Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια στους άνδρες. Στην παρούσα μελέτη, LNCaP (ευαίσθητο σε ανδρογόνο ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη) και κυττάρων (ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη κύτταρα) 3 PC-χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις της ιοντίζουσας ακτινοβολίας (IR) σε συνδυασμό με τριοξείδιο του αρσενικού (ΑΤΟ ) και για τον προσδιορισμό των υποκείμενων μηχανισμών

in vitro

και

in vivo

. Βρήκαμε ότι IR σε συνδυασμό με την ATO αυξάνει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με μεμονωμένες θεραπείες σε LNCaP και PC-3 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη. Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία έδειξαν αυξημένη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε σύγκριση με τη θεραπεία με ΑΤΟ ή IR μόνη της σε PC-3 κύτταρα. Συνδυασμένη θεραπεία επαγόμενης αυτοφαγία και απόπτωση σε κύτταρα LNCaP, και κυρίως προκαλούμενη αυτοφαγία σε PC-3 κύτταρα. Ο θάνατος των κυττάρων που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία ήταν κυρίως αποτέλεσμα της αναστολής των οδών σηματοδότησης Akt /mTOR. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία των κυττάρων προ-επεξεργασία με 3-ΜΑ οδήγησε σε σημαντική μεταβολή της AO-θετικών κυττάρων και κυτταροτοξικότητα. Σε μια

in vivo

μελέτη, η θεραπεία συνδυασμού είχαν αποτελέσματα αύξησης κατά του όγκου. Αυτά τα νέα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική όχι μόνο για εξαρτώμενων από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη, αλλά επίσης για ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Chiu HW, Chen Ya, Ho SY, Wang YJ (2012 ) τριοξείδιο του αρσενικού Ενισχύει την ακτινοβολία ευαισθησίας των εξαρτώμενων από ανδρογόνα και Ανεξάρτητη Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 7 (2): e31579. doi: 10.1371 /journal.pone.0031579

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Νοέμβρη του 2011? Αποδεκτές: 9, Γενάρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Φεβρουαρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Chiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 98 – 2314-B-006-034-MY2) και το Sinlau χριστιανικό Νοσοκομείο, Ταϊνάν, Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί μείζον πρόβλημα υγείας για τους άνδρες σε όλο τον κόσμο. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση των υποδοχέων ανδρογόνων (AR) με ανδρογόνα απαιτείται για την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, οι περισσότεροι όγκοι του προστάτη ανδρογόνο-εξαρτώμενοι στην αρχή [1]. Ωστόσο, με την πάροδο του χρόνου, ο όγκος επανεμφανίζεται σε ανδρογόνα πυρίμαχο τρόπο και παρουσιάζουν μια πιο επιθετική και μεταστατική φαινότυπο, η οποία είναι ανθεκτική σε περαιτέρω ορμονικό χειρισμό [2]. Επειδή τα ανδρογόνα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, όλο και περισσότερες ενδείξεις δείχνουν σημαντικό ρόλο για Akt στην ανάπτυξη ορμονο-ανεξάρτητων ασθένεια του προστάτη [3], [4], [5]. Η αναστολή της Akt σε κύτταρα προστάτη καταργεί HER-2 /neu-επαγόμενη AR σηματοδότηση και κυτταρική επιβίωση /επιδράσεις ανάπτυξη σε απουσία ή παρουσία ανδρογόνων [4]. Επιπλέον, η επιτυχής εξέλιξη σε έναν ανεξάρτητο από ανδρογόνο κατάσταση απαιτεί άθικτο σηματοδότηση ΡΙ3Κ [6]. Έτσι, η αναστολή της οδού Akt αναδύεται ως μια ελκυστική κλινική στόχο για την πρόληψη ορμονικά ανθεκτικών ασθένεια.

Υπάρχει τώρα άφθονα στοιχεία που υποστηρίζουν τα οφέλη της υψηλής δόσης ακτινοθεραπεία εξωτερικής δέσμης σε ασθενείς με κλινικά εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη [7]. Ωστόσο, ακτινοθεραπεία υψηλής δόσης προκαλεί σημαντικές παράπλευρες απώλειες στην κανονική κυτταρικών πληθυσμών στην περιοχή της αγωγής [8]. Έτσι, η χρήση των χημικών τροποποιητών ως ραδιοευαισθητοποιητές σε συνδυασμό με ακτινοβολία χαμηλής δόσης μπορεί να αυξήσει τη συνολική θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Το αρσενικό έχει χρησιμοποιηθεί από καιρό ως αντικαρκινικός παράγοντας στην παραδοσιακή κινεζική ιατρική [9]. Πρόσφατα τριοξείδιο του αρσενικού (ΑΤΟ) έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς στην θεραπεία της πυρίμαχου ή υποτροπή οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία (APL), και η αποτελεσματικότητά του έχει επιβεβαιωθεί ακόμη και σε ασθενείς ανθεκτικοί σε συμβατική χημειοθεραπεία [10]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι ο συνδυασμός του ΑΤΟ και ιονίζουσας ακτινοβολίας (IR) είναι πιθανό να είναι η πιο αποτελεσματική στρατηγική για τη λευχαιμία και τους συμπαγείς όγκους [11], [12], [13]. ATO θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό ευαισθητοποιητή ακτινοβολίας και μπορεί να αυξήσει το ποσοστό θεραπείας των κακοηθών κυττάρων. Ωστόσο, τα αποτελέσματα και ο ακριβής μηχανισμός της συνδυασμένης θεραπείας του ΑΤΟ και IR κατά του καρκίνου του προστάτη παραμένουν ασαφείς.

Autophagy είναι ένας από τους μηχανισμούς ανοχής στρες που διατηρεί τη βιωσιμότητα των κυττάρων και μπορεί να οδηγήσει σε λήθαργο όγκου, εξέλιξη και θεραπευτική αντίσταση. Ωστόσο, πολλοί αντικαρκινικά φάρμακα θα μπορούσαν επίσης να επάγουν την υπερβολική ή παρατεταμένη autophagy που προκαλεί θάνατο κυττάρου όγκου. Μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να καθορίσουν τις βέλτιστες στρατηγικές για να διαμορφώσουν αυτοφαγία για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου και να εκμεταλλευτεί αυτοφαγία ως στόχο για την ανακάλυψη αντικαρκινικών φαρμάκων [14]. Ένας αριθμός των συνδέσεων συμβαίνουν ανάντη του αποπτωτικών και αυτοφαγικά μηχανήματα, όπου τα μονοπάτια σηματοδότησης ρυθμίζουν τις δύο διαδικασίες. Η ενεργοποίηση της κινάσης ΡΙ3 /Akt μονοπάτι, μια πολύ γνωστή μέθοδος για να αναστέλλουν την απόπτωση, αναστέλλει επίσης autophagy [15]. Akt είναι μία κινάση πρωτεΐνης σερίνης /θρεονίνης που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην καταστολή της απόπτωσης με ρύθμιση προς τα κάτω οδών του [16]. Akt φωσφορυλιώνει επίσης στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR), η οποία έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την επαγωγή του autophagy [17]. Τόσο απόπτωση και autophagy μπορούσε να προκληθεί σε ορισμένα κύτταρα όγκου υπό την θεραπεία των φαρμάκων κατά του καρκίνου [18], [19].

ατορβαστατίνη προκαλεί αυτοφαγία στον υποδοχέα ανδρογόνων καρκίνο του προστάτη αρνητικά κύτταρα PC-3 μέσω της ενεργοποίησης της LC3 μεταγραφής [20]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε επίσης ότι ένα φυσικό ΒΗ3 μιμητική ((-) – κατακάθι) επάγει αυτοφαγία στην απόπτωση ανθεκτικά καρκίνο του προστάτη με διαμόρφωση αλληλεπίδραση Bcl-2-Beclin1 στο ενδοπλασματικό δίκτυο [21]. Ανεξάρτητος από ανδρογόνο καρκίνου του προστάτη κύτταρα με υψηλότερα επίπεδα Bcl-2 ήταν πιο ανθεκτικά στην (-) – επαγόμενη κατακάθι απόπτωση. Ωστόσο, (-) – επαγόμενη κατακάθι παρόμοια επίπεδα ολικής κυτταρικό θάνατο σε δύο ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από κύτταρα? σκότωσε κύτταρα ανδρογόνων κυρίως μέσω της απόπτωσης, αλλά σε μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα κυττάρων, ο τρόπος κυτταρικού θανάτου δεν ήταν πλήρως κατανοητή [21]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι η ΑΤΟ ή IR μπορεί επίσης να επάγεται αυτοφαγία αλλά όχι απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [22], [23].

Στην παρούσα μελέτη, LNCaP (ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη ευαίσθητο σε ανδρογόνο) και PC -3 κύτταρα (ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη κύτταρα) χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνηθούν οι αντικαρκινικές επιδράσεις του IR σε συνδυασμό με ΕΦΕ. εξετάστηκαν οι τύποι κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από IR σε συνδυασμό με την ATO. Ερευνήσαμε επίσης τους πιθανούς μηχανισμούς που διέπουν την απόπτωση ή αυτοφαγία σε LNCaP και PC-3 κυττάρων που προκαλείται από IR και /ή ATO.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και φαρμάκων θεραπείας

Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη LNCaP (ATCC CRL-1740) και PC-3 (ATCC CRL-1435) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ) που συμπληρώθηκαν με αντιβιοτικά που περιέχει 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ), και 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (HyClone, Logan South, UT, USA) .Cells επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ) σε μέσο RPMI 1640. Για την έκθεση στο τριοξείδιο του αρσενικού (Sigma Chemical Co.), 1 mM φρέσκα διαλύματα παρακαταθήκης παρασκευάστηκαν πριν από κάθε πείραμα και αποστειρώνεται με διήθηση χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο σύριγγας 0.2 μm. Το αντιδραστήριο προστέθηκε σε συμπυκνωμένη μορφή στο μέσο καλλιέργειας και αναμίχθηκαν ηπίως. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια επωάστηκαν για τους χρόνους που υποδεικνύονται στα σχήματα.

Η θεραπεία με ακτινοβολία και η κυτταρική βιωσιμότητα

δοκιμασία

IR έγινε με 6 MV ακτίνες Χ χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή (Digital Μ Mevatron Accelerator , η Siemens Medical Systems, CA, USA) με ρυθμό δόση 5 Gy /min. Ένα επιπλέον 2 cm από ιστό ισοδύναμου bolus τοποθετήθηκε στην κορυφή πλαστική φιάλη καλλιέργειας ιστού για την εξασφάλιση ηλεκτρονική ισορροπία, και 10 cm από υλικό ιστού ισοδύναμου τοποθετήθηκε κάτω της φιάλης για να εξασφαλίσει την πλήρη back-scatter. Τα επεξεργασμένα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0.1 ml PBS. Κάθε εναιώρημα κυττάρων (0,02 ml) αναμίχθηκε με 0.02 ml του διαλύματος κυανού τρυπάνης (0,2% σε PBS). Μετά από 1 ή 2 λεπτά, κάθε διάλυμα τοποθετήθηκε σε ένα αιμοκυτταρόμετρο και τα μπλε χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν ως μη άθικτο.

κλωνογονική δοκιμασία

κύτταρα ακτινοβολήθηκαν με 2, 4 ή 6 Gy . ΑΤΟ προστέθηκε στα κύτταρα σε συγκεντρώσεις 2 ή 5 μΜ. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Γνωστά αριθμοί κυττάρων στη συνέχεια απλώνονται εκ νέου σε τρυβλία καλλιέργειας 6 cm και επέστρεψαν στον επωαστή για να επιτραπεί ανάπτυξη αποικίας. Μετά από επτά ημέρες, οι αποικίες (που περιέχει ≥50 κύτταρα) βάφτηκαν με ένα 0.5% διάλυμα ιώδους κρυστάλλου για 30 λεπτά. Επιμετάλλωση απόδοσης (ΡΕ) είναι ο λόγος του αριθμού των αποικιών με τον αριθμό των κυττάρων που σπείρονται στην μη ακτινοβοληθέν ομάδα. Υπολογισμό των κλασμάτων επιβίωσης (ΔΤ) διεξήχθη χρησιμοποιώντας την εξίσωση:. SF = αποικίες /(κύτταρα εμβολιάζονται × PE), λαμβάνοντας υπόψη την ατομική PE

Προσδιορισμός πρώιμη απόπτωση

απόπτωση αξιολογείται από την παρατήρηση της μετατόπισης της φωσφατιδυλο σερίνη στην επιφάνεια του κυττάρου, όπως ανιχνεύεται με ένα κιτ αννεξίνης V ανίχνευσης απόπτωσης (Calbiochem, San Diego, CA, USA), σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά μας [13].

Μέτρηση ROS παραγωγή

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας διοξεική 2,7-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Μετά τη θεραπεία με IR και /ή ΑΤΟ, τα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μΜ DCFH-DA για 30 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά και επαναιωρήθηκαν σε PBS. Ο φθορισμός παρακολουθείται χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής.

χρώση supravital κυττάρου με πορτοκαλί της ακριδίνης για

ανίχνευση autophagy

χρώση κυττάρων με πορτοκαλί της ακριδίνης (Sigma Chemical Co.) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με δημοσιευμένες διαδικασίες [13]. Τα κύτταρα προ-αγωγή με αναστολείς autophagy 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) (Sigma Chemical Co.) σε τελική συγκέντρωση 1 mM για 1 ώρα πριν την αγωγή IR.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

τα κύτταρα στερεώθηκαν με διάλυμα που περιέχει 2,5% γλουταραλδεΰδη συν 2% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού, ρΗ 7,3, για 1 ώρα. Μετά τη σταθεροποίηση, τα δείγματα σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% ΟΣΟ

4 στο ίδιο ρυθμιστικό για 30 λεπτά. Εξαιρετικά λεπτές τομές στη συνέχεια παρατηρήθηκαν κάτω από ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEOL JEM-1200ΕΧ, Japan) στα 100 kV.

Western ανάλυση κηλίδος

συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν με συλλογή κυττάρων σε πρωτεΐνες ρυθμιστικό εκχύλισης για 1 ώρα στους 4 ° C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Οι πυκνότητες των ζωνών ποσοτικοποιήθηκαν με ένα πυκνόμετρο υπολογιστή (AlphaImager ™ 2200 Σύστημα της Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Η έκφραση του GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως ο έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης. Τα αντισώματα για την ανίχνευση Akt, φωσφο-Akt, φωσφο-mTOR, φωσφο-p70S6K, ΕΚΚ, φωσφο-ΕΚΚ, φωσφο-ΡϋΚ1, ΡϋΚ1, JNK, ρ38, φωσφο-ρ38, Beclin 1, Βαχ και Bcl-2 ελήφθησαν από την Cell Τεχνολογία σηματοδότησης (Ίπσουιτς, MA, USA)? αντι-GAPDH ελήφθη από Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA)? LC3, Atg5 και Atg5-12 ελήφθησαν από Abgent (San Diego, CA, USA)? αντι-Ρ62 /SQSTM1 αντίσωμα ελήφθη από MBL (Nagoya, Japan)? αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) αντίσωμα ελήφθη από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA)? mTOR, p70S6K, φωσφο-ΙΝΚ, κασπάσης-3 και διασπάστηκε-κασπάσης-3 ελήφθησαν από Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo

δοκιμασίες ανάπτυξης όγκων χρησιμοποιώντας το PC- 3 μοντέλο όγκου σε άτριχα ποντίκια

Όλα τα πειράματα σε ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του ινστιτούτου μας (τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των πειραματόζωων, Εθνική Cheng Kung University). Το πρωτόκολλο χρήση ζώων που αναφέρονται παρακάτω έχει ελεγχθεί και εγκριθεί από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) (Έγκριση No: 99138). Έξι έως οκτώ εβδομάδων αρσενικά γυμνά ποντίκια (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) αποκτήθηκαν από το Εθνικό Κέντρο Εργαστήριο Ζώων (Ταϊβάν). Τα ζώα στεγάστηκαν πέντε ανά κλουβί στους 24 ± 2 ° C και 50% ± 10% σχετική υγρασία και υποβάλλεται σε ένα /σκότους 12-h φως 12 ωρών. Τα ζώα εγκλιματίστηκαν για 1 εβδομάδα πριν από την έναρξη των πειραμάτων και τρέφονται με μια δίαιτα τροφής Purina και νερό κατά βούληση. Οι όγκοι επάγονται με υποδόρια ένεση (s.c.) από PC-3 κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα σε 0.1 mL PBS) σε μία θέση του δεξιού πλευρού. Οι όγκοι (οπτικοποιήθηκε ως μικρά οζίδια στις θέσεις της ένεσης) εμφανίστηκε ~ 7 ημέρες μετά την ένεση, και τα ζώα κατανεμήθηκαν τυχαία σε κάθε ομάδα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με: (1) όχημα (PBS), (2) 6 mg /kg ΑΤΟ τρεις φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες (την ημέρα 0, 2, 4, 7, 9 και 11), (3) μία απλή δόση 6 Gy IR, ή (4) μία συνδυασμένη θεραπευτική αγωγή που αποτελείται από 6 mg /kg ΑΤΟ τρεις φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες άρχισε αμέσως μετά από μια εφάπαξ δόση 6 Gy IR. Mouse σωματικά βάρη μετρήθηκαν μία φορά την εβδομάδα και χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτης συστημικής τοξικότητας της θεραπείας. Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε κάθε δύο ημέρες, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο που δείχνεται παρακάτω [25]: Τα δεδομένα εκφράζονται ως σχετικός όγκος του όγκου σε σύγκριση με τον όγκο προεπεξεργασία μετράται την ημέρα 0. Ο χρόνος όγκου του όγκου τετραπλασιασμό (TVQT, σε ημέρες) προσδιορίστηκε με ανάλυση βέλτιστης προσαρμογής παλινδρόμησης. Η καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου (TGD) χρόνος ορίζεται ως η διαφορά μεταξύ της TVQT των όγκων σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων όγκων ελέγχου. Ο χρόνος TVQT και TGD υπολογίστηκαν για κάθε μεμονωμένο ποντικό και κατά μέσο όρο για κάθε ομάδα. ρυθμός αναστολής ανάπτυξης όγκου υπολογίσθηκε ως εξής: α. Αναστολή (%) = (μέσος όγκος του όγκου χωρίς θεραπεία έλεγχο όγκου ποντικών όγκου των επεξεργασμένων ποντίκια) /μέσο όγκο του όγκου των ποντικών αναφοράς άνευ αγωγής χ 100

Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση ανάλυση

παραφίνη-ενσωματωμένες τομές ιστού (4 μm) ξηραίνονται, αποπαραφινοποιήθηκαν, και επανυδατώθηκαν. Μετά την προεπεξεργασία με μικροκύματα εντός κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 6,0? Για ανάκτηση αντιγόνου), τα πλακίδια βυθίστηκαν σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 20 λεπτά για να εμποδίσει τη δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Μετά εντατική πλύση με PBS, τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με το LC3 (MBL, Ιαπωνία), PCNA (Ομάδα ProteinTec, Inc., Chicago, USA) και Atg5 (Abgent, San Diego, CA, USA) αντισώματα. Οι τομές επωάστηκαν με ένα δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και τα πλακίδια αναπτύχθηκαν με το κιτ ανίχνευσης καθολική HRP STARR TREK (Biocare ιατρική, Concord, CA). Τέλος, τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Κάθε slide σαρώθηκε σε χαμηλή ισχύ (χ 200).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student για σύγκριση μεταξύ των μέσων ή μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης με δοκιμή post-hoc του Dunnett [26]. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η βέλτιστη δόση και η επιλογή του χρόνου των IR και ΑΤΟ για τη θεραπεία των LNCaP και τα κύτταρα PC-3

Η βιωσιμότητα του LNCaP και PC-3 κυττάρων παρατηρήθηκε σε διαφορετικές δόσεις του IR (0 έως 8 Gy) για 6, 12, 18, 24 και 48 ώρες (Εικ. 1Α). Η αγωγή με IR μόνο μείωσε τη βιωσιμότητα του LNCaP και PC-3 κύτταρα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επιπλέον, η βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις ΑΤΟ (0 έως 15 μΜ) για 12, 24, 36 και 48 ώρες (Εικ. 1Β). ΕΦΕ μειωμένη μόνος τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Μετά την επεξεργασία με 5 μΜ ΑΤΟ για 48 ώρες, η βιωσιμότητα των LNCaP και PC-3 κύτταρα μειώθηκε σε 60% και 73%, αντίστοιχα. Το σχήμα 1C δείχνει τη βιωσιμότητα των ΑΤΟ και IR αντιμετωπίζονται μόνες ή σε συνδυασμό σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. Σημαντικά ενισχυμένη τοξικότητα βρέθηκε για τη θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με ΑΤΟ και θεραπεία IR μόνος σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. Τα Σχήματα 1D δείχνει τις καμπύλες ακτινοβολία δόσης-απόκρισης για την επιβίωση LNCaP και PC-3 κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία ΕΦΕ. Οι καμπύλες επιβίωσης μετατοπίζονται δραματικά προς τα κάτω. ΑΤΟ (2 μΜ) αυξήθηκε IR επαγόμενη κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. ΕΦΕ μείωσε σημαντικά το κλάσμα επιβίωσης σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με IR μόνο. ​​

(Α) Χρόνος πιάτων και δοσοεξαρτώμενη επιδράσεις του IR στην βιωσιμότητα των LNCaP και PC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2, 4, 6 ή 8 Gy IR του για 6, 12, 18, 24 και 48 ώρες. (Β) Χρόνος πιάτων και εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση επιδράσεις της ΕΦΕ σχετικά με τη βιωσιμότητα των LNCaP και PC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2, 5, 10 ή 15 μΜ ΑΤΟ για 12, 24, 36 και 48 ώρες. (C) Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με IR (4 Gy) και ΑΤΟ (5 μΜ). (D) η ακτινοβολία δόσης-απόκρισης καμπύλες επιβίωσης των LNCaP και PC-3 κύτταρα με ή χωρίς ΕΦΕ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Μέτρηση της απόπτωσης σε LNCaP και κυττάρων 3 PC-αγωγή με ΑΤΟ και IR μόνες ή σε συνδυασμό

Η επαγωγή αποπτωτικού θανάτου κυττάρου είναι ένας σημαντικός μηχανισμός των καρκινικών κυττάρων υπό την επίδραση του ακτινο /χημειοθεραπεία [27]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, πρώιμη απόπτωση σε LNCaP και PC-3 κύτταρα μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V. Ποσοτικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε περισσότερο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από θεραπεία μόνο με ΑΤΟ ή IR σε κύτταρα LNCaP. Αντίθετα, η εμφάνιση της πρώιμης απόπτωσης στα κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΑΤΟ και /ή IR ήταν χαμηλή (λιγότερο από 10%). γενιά ROS αξιολογήθηκε περαιτέρω με κυτταρομετρία ροής. Ένα περίπου 3.5-πλάσια αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα του υπεροξειδίου του βρέθηκε όταν PC-3 κύτταρα εκτέθηκαν στη θεραπεία συνδυασμού για 1 ώρα (Σχ. 2Β, 2C). Το σχήμα 2D δείχνει την ανάλυση western blot του πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), κασπάσης-3, και Bcl-2. Η διάσπαση της PARP από ενεργοποιημένα κασπάσης-3 σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός 85-kDa C-τερματικό θραύσμα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ειδική διάσπαση της PARP και κασπάσης-3 θα μπορούσε να βρεθεί σε κύτταρα κατεργασμένα με IR, μόνες ή σε συνδυασμό σε κύτταρα LNCaP ΕΦΕ. Αναλύσαμε επίσης το επίπεδο έκφρασης της Bcl-2, η οποία είναι ένας καταστολέας του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, και διαπίστωσαν ότι οι πρωτεΐνες Bcl-2 μειώθηκαν όταν έλαβαν θεραπεία με IR μόνο και τη θεραπεία συνδυασμού σε δύο κύτταρα.

(Α ) ανίχνευση πρώιμη απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR (4 Gy) και ΑΤΟ (5 μΜ) για 48 ώρες. #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, ATO έναντι συνδυασμένη θεραπεία. (Β) (C) ROS παραγωγή σε κύτταρα PC-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 5 μΜ ΑΤΟ ή 4 Gy IR μόνα ή σε συνδυασμό για 30, 60, 120 λεπτά και με DCFH-DA για επιπλέον 30 λεπτά. Ο φθορισμός στα κύτταρα αμέσως προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, ATO έναντι συνδυασμένη θεραπεία. (D) κηλίδωση Western της PARP, διασπάται-PARP, προ-κασπάσης 3, διασπασμένη κασπάση-3και Bcl-2. Το επίπεδο της ολικής πρωτεΐνης GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR (4 Gy) και ΑΤΟ (5 μΜ) για 48 ώρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Μέτρηση της αυτοφαγία σε LNCaP και κυττάρων 3 PC-αγωγή με ΑΤΟ και IR μόνες ή σε συνδυασμό

Autophagy είναι χαρακτηρίζεται από τον σχηματισμό πολλών όξινων κυστιδίων, οι οποίες ονομάζονται όξινες φυσαλιδώδους οργανίδια (avos) [23]. Μικροφωτογραφίες Avós παρατηρήθηκαν μέσω πράσινου και κόκκινου φθορισμού σε πορτοκαλί ακριδίνης (AO) -stained κυττάρων με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Σχ. 3Α). Η συνδυασμένη θεραπεία αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση στην Avos σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου στις LNCaP και PC-3 κύτταρα. Οι υπερδομές των PC-3 κύτταρα για κάθε ομάδα αγωγής παρατηρήθηκαν με ΕΜ φωτομικρογραφία (Σχ. 3Β). Η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε επίσης σε ένα μεγάλο αριθμό κενοτόπια αυτοφαγικά και autolysosomes στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, δεν υπήρχε συμπύκνωση χρωματίνης ή πυρηνικά πύκνωση, τα οποία είναι χαρακτηριστικά της απόπτωσης, σε οποιοδήποτε από τα επεξεργασμένα κύτταρα. Επιπλέον, η χρώση AO ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής (Σχ. 3C, 3D). Μια σημαντική αύξηση AO-θετικά κύτταρα βρέθηκε για κύτταρα που λαμβάνουν συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με εκείνους που έλαβαν θεραπεία με IR ή ΑΤΟ μόνη της σε δύο κύτταρα. Για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με αυτοφαγία-, εκτελέσαμε κηλίδωση Western με προϊόντα λύσης από LNCaP και PC-3 κύτταρα που λαμβάνουν κάθε μία από τις διαφορετικές θεραπείες (Σχ. 3Ε, 3F). Τα επίπεδα έκφρασης του LC3-ΙΙ, Ρ62, πρωτεΐνες Atg5 και Atg5-12 αυξήθηκε με συνδυασμένη θεραπεία σε αμφότερες κύτταρα. Η συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αυτοφαγία στα LNCaP και PC-3 κύτταρα.

(Α) Μικροφωτογραφία του Avós σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. Ανίχνευση του πράσινου και κόκκινου φθορισμού σε πορτοκαλί ακριδίνης (AO) -stained κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Η

λευκά βέλη

σημείο να Avós. (Β) ΗΜ μικροφωτογραφίες του PC-3 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με IR (4 Gy) και ΑΤΟ (5 μΜ) για 48 ώρες. Η

λευκά βέλη

σημείο να αυτοφαγικά κενοτόπια και autolysosomes. (Γ) Ανάπτυξη Avós σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. Ανίχνευση του πράσινου και κόκκινου φθορισμού σε AO-χρωματισμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. (D) Ποσοτικός προσδιορισμός των Avós με ΑΟ-χρώση κύτταρα κατεργασμένα με IR (4 Gy) ή ΑΤΟ (5 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή τυπικής απόκλισης ± από τρία ανεξάρτητα πειράματα. #,

σ

& lt? 0,05, IR σε σχέση με συνδυασμένη θεραπεία. *,

σ

& lt? 0,05, ATO έναντι συνδυασμένη θεραπεία. (Ε) (F) κηλίδωση Western της LC3-Ι, LC3-ΙΙ, Ρ62 /SQSTM1, Atg5 και Atg5-12 έκφραση σε LNCaP και PC-3 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR (4 Gy) και ΑΤΟ (5 μΜ) για 48 ώρες.

Η

ΡΙ3Κ οδού σηματοδότησης /Akt εμπλέκεται σε συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από το κυτταρικό θάνατο και κύτταρα υφίστανται τόσο αποπτωτικών και αυτοφαγικά κύτταρο θάνατο όταν εκτεθούν σε IR και ATO σε LNCaP και τα κύτταρα PC-3

για να διερευνηθεί αν η PI3K /Akt μονοπατιού σηματοδότησης είχε εμπλακεί σε συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο, θα πραγματοποιηθεί κηλίδωση Western για την ανίχνευση της κατάστασης φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών ( Τα Σχ. 4Α, 4Β). Φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ΡΙ3Κ /Εξετάστηκαν επίσης οδούς σηματοδότησης Akt. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση της Akt, mTOR, p70S6K και ΡϋΚ1 μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με τη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με τον έλεγχο. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε κατά πόσον η αναστολή της autophagy θα μπορούσε να αλλάξει το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων που είχαν υποβληθεί σε αγωγή με ΑΤΟ και IR (Εικ. 5). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε 3-μεθυλαδενίνη (3-ΜΑ) (ένας αναστολέας αυτοφαγία). Annexin V και χρώση AO ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η συνδυασμένη θεραπεία του LNCaP και PC-3 κύτταρα προ-επεξεργασία με 3-ΜΑ δεν έδειξε καμία επίδραση σε αποπτωτικά κύτταρα (Εικ. 5C, 5F), και μία σημαντική μείωση στην ΑΟ-θετικών κυττάρων (σχ. 5Β, 5Ε) σε σύγκριση με συνδυασμένη θεραπεία. Επιπλέον, εξετάσαμε το εάν η αναστολή της autophagy θα μπορούσαν να μεταβάλουν την κυτταροτοξικότητα της συνδυασμένης θεραπείας (Εικ. 5Α, 5D). Βρήκαμε μια σημαντική μείωση στην κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τα κύτταρα που λαμβάνουν τη συνδυασμένη θεραπεία χωρίς προ-θεραπεία με 3-ΜΑ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΑΤΟ σε συνδυασμό με IR μπορεί να προκαλέσει αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο σε LNCaP και PC-3 κύτταρα.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με IR (4 Gy) και ATO (5 μΜ) για 48 ώρες.

(α) (δ) Επιπτώσεις της 3-MA στην κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία. (Β) (Ε) πρώιμη απόπτωση μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με αννεξίνη V. (C) (F) Ποσοτικοποίηση Avós με ΑΟ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. *,

σ

& lt?. 0.05, ATO + IR σε σχέση με την ATO + IR + 3-ΜΑ

Η

Η ανάπτυξη του όγκου σε άτριχα ποντίκια κατεστάλη με IR και ATO

στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την επόμενη την αντινεοπλασματική επίδραση της αύξησης IR και ΑΤΟ

in vivo

. Οι όγκοι επάγονται από s.c. ένεση του PC-3 κύτταρα σε γυμνούς ποντικούς. Μετρήσαμε το σωματικό βάρος των ποντικών κάθε εβδομάδα και ο όγκος του όγκου κάθε δύο ημέρες. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι καμία από τις θεραπευτικές αγωγές που παράγονται κάθε απώλεια σωματικού βάρους, η οποία μπορεί να είναι ένα σημάδι τοξικότητας (Εικ. 6Α). Η συνδυασμένη θεραπεία κατέστειλε τον όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου σε γυμνά ποντίκια σε σύγκριση με ΑΤΟ ή θεραπείες IR μόνο (Σχ. 6Β, 6C, 6D). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ο χρόνος όγκος του όγκου τετραπλασιασμό (TVQT) της ομάδας ελέγχου μετρήθηκε την ημέρα 18 (17.9 ± 2.2). Ο χρόνος καθυστέρησης ανάπτυξης όγκου (TGD) για την 18-ημερών θεραπευτική αγωγή μόνη της ΑΤΟ ήταν 11 ημέρες, η οποία δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από ό, τι για την ομάδα ελέγχου (

σ

= 0,11). IR μόνο παρήγαγε μια TGD χρόνο 8,9 ± 5,1 ημέρες (

σ

= 0,17 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου). Η θεραπεία συνδυασμού οδήγησε σε μια εποχή TGD 39,5 ± 8,3 ημέρες (

σ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με IR μόνο του ή ATO μόνο). Η θεραπεία συνδυασμού IR και ΑΤΟ οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου κατά 74% την ημέρα 18. Έτσι, η θεραπεία συνδυασμού έχει αντινεοπλασματική δράση ανάπτυξης

in vivo

. Στη συνέχεια, η PCNA, LC3 και πρότυπο έκφρασης Atg5 στα PC-3 όγκοι εξετάστηκαν με IHC χρώσης (εικ. 6Ε). έκφραση PCNA μειώθηκε και LC3 και Atg5 αυξήθηκαν στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με την ΑΤΟ ή θεραπεία IR μόνο. ​​

(Α) Μέτρηση του σωματικού βάρους σε άτριχα ποντίκια μια φορά την εβδομάδα. (Β) Μέτρηση του όγκου του όγκου σε γυμνούς ποντικούς κάθε δύο ημέρες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ο σχετικός όγκος του όγκου (μέση ± τυπικό σφάλμα) κανονικοποιημένη με τον αρχικό όγκο του όγκου μετρήθηκε την ημέρα 0. (C) Άμεση παρατηρήσεις των ποντικιών με όγκους. Μετά τα πειράματα, οι ποντικοί θυσιάστηκαν, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν. (D) Μέτρηση του βάρους του όγκου σε γυμνά ποντίκια μετά τη θυσία. (Ε) Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση των ιστών PC-3 ξενομοσχεύματος ποντικού. IHC χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των PCNA, LC3 και Atg5 (× 200 στόχος μεγέθυνση).

Η

Συζήτηση

Σήμερα, η εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη σε μια κατάσταση ανδρογόνου ανεξαρτησία παραμένει το πρωταρχικό εμπόδιο στη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών. Έτσι, πρέπει να προσδιοριστούν νέα στρατηγικές θεραπείας που είναι χρήσιμοι για ανεξάρτητου από ανδρογόνο νόσο [28]. Στην παρούσα μελέτη, ένας συνδυασμός IR και ΑΤΟ έδειξε δυνατότητες ως θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου του προστάτη (ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη) (Εικ. 1). Lian et al. ανέφεραν ότι το φυσικό ΒΗ3-μιμητική (-) – κατακάθι επάγει προνομιακά αυτοφαγία σε ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη κύτταρα που είναι ανθεκτικά στην απόπτωση, ενώ η απόπτωση κατά προτίμηση επάγεται σε κύτταρα ανδρογονο-εξαρτώμενη [29]. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι IR σε συνδυασμό με την ATO έχει αυξημένη θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε LNCaP και PC-3 καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη. Συγκεκριμένα, η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε αυτοφαγία και απόπτωση σε κύτταρα LNCaP, και κυρίως προκαλούμενη αυτοφαγία σε PC-3 κύτταρα (Σχ. 1, 2, 3). Η παραπάνω

in vitro

Τα αποτελέσματα τεκμηριώνονται από

in vivo

πειράματα που απασχολούσε μοντέλα ποντικών με όγκους ξενομοσχεύματος από το PC-3 κύτταρα. Η συνδυασμένη θεραπεία κατέστειλε τον όγκο του όγκου και του βάρους του όγκου σε γυμνά ποντίκια σε σύγκριση με ΑΤΟ ή θεραπεία IR μόνο (Σχ. 6Β). Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού IR και ΑΤΟ οδήγησε σε αναστολή της ανάπτυξης του όγκου κατά 74% (Πίνακας 1). Περαιτέρω, οι ιστοί του όγκου της έκφρασης LC3 και Atg5 αυξήθηκαν στη συνδυασμένη θεραπεία σε σύγκριση με την ΑΤΟ ή θεραπεία IR μόνο (Σχ. 6Ε).

Shen et al. έδειξε ότι η θεραπεία ATO είναι σε μεγάλο βαθμό ασφαλής και λίγοι ασθενείς απαιτούν τη διακοπή της θεραπείας λόγω ανεπιθύμητων ενεργειών [30]. Το επίπεδο πλάσματος του αρσενικού στην κλινική αντιμετώπιση της οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας φθάνει συνήθως 5.5 έως 7.3 μΜ [30]. Έχει αναφερθεί ότι η μέγιστη συγκέντρωση του επιπέδου αρσενικού στο πλάσμα ήταν 10,6 μΜ μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση 0,2 mg (10 mg /kg) του ΑΤΟ σε ποντικούς [31]. Η δοσολογία που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη μας ήταν 6 mg /kg ΑΤΟ σε ποντίκια αντιπροσωπεύουν μια συγκέντρωση του επιπέδου αρσενικού πλάσματος των 6,4 μΜ, η οποία είναι κλινικά σημαντική. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας στο μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος διαπίστωσε ότι δεν υπήρχε σημαντική απώλεια βάρους σώματος σε ποντίκια της συνδυασμένης θεραπείας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχ. 6Α), και ως εκ τούτου σε συνδυασμό διαδικασία επεξεργασίας (6 mg /kg ΑΤΟ τρεις φορές την εβδομάδα για δύο εβδομάδες και μια μόνο δόση των 6 Gy IR) ήταν καλά ανεκτή.

Ο ρόλος της αυτοφαγία στη θεραπευτική του καρκίνου εξακολουθεί να είναι αμφιλεγόμενη. Autophagy έχει βρεθεί ότι παίζει ένα ρόλο ως ένας μηχανισμός επιβίωσης κυττάρου που επιτρέπει στα κύτταρα να διώξει κατεστραμμένο κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και οργανιδίων μέσω λυσοσωματική αποικοδόμηση και να επιβιώσουν μεταβολικό στρες [32]. Από την άλλη πλευρά, autophagy έχει βρεθεί να συμβάλει στην τύπου II προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε απόκριση σε υποξία, χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ιογενής λοίμωξη, και τοξίνες [33]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η παρατηρούμενη σημαντική αύξηση της αυτοφαγία μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, η κυτταροτοξική δράση της συνδυασμένης θεραπείας διότι προ-επεξεργασία με 3-ΜΑ, ένας αναστολέας αυτοφαγία, είχε προστατευτική επίδραση στη συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ. 3, 5). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η οδός Akt /mTOR παίζει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση τόσο της απόπτωσης και autophagy [34]. Ser473 είναι σημαντικά για την αναγνώριση και την φωσφορυλίωση της Akt από ΡϋΚ1 [35]. Επιπλέον, τα αποτελέσματα κατά του όγκου του OSU-03012, ένα παράγωγο celecoxib, ήταν πιθανά να διαμεσολαβείται κυρίως μέσω της αναστολής της ΡϋΚ1 [36]. Η διακοπή της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, με αποκορύφωμα την αναστολή της Akt, έχει βρεθεί ότι συνδέεται με autophagy που προκαλείται από μία ποικιλία αντινεοπλαστικών παραγόντων σε καρκινικά κύτταρα [34]. Ένας συνδυασμός ινδολ-3-καρβινόλη και genistein επάγει συνεργικά απόπτωση και αυτοφαγία σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου ΗΤ-29 κυττάρων με αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt [37]. Friedrichs et al. ανέφεραν ότι τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μπορεί να αποτρέψει την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη με ορμονικές ανεξαρτησία τροποποιώντας μονοπάτια μεταγωγής σήματος, όπως το μονοπάτι Akt /mTOR [28]. Ένα ανέπαφο ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι απαιτείται για τα κύτταρα LNCaP για την πρόοδο στο ορμονοάντοχου κατάσταση, και Akt δραστηριότητα αυξάνεται καθώς τα κύτταρα μετατρέπουν από ορμονοεξαρτώμενου να ορμόνη ανεξάρτητη [6]. Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι η έκφραση του ρ-Akt, ρ-mTOR, ρ-p70S6K και πρωτεϊνών ρ-ΡϋΚ1 μειώθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα με IR σε συνδυασμό με ΑΤΟ σε σύγκριση με τη θεραπεία με ΑΤΟ ή IR μόνο (Σχ. 4Α).