Αφηρημένο

Η ρεσβερατρόλη, που εξάγεται από κινέζικα βότανα ιατρικής Polygonum cuspidatum, είναι γνωστό ότι αναστέλλουν την εισβολή και τη μετάσταση των ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο (CRC), στην οποία μακρά μη-κωδικοποίησης Μετάσταση Associated αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα μεταγραφής 1 (RNA-MALAT1) παίζει επίσης σημαντικό ρόλο. Χρησιμοποιώντας MALAT1 βραδέος shRNA και υπερ-έκφραση κατασκευασμάτων σε CRC προέρχονται κυτταρικές γραμμές, LoVo και HCT116, αποδείξαμε ότι τα αποτελέσματα κατά του όγκου της ρεσβερατρόλης στην CRC είναι μέσω αναστολής της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, έτσι την έκφραση των γονιδίων στόχων της, όπως c-myc, ΜΜΡ-7, καθώς και η έκφραση του MALAT1. Λεπτομερώς, η ρεσβερατρόλη ρυθμίζει προς τα κάτω MALAT1, με αποτέλεσμα την μειωμένη πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης έτσι εξασθενημένο σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης, η οποία οδηγεί στην αναστολή της CRC εισβολή και τη μετάσταση. Αυτό το εύρημα μας προσφέρει σίγουρα σημαντικές προ-κλινικές ενδείξεις που υποστηρίζουν τη μελλοντική χρήση της ρεσβερατρόλης στην πρόληψη και τη θεραπεία της CRC

Παράθεση:. Ji Q, Liu Χ, Fu Χ, Zhang L, Sui Η, Zhou L, et al. (2013) Η ρεσβερατρόλη Αναστέλλει εισβολή και μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω MALAT1 Mediated Wnt /β-κατενίνης Σήμα διάβαση. PLoS ONE 8 (11): e78700. doi: 10.1371 /journal.pone.0078700

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Μαΐου 2013? Αποδεκτές: 15 Σεπτέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81202812, 81303102, 81303103), Πρόγραμμα της Σαγκάης Δημοτική Επιτροπή Παιδείας (2011JW57, 12YZ058), Σαγκάη Δημοτικό Γραφείο Υγείας (ZYSNXD-CC-YJXYY-JS20, 2011ZJ030, 20114Y001, 20114037), Σαγκάη Βασικά Εργαστήριο της Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής Κλινικής (C10dz2220200). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι τα αποτελέσματα της μετάλλαξης των πολλαπλών γονιδίων που περιλαμβάνουν τα πρωτο-ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια. Καθώς τα ογκογονίδια έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παραμένουν εντόνως εκφρασμένα, ή τα ογκοκατασταλτικά γονίδια που μεταλλάχθηκαν, τα προκύπτοντα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν του ανοσοποιητικού συστήματος, τη μορφή όγκων σε περιφερικό θέσεις /οργάνων, δηλαδή μετάσταση και το τερματικό στάδιο του καρκίνου αρχίζει [1].

Η εμφάνιση της νέας κινεζικής ιατρικής μονομερούς αντικαρκινικών φαρμάκων προσέφερε μια νέα επιλογή στο reptoire των συνθετικών ναρκωτικών για τη θεραπεία του καρκίνου [2]. Polygonum cuspidatum είναι τα ριζώματα και ρίζες της πολυετής πόα Tateshina – Polygonum cuspidatum [3]. Προηγούμενα δεδομένα έδειξαν ότι Polygonum cuspidatum είχε διάφορες ανασταλτικές επιδράσεις επί του όγκου, βακτηριακές ιογενείς λοιμώξεις και /φλεγμονής [3] – [7]. Η ρεσβερατρόλη που προέρχονται από το Polygonum cuspidatum είναι ένα φυσικό αντιοξειδωτικό, το οποίο μπορεί να μειώσει το ιξώδες του αίματος, αναστέλλει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων και αγγειοδιαστολή, να διατηρήσει τη ροή του αίματος, και να αποτρέψει την εμφάνιση και την ανάπτυξη του καρκίνου [8] – [10].

Early το 2003, Ji

et al

πρώτον εντοπίστηκαν μεγάλες μη-κωδικοποίησης του RNA – MALAT1. Σε 225 περιπτώσεις σταδίου Ι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), διαπιστώθηκε σε 70 περιπτώσεις, μετάσταση συσχετίζεται με MALAT1 υπερέκφραση, σε μια πορεία και ιστού ειδικό τρόπο, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση MALAT1 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα δυνητικό δείκτη της επιβίωση στο στάδιο 1 ασθενείς με NSCLC [11]. Επιπλέον, άλλες ομάδες έδειξαν ότι MALAT1 υπερ-εκφράζεται σε ήπαρ, του τραχήλου της μήτρας και του παχέος εντέρου [12] – [14]

Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι μονοπάτι σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης ρυθμίζει κυττάρου όγκου εισβολή και τη μετάσταση.. Soichi

κ.ά.

βρήκαν ότι σε κύτταρα του στόματος πλακώδες καρκίνωμα, η συσσώρευση του β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα επάγει TCF /LEF μεταγραφική δραστικότητα, και να αυξήσει την έκφραση ΜΜΡ-7, προκαλώντας έτσι τη μετατροπή των επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά κύτταρα, καθώς και την ενίσχυση εισβολή και μετάσταση [15]. Guo

κ.ά.

αποδειχθεί σε κυτταρική γραμμή ΗΤ29 CRC, προϊόν του γονιδίου NGX6 ανέστειλε τη μεταφορά της β-κατενίνης από τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα με την κυτταρική μεμβράνη, αναστέλλοντας έτσι την μεταγραφική δραστικότητα του TCF και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της Wnt γονίδια στόχους c-myc, cyclinD1 και COX-2, που οδηγεί σε μείωση των καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση [16].

παρούσες μελέτες μας ανέκριναν τους μηχανισμούς με τους οποίους η ρεσβερατρόλη ρυθμίζει MALAT1 και σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης , με αποτέλεσμα καταπιεσμένη καρκινικών κυττάρων εισβολής και της μετάστασης.

Υλικά και Μέθοδοι

in situ υβριδισμό σε δείγματα ιστών από ασθενείς με CRC

εγκλεισμένα σε παραφίνη όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό δείγματα ιστού από 60 ασθενείς CRC οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εκτομή του όγκου σε Πουτούο Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής (SUTCM) μεταξύ 2010 και 2012 είχαν επιλεγεί για την υβριδοποίηση με διγοξιγενίνη (DIG) -επισημασμένο καθετήρα MALAT1 DNA (Shinegene Μοριακής Βιοτεχνολογίας, Σαγκάη, Κίνα). Το πείραμα διεξήχθη σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται από τον Tanner

κ.ά.

[17]. Η μελέτη εγκρίθηκε από την ηθική επιτροπή του Pu Tuo Νοσοκομείο, SUTCM και όλοι οι ασθενείς που παρέχονται με γραπτή συγκατάθεση.

Προβολή της Κινέζικης Ιατρικής Μονομερές Αντικαρκινικά Φάρμακα για MALAT1 Έκφραση σε LoVo κύτταρα

LoVo κύτταρα (που προέρχονται από το αριστερό υπερκλείδιους μετάσταση περιοχή, Dukes ‘τύπου C, βαθμός IV, ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα) καλλιεργήθηκαν σε μέσο F12K συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 g /ml στρεπτομυκίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη, στους 37 ° C, 5% CO2, και υψηλή υγρασία. Όλες οι Κινέζοι αντικαρκινικά φάρμακα φάρμακο μονομερούς αραιώθηκαν σειριακά για την ανίχνευση της μισό συγκέντρωση αναστολή επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων LoVo. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LoVo προσδιορίστηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) δοκιμασία όπως περιγράφεται προηγουμένως [18]. Real time PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του ποσοστού αναστολής των υποψήφιων φαρμάκων επί MALAT1 έκφρασης. Για ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου, ο πρόσθιος εκκινητής, ο αντίστροφος εκκινητής, και ο ανιχνευτής Taqman σχεδιάστηκαν ως ακολούθως: πρόσθιος (5-AGGCGTTGTGCGTAGAGGA-3), αντίστροφη (5-GGATTTTTACCAACCACTCGC-3), ανιχνευτή TaqMan (5-fam + CCTAGACCAGCATGCCAGTGTGCC + Tamara-3). Πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη στο 7300 System Applied Biosystems (Applied Biosystems Deutschland GmbH) χρησιμοποιώντας πρόμιγμα Ex Taq (Takara, Νταλιάν, Κίνα). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά

Knockdown και υπερέκφραση του γονιδίου MALAT1

MALAT1 cDNA Ανθρώπου (Gene ID: 378938). Ενισχύθηκε με RT-PCR με το RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα LoVo, και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε φορέα pLV4. MALAT1 αναζητήθηκαν για αλληλουχίες στόχους κατάλληλο siRNA, τρεις αλληλουχίες siRNA σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν, και επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας, αντίστοιχα. Λεντοϊών σωματίδια παρήχθησαν με συν-επιμόλυνση φορέα έκφρασης pLV4-MALAT1 cDNA ή pLV4-MALAT1 shRNA με ιικό σωματίδιο συσκευασίας βοηθού φορέα σε κύτταρα 293Τ. Προκαταρκτικά πειράματα διάλεξε τις πιο αποτελεσματικές σειρές siRNA του νοκ ντάουν από την παραπάνω τρεις υποψήφιες siRNA (Σχήμα S1): αίσθηση 5′-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3 ‘, αντι-νόημα 5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTT-3′? με αρνητική ακολουθία siRNA ελέγχου: νόημα 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘., αντι-νόημα 5’-ACGUGACACGUUCG

GAGAATT-3′. Ο τίτλος ιικών σωματιδίων που περιέχουν MALAT1 shRNA και MALAT1 cDNA προσδιορίστηκε με περιορισμένη σειριακή αραίωση. Η αποτελεσματικότητα της knockdown ή υπερ-έκφραση προσδιορίσθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. κύτταρα LoVo ή κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν με τον φακοϊό με το cDNA pLV4-MALAT1, pLV4-MALAT1 shRNA ή pLV4-φορέα.

Λουσιφεράσης Reporter

Για να ελέγξετε MALAT1 προαγωγό ή LEF /υποκινητή TCF δραστηριότητα, τα κύτταρα LoVo συν-επιμολύνθηκαν με είτε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pGL3-βασικό-MALAT1 προαγωγό ή pGL3-βασικό-LEF /TCF υποκινητή με ένα μάρτυρα θετικού πλασμιδίου pRL-SV40, όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Η δραστικότητα προαγωγού αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ δοκιμασίας διπλής λουσιφεράσης (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μετανάστευση και Δοκιμασία εισβολή

Ένα σύνολο 5 × 10

5 κυττάρων LoVo καλλιεργήθηκαν σε 100 μλ F12K με 0,5% FBS σπάρθηκαν στο άνω μέρος ενός θαλάμου Transwell (Corning Incorporated, Corning, ΝΥ). Για την ανάλυση της μετανάστευσης, στο κάτω μέρος του θαλάμου, 600 μΐ F12K με 15% FBS και 10 μg /ml ινονεκτίνης προστέθηκε και η δοκιμασία πραγματοποιήθηκε για 24 ώρες στους 37 ° C και 5% CO2. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν αναλύθηκαν με χρώση κρυσταλλικού ιώδους, που ακολουθείται με παρατήρηση κάτω από ένα DMI3000 Β ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Leica, Germany). Για την ανάλυση εισβολή, 100 μΐ matrigel (BD, USA) κατ ‘αρχάς προστίθεται εις τον πυθμένα του θαλάμου transwell πριν κύτταρα LoVo σπάρθηκαν, και οι ακόλουθες διαδικασίες ήταν οι ίδιες με ανάλυση της μετανάστευσης, εκτός από τις επεμβατικές κύτταρα που αναλύονται μετά από συν-καλλιέργεια για 48 ώρες. Όπως με τα κύτταρα HCT116, οι διαδικασίες ήταν παρόμοιες, η μόνη διαφορά ήταν κύτταρα που καλλιεργείται με RIPM 1640.

Western Blot

ολόκληρων κυττάρων, κυτόπλασμα, και πυρηνικές πρωτεΐνες από LoVo ή HCT116 κύτταρα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του ProteoJET Κυτταροπλασματικά και πυρηνική πρωτεΐνη κιτ εκχύλισης (Fermentas, USA). Οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν στα πηκτώματα SDS-PAGE για την ηλεκτροφόρηση, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και αποκλείστηκαν σε 5% γάλα πριν από την επώαση με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα και τα δευτερεύοντα αντισώματα. Τα προκύπτοντα ανοσοσύμπλοκα έγιναν ορατά με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Πρωτεΐνη φόρτωση ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνης (ολόκληρη πρωτεΐνη ή κυτταρόπλασμα πρωτεΐνη) ή PCNA (πυρηνική πρωτεΐνη).

RNA-δεσμευτική πρωτεΐνη Ανοσοκαταβύθιση

RNA-πρωτεΐνης δέσμευσης ανοσοκαταβύθιση (RIP) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή από την EZ-Magna RIP Kit (Millipore, USA). Εν συντομία, τα κύτταρα LoVo ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με παγωμένο φωσφορικό άλας (PBS), υποβλήθηκαν σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης RIP. Τόσο β-κατενίνης (CST, USA) και μη ειδικά αντισώματα IgG κουνελιού ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκατακρήμνιση. λύματα RIP και μαγνητικά αντίσωμα β-κατενίνης σφαιρίδια δεσμευμένα επωάστηκαν μαζί με περιστρεφόμενα για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες στο ανοσοΐζημα υπέστησαν πέψη με πρωτεϊνάση Κ και δεσμεύεται RNAs καθαρίστηκαν από τα υπερκείμενα, αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimeScript RT ακολουθούμενο από ποσοτική ανάλυση.

Inmunofluorescence Μικροσκοπία

LoVo κυττάρων ( 2,5 × 10

5) αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου (Millipore, USA) για 8 ώρες, σε νηστεία επί 12 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν για 40 λεπτά με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου, permealized και δεσμεύτηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα, 1% BSA, 0.5% Triton Χ-100 και επωάστηκαν για μία νύχτα με μονοκλωνικό αντι-β-κατενίνης ( CST, USA). Μετά το πλύσιμο των πλακών, Cy3-συζευγμένο αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG (Beyotime Ινστιτούτο Βιοτεχνολογίας, Κίνα) προστέθηκε σε διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα. 4-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη εφαρμόστηκε σε πυρήνες λεκέ. εικόνες ανοσοφθορισμού ελήφθησαν με DMI3000B ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Leica, Γερμανία).

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Οι μέσες τιμές των δύο ομάδων συγκρίθηκαν με

t

test του Student. Οι ενώσεις μεταξύ της έκφρασης των MALAT1 και κλινικοπαθολογικών παράμετροι αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher, chi-square τεστ ή διόρθωση συνέχειας chi-square τεστ από το λογισμικό SPSS18.0.

Αποτελέσματα

1. MALAT1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου Ιστοί και συσχετίζεται με μετάσταση όγκου και εισβολή

Χρησιμοποιώντας

in situ υβριδισμού

, βρήκαμε υπήρχε υψηλότερη έκφραση της MALAT1 στον ιστό καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) από ό, τι η παρακείμενο φυσιολογικό ορθοκολικό ιστό (Σχήμα 1 και Πίνακας 1). Είμαστε δίπλα διεξάγεται ανάλυση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης MALAT1 και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά της CRC. Μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ MALAT1 έκφραση και την έκταση της μετάστασης και εισβολής. Σε αντίθεση με παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς, η έκφραση σε ιστούς MALAT1 CRC εκτομή από ασθενείς με μεταστατικό ασθένειες ήταν υψηλότερες από εκείνες που δεν μετάσταση (Πίνακας 2). Αυτή η συσχέτιση μεταξύ MALAT1 της έκφρασης και την έκταση της μετάστασης και εισβολής επιβεβαιώθηκε επίσης με PCR σε πραγματικό χρόνο (Σχήμα S1).

In situ υβριδισμού

εφαρμόστηκε για τη διερεύνηση της έκφρασης MALAT1 σε 60 παραφίνη-ενσωματωμένες ιστό του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών δειγμάτων ιστών ασθενών CRC.

Η

Η

2. Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των LoVo κύτταρα

Για να γίνει διαλογή κινεζική ιατρική μονομερούς αντικαρκινικά φάρμακα, τα οποία ανέστειλαν MALAT1 έκφραση στα κύτταρα LoVo, ερευνήσαμε πρώτα τον αντίκτυπο των υποψηφίων φαρμάκων στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LoVo, και υπολογίζεται το μισό συγκέντρωση αναστολής (IC50) όλων των υποψήφιων φαρμάκων (Πίνακας 3). Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση των υποψηφίων φαρμάκων για την αναστολή της έκφρασης MALAT1. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη και osthole ήταν τα 2 κορυφαία αντικαρκινικά φάρμακα σε σχέση με την αναστολή της έκφρασης MALAT1, με τη ρεσβερατρόλη είναι το καλύτερο ένα μεταξύ αυτών των δύο (Σχήμα 2Α). Ως εκ τούτου, επιλέξαμε ρεσβερατρόλη για περαιτέρω μελέτες μας για MALAT1 και των σχετικών μηχανισμών. Με τα δεδομένα μας δείχνουν μια ρεσβερατρόλη IC50 55 μm στα κύτταρα LoVo (Σχήμα 2Β), οι δόσεις των φαρμάκων της 15, 30 και 50 μΜ επομένως επιλέγονται για τη διερεύνηση της επίδρασης της ρεσβερατρόλης στις εισβολή και τη μετανάστευση των δυνατοτήτων των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν κύτταρα LoVo ήταν σημαντικά ανέστειλε την ικανότητά τους να εισβάλουν και να μεταναστεύσουν από ρεσβερατρόλη, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2C)

(Α):. Είκοσι δύο υποψήφιες κινεζική ιατρική μονομερούς αντικαρκινικά φάρμακα δοκιμάστηκαν για τις αποτελεσματικές δόσεις αναστολής επί της έκφρασης MALAT1 σε κύτταρα LoVo. (Β): Συσχέτιση των δόσεων φαρμάκου ρεσβερατρόλης και αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων LoVo. άξονας Υ: ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης? άξονα Χ: η ρεσβερατρόλη συγκεντρώσεις (μΜ). (C): Αξιολόγηση και ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων LoVo. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των μεταναστευτικών /επεμβατική κύτταρα ανά 5 πεδία υψηλής ισχύος. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo έλεγχο

Η

3. Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τη Nuclear Localization του β-κατενίνης, Επίπεδα μεταγενέστεροι Πρωτεΐνες του, και MALAT1 Έκφραση σε Κύτταρα LoVo

Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι η ρεσβερατρόλη εξασθένησε την κυτταρική εντόπιση του β-κατενίνης, καρκινικό κύτταρο εισβολή πρωτεΐνη που ρυθμίζει και μετάσταση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, η ρεσβερατρόλη ενίσχυσε τις κυτταροπλασματικά επίπεδα β-κατενίνης, ενώ μειώνουν την παρουσία της στον πυρήνα, με μικρή επίδραση επί της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης β-κατενίνης.

( Α): Συνολική ή κυτταρικών εκχυλισμάτων διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων από τα κύτταρα LoVo αγωγή με ρεσβερατρόλη ανιχνεύθηκαν για β-κατενίνης. β-κατενίνης επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. (Β): Συνολικός κυτταρικά εκχυλίσματα των κυττάρων LoVo αγωγή με ρεσβερατρόλη ανιχνεύθηκαν για c-myc, τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΜΜΡ-7 και προσδιορίστηκαν ποσοτικά. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo έλεγχο. (C): Τα επίπεδα έκφρασης του MALAT1 από κύτταρα LoVo σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες δόσεις ρεσβερατρόλης προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR. Οι σχετικές δραστηριότητες MALAT1 υποκινητή σε κύτταρα LoVo αγωγή με δόσεις ρεσβερατρόλης υποδεικνυόμενη μετρήθηκαν. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo έλεγχο

Η

Είμαστε δίπλα μελέτησαν την έκφραση των κατάντη της β-κατενίνης γονίδια στόχου παρουσία της ρεσβερατρόλης, για τον κύριο ρόλο της β-κατενίνης στον πυρήνα είναι μέσω ρύθμισης της για γονιδιακή μεταγραφή. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε την έκφραση του β-κατενίνης κατάντη γονιδίων στόχων c-Myc και ΜΜΡ-7 μειώθηκε σημαντικά από ρεσβερατρόλη, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη μπορεί να αναστέλλει τον καρκίνο κυτταρική εισβολή και μετανάστευσης μέσω καταστολής Wnt /σηματοδοτικό μονοπάτι β-κατενίνης.

Επιπλέον, ανακαλύψαμε ότι η ρεσβερατρόλη κάτω ρυθμισμένη την έκφραση της μακράς μη κωδικοποιητικού RNA-MALAT1 σε μία δόση εξαρτώμενης τρόπο (Εικόνα 3C). Για να επαληθεύσετε την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην MALAT1 έκφρασης, χρησιμοποιήσαμε MALAT1 υποστηρικτής του συστήματος διπλής λουσιφεράσης και διαπίστωσε ότι η ρεσβερατρόλη ανέστειλε άμεσα την δράση του υποκινητή της MALAT1, π.χ. μόνο δραστικότητα προαγωγού 10% επιτεύχθηκε με 50 μΜ της ρεσβερατρόλης σε σχέση με το μάρτυρα (Σχήμα 3D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ρεσβερατρόλη έχει άμεσο αντίκτυπο στην μεταγραφή του γονιδίου MALAT1.

4. MALAT1 προάγει τον πολλαπλασιασμό, εισβολή και Μετανάστευσης, και αυξάνει την πυρηνική εντόπιση της β-κατενίνης και τα επίπεδα μεταγενέστεροι γονιδιακών προϊόντων της στην LoVo κύτταρα

Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας φακοϊό μεσολάβηση κατασκευάσματα, που γκρέμισε ή πάνω εκφρασμένο γονίδιο MALAT1 έκφραση σε κύτταρα LoVo. Τα δεδομένα μας έδειξε σαφώς ότι η διάδοση και την ικανότητα εισβολής /μετανάστευση των κυττάρων LoVo ήταν σημαντικά μειωμένα κατά MALAT1 νοκ ντάουν, και αυξήθηκε κατά MALAT1 υπερέκφραση (Εικόνα 4Α, 4Β)

(Α):.

Σε vitro

ανάπτυξη των κυττάρων LoVo εκφράζουν MALAT1-shRNA, MALAT1-υπερέκφραση, κενό φορέα εναντίον γονικών κυττάρων. (Β): Αξιολόγηση και ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων LoVo υποδεικνύεται στο Α Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των μεταναστευτικών /επεμβατική κύτταρα ανά 5 πεδία υψηλής ισχύος. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου LoVo

Η

Όταν χτύπησε κάτω, χρησιμοποιώντας την έκφραση του γονιδίου MALAT1 shRNA κατασκευάσει στα κύτταρα LoVo, ήμασταν έκπληκτοι να διαπιστώσουν ότι η πρωτεΐνη β-κατενίνης διατηρήθηκε στο κυτταρόπλασμα ενώ η παρουσία της στην πυρήνων remarkedly αύξηση (σχήμα 5Α). Επιπλέον, βρήκαμε MALAT1 knockdown μείωσε την έκφραση της β-κατενίνης κατάντη γονίδια στόχους όπως c-myc, ΜΜΡ-7, ως MALAT1 υπερέκφραση έκανε το αντίθετο (Σχήμα 5Β). Αυτό το σύνολο των δεδομένων που υποδηλώνονται με έμφαση ότι η ρεσβερατρόλη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση ιδιότητες των κυττάρων CRC μέσω ρύθμισης προς τα κάτω την έκφραση MALAT1

(Α):. Ολόκληρο ή κυτταρικών εκχυλισμάτων των διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων από τα κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1 -shRNA, MALAT1-υπερέκφραση, κενό φορέα ανιχνεύθηκαν για β-κατενίνης και τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο του φορέα. (Β): Ολόκληρο ή κυτταρικών εκχυλισμάτων διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων από τα κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1-shRNA, MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα ανιχνεύθηκαν για c-myc, ΜΜΡ-7 και τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με το φορέα ελέγχου

Η

5. Η υπερέκφραση του MALAT1 διασώζει LoVo Κύτταρα από Καταστολής τη Μετανάστευση και την εισβολή από ρεσβερατρόλη

Για να επιβεβαιωθεί το εύρημα μας ρεσβερατρόλης καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων LoVo μέσω MALAT1, ένα πείραμα MALAT1 διάσωσης πραγματοποιήθηκε. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι φακοϊό μεσολάβηση υπερέκφραση MALAT1 εξασθενημένου σημαντικά ρεσβερατρόλη επαγόμενη αναστολή για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή σε κύτταρα LoVo (Σχήμα 6Α). Με άλλα λόγια, η υπερέκφραση του MALAT1 μπορούσε να αντιστρέψει την επίδραση της ρεσβερατρόλης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα κηλίδος Western έδειξε ότι η υπερέκφραση του MALAT1 ανέστρεψε την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην πυρηνική β-κατενίνης και της πρωτεΐνης έκφρασης του c-myc και ΜΜΡ-7 σε κύτταρα LoVo (Σχήμα 6Β).

(Α) : κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ ρεσβερατρόλης για 48 ώρες και μετρήθηκαν κυτταρική μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής. (Β): Ολόκληρο ή κυτταρικών εκχυλισμάτων διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων από τα κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ ρεσβερατρόλη ανιχνεύθηκαν για β-κατενίνης, c-myc, ΜΜΡ-7, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν . *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo θεραπεία με 50 μΜ ρεσβερατρόλη

Η

6. Η ρεσβερατρόλη Αναστέλλει Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση μέσω MALAT1

Υποθέσαμε ότι η ρεσβερατρόλη ανέστειλε την σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης μέσω της ρύθμισης MALAT1. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, χρησιμοποιήσαμε ανοσοχρώση και αναλύσεις Western blot να παρατηρήσει αν β-κατενίνης trans-που βρίσκεται από το κυτταρόπλασμα στα πυρηνικά με την παρουσία της ρεσβερατρόλης και χειραγώγηση των επιπέδων έκφρασης MALAT1. Για να γίνει η επίδραση πιο προφανές, χρησιμοποιήσαμε LiCl για την αναστολή της ΟδΚ3β από δέσμευση με β-κατενίνης πρωτεΐνη, για να αυξηθεί η ενεργή κατάσταση του μονοπατιού σήματος /β-κατενίνης Wnt. Τα αποτελέσματά μας, που, κατά LiCl πράγματι προκάλεσε την μετατόπιση της πρωτεΐνης β-κατενίνης από κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, η ρεσβερατρόλη (50 μΜ) παρεμποδίζεται σημαντικά τη διαδικασία αυτή (Σχήμα 7Α). Στη συνέχεια, προς τα κάτω ρύθμιση MALAT1 ενίσχυσε την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην αναστροφή της β-κατενίνης μετατόπιση από κυτόπλασμα σε πυρήνα σε κύτταρα shRNA /MALAT1 LoVo, ενώ τα πάνω ρύθμιση του MALAT1 αυτό (Εικόνα 7Β, 7C) αποδυναμωθεί.

(Α): Η ρεσβερατρόλη αναιρείται LiCl επαγόμενη πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης. χρώση ανοσοφθορισμού της β-κατενίνης σε κύτταρα LoVo σε επεξεργασία με LiCl, με ή χωρίς ρεσβερατρόλη. (Β): Πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1-shRNA, MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα, υποβάλλεται σε επεξεργασία με LiCl, με ή χωρίς ρεσβερατρόλη, ανιχνεύθηκαν για β-κατενίνης, c-myc, ΜΜΡ-7. (C): Ποσοτικοποίηση της β-κατενίνης, c-myc, ΜΜΡ-7 επίπεδα πρωτεΐνης από τα δεδομένα που δείχνονται στο (Α). **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το κενό ομάδα ή μόνη ομάδα LiCl. (D): Οι σχετικές δραστηριότητες υποκινητή /TCF LEF σε κύτταρα LoVo εκφράζουν MALAT1-shRNA, MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα, αντιμετωπίζονται από LiCl, με ή χωρίς ρεσβερατρόλη. **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το κενό ομάδα ή μόνη ομάδα LiCl. (Ε): Δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ MALAT1 και β-κατενίνης. Εισάγετε: αποτέλεσμα RT-PCR δείχνει ποσότητα RNA τράβηξε προς τα κάτω από την RNA-δεσμευτικές πρωτεΐνες ανοσοκαθίζησης. Ως αρνητικοί έλεγχοι, δεν χρησιμοποιήθηκε cDNA (κενό) ή IgG μόνο. Κάτω παράθυρο: αποτέλεσμα ποσοτικοποίηση του ενθέτου

Η

Επιπλέον, ελέγξαμε την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης χρησιμοποιώντας ένα κατασκεύασμα διπλής λουσιφεράσης LEF /TCF προαγωγού.. Τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι, η ρεσβερατρόλη ανέστειλε τη δράση του υποκινητή του LEF /TCF που προκαλείται από LiCl, και συν-καταστολή των MALAT1 οδήγησε στην ενίσχυση αυτού του φαινομένου, ως συν-υπερέκφραση του MALAT1 αντίθετες αυτό (Σχήμα 7D). Όλα αυτά τα δεδομένα υποστηρίζονται ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τη δράση του μονοπατιού σήματος /β-κατενίνης Wnt μέσω καταστέλλοντας την έκφραση MALAT1. Από MALAT1 και πρωτεΐνη β-κατενίνης τόσο υπάρχουν στον πυρήνα, έτσι ώστε να έχει μεγάλο ενδιαφέρον για εμάς να γνωρίζουμε αν αυτά τα δύο μόρια μπορούν να αλληλεπιδρούν άμεσα με το άλλο, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας μια τεχνική ανοσοκατακρήμνισης πρωτεΐνη δέσμευσης RNA. Παραδόξως, τα δεδομένα μας έδειξαν μικρή αλληλεπίδραση μεταξύ MALAT1 και β-κατενίνης (Σχήμα 7Ε). Αυτό φαίνεται ότι MALAT1 θα μπορούσε έμμεσα να αλληλεπιδράσουν με β-κατενίνης να επηρεάσει καταρράκτη σήμα της.

7. Επιβεβαίωση της Βασικά Ευρήματα μας σε μια άλλη CRC Κυτταρική σειρά HCT116

Για να επιβεβαιώσετε τα βασικά ευρήματα μας στα κύτταρα LoVo, δοκιμάσαμε μια άλλη γραμμή κυττάρων CRC HCT116 χρησιμοποιούν παρόμοιες προσεγγίσεις. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 από το IC50 100 μΜ (Σχήμα 8Α). HCT 116 κύτταρα είχαν πολύ χαμηλότερη έκφραση MALAT1 από τα κύτταρα LoVo, αλλά παρ ‘όλα αυτά, ως παρόμοια με τα κύτταρα LoVo, η υπερέκφραση του MALAT1 προήγαγαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 (Σχήμα 8Β, 8C, 8D)

(Α):. Ρεσβερατρόλη ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HCT116 με IC50 100 μΜ. (Β): HCT 116 κύτταρα παρουσίασαν χαμηλότερη έκφραση MALAT1 από τα κύτταρα LoVo. **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo. (C): Η υπερέκφραση του MALAT1 σε κύτταρα HCT116. (D): Υπερέκφραση του MALAT1 προώθησε την in vitro ανάπτυξη των κυττάρων HCT116. (Ε): Η υπερέκφραση της MALAT1 εξασθένησε την κατασταλτική δράση της ρεσβερατρόλης για τη μετανάστευση και την εισβολή στα κύτταρα HCT116. κύτταρα HCT116 που εκφράζουν MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ ρεσβερατρόλης για 48 ώρες και μετρήθηκαν κυτταρική μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής. (F): Ολόκληρο ή κυτταρικών εκχυλισμάτων διαφορετικών κυτταρικών διαμερισμάτων από κύτταρα HCT116 που εκφράζουν MALAT1-υπερεκφράζεται, κενό φορέα υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς 50 μΜ ρεσβερατρόλης για 48 ώρες ανιχνεύθηκαν για β-κατενίνης, c-myc, ΜΜΡ-7 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά. *

σ

& lt? 0,05 ή **

σ

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116 αγωγή με 100 μΜ ρεσβερατρόλη

Η

Επιπλέον, η ρεσβερατρόλη επίσης σημαντικά ανέστειλε την μετανάστευση και την εισβολή ικανότητα του HCT116. Όπως στα κύτταρα LoVo, η υπερέκφραση του MALAT1 διασωθεί κυττάρων HCT116 από την καταστολή της μετανάστευσης και της εισβολής ρεσβερατρόλη (Εικόνα 8Ε). Αποτελέσματα κηλίδα Western έδειξε επίσης ότι η υπερέκφραση του MALAT1 ανέστρεψε την επίδραση της ρεσβερατρόλης στην πυρηνική β-κατενίνης και της πρωτεΐνης έκφρασης του c-myc και ΜΜΡ-7 σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 8F).

Συζήτηση

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους στον κόσμο, με υψηλό ποσοστό υποτροπής και μετάσταση. Οι μηχανισμοί της υποτροπής και της μετάστασης παραμένουν πολύ περίπλοκη. Επί του παρόντος, η θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι κυρίως χειρουργική εκτομή, σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, ανοσοθεραπεία, και άλλες εναλλακτικές φροντίδες, όπως η παραδοσιακή κινεζική ιατρική. Παραδοσιακή κινεζική ιατρική και, πιο πρόσφατα, που προέρχονται εξάγεται θεραπεία μονομερές του μπορεί να βελτιώσει τα συμπτώματα του καρκίνου, μείωση της μετάστασης του καρκίνου, καθώς και να μειώσει τον κίνδυνο επανεμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, οι θεραπευτικοί στόχοι και οι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Μεταξύ αυτών εξάγεται μονομερή, η ρεσβερατρόλη είναι ένα τέλειο παράδειγμα. Ήδη από το 1993, Jayafilake

et al

έχει βρεθεί ότι η ρεσβερατρόλη έχει το χαρακτηριστικό αντι-καρκίνου λόγω των κατασταλτικών επίδρασή του στην δραστηριότητα της πρωτεϊνικής κινάσης-τυροσίνης [20]. Άλλοι ερευνητές βρήκαν επίσης ότι η ρεσβερατρόλη έχει ανασταλτική επίδραση σε μια μεγάλη φάσμα κακοήθων κυττάρων όγκου που προέρχονται από μαστού, γαστρικό, του παχέως εντέρου, του προστάτη, των ωοθηκών, και καρκίνων του δέρματος [21] – [26]. τρέχουσες μελέτες μας έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων.

Όντας το βασικό παράγοντα μεταγραφική ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt σήματος /β-κατενίνης, κατόπιν ανάντη ενεργοποίησης, β-κατενίνης μετατοπίζεται συχνά στην πυρήνα από κυτταρόπλασμα, σε συντονισμό με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες όπως TCF /LEF, για την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του c-myc, cyclinD1, MMP-7, και CD44, η οποία με τη σειρά τους παίζουν καθοριστικό ρόλο στην έναρξη και την ανάπτυξη [27] όγκων – [ ,,,0],30]. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη μπλοκάρει την μετατόπιση του β-κατενίνης στον πυρήνα, οδηγώντας σε μειωμένες έκφραση του c-myc και ΜΜΡ-7.

Long μη-κωδικοποίησης ΚΝΑ-MALAT1 ήταν αρχικά αναφέρθηκε στην επεμβατική μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα, και πρόσφατα έχει βρεθεί υπερεκφράζουν σε πολλούς άλλους ιστούς του καρκίνου, που υποδεικνύεται MALAT1 σχετίζεται με εισβολή και τη μετάσταση [11] – [14]. Οι μελέτες μας έδειξαν MALAT1 υπερεκφράζεται σε 60 ιστούς CRC σε σύγκριση με τις παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, και MALAT1 υπερέκφραση συσχετίζονται με CRC εισβολή και μετάσταση χαρακτηριστικά. Σε πειράματα ελέγχου μας, έχουμε εντοπίσει δύο παραδοσιακή κινεζική ιατρική εξάγεται μονομερή που έχουν άμεση επίδραση στην MALAT1 έκφρασης. Η ρεσβερατρόλη είναι το καλύτερο από αυτούς. Σε τρέχουσες μελέτες μας, φαίνεται ότι shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της MALAT1 μειώνεται προφανώς εισβολή και τη μετανάστευση των δυνατοτήτων της CRC LoVo και τα κύτταρα HCT116. Παρόμοια με τα αποτελέσματα της θεραπείας ρεσβερατρόλη, knockdown του MALAT1 ανέστειλε την trans-θέση του β-κατενίνης από κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, με αποτέλεσμα την μειωμένη c-Myc και ΜΜΡ-7 έκφραση, ενώ MALAT1 υπερέκφραση έκανε το αντίθετο.

με τη χρήση ενός LEF /TCF υποκινητή κατασκεύασμα διπλής λουσιφεράσης και ενεργοποίηση της /β-κατενίνης σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt με LiCl, αποδείξαμε επίσης ότι knockdown του MALAT1 ενίσχυσε την ανασταλτική επίδραση της ρεσβερατρόλης στην δραστηριότητα προαγωγέα του LEF /TCF που προκαλείται από LiCl, ενώ η υπερέκφραση του MALAT1 να αποδυναμωθεί. Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπογραμμίζοντας μηχανισμός της ρεσβερατρόλης μπορεί να είναι μέσω της καταστολής της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της έκφρασης MALAT1.

MALAT1 είναι ειδικά διατηρείται στην πυρηνική στίγματα, που σχετίζονται με την αποθήκευση ή την τροποποίηση του προ-mRNA μηχανήματα επεξεργασίας, έχει δυνητικά επίδραση στη ρύθμιση της γονιδιακής λειτουργίας, όλα αυτά συνεπάγονται ότι MALAT1 μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση [31] – [33]. Για το λόγο ότι MALAT1 και πρωτεΐνη β-κατενίνης τόσο διαμένουν στον πυρήνα, εξετάσαμε αν υπάρχει άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο μορίων στον πυρήνα. Δυστυχώς παρατηρείται μικρή άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ MALAT1 και β-κατενίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχουν και άλλα μόρια που εμπλέκονται στην ρύθμιση μεταξύ MALAT1 και β-κατενίνης. Δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης υψηλή MALAT1 σε κλινικά δείγματα και πυρηνική συσσώρευση της β-κατενίνης βρέθηκε. Όπως προτείνεται από Brabletz Τ

et al

, β-κατενίνης (Σχήμα S1) σε καρκινώματα του παχέος εντέρου έδειξε μια ισχυρή πυρηνική εμπλουτισμού στο μέτωπο εισβολής, ενώ σε μεγάλα τμήματα της κεντρικής περιοχής του όγκου, της β-κατενίνης ανιχνεύθηκε σε το κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη [34] – [36]. Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να διαχωρίζει το μπροστινό εισβολή από το υπόλοιπο του ιστού CRC και μετρηθούν τα επίπεδα έκφρασης του MALAT1, β-κατενίνης και τον εντοπισμό τους, για τη συσχέτιση τους. Σχεδιάζουμε σε μελλοντικές μελέτες, με τη χρήση τεχνολογιών όπως το λογισμικό πρόβλεψης ανάλυση, συνανοσοκαθίζησης, αλληλουχίας της πρωτεΐνης, η πρωτεΐνη τσιπ και τσιπ γονιδίων, να εντοπίσει τις συγκεκριμένες σχέσεις μεταξύ MALAT1 και β-κατενίνης.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματά μας Ανοιχτό τους μηχανισμούς με τους οποίους η ρεσβερατρόλη ρυθμίζει MALAT1, με τη σειρά του μεταβάλλει την πυρηνική εντόπιση του β-κατενίνης, οδηγώντας σε μειωμένες Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση και την ενδεχόμενη αναστολή της εισβολής και της μετάστασης. Αυτή η ανακάλυψη θα δώσει σίγουρα ζωτικής σημασίας προ-κλινικές ενδείξεις που υποστηρίζουν τη μελλοντική χρήση της ρεσβερατρόλης στην πρόληψη και τη θεραπεία της CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επιλογή του πιο αποτελεσματική shRNA για MALAT1, ανίχνευση MALAT1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης β-κατενίνης σε ιστούς CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. (Α): κύτταρα LoVo μολύνθηκαν με τον φακοϊό με τρεις pLV4-MALAT1 Τα siRNAs ή pLV4-φορέα. αποδόσεις τους νοκ ντάουν εντοπίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR *

σ

& lt?. 0,05 ή **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο του φορέα. (Β): τα επίπεδα έκφρασης του mRNA MALAT1 μετρήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, ιστούς CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. **

σ

& lt? 0,01, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς ή ιστούς CRC χωρίς μετάσταση.