Αφηρημένο

PIK3CA

(φωσφοϊνοσιτιδίου -3-κινάση, καταλυτικό, πολυπεπτίδιο alpha) μεταλλάξεις μπορούν να βοηθήσουν να προβλέψει την αντικαρκινική δραστικότητα του φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /στόχου θηλαστικού αναστολέων μονοπατιού ραπαμυκίνης (mTOR) και στα δύο προκλινικές και κλινικές ρυθμίσεις. Υπό το φως της πρόσφατης ανακάλυψης ογκογενή καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) σε διάφορους τύπους όγκων, έχουμε αναπτύξει μια

in vitro

CSC μοντέλο από όγκους ξενομοσχεύματος εγκατεστημένοι σε ποντίκια από έναν όγκο ασθενή καρκίνο του παχέος εντέρου στο οποίο το CD133 + /EpCAM + πληθυσμού αντιπροσωπεύεται καρκινικά κύτταρα-κίνηση. CD133 + /ΕρΟΑΜ + ΚΕΠ εμπλουτίστηκαν υπό συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας βλαστικών και σχηματίζεται 3-διαστάσεων σφαιροειδή όγκου. κύτταρα σφαιροειδές όγκου παρουσίασαν ιδιότητες CSC, συμπεριλαμβανομένης της δυνατότητας για τη διαφοροποίηση και την αυτο-ανανέωση, υψηλότερη ογκογόνο δυναμικό και χημειο-αντίσταση. Γενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα πίνακα OncoCarta ™ αποκάλυψε ένα

PIK3CA (H1047R)

μετάλλαξη στα κύτταρα αυτά. Χρησιμοποιώντας ένα αναστολέα της διπλής PI3K /mTOR, PF-04691502, μπορούμε στη συνέχεια έδειξαν ότι η παρεμπόδιση του μονοπατιού PI3K /mTOR ανέστειλε την

in vitro

πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ και

in vivo

ανάπτυξη του όγκου ξένου μοσχεύματος με διαχειρίσιμο τοξικότητα. Αναστολή ανάπτυξης όγκου σε ποντικούς συνοδεύτηκε από μία σημαντική μείωση του φωσφορυλιωμένου Akt (ρΑΚΤ) (S473), ένα καθιερωμένο υποκατάστατο βιοδείκτη της ΡΙ3Κ /mTOR αναστολή μονοπάτι σηματοδότησης. Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι PF-04691502 παρουσιάζει ισχυρή αντικαρκινική δράση σε καρκίνο του παχέος εντέρου με τη στόχευση τόσο

PIK3CA (H1047R)

μεταλλαγμένο ΚΕΠ και τα παράγωγά τους. Αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στην κλινική ανάπτυξη του PF-04691502 για τη θεραπεία μιας υποπληθυσμό των ασθενών καρκίνου του παχέος εντέρου με κακή έκβαση

Παράθεση:. Fang DD, Zhang CC, Gu Υ, Jani JP, Cao J, Tsaparikos Κ, et al. (2013) Αντικαρκινική Αποτελεσματικότητα της διπλής PI3K /mTOR αναστολέα PF-04691502 σε ένα ξένο μόσχευμα ανθρωπίνου καρκινώματος Μοντέλο Προέρχεται από τον καρκίνο του παχέος βλαστικά κύτταρα που φέρουν ένα

PIK3CA

μετάλλαξη. PLoS ONE 8 (6): e67258. doi: 10.1371 /journal.pone.0067258

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 23 Δεκ 2012? Αποδεκτές: 13η Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου του 2013

Copyright: © 2013 Fang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. Όλοι οι συγγραφείς είναι είτε νυν ή πρώην υπαλλήλους της Pfizer, το χρηματοδότη της μελέτης αυτής. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνου για τους άνδρες και τις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Περίπου 103.170 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο, με περίπου 51.690 ετήσιων θανάτων [1]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, η οδός ΡΙ3Κ /mTOR συχνά απορρυθμισμένης λόγω μεταλλάξεων στο ρ110α υπομονάδα του

ΡΙ3Κ

. Το μονοπάτι σηματοδότησης ΡΙ3Κ /mTOR είναι ένας ρυθμιστής κλειδί των διαφόρων διαδικασιών κυττάρου, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης, κινητικότητα, τον μεταβολισμό, και αυτοφαγία. Έτσι, η ενεργοποίηση ογκογόνος μονοπάτι έχει γίνει ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για την ανάπτυξη φαρμάκων [2]. Προκλινικές και κλινικές μελέτες δείχνουν ότι το

PIK3CA

μετάλλαξη σε περίπτωση απουσίας του ένα

KRAS

μετάλλαξη είναι μια έξυπνη δείκτης για την ανταπόκριση σε αναστολείς PI3K και mTOR [3] – [6].

Εκτός από την πρόσφατα ξεκίνησε everolimus αναστολέας mTOR, η οποία χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος τύπων καρκίνου, ένας αριθμός μικρών μορίων αναστολέων της ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι σηματοδότησης είναι προς το παρόν σε κλινική ανάπτυξη [7] – [10]. Αυτοί οι παράγοντες περιλαμβάνουν PI3K-εκλεκτικούς αναστολείς, αναστολείς ΑΚΤ, αναστολείς καταλυτική περιοχή mTOR, και διπλή PI3K /αναστολείς mTOR. PF-04691502, 2-amino-8-[trans-4-(2-hydroxyethoxy)cyclohexyl]-6-(6-methoxypyridin-3-yl)-4-methylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one, είναι ένας ισχυρός αναστολέας διπλή όλων των ισομορφών PI3K και mTOR (TORC1 και TORC2). Οι φαρμακολογικές ιδιότητες αυτού του στόματος αποτελεσματικός παράγων πρόσφατα αναφερθεί [11]. PF-04691502 ανέστειλε την ανασυνδυασμένη κατηγορίας Ι PI3K και mTOR σε βιοχημικούς προσδιορισμούς και κατέστειλε την μετατροπή των ινοβλαστών γρίπης που προκαλείται από άγριου τύπου ΡΙ3Κγ, δ ή μεταλλαγμένο PI3Kα. PF-04691502 ανέστειλε επίσης δραστηριότητα mTORC1 στα κύτταρα. Στις

PIK3CA

μεταλλαγμένου κυτταρικές σειρές καρκίνου, PF-04691502 κατέστειλε την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ (S473) και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανέστειλαν [11]. PF-04691502 καταδειχθεί κατά του όγκου δραστηριότητες σε μοντέλα των ωοθηκών και γλοιοβλάστωμα όγκου ξενομοσχεύματος που προέρχεται από καρκίνο κυτταρικές γραμμές που φέρουν είτε ένα

ΡΤΕΝ

διαγραφή ή

PIK3CA

μετάλλαξη [11] και σε μια γενετική μηχανική μοντέλο ποντικού ωοθηκών καρκίνο οδηγείται από ένα

Kras

μετάλλαξη και

PTEN

διαγραφή [12]. Οι αντικαρκινικές δράσεις των αναστολέων PI3K /mTOR, συμπεριλαμβανομένων PF-04691502, σε καρκίνο του παχέος εντέρου μένει να διερευνηθεί.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ιεραρχικά οργανωμένη όγκους του παχέος συνθέτουν ένα μικρό υποσύνολο του CD133 + /EpCAM + εκφράζουν ΚΕΠ [13 ], [14]. ΚΕΠ είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη των όγκων και την εξέλιξη, καθώς και αντοχή στο φάρμακο και μετάσταση όγκου [15], [16]. Η απόδραση του ΚΕΠ από την τρέχουσα χημειοθεραπεία και radiotherapies θα μπορούσε να εξηγήσει την αντίσταση και την υποτροπή του όγκου [15], [16]. Η σημασία του δικτύου σηματοδοσίας /mTOR PI3K στην CSC βιολογία έχει σημειωθεί πρόσφατα [17]. Η συσχέτιση της ενεργοποίησης ΑΚΤ και την αυξημένη ογκογονικότητα, βλαστική ικανότητα και διεισδυτικότητα ταυτοποιήθηκε σε ένα μοντέλο γλοιοβλαστώματος [18]. Ενεργοποιημένος σηματοδότηση ΡΙ3Κ βρέθηκε να παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση του προστάτη βασικής /βλαστοκύτταρα [19], [20]. Σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, η απόφραξη των ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι στον καρκίνο του παγκρέατος ήταν σε θέση να εξαλείψει παγκρεατικής ΚΕΠ και λευχαιμίας βλαστικών κυττάρων, καταδεικνύοντας την αποτελεσματικότητα αντι-CSC αναστολής της ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι [21], [22]. Λαμβάνοντας υπόψη τις σημαντικές λειτουργίες του ΚΕΠ, είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί κατά πόσον θεραπευτικών παραγόντων που στοχεύουν το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K /mTOR είναι αποτελεσματικά σε καρκίνο του παχέος εντέρου οδηγείται από ΚΕΠ που φιλοξενούν ένα σωματικό

PIK3CA

μετάλλαξη.

Αναφέρουμε εδώ η στοματική αποτελεσματικότητα ενός αναστολέα διπλής ΡΙ3Κ /mTOR, PF-04691502, σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου καθοδηγείται από υψηλά ογκογόνα CD133 + /EpCAM + ΚΕΠ. Στον όγκο του ασθενούς, CD133 + /EpCAM + κύτταρα εκπροσωπούνται τα καρκινικά κύτταρα-κίνηση κατά την ξενομεταμόσχευση. CD133 + /ΕρΟΑΜ + κύτταρα στη συνέχεια πολλαπλασιάζονται και εμπλουτίζεται ως κύτταρα σφαιροειδές όγκου υπό συνθήκες βλαστοκυττάρων. καρκινικά κύτταρα σφαιροειδές κατείχε τα πρόσθετα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, συμπεριλαμβανομένης της αυτο-ανανέωσης, χημειο-αντίσταση, υψηλότερη ογκογόνο δυναμικό

in vivo

, και την ικανότητα να ανακεφαλαιώσω τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του αρχικού όγκου του ασθενούς

in vivo

. Γενετική ανάλυση των 19 κοινών ογκογονίδια αποκάλυψε ότι ο πληθυσμός CSC δοκιμάζεται έτρεφε μια

PIK3CA (H1047R)

μετάλλαξη. Επιπλέον, ένας διπλός αναστολέας ΡΙ3Κ /mTOR, PF-04691502, ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ

in vitro,

καθώς και η ανάπτυξη των όγκων ξενομοσχεύματος που προέρχονται από τον πληθυσμό CSC σε ποντικούς. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι ρΑΚΤ (S473) ήταν προς τα κάτω σε ξενομοσχεύματος όγκους που υποβλήθηκαν σε αγωγή με PF-04691502. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο αναστολέας ΡΙ3Κ /mTOR μονοπάτι PF-04691502 έχει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα στο

PIK3CA

μεταλλαγμένο ΚΕΠ, τα οποία δικαιολογούν περαιτέρω αξιολόγηση των αναστολέων σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου που φέρουν μεταλλάξεις PIK3CA.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα, Δείγμα ασθενούς, και η ίδρυση του ασθενούς που προέρχονται ξενομοσχεύματος (PDX) όγκου Μοντέλο

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από τον συμμετέχοντα μελέτη, ένα 39-χρόνο- γέρος με καρκίνο του παχέος εντέρου, πριν από τη χειρουργική επέμβαση και τη συλλογή του δείγματος του ιστού. Οι διαδικασίες αυτές εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Ντιέγκο Ξιφασκία Πρόγραμμα Διοικητικό κριτική Θεσμικών Ανθρωπίνων Έρευνας (IRB). Όλες οι πειραματικές διαδικασίες ζώων συμμορφωθεί με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών Ζώων (Institute for Laboratory Animal Research, 1996) και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Παγκόσμιας Έρευνας και Ανάπτυξης Θεσμικών φροντίδα των ζώων και τη χρήση της Pfizer. Εν συντομία, εκτομή αποκάλυψε ένα στάδιο T3N2 κακώς διαφοροποιημένο παχέος βλεννώδες καρκίνωμα με τα χαρακτηριστικά των κυττάρων σφραγίδα δακτύλιο. Χειρουργικά ιστός όγκου κόπηκε σε 2- έως 4-mm

3 θραύσματα και υποδόρια εμφυτευμένων στο πλευρό του NOD /SCID ποντίκια (το The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Ψηλαφίσιμοι P

0 όγκους ξενομοσχεύματος (η πρώτη γενιά σε ποντίκια) που σχηματίζονται σε ποντίκια σε έξι εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Όταν το μέγεθος των όγκων έφθασε περίπου 500 mm

3, Ρ

0 όγκοι στη συνέχεια επεκτάθηκαν σε δέκα ποντίκια NOD /SCID με υποδόρια εκ νέου εμφύτευση των θραυσμάτων του όγκου να παράγουν Ρ

1 όγκους ξενομοσχεύματος. Η ιστοπαθολογική εξέταση των όγκων ξενομοσχεύματος αναθεωρήθηκε σε σύγκριση με τον όγκο ασθενών από ένα διοικητικό συμβούλιο πιστοποιημένο παθολόγο (PBL).

Επεξεργασία ιστών και όγκων σφαιροειδές Καλλιέργειες ΚΕΠ

αφαιρεθεί χειρουργικά ιστούς όγκων ξένου μοσχεύματος από ποντίκια διαχωρίστηκαν ενζυμικά χρησιμοποιώντας διάλυμα Accumax (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) σε απλά κύτταρα και καλλιεργήθηκαν σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2, υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Μέσο βλαστοκυττάρων παρήχθη με κλιματισμό μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό, το οποίο χρησιμοποιείται συνήθως για τα ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (hESC), σε εμβρυϊκά καλλιέργειες ινοβλαστών ποντικού για 24 ώρες και στη συνέχεια ανάμιξη του ρυθμισμένου μέσου με φρέσκο ​​μέσο hESC (σε 1:01 αναλογία) συμπληρωμένο με 4 ng /ml bFGF, 10 ng /ml EGF, 10 mg /ml βόεια ινσουλίνη (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA), 5.5 mg /ml ανθρώπινης τρανσφερίνης (Sigma-Aldrich), και 5 ng /ml σεληνικό νάτριο (Sigma-Aldrich? 23). Πρωτογενή καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φιάλες Εξαιρετικά χαμηλή επιφάνεια προσάρτησης (Corning, Lowell, MA) για τους πρώτους 3 μήνες για να σχηματίσουν μη προσκολλημένα σφαιροειδή όγκου. Μετά σφαιροειδές καλλιέργειες κυττάρων έγινε σταθερός, CSC καλλιέργειες μεταφέρθηκαν σε Nunc ™ φιάλες μη επεξεργασμένων κυττάρων καλλιέργειας πολυστυρενίου (Thermo Fisher Scientific, Rochester, ΝΥ).

Κυτταρομετρία ροής και ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS)

επισήμανση αντιγόνου Πρότυπο επιφάνεια των κυττάρων και κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκαν αξιολογήσεις. Διαχωρισμένα κύτταρα όγκου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένα με φυκοερυθρίνη CD133 (Miltenyi Biotech) και ΑΡΟ-συζευγμένο επιθήλιο-ειδικό EpCAM αντιγόνο (CD326, επιθηλιακό αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας, BD Biosciences) αντισώματα. Διαλογή κυττάρων διεξήχθη σε κυτταρικό διαλογέα FACSAria I (BD). Μη βαμμένα κύτταρα και τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντισώματα ελέγχου ισότυπο χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Στην πρωτογενή κύτταρα που απομονώνονται από ξενομοσχεύματος όγκους, τα νεκρά κύτταρα και κύτταρα ποντικού αποκλείστηκαν χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ποντικού συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (H-2k [ά] -FITC? BD)., Αντιστοίχως

βιωσιμότητα Δοκιμασία κυττάρων μετά από θεραπεία με την ένωση

διαχωρισμένα βιώσιμα, ενιαία ΚΕΠ σφαιροειδές και διαφοροποιημένα κύτταρα απλώθηκαν σε 10000 και 5000 κυττάρων /φρεάτιο, αντιστοίχως, σε διαυγούς πυθμένα των 96 φρεατίων (Corning) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες ενώσεις για 5 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρήση ενός κιτ δοκιμασίας φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας CellTiter Glo® (Promega).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίηση Induction

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η έκφραση κυτοκερατίνη μετρήθηκαν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη 5- κιτ βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) ροή (BD Biosciences) και αντι-κυτοκερατίνης αντισώματα (φυκοερυθρίνη-συζευγμένο κυτοκερατίνη 7/8 CAM 5.2, BD Biosciences). CSC διαφοροποίηση προκλήθηκε με καλλιέργεια ΚΕΠ σφαιροειδές σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) σε τυπικές φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας.

μεταλλακτική ανάλυση των ογκογόνων μεταλλάξεων

Μεταλλακτική ανάλυση αλληλουχίας παρεσχέθη από Sequenom (www.sequenom.com) χρησιμοποιώντας ένα v1.0 πίνακα OncoCarta ™, το οποίο περιέχει 238 μεταλλάξεις hotspot σε 19 ογκογονίδια εντός 24 πολυπλέκτες. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση της λειτουργίας Oncomutations έκθεση σε Typer 4.0 (Sequenom Inc, San Diego, USA) χρησιμοποιώντας τη λειτουργία «OncoMutation Αναφορές». Ο αλγόριθμος αυτός επανεπεξεργάζεται τις πρώτες φασματικά δεδομένα και αυτόματα αντισταθμίζει τα εμβαδά των κορυφών με βάση προηγουμένως συσταθεί σχηματισμούς αλάτι και το προϊόν προσθήκης μήτρα που μπορεί να συγκαλύψει C σε Α και G προς Τ μεταλλάξεις. Τα προκύπτοντα στοιχεία διορθωμένα μετά υποβλήθηκαν σε διαλογή για τις κορυφές μετάλλαξη σε περίσσεια του 7% σε σχέση με τον άγριο κορυφή τύπου, και κάθε αναφερόμενη δοκιμασία ατομικά αναλύονται και αξιολογούνται για την ισχύ με βάση κριτήρια όπως η ταχύτητα επέκταση, το σχήμα των εμβαδών και τη θέση των εμβαδών πάνω από την αναμενόμενη θέση της κορυφής.

In vivo

Ογκογένεση Δοκιμασία

FACS-ταξινομημένο CD133 + /EpCAM + και + κύτταρα CD133- /EpCAM απομονωθεί από P

1 (δηλαδή, η 2

nd γενιά σε ποντικούς) ξενομοσχεύματος όγκους αναμίχθηκαν με Matrigel (BD, 1:01 κατ ‘όγκο) και εμφυτεύεται υποδορίως σε ποντίκια NOD /SCID (το Jackson Laboratory) να αναλύσει την ικανότητά τους να κινήσουν όγκους. Οι όγκοι των όγκων, η οποία υπολογίστηκε ως μήκος Χ πλάτος Χ ύψος χ 0,5, μετρήθηκαν την ημέρα 84 μετά την εμφύτευση και εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 5).

In vivo

Ο περιορισμός αραίωση

Η διαφορά ογκογόνο δυναμικό των καλλιεργημένων ΚΕΠ και διαφοροποιημένη απογόνους τους προσδιορίστηκαν σε SCID-bg ποντίκια (Το Εργαστήριο Jackson) με την έγχυση τιτλοποιηθεί αριθμούς των κυττάρων αναμιγνύεται με Matrigel σε αναλογία 1:01. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα για μια περίοδο 63 ημερών και απεικονίζονται ως η μέση τιμή ± SEM (n = 5).

In vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα Αξιολόγηση

Tumor μελέτες αναστολής ανάπτυξης διεξήχθησαν σε SCID-bg ποντικούς. Εν συντομία, 2 χ 10

6 βιώσιμα διαχωριστεί ΚΕΠ υποδορίως εμβολιάσθηκαν, και ποντίκια που φέρουν -200 mm

3 όγκους χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες και έλαβαν θεραπεία με 10 mg /kg PF-04691502 (ΡΟ, QD × 14 ? η = 8) ή φορέα (0,5% μεθυλοκυτταρίνη σε νερό, ΡΟ, QD × 14? n = 8). Οι όγκοι των όγκων δείχνονται ως μέσος όρος ± SEM. Σχετική μεταβολή του σωματικού βάρους (RCBW?%) Υπολογίστηκε ως το γινόμενο του (BWI-BW0) /BW0 × 100%. BWI ήταν το σωματικό βάρος κατά την ημέρα της χορήγησης της δόσης, και BW0 ήταν το σωματικό βάρος κατά την πρώτη ημέρα της αγωγής.

Ανάλυση Western Blot

με φορέα ή PF-04691502-αγωγή όγκοι ήταν φλας καταψύχθηκε με υγρό άζωτο. Κατεψυγμένα όγκοι ομογενοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων (Cell Signaling Technologies). Τα λύματα καθαριστεί από τα κυτταρικά υπολείμματα με φυγοκέντρηση στα 14.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό πρωτείνης BCA (Pierce). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου. Μετά τη μεταφορά της πρωτεΐνης σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, οι μεμβράνες κηλιδώθηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα ρΑΚΤ (Ser473? Cell Signaling Technologies) ή α-τουμπουλίνης (Sigma). Δευτερεύοντα αντισώματα αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια με τη SuperSignal West Dura υπόστρωμα (Pierce), και οι εικόνες συλλήφθηκαν με ένα σύστημα AlphaImager.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism (V.5.00 για παράθυρα). Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Ίδρυση PDX μοντέλα όγκων και επιβεβαίωση της CD133 + /EpCAM + Ογκογονικά CSC Πληθυσμός

Αποσπάσματα από φρέσκα εκτομή του δείγματος όγκου από. ένα ορθοκολικό καρκίνο ασθενής εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε δύο NOD ποντίκια /SCID η θέσπιση ορθοκολικό καρκίνο PDX μοντέλο, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει σφαιροειδές CSCs σε καλλιέργεια (ροή εργασίας για την παραγωγή του σφαιροειδούς ΚΕΠ φαίνεται στο Σχ. 1Α). Ταυτόχρονα, προσφάτως διαχωριστεί πρωτογενή κύτταρα από δείγματα ασθενών αξιολογήθηκαν για την έκφραση του παχέος εντέρου CSC Σημάδια CD133 /EpCAM με κυτταρομετρία ροής (Εικ. 1Β). Μετά τον αποκλεισμό μη βιώσιμα κύτταρα με βαφή ιωδιούχου προπιδίου (σχ. 1Β-α), περίπου 4-6% CD133 + /ΕρΟΑΜ + κύτταρα ανιχνεύθηκαν στον ιστό του όγκου (Σχ. 1Β-C), υποδηλώνοντας την παρουσία υποθετικού ΚΕΠ.

μια

, Schema που απεικονίζει τη ροή των εργασιών της σφαιροειδές γενιάς CSC και των πληθυσμών διαφοροποιημένων κυττάρων ως πειραματικό σύστημα, περιλαμβανομένης και της μεταμόσχευσης ενός όγκου του ασθενούς σε NOD /SCID ποντίκια, η διάδοση των ΚΕΠ από την P

1 όγκους ξενομοσχεύματος (σφαιροειδές? 10 × στόχος μεγέθυνσης), και διαφοροποίηση των ΚΕΠ σε προσκολλημένων κυττάρων με επιθηλιακά μορφολογία (διαφοροποιημένα? 20 ×).

Β

. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των πρωτογενών κυττάρων που απομονώνονται από τον αρχικό όγκο του ασθενούς. χρώση ΡΙ αποκλείει τα νεκρά κύτταρα (α). APC και την ΡΕ-συζευγμένα έλεγχοι ισοτύπου δείχνονται στο (β). Ένας πληθυσμός CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων ανιχνεύθηκε (γ).

C

. FACS των ΚΕΠ του παχέος εντέρου CD133 + /EpCAM + από τον κύριο πληθυσμό κυττάρων που προέρχονται από P

1 όγκους ξενομοσχεύματος. Τα νεκρά κύτταρα και κύτταρα ποντικού αποκλείστηκαν πρώτα με χρώση ΡΙ και χρησιμοποιώντας ένα αντι-ποντικού ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα H-2k [d], αντίστοιχα (α & amp? Β). CD133 + /EpCAM + και CD133- /EpCAM + πληθυσμών ήταν περιφραγμένη, σύμφωνα με τις γραμμές βάσης των ελέγχων ισοτόπου και να ταξινομηθούν (γ). Τέλος, ο εμπλουτισμός και των δύο πληθυσμών στις ταξινομημένο δείγματα επιβεβαιώθηκε με κυτταρομετρία ροής (d & amp? Ε).

D

. Η έκφραση των δεικτών CSC σε ένα κλάσμα καλλιεργημένων ΚΕΠ σφαιροειδούς (δεξί πάνελ). Αριστερό πλαίσιο δείχνει έλεγχοι ισοτόπου.

Η

Όταν P

1 όγκους ξενομοσχεύματος φτάσει 500-700 mm

3, οι ιστοί του όγκου συλλέχθηκαν και επεξεργάστηκαν για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και κυτταρική διαλογή. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι το ποσοστό των CD133 + /ΕρΟΑΜ + κύτταρα σε Ρ

1 όγκων ξενομοσχεύματος παρέμειναν στο ίδιο εύρος με αυτό του πρωτογενούς όγκου. Διασπασμένα μόνο

1 καρκινικά κύτταρα Ρ περαιτέρω διαλογή με FACS. Μετά τον αποκλεισμό των μη βιώσιμων κυττάρων (Σχ. 1C-α) και κύτταρα ποντικού (Σχ. 1C-β) όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι, οι πληθυσμοί CD133 + /EpCAM + και CD133- /ΕρΟΑΜ + κυττάρων απομονώθηκαν (Σχ. 1C-c ). Ταξινόμηση κυτταρικών πληθυσμών ήταν εμπλουτισμένα για CD133 + /EpCAM + (-98%? Σχ. 1C-d) ή CD133- /EpCAM + (-96%? Σχ. 1C-e) κύτταρα. Αμφότερες οι κυτταρικοί πληθυσμοί αναμείχθηκαν αμέσως με Matrigel (σε αναλογία 1:01 σε όγκο) και εμφυτεύεται υποδορίως σε ποντικούς NOD /SCID για να καθοριστεί ογκογόνο δυναμικό τους. Με βάση τις εφικτές αριθμούς των κυττάρων, CD133 + /EpCAM + και CD133- /ΕρΟΑΜ + κύτταρα εμφυτεύθηκαν σε πέντε NOD /SCID ποντικούς σε 2.400 και 25.000 κύτταρα ανά ζώο, αντιστοίχως. Ψηλαφητών όγκων παρατηρήθηκε μόνο σε CD133 + /ΕρΟΑΜ + ομάδα στην 6 εβδομάδες και στη συνέχεια ανιχνεύεται στο CD133- /EpCAM + ομάδας σε 7 εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Όταν τα ζώα θυσιάστηκαν την εβδομάδα 12, ο όγκος των όγκων που προέρχονται από CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων ήταν σημαντική μεγαλύτερη από εκείνη που προέρχεται από CD133- /EpCAM + κύτταρα (Σχ 2Α?. Ρ & lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι καρκίνου του παχέος εντέρου αποτελείται από ένα μικρό πληθυσμό των ΚΕΠ ογκογενή, τα οποία είναι θετικά για CD133 και της έκφρασης EpCAM.

Μια

. Μέσους όγκους των όγκων σε NOD ποντίκια /SCID που εμβολιάστηκαν με CD133 + /EpCAM + (3.400 κυττάρων /ζώο? Υποθετικό ΚΕΠ) ή CD133- /EpCAM + (25.000 κυττάρων /ζώο? Υποθετικό διαφοροποιημένα) κυττάρων μετά από 12 εβδομάδες εμφύτευσης (μέση τιμή ± SEM? Η = 5 ).

Β

. Ποσοστό CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων που εκφράζουν το CSC και πληθυσμούς διαφοροποιημένο κύτταρο (μέσος όρος ± SEM, η = 3? Μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student t-test, Ρ & lt? 0,05).

C

. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα των ποσοστών πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τα επίπεδα έκφρασης του κυτοκερατίνη σε ΚΕΠ και διαφοροποιημένα κύτταρα. Οι αριθμοί κυττάρων στους άξονες Υ ρυθμιστεί ως ποσοστό των μέγιστων αριθμών των κυττάρων που αναλύθηκαν.

D

. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα που δείχνουν το

in vitro

ευαισθησία των ναρκωτικών των ΚΕΠ και των διαφοροποιημένων απογόνων τους ως απάντηση στην οξαλιπλατίνη όπως εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία CellTiter Glo®.

Η

Δημιουργία Σταθερό Πολιτισμών σφαιροειδές των ΚΕΠ

Μετά την καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων που απομονώνονται από P

1 όγκων ξενομοσχεύματος σε μέσο βλαστοκυττάρων χωρίς ορό, τα μη-προσκολλημένα 3-διαστάσεων σφαιροειδή παρατηρήθηκαν μέσα σε 2-3 εβδομάδες (Εικ. 1Α), και η περαιτέρω επέκταση του καλλιέργεια δημιουργείται μία μεγάλη ποσότητα σφαιριδίων εντός 2 μηνών. κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις καλλιεργημένων κυττάρων σφαιροειδούς δείχνουν ότι + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων CD133 αποτελείται 33,2% του συνόλου των κυττάρων (Σχ 1D?. δεξί πάνελ), γεγονός που υποδηλώνει ότι + /ΕρΟΑΜ + κύτταρα CD133 εμπλουτίστηκαν περίπου 5-φορές σε καλλιέργεια σφαιροειδές όγκου σε σύγκριση με 4-6 % του CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων τόσο στην αρχική δείγμα του ασθενούς και των όγκων ξενομοσχεύματος (Εικ. 1 Β και δεδομένα που δεν δείχνονται, αντίστοιχα). καρκινικά κύτταρα σφαιροειδές ήταν συνεχώς καλλιεργήθηκαν

in vitro

τα τελευταία 2,5 χρόνια, χωρίς να παρουσιάζει μια σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης /EpCAM CD133 ή σημάδια της γήρανσης. Οι ιδιότητες των κυττάρων CSC σφαιροειδούς όγκου καταδεικνύεται στα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω. Τα καρκινικά κύτταρα σφαιροειδές αναφέρεται έτσι στο κείμενο ως ΚΕΠ.

Σχετικά ηρεμίας, αδιαφοροποίητη κατάσταση των ΚΕΠ

Για να επάγει την διαφοροποίηση των ΚΕΠ, τα κύτταρα σφαιροειδή όγκου διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα και καλλιεργήθηκαν σε ορό που περιέχει μέσα όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Προσκολλημένα κύτταρα με τη μορφολογία των επιθηλιακών εμφανίστηκε μέσα σε 1-2 ημέρες (Εικ. 1Α) και συνέχισε να διαδώσει γρήγορα για 2-3 μήνες μέχρι να σταματήσει τον πολλαπλασιασμό. Συνεπής με τα προηγούμενα εύρημα μας στον πληθυσμό CSC που προέρχεται απ ‘ευθείας από ένα δείγμα ασθενούς [23], η μείωση του + /EpCAM + κύτταρο κλάσμα CD133 παρατηρήθηκε στην προσκολλημένα, διαφοροποιημένα κύτταρα (11.2%, Εικ. 2Β).

έχει ενοχοποιηθεί ότι ΚΕΠ διατηρούν μια κατάσταση ηρεμίας. Εκτιμήσαμε ρυθμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τη χρήση ενός ροής BrdU κυτταρομετρίας κιτ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο εμπλουτισμένος πληθυσμός CSC περιείχε ~38.5% κύτταρα BrdU-θετικών έναντι ~51.6% στα διαφοροποιημένα κύτταρα. Μειωμένη ενσωμάτωσης BrdU στον πληθυσμό CSC υποδεικνύει ότι αυτά τα κύτταρα ήταν σχετικώς αδρανή έναντι διαφοροποιημένα κύτταρα (Σχ. 2C). Ομοίως, το κλάσμα των κυττάρων που εκφράζουν κυτοκερατίνη-σε ΚΕΠ ήταν μικρότερη (~17.8%) σε σύγκριση με εκείνες του πληθυσμού διαφοροποιημένων κυττάρων (~44.7%? Εικ. 2C). Όπως κυτοκερατίνη είναι ένας γενικός δείκτης για επιθηλιακή διαφοροποίηση, χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης κυτοκερατίνη στο ΚΕΠ είναι ενδεικτικά της σχετικά αδιαφοροποίητη κατάσταση τους.

Drug Resistance των ΚΕΠ

In vitro

κυττάρων δοκιμασίες βιωσιμότητας έδειξε ότι, σε σύγκριση με τα διαφοροποιημένα κύτταρα, ΚΕΠ παρουσίασαν σημαντική αντίσταση σε οξαλιπλατίνη (σχήμα 2D?. διαφορά σε γραμμική κλίση παλινδρόμησης? Ρ & lt? 0,01). Το εύρημά μας είναι σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν την ανθεκτικοί στα φάρμακα φύση των ΚΕΠ [24] – [26]., γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να ευθύνονται για την κλινική υποτροπή σε ασθενείς με καρκίνο μετά από χημειοθεραπεία

Ογκογονικότητα και Όγκων Ανάπτυξη ΚΕΠ

in vivo

Η

διάφορες ποσότητες (δηλαδή, 10

3, 10

4, 10

5 και 10

6 κύτταρα /ζώο) των διαχωρισμένων ΚΕΠ και διαφοροποιημένα κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως σε πέντε SCID-bg ποντικούς. Ο όγκος λαμβάνει τιμές μεταξύ των δύο ομάδων φάνηκε να είναι παρόμοια (Σχήμα 3Β).? Ωστόσο, οι μέσες όγκοι του όγκου ήταν δραματικά μεγαλύτερα στα ποντίκια εμφυτεύθηκαν με 1 χ 10

5 ή 1 × 10

6 CSCs συγκριτικά με τις ομάδες ένεση με τον ίδιο αριθμό των διαφοροποιημένων κυττάρων (Σχήμα 3Α?. διαφορά σε γραμμικά κλίση παλινδρόμησης, P & lt? 0,01). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΚΕΠ είναι πιο ογκογόνο σε σύγκριση με διαφοροποιημένο κύτταρο απογόνους τους.

Μια

. Οι όγκοι των όγκων στο

in vivo

περιοριστική δοκιμασία αραίωσης για ΚΕΠ και διαφοροποιημένους απογόνους τους σε SCID-bg ποντίκια όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι (μέση ± SEM? n = 5). Διαφορές στα ποσοστά ανάπτυξης βρέθηκαν μεταξύ της CSC και διαφοροποιημένη κυτταρικές ομάδες που εμβολιάστηκαν με υψηλότερους αριθμούς κυττάρων (1 × 10

6 και 1 × 10

5? Διαφορά κλίση στην καταγωγή παλινδρόμηση? P & lt? 0,01).

Β

. Όγκου να λάβει τα ποσοστά μετά από 63 ημέρες μετά την εμφύτευση για την ΚΕΠ και διαφοροποιημένη απογόνους.

C

. Η &? Ε τομές του πρωτογενούς όγκου ασθενή (

α

) και ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από τα ΚΕΠ (

b

) και διαφοροποιημένα κύτταρα (

γ

? Άνω πάνελ, 40 ×? κάτω πίνακα, 4 ×). κύτταρα Signet-δακτυλίου έχουν συχνά εντοπίζονται τόσο των ασθενών και CSC με γνώμονα όγκους και υποδεικνύονται με τα βέλη (α και β κατά 40 φορές). Ένα οικόπεδο dot δείχνει την συχνότητα των κυττάρων σφραγίδα δακτύλιο που προσδιορίζονται στον όγκο του ασθενούς, η CSC που προέρχονται από ξενομόσχευμα και η διαφοροποιημένη ξενομόσχευμα κύτταρα που προέρχονται από (δ).

Η

Ανακεφαλαίωση Η ιστοπαθολογική εξέταση του ασθενούς και τη συχνότητα της CD133 + /ΕρΟΑΜ + κύτταρα σε όγκους ξενομοσχεύματος

ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από ΚΕΠ και διαφοροποιημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ιστολογική εξέταση για να συγκριθούν με την μορφολογία του πρωτογενούς όγκου ασθενή. κύτταρα Signet-δακτυλίου έχουν συχνά εντοπίζονται τόσο στον όγκο του ασθενούς (Σχ. 3C-α) και οι CSC προερχόμενα ξενομοσχεύματα (Σχ. 3C-b). κύτταρα Σφραγιστικό-δαχτυλίδι περιέχει ένα μοναδικό κυτταροπλασματική χυμοτόπια, το οποίο εκτοπίζει εκκεντρικά τον πυρήνα (σημειωμένες με βέλη). Σε αντίθεση, τα κύτταρα signet δακτυλίου ήταν σχεδόν απούσα στα διαφοροποιημένα ξενομοσχεύματα που προέρχεται από κύτταρα (Σχ. 3C-c). Με βάση την αξιολόγηση της παθολογοανατόμο πίνακας-επικυρωμένο, τα ποσοστά των κυττάρων σφραγίδα-δαχτυλίδι ήταν περίπου 45%, 38% και 1% για τον όγκο του ασθενούς, CSC που προέρχονται από ξενομόσχευμα και το διαφοροποιημένο κύτταρο που προέρχεται ξενομοσχεύματος, αντίστοιχα (Σχήμα 3C -ρε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από τον πληθυσμό CSC καλύτερα ανακεφαλαίωση των ιστολογικά χαρακτηριστικά του αρχικού όγκου του ασθενούς.

πριν την εμφύτευση στα ποντίκια, τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν CD133 + /ΕρΟΑΜ + σημειωτές ήταν υψηλότερες στην CSC εμπλουτισμένο πληθυσμό (33,2%) από ό, τι σε διαφοροποιημένα κύτταρα (11.2%? Εικ. 2Β). Παρά τις υψηλότερα ποσοστά CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων στον καλλιεργημένο πληθυσμό CSC, το ποσοστό των + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων CD133 στους όγκους ξενομοσχεύματος μειώθηκε στο 4-6%, το οποίο είναι σύμφωνο με το ποσοστό των CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων παρατηρήθηκαν στην αρχική του όγκου του ασθενούς (Εικ. 1Bc και το Σχ. 4Α). Σε αντίθεση, ~ 2% CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων παρατηρήθηκαν στην διαφοροποιημένο κύτταρο ξενομοσχεύματος όγκου (Σχ. 4Α). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι καλλιεργημένα ΚΕΠ διαφοροποιούνται κατά την εμφύτευση.

Μια

. Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της CD133 + /ΕρΟΑΜ + κλάσμα σε όγκους ξενομοσχεύματος που παράγεται από ΚΕΠ και διαφοροποιημένους απογόνους. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η συχνότητα CSC που αντιπροσωπεύει το ποσοστό των CD133 + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων σε όγκους από δύο ξεχωριστές προελεύσεων (μέση ± SEM, η = 3? μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student t-test, Ρ & lt? 0,05).

Β

. Re-εμφύτευση θραυσμάτων όγκου που λαμβάνεται από ΚΕΠ ή διαφοροποιημένο κύτταρο που προέρχεται από όγκους ξενομοσχεύματος σε δευτερεύουσες SCID-bg ποντικούς. Οι όγκοι των όγκων δείχνονται ως μέσος όρος ± SEM (n = 5). Η διαφορά στις καμπύλες ανάπτυξης μεταξύ των δύο ομάδων είναι στατιστικά σημαντική (διαφορά σε κλίση με γραμμική παλινδρόμηση? Ρ & lt? 0,05).

C

. Κυτταρικός πολλαπλασιασμός των πρωτογενών κυττάρων που απομονώνονται από είτε ΚΕΠ ή διαφοροποιημένο κύτταρο που προέρχεται από όγκους ξενομοσχεύματος στην κατάσταση καλλιέργεια βλαστικών κυττάρων. Βιώσιμα κύτταρα επιστρώθηκαν σε 20.000 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν για 17 ημέρες. Οι αριθμοί των κυττάρων με το χέρι μετρήθηκαν, και οι συνολικές μετρήσεις κυττάρων παρουσιάζονται ως η μέση ± SEM (η = 6? μη ζευγαρωμένα, δίπλευρη Student t-test, Ρ & lt? 0,01).

D

. Σφαιροειδές CSC καλλιέργειες αποκαθίστανται σύμφωνα με τους όρους βλαστικών κυττάρων από όγκους ξενομοσχεύματος που παράγεται από τη σειριακή εμφύτευση του CSC που προέρχονται από όγκους ξενομοσχεύματος. P

2, ΚΕΠ καλλιεργούνται από ξενομόσχευμα όγκων που προέρχεται από τα αρχικά των ΚΕΠ. P

3, ΚΕΠ καλλιεργούνται από ξενομόσχευμα όγκων που προέρχονται από την P

2 ΚΕΠ.

E

. Μερική φάσμα μάζας MALDI-TOF που δείχνει τη μετάλλαξη H1047R στο

PIK3CA

. Οι κόκκινες διακεκομμένες γραμμές δείχνουν, από αριστερά προς τα δεξιά, η μη εκτεταμένη κορυφή εκκινητή, τα 3 δυναμικό κορυφές για τα μεταλλαγμένα G ή Τ αλληλόμορφα και ο άγριου τύπου Α αλληλόμορφο. Η υψηλή αιχμής στο μέσο του σχήματος είναι ένα Τ αλληλόμορφο

PDGFRA

στο ίδιο φάσμα μάζας MALDI-TOF.

Η

Αυτο-ανανέωση Χωρητικότητα του ΚΕΠ

Η ικανότητα να αυτο-ανανέωση, μια ιδιότητα κλειδί του ΚΕΠ, αξιολογήθηκε με τη σειριακή μεταμόσχευση ξενομοσχεύματος όγκων, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Εν συντομία, ξενομόσχευμα όγκων που προέρχονται από ΚΕΠ ή διαφοροποιημένα κύτταρα αφαιρέθηκαν από ποντίκια που φέρουν όγκο. θραύσματα όγκου (2-4 mm

3) εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε δευτερεύουσα SCID-bg ποντίκια. Ξενομοσχεύματος όγκοι (που ορίζεται ως Ρ

2 όγκους ξενομοσχεύματος) που προέρχονται από διαφοροποιημένα θραύσματα των κυττάρων του όγκου αυξήθηκε αργά σε σύγκριση με όγκους που προέρχονται από θραύσματα CSC όγκου (Σχ. 4Β). Τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος σειριακή εμφύτευση προτείνουν ότι οι όγκοι CSC προέλευση μεγαλώνουν πιο επιθετικά σε συνδυασμό με ένα μεγαλύτερο ποσοστό του ΚΕΠ εντός του εμφυτεύματος κυττάρου /τεμάχιο. Κατά συνέπεια, η

in vitro

καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων όγκου που προέρχονται από τον όγκο ξενομοσχεύματος που προέρχονται από ΚΕΠ εμφάνισαν υψηλότερη πολλαπλασιαστική ικανότητα υπό συνθήκες βλαστικών κυττάρων σε σύγκριση με εκείνες που απομονώνονται από τους όγκους που προέρχονται από διαφοροποιημένα κύτταρα (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα πρωτογενή κύτταρα από CSC προερχόμενα όγκοι μπορεί να έχει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης

in vitro

πιθανότατα λόγω της υψηλότερης περιεκτικότητάς τους σε ΚΕΠ.

σφαιροειδές ΚΕΠ (που ορίζεται ως S

2 ) έχουν διαδοχικά συσταθεί από P

2 ξενομοσχεύματος όγκων (Σχ. 4D). Όταν εμφυτεύονται σε ποντικούς, S

2 ΚΕΠ που σχηματίζεται με συνέπεια ταχέως αυξανόμενο Ρ

3 όγκους ξενομοσχεύματος (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). S

3 ΚΕΠ ήταν επίσης αποκαθίσταται από πρωτογενή κύτταρα που παράγονται από την P

3 όγκους (Σχ. 4D). Τόσο s

2 και S

3 ΚΕΠ περιείχε + /ΕρΟΑΜ + κυττάρων CD133 σε επίπεδα συγκρίσιμα με τα γονικά ΚΕΠ (30-40%? Τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι

in vitro

καλλιεργημένα παχέος ΚΕΠ είναι σε θέση να αυτο-ανανέωση.

Ανάλυση της Κοινής Ογκογόνες Μεταλλάξεις στα ΚΕΠ και βιοδεικτών Discovery

Για την αναγνώριση πρόβλεψης βιοδείκτες που μπορεί ενδεχομένως να καθοδηγήσει στοχευμένη θεραπεία, πραγματοποιήσαμε γενετική ανάλυση με τον πίνακα χρησιμοποιώντας DNA OncoCarta ™ απομονώνεται από καλλιεργημένα ΚΕΠ και διαφοροποιημένα κύτταρα. Ανάλυση μεταλλάξεων των 19 κοινών ογκογονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

ABL1, ΑΚΤ1, ΑΚΤ2, BRAF, CDK, EGFR, erbB2, FGFR1, FGFR3, FLT3, JAK2, KIT, ΚΟΑ, HRAS, KRAS, ΕΡΑ, PDGFRα, PIK3CA,

και

RET

, διεξήχθη. Είναι ενδιαφέρον, μόνο το

PIK3CA (H1047R)

μετάλλαξη εντοπίστηκε σε δύο τύπους κυττάρων (Εικ. 4Ε).

Ριζική αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα PF-04691502 στο Mutant ΚΕΠ

στη συνέχεια προσδιορίζεται το

in vitro

ανασταλτική δράση του PF-04691502, ένας ισχυρός αναστολέας διπλή όλων των ισομορφών PI3K και mTOR (TORC1 και TORC2). Πράγματι, PF-04691502 παρουσίασαν σημαντική ανασταλτική δράση επί του κυττάρου πολλαπλασιασμό των ΚΕΠ (Εικ. 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με οξαλιπλατίνη (βλέπε Σχ. 2D), PF-04691502 έδειξε ένα παρόμοιο ανασταλτικό αποτέλεσμα και στις δύο μεταλλαγμένο ΚΕΠ και διαφοροποιημένους απογόνους τους (IC

50 = 202 ηΜ και 195 ηΜ, αντίστοιχα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα της PF

Β

. Όπως φαίνεται στο Σχ.