη. Η μεταβολή στο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε με τη χρήση της μιτοχονδριακής μεμβράνης πιθανό δείκτη JC-1. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση αναλογία κόκκινο /πράσινο ένταση φθορισμού στο ίδιο οπτικό πεδίο (μέση ± SEM). Τουλάχιστον 5 πεδία μελετήθηκαν σε κάθε κατάσταση. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με τη χρήση της δοκιμής t (SigmaPlot 12.)? * P & lt? 0.002. Β, Καλλιέργειες κυττάρων MIAPaCa-2 PANC-1 και επωάστηκαν με την απουσία ή παρουσία του berberine ή μετφορμίνη στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 17 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 5 mM γλυκόζη και 2.5% FBS. C, καλλιέργειες PANC-1 (άνω πάνελ) και MiaPaCa-2 (κατώτεροι πίνακες) επωάστηκαν απουσία ή παρουσία berberine στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 17 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν για 1 ώρα με 5 ηΜ νευροτενσίνη και 10 ng /ml ινσουλίνη και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 2Χ SDS-PAGE. Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση με αντισώματα που ανιχνεύουν την φωσφορυλιωμένη κατάσταση της ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάση (ACC) σε Ser

79. Western blotting για ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευτεί η ίση φόρτωση στην ίδια μεμβράνη και ένα ξεχωριστό πήγμα επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης ACC δεν άλλαξε με οποιαδήποτε από τις θεραπείες. Α, Ποσοτικοποίηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολλαπλών V3.0 Gauge. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SEM? n = 3, πλάσια αύξηση στην φωσφορυλίωση ACC σε Ser

79. Ένθετο, φωσφορυλιωμένη κατάσταση της AMPK σε Thr

172 στις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις berberine (μΜ).

Η

επόμενο καθοριστεί αν berberine διεγείρει τη δραστηριότητα AMPK εντός ανέπαφη MiaPaCa-2 και τα κύτταρα PANC-1. Τα προϊόντα λύσης αυτών των κυττάρων αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντισώματα που ανιχνεύουν την φωσφορυλιωμένη κατάσταση της ακετυλ-ΟοΑ καρβοξυλάσης (ACC) σε Ser

79, ένα υπόλειμμα φωσφορυλιώνεται άμεσα από ΑΜΡΚ και χρησιμοποιείται ως βιολογικός δείκτης της δραστηριότητας ΑΜΡΚ εντός ακέραια κύτταρα [75] . Η θεραπεία με berberine προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση της φωσφορυλίωσης του ACC σε Ser

79 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και στις δύο κύτταρα PANC-1 και MiaPaCa-2 (Σχήμα 3, C?.. Ποσοτικοποίηση στο Σχήμα 3 D). Η μέγιστη επίδραση προκλήθηκε σε δόσεις & gt? 2 μΜ σε αμφότερες τις PDAC κύτταρα (Σχήμα 3 D.). Επιπλέον, η θεραπεία του MiaPaCa-2 ή PANC-1 κύτταρα με berberine προκάλεσε μία εντυπωσιακή αύξηση στην φωσφορυλίωση της ΑΜΡΚ σε Thr

172, το υπόλειμμα στο πεδίο κινάσης της καταλυτικής υπομονάδας (α) του ΑΜΡΚ κρίσιμη για την ενεργοποίηση (Ένθετα στην Εικ. 3 D). Συλλογικά, τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι berberine μειώνει μεμβράνη των μιτοχονδρίων δυναμικό και μειώνει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα του ΑΤΡ διεγείροντας έτσι δραστηριότητα ΑΜΡΚ σε κύτταρα PDAC καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει μια φυσιολογική συγκέντρωση γλυκόζης (5 mM).

Βερβερίνη αναστέλλει την ενεργοποίηση mTORC1 και ERK στα κύτταρα PDAC

Η ενεργοποίηση της PI3K /Akt /mTORC1 και μονοπάτια /ERK ΜΕΚ διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην τόνωση της σύνθεσης του DNA, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιασμό των κυττάρων PDAC και ρυθμίζονται αρνητικά από AMPK [21]. Συνεπώς, προσδιορίσαμε αν berberine αναστέλλει mTORC1 και ενεργοποίηση ERK σε κύτταρα PDAC. Καλλιέργειες κυττάρων MiaPaCa-2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις βερβερίνης και στη συνέχεια διεγείρονται με έναν συνδυασμό ινσουλίνης και νευροτενσίνη να αποσπάσει θετικό στιχομυθία (Εικ. 4). Όπως φαίνεται στο Σχ.