Αφηρημένο

Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, αυξανόμενες αποδείξεις έχει ενοχοποιηθεί για τον ιό JC ιό της ανθρώπινης neurotropic στο παθολογία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί της ογκογένεσης ιού μεσολάβηση JC εξακολουθούν να μην προσδιορίζονται πλήρως. Ένας υποψήφιος να μεσολαβήσει αυτά τα αποτελέσματα είναι η ιογενής πρώιμη μεταγραφική προϊόν Τ-αντιγόνου, η οποία έχει την ικανότητα να αδρανοποιήσουν ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, όπως το ρ53. Σε μυελοβλαστώματα, Τ-αντιγόνο έχει αποδειχθεί ότι δεσμεύουν την πρωτεΐνη Wnt μονοπάτι σηματοδότησης β-κατενίνης? Ωστόσο, τα αποτελέσματα αυτής της αλληλεπίδρασης στις ρυθμιστικές πρωτεΐνες κατάντη του κυτταρικού κύκλου παραμένουν άγνωστα. Υπό το φως αυτών των παρατηρήσεων, ερευνήσαμε τη σύνδεση των Τ-Αντιγόνου και της πυρηνικής β-κατενίνης σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και τα αποτελέσματα αυτού του συγκροτήματος στην ενεργοποίηση της μεταγραφής και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστές c-Myc και κυκλίνης D1

in vitro

. Η γονιδιακή ενίσχυση κατέδειξε την παρουσία ιικών αλληλουχιών σε 82,4% των περιπτώσεων και ανιχνεύσαμε έκφραση του Τ-αντιγόνου σε 64,6% των περιπτώσεων με ανοσοϊστοχημεία. Περαιτέρω, βρήκαμε ότι Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης συν-εντοπίζεται στους πυρήνες των κυττάρων του όγκου και επιβεβαιώσαμε τη φυσική σύνδεση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών

in vitro

. Η πυρηνική παρουσία Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική ενίσχυση της δραστικότητας TCF-εξαρτώμενη προαγωγό και ενεργοποίηση των κατάντη στόχων β-κατενίνης, c-Myc και Κυκλίνη D1. Οι παρατηρήσεις αυτές παρέχουν περαιτέρω απόδειξη για ένα ρόλο του ιού JC Τ-αντιγόνο στην απορύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt και στην παθογένεια του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Ripple MJ, Parker Struckhoff Α, Trillo-Tinoco J, Li L, Margolin DA, McGoey R, et al. (2014) Η ενεργοποίηση του c-myc και Κυκλίνη D1 με JCV Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης σε καρκίνο παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e106257. doi: 10.1371 /journal.pone.0106257

Επιμέλεια: Shao-Ιούνιος Tang, Πανεπιστήμιο του Τέξας Ιατρικού Κλάδου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2014? Αποδεκτές: 30 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 17, Σεπτέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Ripple et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό ήταν δυνατό χάρη στη χορήγηση P20 RR021970 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, με LDV. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας σε όλο τον κόσμο παρά τις προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία. Είναι κατατάσσεται στην τρίτη θέση στη συνολική συχνότητα εμφάνισης καρκίνου και είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, όπου υπολογίζεται ότι υπάρχουν 140.000 νέες περιπτώσεις και 50.000 CRC που σχετίζονται με θανάτους κάθε χρόνο [1]. Ο κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου σποραδικές στο γενικό πληθυσμό είναι 5%, αλλά αυτό επίπτωση αυξάνει με την ηλικία λόγω της συσσώρευσης των γενετικών και επιγενετικών αλλαγών [2]. Μερικές από αυτές τις μεταβολές μπορεί να προκληθεί από περιβαλλοντικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των ιών, τα οποία έχουν εμπλακεί σε αρκετές άλλες μορφές καρκίνου. Αρκετές ανεξάρτητες μελέτες απέδειξαν ότι περίπου το 20% όλων των καρκίνων που προκαλούνται από μολυσματικούς παράγοντες [3], [4]. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η ανθρώπινη νευροτρόπο ιό JC (ιού JC), ένα μέλος του

Polyomaviridiae

οικογένειας, η οποία περιλαμβάνει επίσης SV-40, ο ιός ΒΚ (BKV) και η ανακαλύφθηκαν πρόσφατα Μέρκελ κυττάρων polyomavirus (MCPyV), διαπιστώθηκε να ενσωματωθούν κλωνικά σε ένα υψηλό ποσοστό των καρκινωμάτων Merkel. Ιού JC έχει καθιερωθεί ως ο αιτιολογικός παράγοντας της Προοδευτικής πολυεστιακή λευκοεγκεφαλοπάθεια (PML), μια απομυελινωτική νόσος που επηρεάζει ασθενείς με HIV [5], και πιο πρόσφατα σε ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με ανοσοτροποποιητικά [6]. Κατά την τελευταία δεκαετία, αρκετά εργαστήρια έχουν αποδείξει ότι JCV σχετίζεται με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του εγκεφάλου [7], [8], τον καρκίνο του πνεύμονα [9], και κακοήθειες του άνω και κάτω πεπτικού συστήματος [10] – [12 ].

ιού JC είναι ένα πανταχού παρόν ιός που μολύνει ένα μεγάλο ποσοστό του γενικού πληθυσμού. Σύμφωνα με τον ορο-επιδημιολογικών μελετών, πρωτογενή μόλυνση με ιού JC εμφανίζεται στην πρώιμη παιδική ηλικία και πάνω από 70-90% των ενήλικων ατόμων είναι θετικοί για αντισώματα κατά του ιού JC [13], [14]. Παρά το γεγονός ότι πρωτογενής μόλυνση είναι ασυμπτωματική, η προτεινόμενη οδός μετάδοσης είναι μέσω της αναπνευστικής οδού, μετά την οποία JCV καθιερώνει μια λανθάνουσα μόλυνση στο νεφρό. Σε περίπου 30% των υγιών οροθετικών ατόμων, JCV αποβάλλεται με τα ούρα, υπό κανονικές συνθήκες [15], [16]. Ως αποτέλεσμα, έχουν ανέπαφα σωματίδια ιού JC έχει απομονωθεί από δείγματα πρώτων αστικών λυμάτων από όλο τον κόσμο [17], [18], η οποία μαζί με το εύρημα του ιικού DNA σε επιθηλιακά κύτταρα από το ανώτερο και κατώτερο πεπτικό σύστημα [19], προτείνει ένα επιπλέον σημείο εισόδου του ιού μέσω του γαστρεντερικού σωλήνα, μέσω της έκθεσης σε μολυσμένο νερό ή τρόφιμα. Είναι σημαντικό, Bofill-Mas,

et al

έδειξε ότι ιικά σωματίδια που απομονώνονται από λύματα παρέμεινε άθικτο μετά τη θεραπεία σε pH 1 για 30 λεπτά, υποδεικνύοντας ότι η κατάποση μολυσμένου νερού ή τροφίμων μπορεί να είναι επαρκής για τη μόλυνση ιού JC του γαστρεντερικό σωλήνα [20]. Πολλές μελέτες, εφόσον, έχουν αποδείξει την παρουσία των γονιδιωματικών αλληλουχιών του ιού JC και την έκφραση των Τ-αντιγόνου σε ιστούς από γαστρεντερικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του οισοφάγου [11], γαστρικό καρκίνωμα [12], [21], [22], σποραδικές αδενωματώδεις πολύποδες [ ,,,0],23], και του παχέος αδενοκαρκινώματα [10], [24] – [30]

το γονιδίωμα του ιού JC είναι περίπου 5,2 kb σε μέγεθος και μπορεί να χωριστεί σε τρεις περιοχές:. η πρώιμη ιική γονιδιωματική περιοχή (EVGR), η καθυστερημένη ιική γονιδιωματική περιοχή (LVGR), και η περιοχή μη-κωδικοποίησης ελέγχου (NCCR), το οποίο περιέχει την αρχή της αντιγραφής, και βρίσκεται ανάμεσα πρώιμη και όψιμη γονιδιωματικές περιοχές. Η EVGR κωδικοποιεί ένα ισχυρό ογκογόνο πρωτεΐνη, μεγάλο Τ-αντιγόνο, ενώ το LVGR κωδικοποιεί τις ιικές πρωτεΐνες καψιδίου VP1, νΡ2 και VP3, καθώς και η αγκνοπρωτεϊνη, ένα μικρό εξάρτημα προϊόν [31]. Το τρέχον μοντέλο της ιού JC μεσολάβηση ογκογένεση περιλαμβάνει την ενσωμάτωση των τμημάτων του γονιδιώματος του ιού JC, ιδιαίτερα του γονιδίου Τ-αντιγόνου, η οποία προτείνεται να αυξήσει τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου λόγω της μετέπειτα έκφραση του Τ-αντιγόνου. Προς υποστήριξη αυτού του μοντέλου, Θεοδωρόπουλος

κ.ά.

έδειξε ότι το ιικό φορτίο του ιού JC ήταν 10- έως 50- φορές υψηλότερη σε αδενώματα του κόλον και αδενοκαρκινωμάτων σε σύγκριση με συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό [32]. Επιπλέον, Coelho

et al

πρόσφατα απέδειξαν ότι CRC ιστός έχει μια σημαντικά υψηλότερη σχετική συχνότητα του ιού JC αλληλουχίες γονιδιώματος από το γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο και μακρινό φυσιολογικό βλεννογόνο [33].

Οι μετατρέποντας τις ικανότητές του ιού JC Τ -Antigen

in vitro

είναι πασίγνωστες [34].

In vivo

Τ-αντιγόνου προκαλεί μια ποικιλία Κεντρικό Νευρικό Σύστημα όγκων όταν εγχέεται στον εγκέφαλο των τρωκτικών και πρωτευόντων πλην του ανθρώπου, που κυμαίνονται από μυελοβλαστώματα νευρογλοία όγκους [35] – [37]. Διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν JCV Τ-αντιγόνο από το NCCR αναπτύξουν όγκους νευροεξωδερμικής προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων μυελοβλαστώματα, νευρογλοιακά όγκους και κακοήθεις όγκους περιφερικών νεύρων θηκάρι [38] – [40]. Αυτή η διαδικασία μετασχηματισμού λαμβάνει χώρα μέσω της αλληλεπίδρασης του Τ-αντιγόνου με κλειδί ρυθμιστικές πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου, περιλαμβανομένων των ρ53, Rb, και το κεντρικό μόριο σηματοδότησης στο μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, β-κατενίνης [41] – [43].

β-κατενίνης είναι συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [44], [45]. Τα επίπεδα της β-κατενίνης ελέγχονται αυστηρά από περίπλοκες καταστροφή του, που αποτελείται από τις πρωτεΐνες APC, Axin, GSK3, και CK1, που σηματοδοτούν για ουβικουϊτινίωση. Μεταλλάξεις στα συστατικά του συμπλόκου καταστροφή μπορεί να οδηγήσει σε παρεκκλίνουσα πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης, μια καθιερωμένη μηχανισμός της καρκινογένεσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [44], [46], η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση του Wnt γονιδίων στόχων μονοπάτι ελλείψει σηματοδότηση Wnt και οδηγεί σε ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό [2]. Ενώ η οδός Wnt ενεργοποιείται από γενετικές μεταλλάξεις σε πάνω από 90% των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου [47], η έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης ανιχνεύεται μόνο σε περίπου 50% των περιπτώσεων [48], υποδηλώνοντας ότι υπάρχουν πρόσθετοι παράγοντες που συμβάλλουν στην πυρηνική εντοπισμός της β-κατενίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Έχει αποδειχθεί ότι JCV Τ-αντιγόνου έχει την ικανότητα να δεσμεύει β-κατενίνης μέσω μιας αλληλεπίδρασης με το Ο-άκρο του β-κατενίνης [41], και ότι τα Τ-αντιγόνου μπορεί να σταθεροποιήσει β-κατενίνης σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος [49]. Επιπλέον, Τ-αντιγόνο έχει μια κλασική σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS) και εκφράζεται ισχυρά κυρίως στους πυρήνες των νεοπλασματικών κυττάρων [10], [42], [50]. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση της κατά του ιού JC Τ-αντιγόνου στην πυρηνικό εντοπισμό του β-κατενίνης και το ρόλο αυτού του συμπλόκου στην ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης ως μηχανισμός για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

στην παρούσα μελέτη, μετράμε την επικράτηση των γονιδιωματικών αλληλουχιών Τ-αντιγόνου και η έκφραση πρωτεΐνης σε ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του κόλου χρησιμοποιώντας μια συλλογή από καλά χαρακτηρισμένα δείγματα βιοψίας. Σημαντικά, δείχνουμε μια ένωση του Τ-αντιγόνου και της πυρηνικής β-κατενίνης σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και περίτεχνο αυτή την ένωση με διασάφηση των μοριακών αποτελέσματα αυτής της αλληλεπίδρασης στην απορύθμιση του καταρράκτη σηματοδότησης Wnt και την ενεργοποίηση των στόχων β-κατενίνης χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

Ένα σύνολο 113 απο-προσδιορίζονται εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και προ-νεοπλασματικών πολύποδες συλλέχθηκαν από τα αρχεία παθολογία των παρακάτω ιδρυμάτων: LSUHSC-Νέα Ορλεάνη (34 δείγματα) και η Ochsner Κλινική (79 δείγματα). Οι όγκοι ήταν ιστολογικά ταξινομούνται και ανοσοϊστοχημικά χαρακτηρίζεται σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ όγκοι του γαστρεντερικού σωλήνα.

DNA Εξαγωγή και Ανάλυση

Ένα ειδικό μικροτόμου χρησιμοποιήθηκε για την ενότητα των μπλοκ παραφίνης, προκειμένου να αποφεύγεται η μόλυνση. Επιπλέον, το μπλοκ και υποδοχέα λεπίδας περιοδικά αυτόκαυστο, και μια νέα, μίας χρήσης λεπίδα χρησιμοποιήθηκε για κάθε δείγμα. DNA εκχυλίστηκε από περίπου 10 τομές 10 μm σε πάχος από καθένα από τα δείγματα ιστού με τη χρήση του QIAamp Kit ιστών, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen). PCR ενίσχυση του γονιδίου Τ-αντιγόνου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας PEP1 και πεπ2 εκκινητές (νουκλεοτίδια 4.255 – 4.272 και 4.408 με 4.427, αντίστοιχα), οι οποίες ενισχύουν τις αλληλουχίες στην Ν-τερματική περιοχή του ιού JC Τ-αντιγόνο (αλληλουχία PEP1: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC? ακολουθία πεπ2 : AGGTGCCAACCTATGGAACA). Για την ενίσχυση της Περιφέρειας Ελέγχου (CR), χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές NCRR1 και NCRR2, που αντιστοιχεί στα νουκλεοτίδια 4993-5004 και 258-279, αντίστοιχα (ακολουθία NCRR1: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG? NCRR2 ακολουθία: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε επί 250 ng εκμαγείου DNA με το σύστημα FailSafe PCR (Epicentre) σε συνολικό όγκο 25 μΙ. PCR διεξήχθη στις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 s, ανόπτηση στους 62 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s. Ως ένα βήμα τερματισμού, ο χρόνος επέκτασης του τελευταίου κύκλου αυξήθηκε σε 7 λεπτά. Δείγματα ενισχύθηκαν με την απουσία του πρότυπου DNA χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, ενώ το DNA που εξάγεται από Τ-αντιγόνο κυττάρων θετικών BSB8 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για κάθε διαδικασία. κηλίδας Southern πραγματοποιήθηκε με την επίλυση των 10 μΐ κάθε PCR αντίδρασης σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2%. Το πήκτωμα ακολούθως υφίσταται κατεργασία επί 15 λεπτά το καθένα με 0,2 Μ HCl για αποπουρίνωση, 1,5 Μ NaCl /0,5 Μ NaOH για μετουσίωση, και 1,5 Μ NaCl /0,5 Μ Tris-HCl (ρΗ 7.4) για εξουδετέρωση, ακολουθούμενη από μεταφορά των τεμαχίων ενισχυμένου από την πηκτή σε μεμβράνες νάϋλον (Ηγ & οηά-Ν? Amersham). Οι μεμβράνες στη συνέχεια προ-υβριδοποιήθηκαν για 1 ώρα σε διάλυμα EasyHyb (Roche), που ακολουθείται από υβριδισμό στο ίδιο διάλυμα που περιέχει 2 μg DIG-επισημασμένο ολιγονουκλεοτίδιο ειδικό για JCV Τ-αντιγόνο (νουκλεοτίδια 4304 έως 4.405) για μια νύχτα. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση της DIG σημασμένο ανιχνευτή είναι PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) και PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). Για τον ανιχνευτή CR χρησιμοποιήσαμε πριμοδότες από τα νουκλεοτίδια 62 – 81. Οι ανιχνευτές συντέθηκαν με τη χρήση του DIG DNA Labeling και Detection Kit (Roche). Οι μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα, πλύθηκαν και αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το DIG Wash και Block Buffer Set ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (Roche).

αλληλουχίας DNA της περιοχής ελέγχου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 3730x /αναλυτή DNA. Για την ενίσχυση του DNA από το γονίδιο καθαριότητας, GAPDH, χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω εκκινητές:.

5 ‘TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3’ και 3 ‘GTA CAT GGT ΑΤΤ CAC CAC CC 5’

Ιστολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

εγκλεισμένα σε παραφίνη ιστός προηγουμένως σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη ήταν χωρισμένο σε πάχος 4-μm και τοποθετήθηκαν σε φορτισμένη διαφάνειες. Οι τομές τοποθετήθηκαν σε έναν κλίβανο στους 65 ° C για να λιώσει το παραφίνη και έπειτα αποπαραφινοποιήθηκαν σε τρεις αλλαγές ξυλολίου για 30 λεπτά το καθένα. Οι τομές στη συνέχεια επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης σειράς αλκοολών μέχρι νερό, και μη-ενζυματική ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη σε 0,01 Μ κιτρικό νάτριο (ρΗ 6.0) στους 97 ° C σε φούρνο κενού για 35 λεπτά. Μετά από μια περίοδο ψύξης 25 λεπτών, οι τομές ξεπλύθηκαν με PBS, και ενδογενούς υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με επώαση των αντικειμενοφόρων πλακών σε μεθανόλη /3% Η

2O

2 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές μπλοκαριστεί σε 2% ορό αλόγου και επωάστηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα υγροποιημένο θάλαμο. Αντισώματα που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ιικών πρωτεϊνών περιελάμβανε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού έναντι SV40 μεγάλου Τ-αντιγόνου που αντιδρά εγκάρσια με JCV Τ-Αντιγόνου (κλώνος pAb416, 1:100 αραίωση? Calbiochem) και ενός μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού αντι-β-κατενίνης (κλώνος Ε -5, 1:100 αραίωση? Santa Cruz Biotechnology). Μετά από ξέπλυμα τα τμήματα σε PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού και στην συνέχεια ξεπλύθηκαν σε PBS. Ο ιστός ακολούθως επωάστηκε με σύμπλοκα αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Vector Laboratories) και τέλος, οι τομές αναπτύχθηκαν με υπόστρωμα 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Sigma), αντίθετα με αιματοξυλίνη, και καλύφθηκαν με Permount (Fisher). Για να εκτιμηθεί το κλάσμα ανοσοσημασμένων κυττάρων σε δείγματα από κάθε περίπτωση ασθενή, ο δείκτης σήμανσης ορίζεται ως το ποσοστό των θετικών κυττάρων του συνολικού αριθμού των κυττάρων του όγκου μετρήθηκαν προσδιορίστηκε.

Διπλή σήμανση ανοσοφθορισμού

Για ανοσοφθορισμό και διπλή επισήμανση των εγκλεισμένων σε παραφίνη τομές, αποπαραφίνωση, ανάκτηση αντιγόνου, ενδογενής υπεροξειδάση βαφής και αποκλεισμού διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Για ανοσοφθορισμού διπλή επισήμανση των κυττάρων HCT116 σε καλλιέργεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη, και μπλοκαρίστηκαν σε PBS που περιέχει 5% ορό αλόγου και 0,1% BSA για 2 ώρες. Τμήματα ή κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-Τ-αντιγόνου αντισώματος (κλώνος pAb416, 1:100 αραίωσης, Oncogene Science) και αντίσωμα αντι-β-κατενίνης κουνελιού (κλώνος D13A1, 1:100 αραίωση Cell Signaling) για 16 ώρες που ακολουθείται από πλύσιμο σε PBS και επώαση σε αντι-ποντικού Rhodamine αντίσωμα και αντι-κουνελιού αντίσωμα φθορεσκεΐνη (1:200 αραίωση? Vector Laboratories). Τέλος, τα τμήματα πλύθηκαν σε PBS και τοποθετήθηκαν σε υδατικά μέσα στερέωσης με DAPI (Vector Laboratories), και οπτικοποιήθηκε σε ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Olympus FV1000).

παροδική επιμόλυνση και λουσιφεράσης κατασκευάζει

κύτταρα HCT116 ευγενικά από τον Dr. Χαμίντ Boulares. Τα κύτταρα επιμολύνονται χρησιμοποιώντας Xtreme Gene-HP (Roche). Οι ακόλουθες κατασκευές χρησιμοποιήθηκαν για προσδιορισμούς λουσιφεράσης: M72 Σούπερ 16x TOPflash κατασκεύασμα ανταποκριτή: Addgene πλασμίδιο 17.165? M51 Σούπερ 8x FOPflash: πλασμίδιο Addgene 12457? c-Myc υποστηρικτής: Addgene πλασμίδιο 16595? Η κυκλίνη D1 υποκινητή: Addgene πλασμίδιο 32727. Αυτά τα κατασκευάσματα αναφοράς επιμολύνθηκαν μόνο του ή μαζί με pcDNA-Τ-αντιγόνου και /ή ροϋΝΑ-β-κατενίνης και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ένα σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega) στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση.

πρωτεΐνη Extraction, συνανοσοκαθίζησης και Ανάλυση

κυτταροπλασματικά και πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων πυρηνικής από κύτταρα HCT116 συλλέχθηκαν με τη χρήση κυτταροπλασματικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και ρυθμιστικό πυρηνικής λύσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [51]. Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, σφαιροποιήθηκαν στα 2000 g για 5 λεπτά, και επανα-εναιωρήθηκαν σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης κυτταροπλασματική επί 10 λεπτά επί πάγου. Μετά την λύση της κυτταρικής μεμβράνης, οι πυρήνες υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 14,000 g για 10 λεπτά. Οι πυρήνες πλύθηκαν μία φορά σε κυτταροπλασματικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, σφαιροποιήθηκαν και λύθηκαν σε 250 μΙ ρυθμιστικού λύσης πυρηνικό για 20 λεπτά στους 4 ° C με ανακίνηση. 500 μg ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος επωάσθηκε με 10 μg αντι-Τ-αντιγόνου ή αντισώματος αντι-β-κατενίνης επί μία νύκτα στους 4 ° C με ανακίνηση. σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος στη συνέχεια ανοσοκαταβυθίστηκαν με /G μαγνητικά σφαιρίδια Πρωτεΐνης Α (Pierce), πλύθηκε σε ρυθμιστικό HNTG (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 0,1% Triton Χ-100), μετουσιωμένη και αναλύθηκαν με SDS-PAGE .

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις οδηγίες Institutional Review Board Louisiana State University και έγκριση. Όλα τα 113 ενσωματωμένες σε παραφίνη δείγματα ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινώματος και προ-νεοπλασματικών πολύποδες, που συλλέχθηκαν από τα αρχεία παθολογία του LSUHSC Νέα Ορλεάνη (34 δείγματα) και την Ochsner Κλινική (79 δείγματα). Το Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Λουιζιάνας Διοικητικό Institutional Review (IRB) παραιτήθηκε από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση, όπως τα δείγματα είναι αρχειακές, de-εντοπίστηκαν και ακολουθούν κάτω από τις οδηγίες του ΝΙΗ για την απαλλαγή των ιστών που θα απορρίπτονται και δεν μπορούν να αναχθούν σε ασθενείς (IRB πρωτόκολλο # 8077).

Αποτελέσματα

Η έκφραση του Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου

Η πρώιμη μεταγραφική προϊόν του ιού JC, Τ-αντιγόνου, είναι μια καλά ονομαστές ισχυρός ογκογόνο πρωτεΐνη, η οποία έχει ανιχνευθεί σε μία ποικιλία όγκων. Προκειμένου να διαπιστωθεί η παρουσία του ιού JC Τ-αντιγόνου, εκτελέσαμε πειράματα ανοσοϊστοχημική σε ένα σύνολο 113 φορμόλη-σταθερό, ενσωματωμένα σε παραφίνη περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου από 2 της Νέας Ορλεάνης μεγαλύτερα ιατρικά ιδρύματα. Η πλειονότητα αυτών των δειγμάτων περιείχαν φυσιολογικό βλεννογόνο, προ-νεοπλασματικών πολύποδες και οι δύο

in situ

και διηθητικό καρκίνωμα. Βρήκαμε έκφραση του Τ-αντιγόνου με ανοσοϊστοχημεία στους πυρήνες των κυττάρων του όγκου σε 73 από τα δείγματα (64,6%). Είναι ενδιαφέρον ότι, Τ-αντιγόνου ήταν επίσης παρούσα στους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων από προ-νεοπλασματικές πολύποδες, αλλά εντελώς απούσα στο κανονικό κολονικό επιθήλιο (σχήμα 1, αριστερά πάνελ).

Η ανοσοϊστοχημεία σε περιοχές της κανονικής κολονικό επιθήλιο είναι αρνητικό για Τ-αντιγόνου, ενώ β-κατενίνης εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη (Πίνακες και Β). έκφραση Τ-αντιγόνου βρέθηκε στους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων σε πολύποδες και νεοπλασματικών κυττάρων σε περιοχές του διηθητικού όγκου (Πάνελ C και Ε, αντίστοιχα). Διαδοχική τμήματα των ίδιων περιπτώσεις δείχνουν ότι β-κατενίνης είναι τώρα βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και πυρήνες των επιθηλιακών και κυττάρων όγκου (Πάνελ D και F αντίστοιχα). Σε Τ-αντιγόνου αρνητικών περιπτώσεων ωστόσο, β-κατενίνη παραμένει στο κυτταρόπλασμα (Πάνελ G και Η). Η στατιστική ανάλυση αποκαλύπτει ότι 67,6% των Τ-Αντιγόνου περιπτώσεις θετικού καρκίνου του παχέος εντέρου εκφράζουν πυρηνικής β-κατενίνης, ενώ μόνο το 40,4% των Τ-αντιγόνου αρνητικών περιπτώσεων εκφράζουν πυρηνικής β-κατενίνης (G? P = 0,006) (Πίνακας Ι). Το σχετικό ποσοστό των πυρήνων θετικά για β-κατενίνης σε ένα τμήμα βαθμολογήθηκε σε μια κλίμακα από 0-4. Τ-αντιγόνου θετικών περιπτώσεων παρουσίασαν σημαντικά περισσότερους πυρήνες θετικά για β-κατενίνης από Τ-Αντιγόνου αρνητικά δείγματα (F? * Ρ & lt? 0,05) (Πίνακας Ι). Διπλό ανοσοφθορισμού επισήμανση καταδεικνύει την συν-εντοπισμό των Τ-αντιγόνο (ροδαμίνη) και β-κατενίνης (φθορεσκεΐνη) στους πυρήνες των νεοπλασματικών κυττάρων σε μια τσέπη των νεοπλασματικών κυττάρων κάτω από ένα φόδρα επιθηλιακά αρνητικών κυττάρων Τ-αντιγόνου, στην οποία β-κατενίνης παραμένει cytoplamic (Πίνακας Κ). Πρωτότυπη μεγέθυνση όλων των πινάκων ανοσοϊστοχημεία είναι 600x, και ανοσοφθορισμός είναι 1000x.

Η

Προηγουμένως, δείξαμε ότι σε μυελοβλαστώματα, Τ-αντιγόνο είναι ικανό σωματικά δεσμεύουν και μετατοπίζουν β-κατενίνης, το κεντρικό μόριο του η οδός σηματοδότηση Wnt, εντός του πυρήνα [45], [52]. Για να καθοριστεί εάν β-κατενίνης είναι παρούσα και συνδέονται με Τ-Αντιγόνου σε καρκίνο του παχέος εντέρου, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημεία στα ίδια 113 δείγματα και ανέλυσε την έκφραση της πυρηνικής β-κατενίνης σε Τ-αντιγόνου θετικών και αρνητικών ομάδων. Βρήκαμε ότι το σύνολο των Τ-Αντιγόνου δείγματα 71 θετικό καρκίνο του παχέος εντέρου, 48 έδειξαν πυρηνική έκφραση του β-κατενίνης (67,6%), ενώ μόνο το 17/42 (40,5%) των Τ-αντιγόνου αρνητικά δείγματα ήταν θετικά για την πυρηνική β-κατενίνης (p≤0.005, Εικόνα 1Ι). Σε όλες τις περιπτώσεις αρνητικός Τ-αντιγόνου, β-κατενίνης παρέμειναν στο κυτταρόπλασμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι ίδιες παρατηρήσεις ήταν παρόντες στα πολύποδες, όπου η πυρηνική β-κατενίνης συσχετίζεται με την έκφραση Τ-αντιγόνου. Στην κανονική βλεννογόνο, β-κατενίνης παρέμειναν εντοπισμένη στο συνήθη θέση του στο κυτταρόπλασμα και μεμβράνη. β-κατενίνης πυρηνικών θετικά κύτταρα βαθμολογήθηκαν σε μια κλίμακα από 0-4, με μια βαθμολογία από το 0 δείχνει ότι περίπου 5% ή λιγότερα κύτταρα και μία βαθμολογία 4 δείχνει -75% ή περισσότερο των κυττάρων με πυρηνική β-κατενίνης. Τ-Αντιγόνου θετικά δείγματα είχαν μέσος όρος των 1.463 (SD 1.164) για την πυρηνική β-κατενίνης, ενώ Τ-Αντιγόνου αρνητικά δείγματα είχαν μέση βαθμολογία των 0,8182 (SD 0,9580? P ≤ 0,05, Σχήμα 1J).

Τέλος, εκτελέσαμε διπλό ανοσοφθορισμό επισήμανση σε ένα θετικό περίπτωση που περιείχε τις τρεις περιοχές (φυσιολογικό κόλον, πολύποδας και καρκίνος) και διαπίστωσε ότι στην φυσιολογικό κόλον, όπου Τ-αντιγόνου είναι αρνητική, β-κατενίνης εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα? Ωστόσο, σε πολύποδες και νεοπλασματικών κυττάρων, τα οποία εκφράζουν Τ-αντιγόνου, β-κατενίνη είναι συν-εντόπιση με το JCV ογκοπρωτεΐνη στον πυρηνικό διαμέρισμα. Σχήμα 1, Πάνελ K δείχνει μια περιοχή που περιέχει φυσιολογικό επιθήλιο στην κορυφή, χωρίς καμία έκφραση του Τ-αντιγόνου και κυτταροπλασματική β-κατενίνης, ενώ ένα υποκείμενο τσέπη των νεοπλασματικών κυττάρων τα οποία σθεναρά εκφράζουν Τ-αντιγόνου δείχνουν την πυρηνική συν-εντοπισμό της β κατενίνης.

Ανίχνευση του ιού JC Τ-αντιγόνου γονιδιωματικές αλληλουχίες σε ορθοκολικό καρκίνο δείγματα

Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του γονιδίου Τ-αντιγόνου, εκτελέσαμε PCR ενίσχυση ακολουθούμενη από στύπωμα Southern χρησιμοποιώντας ένα άκρως ειδικές και ευαίσθητες ανιχνευτής για JCV Τ-αντιγόνου σε ένα επιλεγμένο αριθμό 34 περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου που περιείχαν υψηλής ποιότητας DNA. Μία σχηματική αναπαράσταση του γονιδιώματος του ιού JC έχει δειχθεί, περιέχει τη θέση των εκκινητών για ενίσχυση Southern blot και σύνθεση ανιχνευτή (Εικόνα 2Α). Η περιοχή αναγνώρισης ανιχνευτή στο γονιδίωμα του ιού JC (4.304 έως 4.405 ζεύγη βάσεων) είναι εξαιρετικά μεταβλητή μεταξύ του ιού JC, BKV, και SV40, με 20 αναντιστοιχίες νουκλεοτιδίων μεταξύ του ιού JC και ΒΚ ιού, και 33 αναντιστοιχίες νουκλεοτιδίων μεταξύ του ιού JC και SV40 στην εν λόγω περιοχή. Ενώ οι PEP1 και πεπ2 εναύσματα ενισχύουν τόσο JCV και ΒΚν Τ-Αντιγόνου ανιχνευτή μας αναγνωρίζοντας την περιοχή μεταξύ του PEP1 και εκκινητές πεπ2 είναι εξαιρετικά ειδικό για JCV και δεν δεσμεύεται με ΒΚΥ ή SV40 [53].

Ένα σχηματικό αναπαράσταση του Mad-1 στέλεχος της γονιδιωματικής δομής του ιού JC δείχνει ιικά γονίδια σε κόκκινο, πρώιμο και όψιμο μεταγραφές σε γκρι, και οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση Τ-αντιγόνο (PEP1 και πεπ2) και σύνθεσης Southern ανιχνευτή κηλίδος (PEP INT1 και PEP INT2) (Πίνακας Α). Γονιδιωματικές αλληλουχίες του ιικού πρώιμης περιοχής, η οποία κωδικοποιεί Τ-αντιγόνου, ανιχνεύθηκαν σε 28 από 34 επιλεγμένων δειγμάτων. Ένας εκπρόσωπος της κατά Southern παρουσιάζεται, με αριθμούς περίπτωση πάνω από κάθε λωρίδα. Αρνητικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν οι ίδιες υποθέσεις ελέγχθηκαν με ανιχνευτές για BKV και SV40. Αρνητικοί έλεγχοι δείχνουν τα αποτελέσματα από αντιδράσεις που δεν περιέχουν DNA και τον θετικό μάρτυρα αντιπροσωπεύει ενίσχυση γονιδίου χρησιμοποιώντας pBJC, ένα πλασμίδιο που περιέχει DNA του ιού JC ως πρότυπο ή πλασμίδια που περιέχουν ΒΚν και SV40 Τ-αντιγόνα. PCR για GAPDH και ηλεκτροφόρηση αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η παρουσία του ανέπαφου γονιδιωματικού DNA σε όλες τις περιπτώσεις. (Πίνακας Β). Κηλίδες Southern των πλασμιδίων που περιέχουν το Τ-αντιγόνο του ιού JC, ΒΚν και SV40 ελέγχθηκαν με ειδικούς ανιχνευτές για κάθε polyomavirus, αποδεικνύοντας την εξειδίκευση των ανιχνευτών (Πίνακας C). Ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδας Southern του PCR ενίσχυση της ρυθμιστικής περιοχής ελέγχου που εμφανίζεται (Panel Α, αριστερά). Αλληλούχηση αποκάλυψε την παρουσία Mad-1 και Mad-4 στελέχη με μεταλλάξεις σημείου στα διαφορετικά δείγματα. Μια αντιπροσωπευτική αλληλουχία παρουσιάζεται στο μπλε, κάτω από την γνωστή αλληλουχία του Mad-4 CR περιοχή (μαύρο)? Οι σημειακές μεταλλάξεις επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα (Panel Α, δεξιά).

Η

ενισχυμένες γονιδιωματικές αλληλουχίες από την περιοχή κωδικοποίησης Τ-αντιγόνου σε 28 δείγματα των 34 δειγμάτων (82,4%), 21 εκ των οποίων αποδεικνύεται T -Antigen έκφραση της πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία. Σε μόνο έξι περιπτώσεις βρήκαμε την παρουσία του DNA του ιού, αλλά όχι την έκφραση της πρωτεΐνης, και καμία από τις περιπτώσεις είχαν έκφραση Τ-αντιγόνο απουσία ιικών γονιδιωματικών αλληλουχιών. Δοκιμάσαμε τις ενισχυμένες αλληλουχίες με ειδικούς ανιχνευτές για BKV και SV40, με αποτέλεσμα αρνητική σε όλες τις περιπτώσεις. Υψηλής ποιότητας γονιδιωματικό DNA επιβεβαιώθηκε σε κάθε δείγμα με PCR για GAPDH. (Σχήμα 2Β). Τέλος, εξετάσαμε επίσης ανιχνευτές μας με πλασμίδια που περιέχουν Τ-αντιγόνα από ιού JC, BKV ένα SV40, αποδεικνύουν την εξειδίκευση των ανιχνευτών μας, και που υποδηλώνει ότι η ανοσοϊστοχημεία αποκαλύπτει το Τ-αντιγόνο του ιού JC και όχι το ένα από το άλλο ιοί πολυώματος (Σχήμα 2C ).

Στη συνέχεια, εκτελέσαμε πειράματα PCR με εκκινητές και ανιχνευτές ειδικούς για τη ρυθμιστική περιοχή του ιού JC. Εμείς ενισχυμένο ιικές αλληλουχίες σε 14 από τις 34 περιπτώσεις. Το σχήμα 2D δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό κηλίδα Southern που περιέχουν μία από αυτές τις περιπτώσεις, οι οποίες ήταν επίσης θετικό για την περιοχή Τ-αντιγόνου. Αλληλουχίας αυτών των αμπλικονίων αποκάλυψε ότι Mad-1 και Mad-4 ήταν οι δύο ανιχνεύονται λεκέδες του ιού JC. Ωστόσο, όλες αυτές οι αλληλουχίες που περιέχονται επιμέρους μεταλλάξεις σημείου, διαφορετικό από κάθε άλλο, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές είναι πράγματι μοναδική και απορρίπτοντας την πιθανότητα εργαστηριακής μόλυνσης. Μια αντιπροσωπευτική αλληλουχία εμφανίζεται σε μπλε, κάτω από την ακολουθία τεχνογνωσία του Mad 4 στέλεχος του ιού JC σε μαύρο χρώμα. Οι σημειακές μεταλλάξεις επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα (Σχήμα 2D). Επιπλέον, μια λεπτομερής σύνοψη των περιπτώσεων και τα αποτελέσματα της PCR ενίσχυσης και προσδιορισμού αλληλουχίας, καθώς και ανοσοϊστοχημεία παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.

Η

T-αντιγόνου και β-κατενίνης συν-εντοπίζονται στον πυρήνα στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα και συν-ανοσοκαθιζάνουν

in vitro

η

Προηγούμενες μελέτες προτείνουν ότι Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης αλληλεπιδρούν αλλάζοντας άμεσα την κανονική κυτταροπλασματική υποκυτταρικός εντοπισμός της β-κατενίνης. Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα ευρήματα

in vitro

και να καθορίσει εάν Τ-αντιγόνου και β-κατενίνη είναι παρόντα στο ίδιο κυτταρικό διαμέρισμα σε καρκινικά κύτταρα κόλου, πραγματοποιήσαμε διπλή ανοσοφθορισμό επισήμανσης για αυτές τις δύο πρωτεΐνες στο κόλον HCT116 καρκινική κυτταρική σειρά παροδικά επιμολυσμένα με Τ-αντιγόνου. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν το ογκοπρωτεΐνη δείχνουν μία ισχυρή πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης (Σχήμα 3D-E, βέλη), ενώ σε κύτταρα που δεν παίρνουν επιμολυσμένα και δεν εκφράζουν Τ-αντιγόνου, β-κατενίνη παραμένει στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 3D-E, αιχμές βελών).

Διπλή ανοσοκυτταροχημεία επισήμανσης για β-κατενίνης (Panel Β, φλουορεσκεΐνη), και Τ-αντιγόνο (πάνελ C, ροδαμίνη), που εκτελούνται σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου HTC116 παροδικά επιμολυσμένα με Τ-αντιγόνου δείχνουν την συν-εντοπισμό και των δύο πρωτεϊνών στους πυρήνες της πλειονότητας των κυττάρων (πίνακας Ε, βέλη), ενώ σε μη επιμολυσμένα κύτταρα στα οποία δεν υπάρχει έκφραση του Τ-αντιγόνου, β-κατενίνης παραμένει αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα (Panel Ε, αιχμές βελών).

η

για να καθορίσει περαιτέρω την υποκυτταρική θέση της φυσικής αλληλεπίδρασης μεταξύ Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης, πραγματοποιήσαμε ένα συν-immunoprecipiation για πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα των κυττάρων HCT116 επιμολυσμένα με ένα Τ-αντιγόνου φορέα έκφρασης ή με κενό φορέα ως έλεγχοι. Πυρηνική και κυτταροπλασματικά προϊόντα λύσης επωάστηκαν με ένα αντίσωμα αντι-Τ-αντιγόνου και τα ανοσοσυμπλέγματα αναλύθηκαν μέσω στυπώματος Western με αντισώματα έναντι Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης. Τ-αντιγόνου ανοσοϊζήματα από τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα δείχνουν συν-καταβύθιση του β-κατενίνης στα δύο διαμερίσματα (Σχήμα 4Α). Επιβεβαιώσαμε αυτήν την αλληλεπίδραση στον αντίστροφο πείραμα (β-κατενίνης IP, Τ-Αντιγόνου Western blot- Σχήμα 4Β). Η εξειδίκευση των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών κλάσματα επιβεβαιώθηκε με ανίχνευση λωρίδων εισόδου για Grb-2 (κυτταροπλασματική) και λαμίνη A /C (πυρηνικά).

HCT116 κύτταρα επιμολυσμένα με Τ-αντιγόνο ή κενό φορέα κλασματοποιήθηκαν να απομονώσουν τα πυρηνικά και κυτταροπλασματική διαμερίσματα και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα έναντι Τ-αντιγόνο (Α) ή β-κατενίνης (Β). Τ-αντιγόνου τραβά κάτω β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα (άνω πάνελ, λωρίδα 6) και στον πυρήνα (άνω πάνελ, λωρίδα 8). Το αντίστροφο πείραμα (ΙΡ β-κατενίνης) επιβεβαιώνει την αλληλεπίδραση μεταξύ Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης στο κυτταρόπλασμα (κάτω πάνελ, λωρίδα 6) και του πυρήνα (κάτω πάνελ, λωρίδα 8).

Η

T -Antigen ενεργοποιεί TCF-εξαρτώμενη μεταγραφή

Μετά την επιβεβαίωση ότι Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης συν-εντοπίσουν και να αλληλεπιδρούν με τον πυρήνα, μελετήσαμε τα αποτελέσματα αυτής της αλληλεπίδρασης στην ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων της β-κατενίνης. Αξιοποιήσαμε το κατασκεύασμα ανταποκριτή TOPflash τη μέτρηση των αλλαγών σε β-κατενίνης /TCF με τη μεσολάβηση της μεταγραφής. Το κατασκεύασμα TOPflash περιέχει 16 στοιχεία που δεσμεύουν TCF (TBE που) που κατευθύνει έκφραση του γονιδίου λουσιφεράσης. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με TOPflash και είτε Τ-αντιγόνου, β-κατενίνης, ή και τα δύο Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης. Η φωταύγεια μετρήθηκε σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όλες οι ομάδες επιμολύνθηκαν ξεχωριστά με FOPflash για τη μέτρηση της βασικής γραμμής φωταύγειας. Τ-αντιγόνου ή β-κατενίνης και μόνο ενεργοποιούνται σημαντικά TOPflash κατά 2 φορές και 5 φορές πάνω από κενό φορέα ελέγχου, αντίστοιχα. Εντυπωσιακά, κύτταρα που εκφράζουν Τ-αντιγόνου και εξωγενή β-κατενίνης έδειξαν 113 φορές αύξηση στη δραστικότητα TOPflash έναντι της βασικής γραμμής (Σχήμα 5Α, p≤0.001). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν την ικανότητα των Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης για να ενεργοποιήσετε συνεργικά τους υποκινητές των γονιδίων στόχων β-κατενίνης. Οι τιμές κανονικοποιούνται προς FOPflash-επιμολυσμένα κύτταρα.

κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με το πλασμίδιο Wnt μονοπάτι ρεπόρτερ TOPflash κατασκευάσει και Τ-αντιγόνου, β-κατενίνης, ή και τα δύο. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με Τ-αντιγόνου ή β-κατενίνης και μόνο αυξημένη δραστηριότητα TOPflash περίπου 2 έως 5 φορές πάνω από την αρχική τιμή. Η συν-επιμόλυνση με τα δύο Τ-αντιγόνου και β-κατενίνης είχε ως αποτέλεσμα 113-πλάσια αύξηση στην δραστικότητα TOPflash. Οι τιμές κανονικοποιούνται σε FOPflash (αρχική τιμή) ομάδες (Πίνακας Α). Για τη μέτρηση της ενεργοποίησης των συγκεκριμένων στόχων β-κατενίνης, παρόμοια πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας λουσιφεράση κατασκευάσματα που περιέχουν την Κυκλίνη D1 (Πίνακας C) υποκινητές c-Myc (Πάνελ Β) ή. Η έκφραση του Τ-αντιγόνου αυξάνει σημαντικά δραστηριότητα υποκινητή c-Myc και Κυκλίνη D1 σε κύτταρα HCT116.