Αφηρημένο

Σκοπός

Από μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ-2) είναι ένας σημαντικός δείκτης της κακοήθειας του όγκου, αναπτύξαμε ένα πρωτότυπο στρατηγική σχεδιασμό φαρμάκων, ΜΜΡ-2 δραστηριότητα ανιχνευτές εξαρτάται αγκύρωσης (MDAP), για χρήση σε MMP-2 απεικόνισης δραστηριότητα, και αξιολόγησε τη χρησιμότητα αυτού του καθετήρα στο

in vitro

και

in vivo πειράματα

.

Μέθοδοι

σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

5000, τα οποία αποτελούνται από 4 ανεξάρτητες ομάδες: μονάδα RI (

111In υδρόφιλο χηλικό), ΜΜΡ-2 μονάδα υπόστρωμα ( βραχύ πεπτίδιο), μονάδα αγκύρωσης (αλυσίδα αλκυλίου), και την αγκυροβόληση μονάδα αναστολή (πολυαιθυλενογλυκόλη (PEGn? όπου η αντιπροσωπεύει κατά προσέγγιση το μοριακό βάρος, η = 1000, 3000, και 5000). Probe διάσπαση εκτιμήθηκε με χρωματογραφία μετά την αγωγή ΜΜΡ-2 . Κυτταρική πρόσληψη των ανιχνευτών συνέχεια μετρήθηκε. συσσώρευση ραδιενέργειας σε ξενομοσχεύματα όγκου αξιολογήθηκε μετά από ενδοφλέβια ένεση των ανιχνευτών, και την ανίχνευση διάσπασης αξιολογήθηκε σε προϊόντα ομογενοποίησης όγκου.

Αποτελέσματα

ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

5000 διασπάστηκαν με ΜΜΡ-2 σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. ΜϋΑΡ

3000 προεπεξεργασία με ΜΜΡ-2 έδειξαν υψηλότερη συσσώρευση σε κύτταρα όγκου, και ήταν εντελώς αποκλεισμένη από πρόσθετη θεραπεία με έναν αναστολέα ΜΜΡ. MDAP

3000 παρουσίασε ταχεία κάθαρση του αίματος και τη συσσώρευση υψηλού όγκου μετά από ενδοφλέβια έγχυση σε ένα μοντέλο τρωκτικών. Επιπλέον, φαρμακοκινητική ανάλυση αποκάλυψε ότι MDAP

3000 παρουσίασαν σημαντικά αργό ρυθμό κάθαρσης από όγκους στο αίμα. Ένα ορισμένο κλάσμα διασπαστεί MDAP

3000 υπήρχαν στη όγκου ξενομοσχεύματα

in vivo

.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την πιθανή χρησιμότητα της στρατηγικής MDAP μας για την απεικόνιση του όγκου.

Παράθεση: Temma Τ, Hanaoka Η, Yonezawa Α, Kondo Ν, Sano Κ, Sakamoto Τ, et al. (2014) Διερεύνηση της MMP-2 Δραστηριότητα-Εξαρτημένων Αγκύρωση Probe Πυρηνικής Απεικόνισης του Καρκίνου. PLoS ONE 9 (7): e102180. doi: 10.1371 /journal.pone.0102180

Επιμέλεια: Dominique Heymann, Faculté de Ιατρικής de Nantes, Γαλλία

Ελήφθη: 21 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 16 του Ιούνη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Temma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από JSPs KAKENHI Grant Αριθμός 22791189. μέρος αυτής της μελέτης υποστηρίχθηκε από τη Νέα Ενέργεια και Βιομηχανικής Τεχνολογίας Οργανισμός Ανάπτυξης (NEDO), Ιαπωνία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μετάσταση συμβαίνει όταν ένα υποσύνολο των καρκινικών κυττάρων αποκτά την ικανότητα να σπάσει μέσω της βασικής μεμβράνης και να εισβάλουν μέσα από πυκνά δίκτυα της διάμεσης εξωκυττάριας ουσίας (ECM) [1]. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) αποτελούν το μεγαλύτερο οικογένεια των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση αυτών των διαφόρων συστατικών ECM. Δεδομένου ότι η ΜΜΡ-2 αναγνωρίζεται σήμερα ως ο υποτύπος που έχει την καλύτερη καθιερωμένη συσχέτιση με κακοήθεια όγκων [2],

in vivo

απεικόνιση της δραστηριότητας της θα πρέπει να είναι χρήσιμα για τη διάγνωση των όγκων. Έτσι, έχουμε ως στόχο να αναπτύξει ένα νέο αισθητήρα πυρηνικής απεικόνισης ικανό εκτίμηση

in vivo

δραστηριότητας MMP-2 με Single Photon υπολογιστικής τομογραφίας εκπομπής (SPECT).

Εμείς αρχικά αναπτύχθηκε μια νέα στρατηγική του σχεδιασμού καθετήρα ότι χρησιμοποιεί ένα δραστικότητα εξαρτώμενη ανιχνευτή ΜΜΡ-2 αγκύρωσης (ΜϋΑΡ) (Εικ. 1) για την αποτελεσματική ανίχνευση δραστικότητας ΜΜΡ-2. Μετά από αυτή τη στρατηγική ΜϋΑΡ, ο ανιχνευτής αναμενόταν να διασπάται με ενζυματική δραστικότητα ΜΜΡ-2 στην περιοχή του όγκου, και αποτελεσματικά παγιδευμένοι σε εγγύς καρκινικά κύτταρα. Έτσι, το επίπεδο της ραδιενέργειας που ανιχνεύεται από SPECT θα μπορούσαν να συσχετιστούν με δραστικότητα ΜΜΡ-2 σε όγκους. Σε αυτή τη μελέτη, ειδικά σχεδιασμένη και συντέθηκαν ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

5000, που αποτελείται από μια μονάδα RI (

111In DTPA), μια μονάδα ΜΜΡ-2 υποστρώματος (βραχύ πεπτίδιο ) [3], μονάδα αγκύρωσης (αλκυλ αλυσίδες) [4], και μια μονάδα αναστολή αγκύρωσης (πολυαιθυλενογλυκόλη (PEGn? όπου η δείχνει τον κατά προσέγγιση μοριακό βάρος, n = 1000, 3000, και 5000). (Πίνακας 1) ΜϋΑΡ

CV, το οποίο στερείται το τμήμα PEG, υπηρέτησε ως μάρτυρας. Έχουμε αξιολόγησε τη σκοπιμότητα αυτής της στρατηγικής σχεδιασμού φαρμάκων και τη χρησιμότητα των ανιχνευτών

in vitro

και

in vivo

.

η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές και έχει εγκριθεί από το Πανεπιστήμιο Επιτροπή Φροντίδας ζώων του Κιότο (Αριθμός άδειας :. 2012-49, 2013-33) Όλα χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία

Γενικά

παράγωγα αμινοξέων αγοράστηκαν από Watanabe Chemical Industries (. Χιροσίμα, Ιαπωνία) και Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Γερμανία). Matrix Assisted Laser εκρόφηση /ιοντισμό-Φασματομετρίας Μάζας (MALDI-MS) πραγματοποιήθηκε με μία AXIMA-CFR Plus συσκευή (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Ανάστροφης φάσης Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (RP-HPLC) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός συστήματος Shimadzu-HPLC-κλίση (LC-20AD? Shimadzu Corporation) εφοδιασμένο με στήλη COSMOSIL 5C18-AR-II (10 × 250 mm, Nacalai Tesque, Inc. , Κιότο, Ιαπωνία). Τα προϊόντα εκλούσθηκαν με μία γραμμική κλίση από 50% διαλύτη Β, που αυξήθηκε σε 80% επί 15 λεπτά (διαλύτης Α: 0,1% τριφθοροοξικό οξύ σε νερό [ν /ν]? Διαλύτης Β: 0.1% τριφθοροοξεικό οξύ σε ακετονιτρίλιο [ν /ν ]) σε ένα ρυθμό ροής των 4.0 ml /min. Για την ανάλυση του μεταβολίτη του όγκου, τα προϊόντα εκλούστηκαν με μια γραμμική βαθμίδα ξεκινώντας με 50% διαλύτη Β, που αυξήθηκε σε 80% για 30 λεπτά με ρυθμό ροής 2,0 ml /min.

Παρασκευή ανιχνευτών (Πίνακας 1)

Fmoc-Dap (Boc) -10-ΑΟΟ-Gly-Pro-Leu-Gly-Wang-ρητίνη (Dap: 2,3-διαμινο προπιονικό οξύ, 10-Adc: 10-αμινο-δεκανοϊκό οξύ) ήταν συντέθηκε με μια διαδικασία σύνθεσης πεπτιδίων Fmoc-στερεάς φάσης χρησιμοποιώντας συσκευή σύνθεσης πεπτιδίου (PSSM-8? Shimadzu Corporation) με

N

,

N ‘

-διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο˙ (1.2 eq),

Ν

,

N

-διισοπροπυλαιθυλαμίνη (1.0 eq), και 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο (1.0 eq) ως αντιδραστήρια [5]. Μετά την απομάκρυνση της ομάδας Fmoc με 20% πιπεριδίνη σε

N

,

N-διμεθυλφορμαμίδιο

, παλμιτικό οξύ αντέδρασε με παρόμοιο τρόπο παραπάνω για να δώσει παλμιτοϋλ-Dap (Boc) -10-ΑΟΟ-Gly -Pro-Leu-Gly-Wang-ρητίνη. Παλμιτοϋλ-Dap (Boc) -10-ΑΟΟ-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg (Pbf) -Gly-Lys (ivDde) ​​-PEG

N-αμίδιο ρητίνη (n = 1000, 3000, ή 5000 ) παρασχέθηκε από συνωστισμός Inc. (Τόκιο, Ιαπωνία). Peptide αποπροστασία και διάσπαση από τη ρητίνη ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τριφθοροξικό οξύ /αιθανοδιθειόλη /νερού /τριισοπροπυλοσιλανίου (95 /2,5 /2,5 /1, ν /ν). Τα ακατέργαστα πεπτίδια καθαρίστηκαν με RP-HPLC, που ακολουθείται από λυοφιλίωση. Η καθαρισμένη ένωση αντέδρασε με

ρ

-SCN-Βη-DTPA (2 eq) σε

N

,

N

διμεθυλφορμαμίδιο (1 ml) και

N

,

N

διισοπροπυλαιθυλαμίνη (20-100 μl) για τη ρύθμιση του ρΗ ενός διαλύματος (ρΗ & gt? 6), και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύκτα. Οι πρόδρομοι ραδιοεπισήμανση καθαρίστηκαν με RP-HPLC και χαρακτηρίστηκε με φασματομετρία μάζας. [

111In] συμπ

3 (5,55 MBq σε 100 μl διαλύματος HCl, Nihon Medi-Physics Co., Ltd., Japan) προστέθηκε σε κάθε καθαρισμένο πρόδρομο (2 nmol) σε ρυθμιστικό διάλυμα οξικού 0,1 Μ (ρΗ 6,0, 50 μΙ) και το μίγμα επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Ραδιοχημική καθαρότητα εκτιμήθηκε με RP-HPLC εξοπλισμένο με ανιχνευτή ραδιενέργειας.

Μέτρηση συντελεστών κατανομής

Ο πειραματικός προσδιορισμός των συντελεστών κατανομής ανιχνευτή (log τιμές Ρ) πραγματοποιήθηκε σε 1-οκτανόλη και 0,02 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 7,4, όπου οι δύο φάσεις ήταν προ-κορεσμένο με το άλλο. 1-οκτανόλης (200 μΙ) και φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (200 μΐ) μεταφέρθηκαν με πιπέττα σε σωλήνες Eppendorf που περιέχουν LoBind 0,37 MBq ανιχνευτών. Ο σωλήνας στροβιλίστηκε για 10 δευτερόλεπτα, και φυγοκεντρήθηκαν (5 min, 4.000 ×

ζ

). Κλάσματα (50 μΙ) από τις φάσεις 1-οκτανόλη και ρυθμιστικό διάλυμα μεταφέρθηκαν σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες για μέτρηση της ραδιενέργειας με έναν μετρητή σπινθηρισμού καλά-τύπου Ν & Ι (1470 WIZARD, Perkin Elmer, Kanagawa, Ιαπωνία). Ο συντελεστής κατανομής υπολογίσθηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση Ρ = (μετρήσεις /μl σε 1-οκτανόλη) /(μετρήσεις /μl σε ρυθμιστικό διάλυμα).

Διάσπαση δοκιμασία

Ανθρώπινα-ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΜΜΡ-2 ( 902-ΜΡ-010, R &? D Systems, Inc., Minneapolis, ΜΝ USA) ενεργοποιήθηκε με

σ

-aminophenylmercuric αιθυλεστέρα (1 mM) σε ρυθμιστικό δοκιμασίας (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl , 10 mM ΟαΟ

2, 5 μΜ ΖηΟΙ

2, 0,02% Brij 35, ρΗ 7.5). ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

5000 (370 kBq) επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες με ενεργοποιημένο ΜΜΡ-2 (1-5 ηΜ) και έναν αναστολέα ΜΜΡ (0 ή 100 μΜ, GM6001, Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Η αντίδραση αποσβέστηκε με προσθήκη μεθανόλης, και το ποσοστό του διασπασμένου πεπτιδίου εκτιμήθηκε με RP-HPLC.

Κινητή πρόσληψη μελέτη

ΗΤ1080 ανθρώπινα κύτταρα ινοσαρκώματος αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, USA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με χαμηλή γλυκόζη (Invitrogen), 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. ΜΜΡ-2 cDNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα pENTR (Invitrogen) και εισάγεται εντός του φορέα pLenti6 (Invitrogen) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [7]. Για την autoactivated ΜΜΡ-2 μεταλλαγμένη, η αλληλουχία που κωδικοποιεί το φουρίνης θέση διάσπασης του ΜΤ1-ΜΜΡ (Gly-Ala-Glu-Ile-Lys-Ala-Asn-Val-Arg-Arg-Lys-Arg) εισήχθη μεταξύ Asn109 και Tyr110 σε άγριου τύπου ΜΜΡ-2 με PCR. Οι φορείς λεντοϊών παρασκευάστηκαν και μετάγονται σε κύτταρα ΗΤ1080 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6], [7]. Μετά από μια μέρα στην άλλη προ-επώαση των 5 × 10

5 ΗΤ1080 κύτταρα σε FBS-ελεύθερο DMEM σε καθαρό σωλήνες LoBind Eppendorf, τα κύτταρα επωάστηκαν με MDAP

CV, MDAP

1000, MDAP

3000 ή MDAP

5000 (37 kBq). Τριάντα λεπτά μετά την έναρξη, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) (-) (Seikagaku Biobusiness Co., Japan), μεταφέρεται σε άλλο σωληνάριο, λύθηκαν με 0,2 Μ ΝαΟΗ, και η ραδιενέργεια μετρήθηκε με ένα NaI καλά πληκτρολογήστε μετρητή σπινθηρισμού. Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε με δοκιμασία BCA πρωτείνης (Thermo Fisher Scientific, Inc. Rockford, IL USA). Η κυτταρική μελέτη πρόσληψη ΜϋΑΡ

3000 προεπεξεργασία με ενεργοποιημένη ΜΜΡ-2 (63 ηΜ) σε παρουσία ή απουσία GM6001 (100 μΜ) διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω.

Παρασκευή ποντικών που φέρουν όγκο

Θηλυκά Balb /c

ηυ-ηυ

(ηλικίας 5 εβδομάδων, Japan SLC, Inc., Shizuoka, Ιαπωνία) στεγάστηκαν υπό έναν /σκότους 12-h 12-h φως και δεδομένου ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. κύτταρα ΗΤ1080 (5 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ PBS (-) /ποντικό) υποδορίως εμβολιάσθηκαν στο δεξί πίσω πόδι του Balb /c

ηυ-ηυ

ποντικούς. Τα ζώα χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα δύο εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, όταν το μέσο μέγεθος όγκου ήταν 5,7 ± 2,2 mm κατά μήκος του κύριου άξονα.

In vivo μελέτη

ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000 και ΜϋΑΡ

CV (37 kBq, 100 μΐ σε PBS συμπεριλαμβανομένων 3% αλβουμίνη βόειου ορού και 0.1% Tween 80) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως εντός της φλέβας της ουράς των ποντικών που φέρουν όγκο. Οι ποντικοί θανατώθηκαν σε διάφορα χρονικά μετά την ένεση σημεία (η = 3 για κάθε χρονικό σημείο), και τα όργανα που ενδιαφέρουν, συμπεριλαμβανομένων των ιστών όγκων συλλέχθηκαν για τον προσδιορισμό των συντελεστών στάθμισης. Η ραδιενέργεια του κάθε δείγματος μετρήθηκε με έναν μετρητή σπινθηρισμού NaI καλά-τύπου. Από την τοποθέτηση των δύο καμπύλες αποσύνθεσης φάση για τα δεδομένα η ραδιενέργεια του αίματος αναλύθηκαν με GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA), ολόκληρο το σώμα φαρμακοκινητικές παραμέτρους όπως το αίμα ημιζωής, όγκος κατανομής, ο μέσος χρόνος παραμονής και η συνολική κάθαρση υπολογίστηκαν για κάθε ένα από τους ανιχνευτές και οι τιμές συγκρίθηκαν. Απλή φαρμακοκινητική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα ενιαίο μοντέλο διαμέρισμα ιστού εφαρμόστηκε στα δεδομένα βιοκατανομής για τον υπολογισμό σταθερών ρυθμού (Κ1 και Κ2) για τη μεταφορά της ραδιενέργειας από το αίμα στον όγκο και της κάθαρσης από όγκου προς αίμα με PMOD έκδοση 3.2. Επιπλέον, ΜϋΑΡ

3000 (7,4 MBq σε 200 μλ) εγχύθηκε ενδοφλεβίως εντός της φλέβας της ουράς ποντικών που φέρουν όγκου για ανάλυση μεταβολίτη σε όγκους αποκόπηκε 3, 6, και 24 ώρες μετά την έγχυση (η = 2 το καθένα). ομογενοποιήματα όγκου παρασκευάστηκαν επί πάγου και το αδιάλυτο υλικό αφαιρέθηκε με φυγοκέντρηση μετά από την επεξεργασία μεθανόλη. Το υπερκείμενο που προέκυψε αναλύθηκε με RP-HPLC.

Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΜϋΑΡ

3000 υποβλήθηκε ενδοογκική διάσπασης σε κάποιο βαθμό μετά από ενδοφλέβια ένεση. Έτσι, για την ακριβή ανάλυση της MDAP

3000 μεταβολίτη που παράγεται από τη δραστηριότητα των ΜΜΡ σε όγκους, μια μέθοδος χορήγηση εντός του όγκου καθετήρα εκδόθηκε ώστε να αποφεύγεται η πιθανότητα ότι κάθε μεταβολίτη και σε άλλους ιστούς θα αναδιανείμουν σε όγκους, το οποίο είναι ένα αναπόφευκτο θέμα σε μεθόδους ενδοφλέβια χορήγηση. ΜϋΑΡ

3000 (37 kBq, 10 μl σε αλατούχο ορό) ήταν εντός του όγκου χορηγήθηκε σε ποντικούς που φέρουν όγκο 30 λεπτά μετά την ένεση εντός του όγκου GM6001 (100 μΜ, 20 μΐ σε 1% DMSO αλατόνερο) ή 1% DMSO αλατούχου διαλύματος (20 μΐ) . Τριάντα λεπτά αργότερα, οι ποντικοί θανατώθηκαν (η = 3 κάθε φορά), οι όγκοι απομακρύνονται αμέσως και ομογενοποιήματα καρκινικών παρασκευάστηκαν επί πάγου. Το αδιάλυτο υλικό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση και το υπερκείμενο που προέκυψε αναλύθηκε με RP-HPLC για την εκτίμηση διάσπαση.

Ζυμογράφημα διεξήχθη με προϊόντα ομογενοποίησης όγκου αποκομμένο ΗΤ1080 χρησιμοποιώντας ένα Novex Ζυμόγραμμα Gel (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

η αποτελεσματική δόση της MDAP

3000 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την περιοχή κάτω από τις καμπύλες ραδιενέργειας χρόνο μη-διάσπαση-διορθωθεί που δημιουργείται από τα δεδομένα βιοκατανομής για κάθε όργανο με το πρότυπο πλατφόρμα ποσοτικοποίηση περιλαμβάνονται στο λογισμικού όργανο επιπέδου της εσωτερικής αξιολόγησης Δόση (OLINDA, Πανεπιστήμιο Vanderbilt) [8].

η στατιστική ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Bonferroni ή μη ζευγαρωμένα

t

δοκιμής. Ένα δίπλευρη τιμή

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Προετοιμασία των ανιχνευτών

MDAP

1000, MDAP

3000, ΜϋΑΡ

5000 και ΜϋΑΡ

CV ελήφθησαν με μεγαλύτερη από 95%, 97%, 95%, και 98% ραδιοχημική καθαρότητα, αντίστοιχα (Εικ. 2). Η ειδική ραδιενέργεια των ανιχνευτών εκτιμήθηκε να είναι 2,8 MBq /nmol, η οποία εξαρτιόταν από την ραδιενέργεια του [

111In] συμπερ

3 που χρησιμοποιείται για τη διαδικασία ραδιοεπισήμανσης. Οι τιμές log Ρ των MDAP

1000, MDAP

3000, MDAP

5000 και MDAP

CV ήταν -0,56 ± 0,13, -0,95 ± 0,12, -1,04 ± 0,16 και 0,29 ± 0,07, αντίστοιχα.

RI διαγράμματα (α) MDAP

1000, (β) MDAP

3000, (γ) MDAP

5000, και (δ) MDAP

CV παρουσιάζονται με διαγράμματα UV του αντίστοιχου μη ραδιενεργού ενώσεων.

Η

In vitro

μελέτη

Όπως φαίνεται στο Σχ. 3α, ΜϋΑΡ

1000 έδειξαν υψηλή συσσώρευση ραδιενέργειας σε κύτταρα όγκου και τα επίπεδα που ήταν παρόμοια με ΜϋΑΡ

CV, ενώ ΜϋΑΡ

3000 και ΜϋΑΡ

5000 έδειξαν σημαντικά χαμηλότερη ραδιενέργεια. ΜΜΡ-2 διασπάται ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000 και ΜϋΑΡ

5000 σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 3b). ΜϋΑΡ

3000 προεπεξεργασία με ΜΜΡ-2 συσσωρευτεί σε κύτταρα σε υψηλότερα επίπεδα, ενώ επιπλέον θεραπεία με έναν αναστολέα ΜΜΡ μπλοκαριστεί εντελώς αυτή η αυξημένη πρόσληψη (Σχ. 3c).

(α) Κυτταρική συσσώρευση ΜϋΑΡ

1000, MDAP

3000, MDAP

5000 και MDAP

CV υπολογίζεται με μέτρηση της ραδιενέργειας. (Β) Διάσπαση (%) του ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

5000 που προκύπτουν από την κατεργασία ΜΜΡ-2. Οι τιμές υπολογίστηκαν με HPLC αντίστροφης φάσης. (Γ) Κυτταρική συσσώρευση MDAP

3000 με ή χωρίς πρωτεΐνη ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ αναστολέα (GM6001).

Η

In vivo μελέτη

προφίλ κατανομής της ραδιενέργειας μετά από ενδοφλέβια χορήγηση ΜϋΑΡ

1000, ΜϋΑΡ

3000 και ΜϋΑΡ

CV παρουσιάζονται στους πίνακες 2, 3 και 4, αντίστοιχα. Για να συγκρίνετε φαρμακοκινητική ανιχνευτή, οι αλλαγές στην ραδιενέργεια στο αίμα και όγκου χαράσσεται ως συνάρτηση του χρόνου μετά τη χορήγηση (Σχ. 4α, β), και ως λόγους όγκου προς αίμα (Σχ. 4c). MDAP

3000 παρουσίασε ταχεία κάθαρση του αίματος (Σχ. 4α) και τη συσσώρευση υψηλού όγκου (Εικ. 4β). Έτσι, μεταξύ των ανιχνευτών ΜϋΑΡ

3000 επιτευχθούν σημαντικά υψηλότερες αναλογίες όγκου προς αίμα (2,74 ± 0,89 σε 24 ώρες, Πίνακας 3 και το Σχ. 4c). MDAP

1000 και παρουσίασε ταχεία κάθαρση του αίματος (Σχ. 4α), αλλά έδειξε συσσώρευση χαμηλό όγκο (Εικ. 4β). Εν τω μεταξύ, ΜϋΑΡ

CV έδειξε μια αργή κάθαρσης του αίματος (Σχ. 4α) και το χαμηλότερο λόγους όγκου προς αίμα κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου (0,30 ± 0,02 σε 24 ώρες, Πίνακας 4 και Εικ. 4γ). Φαρμακοκινητικές αναλύσεις επί ολόκληρο το σώμα (Πίνακας 5) και όγκων (Πίνακας 6) αποκάλυψε τα παραπάνω σημεία που υποδεικνύονται από τα δεδομένα βιοκατανομής με μεγαλύτερη σαφήνεια. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5, MDAP

3000 και MDAP

CV εμφανίζεται παρόμοια όγκους διανομής, ενώ MDAP

CV έδειξε πιο αργή συνολική κάθαρση, καθώς και μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής και ο μέσος χρόνος παραμονής από MDAP

3000. Ο Πίνακας 6 παρουσιάζει ένα περίπου επτά φορές πιο αργή έκπλυση ποσοστό MDAP

3000 από τον όγκο (Κ2 = 1.2 × 10

-3 λεπτά

-1) σε σύγκριση με MDAP

CV (k2 = 8.6 × 10

-3 λεπτά

-1). Επιπλέον, η ανάλυση HPLC των όγκων αποκόπηκε 3, 6 και 24 ώρες μετά την ενδοφλέβια ένεση του ΜϋΑΡ

3000 έδειξε μια ορισμένη κλάσμα ΜϋΑΡ

CV υπήρχε στον όγκο (Σχ. 5, λευκό βέλος). Η ανέπαφη μορφή ΜϋΑΡ

3.000 που υποδεικνύεται από το μαύρο βέλος εξαφανίστηκε με το χρόνο, όπως φαίνεται στο διάγραμμα HPLC. Ένα ορισμένο κλάσμα του ΜϋΑΡ

CV ήταν επίσης παρούσα στο εσωτερικό του όγκου μετά από ενδοογκική ένεση ΜϋΑΡ

3000, τα οποία θα μπορούσαν να μπλοκαριστεί από θεραπεία αναστολέα (Εικ. 6). Άλλες κορυφές που παρατηρούνται γύρω από 5-10 λεπτά θα μπορούσε να αποτελέσει περαιτέρω μεταβολίτες που παράγονται στο εσωτερικό των κυττάρων. ΜΜΡ-2 ενζυματική δραστικότητα του ομογενοποιήματος όγκου επιβεβαιώθηκε με ζυμογραφία (Εικ. 7). Η αποτελεσματική δόση του MDAP

3000 εκτιμάται από τα δεδομένα βιοκατανομής ήταν 5,08 × 10

-2 mSv /MBq.

(α) οι καμπύλες χρόνου ραδιενέργειας στο αίμα. (Β) Χρόνος καμπύλες ραδιενέργειας σε όγκους. (Γ) του όγκου σε αναλογίες ραδιενέργειας στο αίμα.

Η

Μαύρο και άσπρο βέλη δείχνουν τις άθικτο και διασπασμένο κορυφές, αντίστοιχα.

Η

Απλή αναζήτηση

η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τη σκοπιμότητα και τη χρησιμότητα της νέας στρατηγικής για τον σχεδιασμό των φαρμάκων μας όπου η ΜΜΡ-2 δραστηριότητα που εξαρτάται από MDAP ανιχνευτή αγκύρωσης χρησιμοποιείται για την ΜΜΡ-2 απεικόνισης δραστικότητα στον καρκίνο. Τόσο

in vitro

και

in vivo

πειράματα έδειξαν ότι MDAP

3000 εμφανίζεται κυτταρικής μεμβράνης αγκύρωσης ιδιότητες μετά την διάσπαση του υποστρώματος από ΜΜΡ-2 σε όγκους, η οποία οδήγησε σε μια κάπως πιο αργή έκπλυση της ραδιενέργειας από όγκους. Ως εκ τούτου, έχουμε καταδείξει με επιτυχία την πιθανή εφαρμογή της στρατηγικής MDAP μας για την απεικόνιση του όγκου.

Κατά τη διάρκεια των αρχικών σταδίων του σχεδιασμού καθετήρα, έχουμε επιλέξει μια διπλή αλυσίδα αλκυλίου ως αγκύρωσης μονάδα βασίζεται σε προηγούμενη έκθεση στην οποία αναφέρεται ότι η διπλή αλκυλο αλυσίδες ήταν ανώτερες ενιαίο αλκυλικές αλυσίδες για αγκύρωση κυτταρικής μεμβράνης. Το μήκος της διπλής αλυσίδα αλκυλίου (ομάδα παλμιτοϋλ και 10-αμινο-δεκανοϊκό οξύ στις δομές καθετήρα) επιλέχθηκε με βάση τα αποτελέσματα από ένα πείραμα πρόσδεσης προκαταρκτική κύτταρο. Εμείς στη συνέχεια συνδυάζονται άλλες ομάδες για να εκπληρώσει τις απαιτήσεις για την MDAP. Συγκεκριμένα, επελέγη

111In για ραδιοεπισήμανση λόγω απλή και γρήγορη ραδιοσύνθεσης του με ένα υδρόφιλο παράγοντα χηλίωσης (DTPA), συζευγμένης πρόδρομος υπό ήπιες συνθήκες [9]. Μεταξύ προηγουμένως αναφερθεί ΜΜΡ-2 πεπτίδια υπόστρωμα, Pro Leu Gly Val Arg-Gly—-επελέγη έτσι ώστε τα υπολείμματα άμινο άκρο (Pro-Leu-Gly) θα διατηρήσει τη ραδιενέργεια τους μετά τη διάσπαση και όχι αναστέλλουν την αγκύρωση ιδιότητα του διπλού αλυσίδα αλκυλίου [10]. PEG επιλέχθηκε λόγω της υδροφιλικότητας και στερεοχημική παρεμπόδιση που θα της επιτρέψουν να λειτουργεί ως αναστολέας των ανιχνευτών ΜϋΑΡ και τρεις τύπους μόριο PEG (ΜΒ: 1000, 3000, και 5000) εξετάστηκαν για να προσδιοριστεί η βέλτιστη μοριακό βάρος τόσο από την άποψη της ανασταλτικά χωρητικότητα αγκύρωσης και αντοχής σε διάσπαση ΜΜΡ-2. Ως αποτέλεσμα, έχουμε λάβει επιτυχώς ραδιοσημασμένους ανιχνευτές ΜϋΑΡ με υψηλή ραδιοχημική απόδοση και καθαρότητα που επέτρεψαν τη χρήση τους σε

in vitro

και

in vivo πειράματα

χωρίς επιπλέον καθαρισμό.

PEG συχνά χρησιμοποιείται για να τροποποιήσει το μοριακό ανιχνευτές για να αλλάξει υδροφιλίας τους και η φαρμακοκινητική [11], [12]. Ως εκ τούτου, περιμέναμε τόσο την υδροφιλικότητα και στερεοχημική παρεμπόδιση της PEG να μεταβάλλουν τις ιδιότητες του ΜϋΑΡ. Cellular αποτελέσματα συσσώρευση χωρίζεται σαφώς τους ανιχνευτές σε μια ομάδα υψηλού συσσώρευσης (MDAP

1000 και MDAP

CV) και χαμηλή ομάδα συσσώρευση (MDAP

3000 και MDAP

5000), όπου το υδρόφιλο καθετήρα αυξάνεται σταδιακά με την μοριακό βάρος της PEG, όπως φαίνεται στα λαμβανόμενα τιμές log Ρ. Ως τέτοια, η στερεοχημική παρεμπόδιση και όχι η υδροφιλικότητα προσδίδεται από PEG λειτούργησε ως αναστολέας της χαρακτηριστικής ομάδας αγκύρωσης ανιχνευτή. Ενώ MDAP

1000, MDAP

3000, και MDAP

5000 αποκόπηκαν από ΜΜΡ-2, όπως αναμενόταν, το διάσπασης της MDAP

5000 ήταν μάλλον χαμηλή, η οποία έδειξε ότι η PEG που βρίσκονται γύρω από το καθετήρα αναστέλλεται της αλληλεπιδράσεις με άλλα μόρια, περιλαμβανομένης της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2. Έτσι, οι

in vitro

πειράματα έδειξαν ότι MDAP

3000 αναγνωρίστηκε ως πιθανή κατάλληλο καθετήρα για την περαιτέρω

in vivo

αξιολόγηση.

Το

in vivo

μελέτη βιοκατανομής αποκάλυψε μια ταχεία κάθαρση του αίματος και υψηλό όγκο πρόσληψη ΜϋΑΡ

3000 μετά από ενδοφλέβια ένεση, ενώ ΜϋΑΡ

CV έδειξαν υψηλή ραδιενέργεια στο αίμα και όγκους. Έτσι, ένα σημαντικά υψηλότερο όγκο αναλογία ραδιενέργειας του αίματος (αναλογία Τ /Β), ένας δείκτης απεικόνισης για [9], ελήφθη για την ΜϋΑΡ

3.000 ομάδα, αναφέροντας τις ανώτερα χαρακτηριστικά του ΜϋΑΡ

3000 ως μέσο απεικόνισης

in vivo

. Η αποτελεσματική δόση του ΜϋΑΡ

3000 εκτιμάται από τα δεδομένα βιοκατανομής ήταν αποδεκτή για τη χρήση ΜϋΑΡ

3000 ως μέσο απεικόνισης [13]. Από την άλλη πλευρά, ΜϋΑΡ

CV έδειξαν υψηλή ραδιενέργεια που παραμένει στο αίμα, η οποία συνεπάγεται μη ειδική σύνδεση με πρωτεΐνες ορού και /ή τα κύτταρα του αίματος. Αυτό το αποτέλεσμα πρότεινε ότι χορηγείται ενδοφλεβίως ΜϋΑΡ

CV μπορεί να δεσμεύεται με τις πρωτεΐνες του ορού και υπάρχουν μέσα στον ενδιάμεσο χώρο των όγκων ως σύνθετη μορφή. Η δυνατότητα αυτή υποδεικνύεται επίσης με ΜϋΑΡ

CV που έχει τις χαμηλότερες αναλογίες Τ /Β (λιγότερο από 0,3) κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου. Οι MDAP

CV αποτελέσματα βιοκατανομής έδειξαν ότι MDAP

CV που παράγονται σε άλλους ιστούς μετά από συστηματική χορήγηση MDAP θα αναδιανεμηθεί λιγότερο συχνά στους όγκους. Έτσι, η συσσώρευση του όγκου των MDAP

3000 δεν ήταν προέρχεται από αναδιανομή του διασπαστεί MDAP

CV αφού MDAP

3000 έδειξε ταχεία κάθαρση του αίματος και αύξηση του λόγου /Β Τ με το χρόνο μετά από ενδοφλέβια χορήγηση. Παρ ‘όλα αυτά, υπήρξε μια μετρήσιμη ποσοστό ΜϋΑΡ

CV που υπάρχουν σε όγκους μετά από ενδοφλέβια και εντός του όγκου εγχύσεις ΜϋΑΡ

3000, και ΜϋΑΡ

CV που προκύπτουν από ενδοογκική ένεση ΜϋΑΡ

3000 ήταν κάπως μειωμένη από την ΜΜΡ απαγορευτής. ΜϋΑΡ

CV μπορούσαν να παραχθούν στον όγκο, ως αποτέλεσμα της ΜϋΑΡ

3000 διάσπαση από ΜΜΡ-2. HPLC αναλύσεις σχετικά με εκτομή όγκων δείχνουν επίσης τη συσσώρευση και διατήρηση των MDAP

3000 που ακολουθείται από σταδιακή υποβάθμιση σε υδρόφιλα μεταβολίτες σε όγκους. Είναι λογικό από τη στρατηγική MDAP που φαρμακοκινητικής ανάλυσης που προβλέπονται σημαντικά βραδύτερο ρυθμό κάθαρσης (τιμή k2) για MDAP

3000 σε σύγκριση με MDAP

CV, επειδή το βραδύτερο ρυθμό κάθαρσης για MDAP

3000 δείχνει MDAP

3000 ραδιενέργεια σύλληψης σε όγκους. Αναφορικά με τους περιορισμούς της παρούσας μελέτης, άμεση απόδειξη ότι ΜϋΑΡ

3000 ήταν αγκυροβολημένο στην κυτταρική μεμβράνη μετά την ενεργοποίηση ΜΜΡ-2 σε καρκινικούς ιστούς δεν επιτεύχθηκε. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον ο ανιχνευτής ΜϋΑΡ εδράζεται στην κυτταρική μεμβράνη μετά την ενεργοποίηση ΜΜΡ-2 με μεγαλύτερη ακρίβεια, περαιτέρω μελέτες όπως η ανάλυση HPLC των κλασμάτων μεμβράνης από τα κύτταρα όγκου μόνα ή συνεστιακή μικροσκοπία προσεγγίσεις χρησιμοποιώντας ένα κατάλληλο φθοριοφόρο εισάγεται σε ΜϋΑΡ

3000 είναι απαιτείται. Ωστόσο, η

in vitro

και

in vivo

μελέτες έκανε επίδειξη MMP-2 διάσπασης εξαρτάται ανιχνευτή, τη διατήρηση της ραδιενέργειας σε ιστούς όγκων και αργή έκπλυση από ιστούς όγκων, υποδεικνύοντας την πιθανή εφαρμογή του MDAP . στρατηγική

Παρά το γεγονός ότι έχουν φθορισμού που ενεργοποιείται ανιχνευτές έχουν αναφερθεί για MMP απεικόνισης [14] – [17], η πυρηνική ιατρική απεικόνιση έχει μεγάλες δυνατότητες για

in vivo

εφαρμογές επειδή μπορεί ποσοτικά να ανιχνεύσει σήματα από τους ιστούς βαθιά στο σώμα, αλλά επίσης μπορεί να εφαρμοστεί για χρήση σε καρκίνο θεραπείες που περιλαμβάνουν α, β, ή εκπομπούς τρυπάνι ηλεκτρονίων [18], [19]. Από ΜϋΑΡ

3000 θα μπορούσε να επιτρέψει επιλεκτική ανάγνωση της ενεργοποιημένης ΜΜΡ-2 υποπληθυσμός λόγω ενίσχυσης σήματος, σε σύγκριση με ανιχνευτές πρόσδεσης ΜΜΡ, ΜϋΑΡ

3000 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός ένωση μολύβδου για χρήση σε μελλοντικές εφαρμογές. Περαιτέρω μελέτες για να συγκρίνετε MDAP

3000 με άλλα ραδιοσημασμένο ανιχνευτές απεικόνισης MMP έτσι δικαιολογείται [20], [21].