Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) περιλαμβάνει μια σύνθετη διαδικασία πολλαπλών γενετικών αλλαγών. Tumor καταστολέα ρ53 είναι ικανή να προσδιορίζει την τύχη των κυττάρων CRC. Ωστόσο, ο ρόλος του p53 επαγόμενο διαμορφωτή, ριβοσωμική πρωτεΐνη S27-όπως (RPS27L), το CRC είναι άγνωστη.

Μέθοδοι

Εδώ, η διαφορική έκφραση των RPS27L εξετάστηκε στα κόπρανα και παχέος ιστούς των ασθενών CRC, να διερευνήσει πιθανή συσχέτιση με την επιβίωση των ασθενών και για τη διερεύνηση των κυτταρικών μηχανισμών που διέπουν τις κλινικές εκβάσεις τους. Ογδόντα ασθενείς CRC ενδιάμεσο στάδιο (42 στο στάδιο II και 38 στο στάδιο ΙΙΙ) χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με κοπράνων επίπεδα RPS27L mRNA. Οι πιθανότητες επιβίωσης των ομάδων εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η πρωτεΐνη RPS27L στις παχέος ιστούς III ασθενείς σταδίου με διαφορετικές προγνώσεις εξετάστηκε περαιτέρω ανοσοϊστοχημικά. RPS27L έκφραση στα κύτταρα LoVo ήταν χειραγωγείται για να εξετάσει τις πιθανές κυτταρικές αποκρίσεις in vitro.

Αποτελέσματα

έκφραση Αυξημένα RPS27L, είτε σε περιττώματα ή ιστούς, σχετιζόταν με καλύτερη πρόγνωση. In vitro, RPS27L-κύτταρα που εκφράζουν LoVo σταμάτησε τη σύνθεση του DNA και αποπτωτική δραστηριότητα, ενώ η έκφραση των μορίων τους επιδιόρθωσης του DNA ρυθμίζεται αυξητικά.

Συμπεράσματα

Αυξημένα RPS27L μπορεί να βελτιώσει τις προγνώσεις ορισμένων CRC ασθενών με την ενίσχυση της η ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA των κυττάρων του κόλου τους, και μπορεί να προσδιοριστεί στα περιττώματα. Με την ενσωμάτωση κλινική, μοριακή και κυτταρική δεδομένα, η μελέτη μας δείχνει ότι κοπράνων RPS27L μπορεί να είναι ένα χρήσιμο δείκτη για την πρόβλεψη πρόγνωση και την καθοδήγηση εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές, ιδιαίτερα σε ασθενείς με ενδιάμεσο στάδιο CRC

Παράθεση:. Huang CJ, Yang SH, Lee CL, Cheng YC, Tai SY, Chien CC (2013) Ριβοσωματιακής πρωτεΐνη S27-Όπως και στον καρκίνο του παχέος εντέρου: Ένας υποψήφιος για Πρόβλεψη προγνώσεις. PLoS ONE 8 (6): e67043. doi: 10.1371 /journal.pone.0067043

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Υγείας του Καναδά και το Πανεπιστήμιο της Οτάβα, Καναδάς

Ελήφθη: 30ης Ιανουαρίου 2013? Αποδεκτές: 13η Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από NSC96-2320-B-281-001-my3 και NSC100-2320-Β-281-001 από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και CGH-MR-9919 από την Cathay Γενικό Νοσοκομείο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC), μία από τις πιο κοινές θανατηφόρου καρκίνου, περιλαμβάνουν μια σύνθετη διαδικασία πολλαπλών γενετικών αλλαγών [1], [2]. Η χειρουργική επέμβαση είναι η βέλτιστη θεραπεία για τους ασθενείς CRC στα στάδια II και III, αλλά επικουρική χημειοθεραπεία έχει βελτιώσει την πρόγνωση για κάποιους από αυτούς τους ασθενείς ενδιάμεσου σταδίου [3]. Ωστόσο, παρά τη θεραπεία, μέχρι 25% των ασθενών στο στάδιο ΙΙ και 30-40% στο στάδιο ΙΙΙ αναπτύξει μια μακρινή μετάσταση ή τοπικής υποτροπής [4]. Μοριακοί δείκτες των CRC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση των αποφάσεων που λαμβάνονται σχετικά με επικουρική χημειοθεραπεία σε αυτούς τους ασθενείς [5], αλλά παραμένουν αμφιλεγόμενα [3].

Όταν τα κύτταρα αντιμετωπίζουν πιέσεις, ογκοκατασταλτικό ρ53 είναι σε θέση να προσδιορίσει την τύχη τους από διευκολύνοντας την επισκευή και την επιβίωση των κατεστραμμένων κυττάρων ή με την εξάλειψη σοβαρά κατεστραμμένα κύτταρα [6]. CRC ογκογένεση έχει από καιρό που σχετίζονται με την λειτουργική απώλεια των ρ53 και τις συνακόλουθες αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που αποκρίνονται p53 [7]. Η πιο μελετημένη αυτών ρ53 αποκρίνεται επιδράσεις είναι η επισκευή των κατεστραμμένων DNA, η οποία πιστεύεται ότι είναι ο κύριος συντελεστής για την εξέλιξη του όγκου [8]. Η ανίχνευση των μεταβολών στην έκφραση του p53-γονιδίων που αποκρίνονται έχει προταθεί να επιτρέπουν την ταυτοποίηση ασθενών με υψηλό κίνδυνο υποτροπής και εκείνων που θα πρέπει να θεωρείται για επικουρική χημειοθεραπεία [9].

Μια ομάδα ριβοσωμικές πρωτεΐνες με κλινικά σημασία για πολλούς ανθρώπινους καρκίνους έχει ταυτοποιηθεί, και τα γονίδια που κωδικοποιούν τα περισσότερα από αυτά να ανταποκρίνονται στις p53 [10], [11]. Στην πραγματικότητα, εκτός από το ρόλο τους στη συναρμολόγηση με rRNA να κατασκευάσει ριβοσώματα για νέα πρωτεϊνική σύνθεση, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι έχουν πολλά εξωριβοσωματική ρόλους [12] – [14]. Μία από τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες, ριβοσωμική πρωτεΐνη S27-σαν (RPS27L), αναφέρθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω στα περιττώματα και ιστούς όγκου ορισμένων ασθενών τελικού σταδίου CRC [15], [16]. Αυτό ριβοσωμική πρωτεΐνη και ομόλογη πρωτεΐνη του, RPS27, έχουν θεωρηθεί ότι έχουν επεκταθεί ρόλους στην ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης και επιδιόρθωσης του DNA [17], [18]. Επιπλέον, RPS27L έχει ταυτοποιηθεί ως ένα ρ53-διεγέρσιμο ρυθμιστής της κυτταρικής μοίρας [19], [20]. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την κλινική σημασία και κυτταρικές επιδράσεις της έκφρασης RPS27L και τους πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν τη συμμετοχή του στις κλινικές εκβάσεις της CRC.

Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR) για την ποσοτικοποίηση των ετερογένεια των κοπράνων επιπέδων RPS27L σε ενδιάμεσο στάδιο ασθενείς CRC, και η διαφορική έκφραση του RPS27L συσχετίστηκε με κλινικά αποτελέσματα τους. RPS27L έκφραση σε κύτταρα LoVo με άγριου-τύπου ρ53 χειρισμό για να εξετάσει τις πιθανές κυτταρικές αποκρίσεις in vitro με την ανάλυση των αλλαγών στις φάσεις των κυττάρων, τις λειτουργίες αποπτωτικών τους, και την επιδιόρθωση του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

κοπράνων και των ιστών δείγματα

Στερεά δείγματα κοπράνων από 80 σποραδικές ασθενείς CRC (42 στο στάδιο II και 38 στο στάδιο ΙΙΙ), που ελήφθη κατά την Cathay Γενικό Νοσοκομείο ή Ταϊπέι Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων, συλλέχθηκαν πριν από τη χειρουργική επέμβαση ή οποιαδήποτε χημειοθεραπεία. Κοπράνων ολικό RNA παρασκευάστηκε σύμφωνα με προηγουμένως αναφερθείσες πρωτόκολλο μας, χρησιμοποιώντας ένα κιτ εκχύλισης RNA (Bioman Scientific, Taipei, Ταϊβάν) με κάποιες τροποποιήσεις [21] (Methods S1). Οι φάσεις κυττάρων στα δείγματα ιστού CRC (n = 68) και τα δεδομένα επιβίωσης των ασθενών (n = 71) αποκτήθηκαν από τους ασθενείς των οποίων δείγματα κοπράνων αναλύθηκαν. Άλλες έξι ιστούς σταδίου III CRC συλλέχθηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση για τον προσδιορισμό της έκφρασης των πρωτεϊνών ρ53 και RPS27L. Η μελέτη αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της Cathay Γενικό Νοσοκομείο. Οι επιτροπές δεοντολογίας, το Institutional Review Board της Cathay Γενικό Νοσοκομείο, ενέκρινε την εν λόγω διαδικασία συναίνεσης. Όλοι οι συμμετέχοντες παρείχαν έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη. Παρακολούθηση δεδομένα ελήφθησαν προοπτικά, και ο μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν 39,0 μήνες (SD, 3,1? Διάμεσος, 28.3)

φακοϊό βάση παρεμβολής RNA (RNAi) και υπερέκφραση του RPS27L

Οι λεντοϊού σωματίδια που δημιουργούνται για να φιμώσουν RPS27L (NM_015920) (pLK0.1-RPS27L, TRCN0000117608: GCCTAGTACAAAGTCCAAATT), να φιμώσουν RPS27 (NM_001030) (pLK0.1-RPS27, TRCN0000117596: GAAGAGGAAACACAAGAAG), ή για να υπερεκφράζουν RPS27L (pLKO AS3w. puro, που περιέχει RPS27L cDNA) ελήφθησαν από το Μηχανισμό Εθνικού RNAi πυρήνα που βρίσκεται στο Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας /Genomic Research Center, Academia Sinica, Ταϊβάν. pLK0.1-Luc (TRCN0000072246) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Διάφορες κυτταρικές σειρές του κόλου μολύνθηκαν με κάθε φακοϊό χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του Μηχανισμού RNAi Core. Εν συντομία, 8.5 χ 10

5 του κόλου κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα 10 cm για 24 ώρες και στη συνέχεια μολύνθηκαν με φακοϊό σε μια πολλαπλότητα μόλυνσης 3. Σταθερό μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν και διατηρήθηκαν σε μέσο που περιείχε 2 μg /mL πουρομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA). Αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων στόχων προσδιορίστηκαν με qRT-PCR ή ανοσοστύπωμα (Methods S1).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Σε 24 ώρες πριν από την VP16 (επίσης γνωστή ως ετοποσίδη ή VP-16 -213? αναστολέας) θεραπεία τοποϊσομεράσης II, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες θάλαμο 16 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Είτε RPS27L εκφράζουν (shLuc) ή RPS27L-λείπει (shRPS27L) κύτταρα LoVo υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ VP16 για 48 ώρες. Για τον προσδιορισμό της απόπτωσης-θετικά κύτταρα, τα κύτταρα βάφτηκαν με μία ανίχνευση αννεξίνης-ν /ΡΙ διπλή χρώση, με FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ι (BD Biosciences), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, με μια μικρή τροποποίηση. Εν συντομία, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (20 mM Tris [ρΗ 7,4], 150 mM NaCl, 1 mM ΟαΟ

2) μετά από επώαση για 15 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 5 μL δέσμευσης αννεξίνης V-FITC και 5 μί PI σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Πρόσθετες αποδείξεις για την εμφάνιση της απόπτωσης ελήφθη χρησιμοποιώντας το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) και διασπάται πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP). Οι διακυμάνσεις ΔΨ αποκαλύφθηκαν μέσω μικροσκοπικής φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα MitoLight Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, ΜΑ) που περιέχει 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine ιωδίδιο (JC- 1), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με μικρές τροποποιήσεις. Πρώτον, 6 × 10

4 του κόλου κύτταρα ανά φρεάτιο επωάστηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με VP16, όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από επώαση για 24 ώρες με VP16, κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αραιωμένο αντιδραστήριο MitoLight (0,2 μί MitoLight και 180 μL απιονισμένου νερού) και 20 μι 10 χ ρυθμιστικού διαλύματος επώαση για 15 λεπτά στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Το δυναμικό εξαιρετικά αρνητική μεμβράνη στα μιτοχόνδρια παράγει πορτοκαλί-κόκκινο φθορισμό από JC-1, και την απώλεια των μιτοχονδριακών διαμεμβρανικό δυναμικό αποτέλεσμα σε πράσινο φθορισμό, με την απώλεια του κόκκινου φθορισμού. Τα επίπεδα της διασπασμένης πρωτεΐνης PARP προσδιορίστηκαν σε ανοσοστυπώματα (Μέθοδοι S1).

γ-H2AX εστίες Δοκιμασία Σχηματισμού

Μετά από 5 × 10

4 κύτταρα LoVo ανά καθώς είχε επωάζονται για 24 ώρες, το DNA διπλής έλικας διαλείμματα (DSBs) προκλήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα με 10 μΜ VP16. την ικανότητα των κυττάρων για την επισκευή των DSBs προσδιορίστηκε με χρώση τους με αντίσωμα αντι-γ-Η2ΑΧ χρησιμοποιώντας το OxiSelect DNA διπλής έλικος Break Χρώση Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με κάποιες μικρές αλλαγές. Εν συντομία, τα κύτταρα αφέθηκαν να ανανήψουν με την αφαίρεση του επαγωγέα DSB για τις υποδεικνυόμενες περιόδους. Οι DSBs αποκάλυψαν (όπως γ-H2AX εστίες) εμφανίστηκε ως πράσινο φθορισμό, και οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με αντικηλίδωση τους με DAPI (4′-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη). Το πράσινο φθορισμό υποδεικνύοντας γ-H2AX εστίες οπτικοποιήθηκε με το Adobe Photoshop CS4 Extended (ver 11.0?. Adobe Systems, San Jose, CA) σε 100-200 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα. Ένα όριο προσδιορίστηκε με μέτρηση παρόμοια επίπεδα του πράσινου χρώματος σε κύτταρα που είχαν ανακτηθεί σε διαφορετικές περιόδους (0 ώρες, 2 ώρες, ή 4 ώρες). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ποσοστά των κυττάρων που εκπέμπουν φθορισμό πάνω από το όριο.

Στατιστική Ανάλυση

Οι καμπύλες επιβίωσης και τις πιθανότητες επιβίωσης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και σε σύγκριση με τη χρήση του log-rank δοκιμή. Μεταβλητές με

P

-τιμές ≤ 0,1 στα μονομεταβλητών αναλύσεις που περιλαμβάνονται στο πολυπαραγοντικό μοντέλο του Cox ανάλυση αναλογικών κινδύνων, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο αρχίζει για την ανάλυση επιβίωσης. Οι διαφορές στην έκφραση γονιδίων και του αριθμού των εστιών γ-Η2ΑΧ συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SPSS 13.0 (SPSS, Somers, ΝΥ). Η MedCalc στατιστικό πακέτο λογισμικού (MedCalc, Mariakerke, Belgium) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της χαρακτηριστικής (ROC) καμπύλη. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα, και

P

-τιμές & lt?. 0.05 θεωρούνται σημαντικές

Αποτελέσματα

Κλινική σημασία των RPS27L σε CRC

το επίπεδο των κοπράνων RPS27L συσχετίζεται θετικά με το ποσοστό των κυττάρων CRC των ασθενών CRC ενδιάμεσο στάδιο στη φάση s (r

s = 0,259?

P

= 0.033, Pearson συσχέτιση δοκιμή). Πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση της καμπύλης ROC και στρωματοποιημένη τους ασθενείς σε δύο ομάδες με τη χρήση του κοπράνων επίπεδο RPS27L των 0,0014, για το οποίο η ευαισθησία των 0,80 (95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI], 0,28 – 0,99) και ειδικότητα 0,77 (95% CI, 0,66 έως 0,86) επιτεύχθηκαν, για να προβλεφθεί η πρόγνωση των ασθενών. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC για κοπράνων RPS27L ήταν 0.733 (

P

= 0,017), με 95% CI των 0,623 – 0,826 (Εικόνα 1Α). Τα ποσοστά επιβίωσης συγκρίθηκαν μεταξύ του RPS27L

+ (n = 51? ≥ 0,0014) και RPS27L

– ομάδες (n = 20? & Lt? 0,0014)? η (DSS) ποσοστό πενταετούς συγκεκριμένες ασθένειες επιβίωσης ήταν υψηλότερη στην RPS27L

+ ομάδα (97,1% ± 2,8%) σε σχέση με το RPS27L

– ομάδα (69,6% ± 12,9%? P = 0,028, ημερολόγιο -rank δοκιμή). Καμία σχέση ήταν εμφανής μεταξύ των RPS27L

+ ομάδα και άλλα κλινικοπαθολογικών παραμέτρων (Πίνακας 1). Ωστόσο, μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλογικών κινδύνων κατά Cox αναλύσεις έδειξαν ότι το κοπράνων επίπεδο RPS27L ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας προγνωστικές (λόγος κινδύνων, 0.086? 95% CI, 0,009 έως 0,852?

P

= 0,036) για DSS των ενδιάμεσων σταδίων ασθενείς CRC (Πίνακας 2). Επιπλέον, τρεις nonrecurrent ασθενείς (στάδιο III) με ευνοϊκή πρόγνωση (επιβίωση & gt? 8 ετών) που εμφανίζεται έντονη ανοσοϊστοχημική χρώση για ρ53 και RPS27L σε τομές ιστού (Σχήμα 1Β, οι ασθενείς 1-3). Τρεις άλλοι ασθενείς σταδίου ΙΙΙ, ο οποίος υπέστη υποτροπή εντός ενός έτους μετά την επέμβαση και πέθανε μετά την πρώτη υποτροπή (επιβίωση & lt? 4 χρόνια), ήταν επίσης θετικά για την πρωτεΐνη ρ53 σε καρκινικά κύτταρα, αλλά η έκφραση της RPS27L πρωτεΐνης ήταν αδύναμη στην αντίστοιχη θέσεις (Σχήμα 1Β, ασθενείς 4-6).

(Α) Κλινική έννοια του RPS27L mRNA στα κόπρανα. Τα επίπεδα του mRNA RPS27L ήταν σχετικά ποσοτικά με qRT-PCR. Τα σημεία της χαρακτηριστικής καμπύλης (μαύρο ένθετο) εκπροσώπησε την ευαισθησία και (1-εξειδίκευση) για DSS. Kaplan-Meier εκτιμώμενο του DSS εξαρτάται από τα επίπεδα RPS27L mRNA (RPS27L-, & lt? 0,0014? RPS27L +, (0,0014) στα κόπρανα των ασθενών CRC (Β) επίπεδα πρωτεΐνης του p53 και RPS27L στους ιστούς CRC Κάθε δείγμα χρωματίζονται με αντι.. ρ53 και αντι-RPS27L αντισωμάτων από δύο παρακείμενα τμήματα μη επαναλαμβανόμενες ασθενείς: ασθενείς 1 έως 3, επιβίωση & gt? 8 y? Περιοδική ασθενείς:.. ασθενείς 4 έως 6, επιβίωση & lt? 4 y Όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη το ίδιο. τομέα της ένθετο σε χαμηλή μεγέθυνση (40 ×) παρουσιάστηκε σε μεγαλύτερη μεγέθυνση (200 ×). τα βέλη, οι αντίστοιχες θέσεις για κάθε ασθενή.

η

η

Μετεγκατάσταση RPS27L σε ορθοκολικό Τα καρκινικά κύτταρα

για τη διερεύνηση της κυτταρικής λειτουργίας του RPS27L, εμείς μολυσμένα κύτταρα LoVo, ένα άγριου τύπου ρ53-εκφράζουσα κυτταρική γραμμή από ένα στάδιο στο στάδιο III CRC, χρησιμοποιώντας ένα φακοϊό μεσολάβηση μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) προς αποτελεσματικά γκρεμίζω έκφραση RPS27L (shRPS27L) ή ένα στοιχείο ελέγχου shRNA (shLuc) (Σχήμα S1). ανοσοκυτταροχημική χρώση για ενδογενή RPS27L ήταν θετική στο κυτταρόπλασμα των shLuc μολυσμένα κύτταρα LoVo αλλά ήταν αρνητικός στα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με shRPS27L (Σχήμα 2Α) . Η κυτταροπλασματική RPS27L ήταν μετατοπίζεται στους πυρήνες των 10 μΜ VP16-κατεργασμένα κύτταρα LoVo, και η έντονη χρώση για πρωτεΐνη RPS27L στους πυρήνες που παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Β. Αυτή η αλλαγή VP16 επαγόμενη παρατηρήθηκε επίσης κατά τη διάρκεια της ανοσοανίχνευση RPS27L στα αρχικά κύτταρα LoVo (Σχήμα 2C).

(Α) Κυτταρικός εντοπισμός του RPS27L. RPS27L ήταν ανοσο-βάφονται σε διάφορα LoVo κυττάρων. (Β) Πυρηνικές επαγωγή RPS27L χρησιμοποιώντας 10 (Μ VP16. Τα βέλη σε ένθετα (α και β) υποδεικνύεται συμπυκνώνονται πυρηνικής RPS27L-λεκέδες. (Γ) Ανοσο-ανίχνευση RPS27L σε διάφορα πυρηνικά εκχυλίσματα. Το πυρηνικό εκχύλισμα παρασκευάστηκε από συγχρονισμένα κύτταρα LoVo με VP16, όπως αναφέρεται shLuc, κύτταρα RPS27L εκφράζουν?… shRPS27L, κύτταρα RPS27L-λείπει, overRPS27L, κύτταρα RPS27L-υπερεκφράζουν το αντίσωμα αντι-RPS27L, 1:2000

η

κυτταρικές επιδράσεις της Κάτω ρυθμιζόμενων RPS27L σε παχέος τα καρκινικά κύτταρα

επόμενο ανέλυσε τα κυτταρικά αποτελέσματα των RPS27L με υπερέκφραση RPS27L σε κύτταρα LoVo (overRPS27L) (Σχήμα S1). Παρόμοια ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε στα κύτταρα VP16-free (ανεξάρτητα από RPS27L έκφραση), όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες (Σχήμα 3Α) [22]. Όταν το DNA των συγχρονισμένων κυττάρων είχε καταστραφεί από VP16 σε πλήρες μέσο, ​​οι αριθμοί των κυττάρων στην S και G

2 /M φάσεις αυξηθεί σύμφωνα με τους έκφραση RPS27L (shLuc ή overRPS27L). Ωστόσο, μια άλλη παρόμοια RP,

RPS27

, δεν μεταβάλλει το μέγεθος του πληθυσμού S-φάση, ανεξάρτητα από το επίπεδο του

RPS27

έκφρασης μετά VP16 αγωγή (Εικόνα S2). Ταυτόχρονη μέτρηση του περιεχομένου DNA και την ποσότητα του BrdU-επισημασμένου DNA έδειξε ότι υπήρχαν λιγότερα κύτταρα με ενεργή σύνθεση του DNA μεταξύ των κυττάρων RPS27L-στερούνται (21% σε shRPS27L) μετά από θεραπεία με 10 μΜ VP16 (Σχήμα 3Β). Σε αντίθεση, τόσο οι RPS27L εκφράζουν και τα κύτταρα RPS27L υπερεκφράζουν είχαν υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων με τη σύνθεση ενεργού DNA (32% το shLuc και 37% σε overRPS27L) υπό τις ίδιες συνθήκες (Εικόνα 3Β).

(Α ) ρύθμιση κυτταρικού κύκλου. φάσεις των κυττάρων προσδιορίστηκαν μετά από ενδεδειγμένη θεραπεία Ρ16. (Β) Κύτταρα με πρόσφατα συντεθεί DNA υπό θεραπεία VP16. Το ποσοστό των BrdU-θετικών κυττάρων (μπλε κηλίδες) προσδιορίστηκε μετά από ενδεδειγμένη θεραπεία Ρ16. (C) Annexin-V /PI δοκιμασία διπλής χρώσης. Βέλη υποδεικνύονται αννεξίνη V-FITC και ΡΙ θετικών κυττάρων. VL, ορατό φως? PI, ιωδιούχο προπίδιο. Καταπράσινο σημείο, αννεξίνη V-FITC? κόκκινη κηλίδα, PI. (D) Κύτταρα με JC-1 λεκέ. Βέλη έδειξε την κόκκινη κοκκώδες μοτίβο του JC-1 συνάθροιση. (Ε) Ανοσο-ανίχνευση της διάσπασης PARP. Διασπασμένη PARP, 89 kDa? GAPDH, 36 kDa. shLuc, τα κύτταρα RPS27L εκφράζουν? shRPS27L, κύτταρα RPS27L-λείπει? overRPS27L, κύτταρα RPS27L-υπερεκφράζουν.

Η

εκτιμήθηκε Η αποπτωτική δραστηριότητα της RPS27L στα κύτταρα LoVo. Εν συντομία, τα κύτταρα ελέγχου (shLuc) ήταν αρνητικά για αννεξίνη V-FITC. Τα κύτταρα RPS27L-στερούνται (shRPS27L) περιείχαν περισσότερο αννεξίνης-ν-θετικών κυττάρων και την εμφάνιση μιας στάδιο αργά αποπτωτική (ή νεκρωτική) όταν διπλά θετική χρώση (αννεξίνη V και ΡΙ) (Σχήμα 3C). Επιπλέον, τα ζωντανά κύτταρα που εκφράζουν RPS27L ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κόκκινο κοκκώδες μοτίβο του JC-1 συσσωμάτωση σε κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ VP16 (Σχήμα 3D) και αυξημένα επίπεδα διασπασμένης ΡΑΚΡ παρατηρήθηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις VP16 (Σχήμα 3Ε). Στα κύτταρα RPS27L-λείπει, αυτό το κόκκινο κοκκώδες μοτίβο δεν υπήρχε και το υψηλότερο επίπεδο της διασπασμένης ΡΑΚΡ παρατηρήθηκε (Εικόνες 3D και 3Ε).

Επισκευή DNA Λειτουργία RPS27L σε καρκινικά κύτταρα του παχέος

Εμείς ποσοτικοποιηθεί περαιτέρω την έκφραση του mRNA του παράγοντα E2F μεταγραφής 1 (E2F1), RAD51, και την πρωτεΐνη κινάση, DNA-ενεργοποιημένα, καταλυτικό πολυπεπτίδιο (PRKDC) για τον προσδιορισμό του ρόλου των RPS27L σε VP16 επαγόμενη DSBs. Σε κύτταρα RPS27L-στερούνται, η θεραπεία με 10 μΜ VP16 προκάλεσε μια μείωση 63,6% (1,1 έως 0,4 φορές) σε έκφραση E2F1 και μείωση 54,5% (1,1 έως 0,6 φορές) σε έκφραση RAD51 (Σχήμα 4Α). Παρομοίως μειωμένη έκφραση του PRKDC (0.8- έως 0.5-φορές) παρατηρήθηκε επίσης υπό τις ίδιες συνθήκες επεξεργασίας. Το ποσοστό των κυττάρων με έντονη φωσφορυλιωμένη ιστόνη Η2ΑΧ (γ-Η2ΑΧ) εστίες μειώθηκε σταδιακά ως ο χρόνος επισκευής αυξήθηκε από 0 έως 4 ώρες, ανεξάρτητα από το αν το κυττάρων LoVo εκφράζεται RPS27L (Σχήμα 4Β). Ωστόσο, η καθυστέρηση στην κινητική της μειώνοντας την ένταση της γ-Η2ΑΧ εστίες παρατηρήθηκε σε κύτταρα που έχουν έλλειψη RPS27L έκφρασης. Έως 61% των κυττάρων RPS27L-λείπει περιείχε μια υψηλή πυκνότητα του γ-H2AX εστίες μετά την επισκευή για 4 ώρες, ενώ μόνο το 17% των κυττάρων RPS27L εκφράζουν ήταν πάνω από το όριο πυκνότητας για γ-H2AX εστίες εκείνη τη στιγμή (Σχήμα 4C) .

(A) Σχετική εκφράσεις των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA. Τα επίπεδα mRNA της

E2F1, RAD51

, και

PRKDC

μετρήθηκαν με qRT-PCR μετά από κύτταρα με ενδεικνυόμενη θεραπεία Ρ16. Η σχετική έκφραση του κάθε γονιδίου υπολογίστηκε συγκρίνοντας εκείνη των κυττάρων shLuc χωρίς θεραπεία VP16. (Β) Εκπρόσωπος φωτογραφίες των κυττάρων με γ-H2AX εστίες. Τα κύτταρα αφέθηκαν να ανανήψουν με την αφαίρεση του επαγωγέα DSBs επί 4 ώρες (100 Χ). Ένα όριο προσδιορίστηκε με μέτρηση παρόμοια επίπεδα πράσινου φθορισμού (γ-H2AX εστίες, ακάλυπτο DSBs) μεταξύ των κυττάρων shLuc και shRPS27L. Ένθετα (200 Χ): 1 και 4, γ-H2AX εστίες (υποδεικνύεται επίσης το κατώτατο όριο)? 2 και 5, ϋΑΡΙ? 3, συγχώνευση των 1 και 2? 6, συγχώνευση των 4 και 5. (C) Στατιστική διαφορά της γ-H2AX εστίες στα κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του VP16 για 1 ώρα και ανακτάται για προκαθορισμένο χρόνο. Ποσοστό της τάξης των 100-200 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα των οποίων πράσινου φθορισμού ήταν υψηλότερο από το όριο υποδείχθηκαν. shLuc, τα κύτταρα RPS27L εκφράζουν? shRPS27L, κύτταρα RPS27L-λείπει. Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01. Δύο έως τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Μοριακοί δείκτες μπορεί να αποτελέσει την καλύτερη βάση για την επιλογή της θεραπείας από την κλινική και ιστοπαθολογική κριτήρια [23]. Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) και το αντιγόνο του καρκίνου του 19-9 (CA19-9) είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα δείκτες CRC [24]. Ωστόσο, τα υψηλά επίπεδα είτε CEA στον ορό ή CA19-9 θεωρείται για να δείξει μια δυσμενή πρόγνωση σε ασθενείς CRC με ενδιάμεσο στάδιο της νόσου [25], [26].

Στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε στην CRC ασθενείς στα ενδιάμεσα στάδια της νόσου τους επειδή επικουρική θεραπεία, είναι σημαντικό για αυτούς τους ασθενείς. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η έκφραση πολλών ρετροϊών, συμπεριλαμβανομένων RPS27L, διέφερε σημαντικά στα κόπρανα των ασθενών CRC? αλλά καμία σημαντική διαφορά έκφραση βρέθηκε για RPS27, ένα μέλος της ίδιας οικογένειας, όπως RPS27L [15]. Έχουμε τώρα δείξει ότι οι ασθενείς ενδιάμεσου σταδίου με αυξημένη έκφραση κοπράνων RPS27L είχαν υψηλότερο ποσοστό DSS και ένα πολύ χαμηλότερο ποσοστό κινδύνων.

Σήμερα, παρακολουθούμε λειτουργικό p53 με τον καθορισμό του καθεστώτος κοπράνων RPS27L των ασθενών με ενδιάμεσο στάδιο CRC. Η κλινική σημασία της RPS27L δεν ήταν μόνο αποδεικνύεται σε δείγματα κοπράνων, αλλά και σε δείγματα ιστού CRC. Στο ενδιάμεσο στάδιο CRC, έντονη χρώση RPS27L, με μια αύξηση στην πρωτεΐνη ρ53, στον ιστό του CRC βρέθηκε σε ασθενείς που εμφανίζουν πλέον επιβίωση. Ωστόσο, οι ασθενείς των οποίων η ρ53 πρωτεΐνη απέτυχε να ενεργοποιήσει την έκφραση του RPS27L είχε κακή πρόγνωση, με υποτροπή και βραχύτερη επιβίωση. Αυτό συνεπάγεται ότι οι ασθενείς ενδιάμεσου σταδίου CRC με υψηλότερα επίπεδα RPS27L, είτε στα κόπρανα ή ιστούς, έχουν μια πιο ευνοϊκή πρόγνωση, και συνεπής έκφραση του p53 και RPS27L παρατηρήθηκε σε αυτούς τους ασθενείς με καλύτερη πρόγνωση.

Αυτό είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει ότι RPS27L είναι ένας πιθανός προγνωστικός δείκτης για CRC. Σε κλινικά δείγματα μας, το επίπεδο των κοπράνων RPS27L συσχετίζεται θετικά με το ποσοστό των κυττάρων στη φάση CRC S. Αυτά τα κλινικά δεδομένα είναι συνεπή με τα αποτελέσματά μας από συγχρονισμένα κύτταρα LoVo τα οποία εκφράζονται RPS27L. RPS27L και ομόλογη πρωτεΐνη του, RPS27, μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τον άξονα p53-MDM2 σε διάφορους τύπους κυττάρων [20]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε παρεμβολή RNA (shRPS27L) να γκρεμίσουμε έκφραση RPS27L στα κύτταρα LoVo. Βρήκαμε ότι δεν υπάρχει διαφορά στην έκφραση RPS27 ανιχνεύθηκε από τα κύτταρα με ή χωρίς RPS27L σίγηση (μη δημοσιευμένα δεδομένα μας) και καμία συνεπής κυτταρική επίδραση παρατηρήθηκε σε RPS27L- και LoVo κυττάρων RPS27-λείπει. Περαιτέρω, shRPS27L δεν επηρεάζει την έκφραση οποιωνδήποτε άλλων γονιδίων, ακόμη και εκείνοι (Κλωθώ, NM_004795? Archaelysin οικογένεια μεταλλοπεπτιδάση 1, NM_133463) με αλληλουχίες mRNA που έχουν μερική αγώνες για να shRPS27L (Σχήμα S3). Στην πραγματικότητα, Κλωθώ και archaelysin οικογένεια μεταλλοπεπτιδάση 1 είναι φυσικώς εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε στόχο CRC κυτταρική σειρά μας, LoVo (τα δεδομένα δεν φαίνονται) [27], [28]. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι τα αποτελέσματα της shRPS27L είναι συγκεκριμένες. Επιπλέον, η αλληλουχία πρωτεΐνης του RPS27L ελέγχθηκε κατά του ανθρώπινου γονιδιώματος στο διακομιστή γονιδίωμα UCSC [29]. Είκοσι-εννέα πρωτεϊνικών ακολουθιών με διάφορους βαθμούς της ταυτότητας (61,6% -98,8%) σε RPS27L εντοπίστηκαν, αλλά κανένα από αυτά δεν είχαν χτυπηθεί κάτω από shRPS27L, λόγω της ειδικής ακολουθίας του. Αυτό τονίζει και πάλι ότι καμία πρωτεΐνη, εκτός από RPS27L μπορεί να χτυπηθεί κάτω από shRPS27L.

Μετά την επιβεβαίωση της ειδικότητας της δράσης της shRPS27L, έχουμε σκεφτεί ότι p53-απόκρισης RPS27L προκαλεί τη σύλληψη των κυττάρων στη φάση S όταν το κυτταρικό DNA έχει υποστεί βλάβη. Μετά βλάβη του DNA και ρ53 που προκαλείται από την προσθήκη του VP16, BrdU-θετικών κυττάρων σε φάση S συσσωρευμένη μεταξύ των RPS27L κύτταρα που εκφράζουν LoVo. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι RPS27L προκαλεί τα κύτταρα να συλλάβουν στη φάση S μετά τη σύνθεση ενεργού DNA, και δεν επιτρέπει στα κύτταρα αυτά να εισέλθουν φάση Μ. Η παρατήρηση αννεξίνης-ν-θετικά και JC-1-συσσωματωμένα κύτταρα υποδηλώνει έντονα ότι το DNA που βλάπτουν παράγοντα, VP16, επάγει μια αντιαποπτωτική επίδραση σε κύτταρα που εκφράζουν τόσο άγριου τύπου ρ53 και RPS27L. Αυτό αντιαποπτωτικού επίδραση αντικατοπτρίζεται και στα υψηλότερα επίπεδα διασπασμένη PARP στα κύτταρα RPS27L-λείπει. Η ενεργοποίηση της PARP είναι επίσης απαραίτητη για τη ρύθμιση πολλών κυτταρικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της επισκευής του DNA και τον κυτταρικό θάνατο [30].

Ωστόσο, η δραστική σύνθεση DNA και αντιαποπτωτικών αποτέλεσμα που παρατηρείται, ακόμη και όταν το κυτταρικό DNA υποστεί βλάβη, φαίνεται ασυμβίβαστη με κλινικά δεδομένα μας, που δείχνει ότι οι ασθενείς με υψηλότερα επίπεδα έκφρασης RPS27L έχουν πιο ευνοϊκή πρόγνωση. Υποθέτουμε ότι nonapoptotic κυττάρων με κατεστραμμένο DNA πρέπει να έχει πρόσβαση μια κατάλληλη μέθοδος για την επιδιόρθωση του DNA DSB, και ότι η στόχευση πρωτεΐνες επιδιόρθωσης DNA θα πρέπει να χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία του καρκίνου [31]. Αυτό μπορεί να επεξηγηθεί με την ποσοτικοποίηση των δύο γονιδίων του DNA DSB επισκευή, RAD51 και PRKDC [32], και ένα γονίδιο το οποίο κωδικοποιεί ένα συστατικό συμπλοκών επισκευής, E2F1 [33]. μειωμένη έκφραση τους συνέπεσε με RPS27L knockdown μετά από θεραπεία με VP16 χαμηλή δόση. Αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα ότι E2F1 παίζει ένα λειτουργικό ρόλο στην καταστολή της απόπτωσης και την προώθηση της επιδιόρθωσης του DNA in vivo μετά από βλάβη του DNA [34]. Κατά συνέπεια, RPS27L απαιτείται για να καταστείλει την απόπτωση και για την επιδιόρθωση του DNA DSB σε κολικό κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53. Επιπλέον, VP16 επαγόμενη DSBs μπορεί να επάγει τη συσσώρευση RPS27L πρωτεΐνης στους πυρήνες των κυττάρων LoVo. Αυτό υποδηλώνει ότι το DNA DSB βλάβη διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επαγωγή της κυκλοφορίας των πρωτεϊνών RPS27L από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Xiong et al. Επίσης ανέφεραν παρόμοια αποτελέσματα σε μια μελέτη των επιθηλιακών κυττάρων ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [20]. Είμαστε εικάζουν ότι η μετατόπιση της RPS27L πρωτεΐνης μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση ορισμένων γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA. Ωστόσο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της έκφρασης RPS27L και γονίδια επιδιόρθωσης του DNA DSB.

Το κρίσιμο ρύθμιση των RPS27L στην επιδιόρθωση του DNA DSB μπορεί επίσης να αξιολογηθεί με τη μέτρηση της κινητικής των αλλαγών στον αριθμό των γ -H2AX εστίες [35]. Σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα για ενσωμάτωση BrdU, προτείνουμε ότι RPS27L συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA DSB μέσω ενός μηχανισμού του ομόλογου ανασυνδυασμού, επειδή οι περισσότεροι BrdU-θετικών κυττάρων περιορίζονταν στην φάση αργά S [36]. Αυτό αντιστοιχεί εν μέρει με τα ευρήματα του Miquel et al., Οι οποίοι έδειξαν ότι ένα υψηλό ποσοστό των κυττάρων CRC δεν είναι σε θέση να επισκευάσει το DNA λόγω των αλλαγών σε ένα ή περισσότερα συστατικά από τους δύο κύριους μηχανισμούς του DNA-επισκευή, συμπεριλαμβανομένου και του ομόλογου μονοπάτι ανασυνδυασμού [37 ].

Συμπεράσματα

Αυξημένα p53-απόκρισης συσσώρευσης RPS27L στον πυρήνα μπορεί να βελτιώσει τις προβλέψεις ορισμένων ασθενών CRC, ενδεχομένως μέσω της επίδρασής της στην επιδιόρθωση του DNA στα κύτταρα του παχέος εντέρου. RPS27L συσσώρευση μπορεί να παρατηρηθεί στα κόπρανα. Με την ενσωμάτωση κλινική, μοριακή και κυτταρική δεδομένα, η μελέτη μας έδειξε ότι κοπράνων RPS27L μπορεί να είναι ένας δείκτης για την πρόγνωση σε ασθενείς με CRC και μπορεί να καθοδηγήσει εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές, ιδιαίτερα σε ασθενείς με ενδιάμεσο στάδιο CRC.

Υποστήριξη Πληροφοριών

Εικόνα S1.

Αποτελεσματική αλλαγές της έκφρασης RPS27L με τη διεξαγωγή πειραμάτων φακοϊό που προκαλούνται στα κύτταρα LoVo. Σταθερό RPS27L εκφράζουν (shLuc), RPS27L-λείπει (shRPS27L), και RPS27L-υπερεκφράζουν (overRPS27L) κύτταρα LoVo αποκτήθηκαν από διάφορες λοιμώξεις φακοϊού. RPS27L, 9 kDa? . GAPDH, 36 kDa

doi: 10.1371 /journal.pone.0067043.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Επίδραση της έκφρασης RPS27 στην κυτταρομετρία ροής. κύτταρα LoVo, τα οποία είτε σιγήσει RPS27 (shRPS27) ή μολυσμένα από τον ιό ελέγχου (shLuc) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 10 μΜ της VP16. Διαλογή αναλύσεις ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) -stained κύτταρα με κυτταρομετρία ροής. Περίπου 104 κύτταρα σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας FlowJo 8.7 Κατεβάστε το doi:. 10.1371 /journal.pone.0067043.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

mRNA ακολουθίες με μερική αγώνες για να shRPS27L. shRPS27L ήταν η παρεμβολή RNA να γκρεμίζω έκφραση RPS27L. Κάθε κουκίδα σήμαινε το πανομοιότυπο νουκλεοτίδιο με την ακολουθία των shRPS27L. υποδείχθηκαν σειρές ταιριάζουν ακολουθιών σε κάθε cDNA. Ριβοσωμική πρωτεΐνη S27-όπως (RPS27L): NM_015920? Klotho: NM_004795? archaelysin οικογένεια μεταλλοπεπτιδάση 1 (AMZ1):. NM_133463

doi: 10.1371 /journal.pone.0067043.s003

(ΔΕΘ)

Μέθοδοι S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0067043.s004

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Drs. Jen-Κου Lin και Shih-Ching Chang (και τα δύο από το Τμήμα Χειρουργικής, Ταϊπέι-Γενικού Νοσοκομείου Βετεράνων), οι οποίοι μας ενημέρωσαν τα κλινικά δεδομένα από ορισμένους ασθενείς και ο Δρ Yih-Yiing Wu για την ανώτερη υποστήριξη του στην παθολογία. Ευχαριστούμε επίσης τον Εθνικό RNAi Πυρήνας Διευκόλυνση στο Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας /Genomic Research Center, Academia Sinica να παρέχει αντιδραστήρια RNAi που υποστηρίζεται από το Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για Γονιδιωματική Ιατρική Επιχορηγήσεις της NSC (NSC 97-3112-B-001-016) .