Αφηρημένο

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η χημειοπροληπτική επίδραση ενός μυθιστορήματος φλαβονοειδών, ampelopsin (AMP) σχετικά με την ανάπτυξη και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. AMP έδειξε την πιο ισχυρή δραστικότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των ανδρογόνων ευαίσθητα LNCaP και, σε μικρότερο βαθμό, ανδρογόνο-ανεξάρτητες PC-3 ανθρώπινου προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές in vitro, κυρίως με επαγωγή της απόπτωσης που σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση του bcl-2. Από την άλλη πλευρά, ΑΜΡ έδειξε πολύ λιγότερη δραστηριότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη από εκείνη του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές. AMP επίσης ανέστειλε την μετανάστευση και την εισβολή του PC-3 κύτταρα in vitro που σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CXCR4. Στη μελέτη ζώο χρησιμοποιώντας ένα ορθοτοπικό πρότυπο όγκου προστάτη, ΑΜΡ (150 και 300 mg /kg σωματικού βάρους) ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-3 όγκων και των λεμφαδένων και των μεταστάσεων πνεύμονα σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε σύγκριση με τους ποντικούς ελέγχου, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ΑΜΡ στα 300 mg /kg σωματικού βάρους είχαν μειωμένη τελικό βάρος του όγκου κατά 49,2% (Ρ & lt? 0,05), λεμφαδένα μεταστάσεων κατά 54,5% (Ρ = 0,3) και πνευμονικών μεταστάσεων κατά 93% (Ρ & lt? 0.05), αλλά δεν είχε καμία εμφανή αλλαγή στην πρόσληψη τροφής ή το σωματικό βάρος. Οι δραστηριότητες σε βιολογικό περιβάλλον αντί-ανάπτυξης και αντι-μετάσταση του ΑΜΡ σχετίζονται με την επαγωγή της απόπτωσης και αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, η μείωση της αγγειογένεσης του όγκου του προστάτη, και η μείωση της έκφρασης CXCR4. Τα αποτελέσματά μας παρέχει επαρκή αποδεικτικά στοιχεία για να δικαιολογήσουν την περαιτέρω έρευνα για την ανάπτυξη AMP ως ένα νέο αποτελεσματικό και ασφαλές υποψήφιο παράγοντα κατά την εξέλιξη και τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Ni F, Γκονγκ Υ, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) Φλαβονοειδών Ampelopsin αναστέλλει την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του προστάτη in vitro και in ποντίκια. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10.1371 /journal.pone.0038802

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Δεκεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 10η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 5, Ιουν 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα του κινεζικού υπουργείου Υγείας & amp? Ηνωμένες Fujian Provincial Υγείας και Παιδείας (WKJ2008-2-60), Ίδρυμα της Fujian Επαρχιακό Τμήμα Επιστήμης & amp? Τεχνολογίας (2011Y0015) και Επιστημονική Ίδρυμα Ερευνών της εκμετάλλευσης Βιομηχανικής Τεχνολογίας της Fujian Ανάπτυξης και της Επιτροπής Μεταρρυθμίσεων (2.008-762) στην FN, και το Υπουργείο Άμυνας (PC073988) και NCI /ΝΙΗ (R21 CA133865) για να JRZ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία της menuscript

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

προστάτη είναι η πιο κοινή επεμβατική κακοήθεια και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες στις ΗΠΑ εκτιμάται ότι 241.740 νέες περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη θα διαγνωστούν και περίπου 28.170 άτομα θα πεθάνουν από καρκίνο του προστάτη στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2012 [1]. Τρέχουσες θεραπευτικούς τρόπους για τον καρκίνο του προστάτη έχουν συνήθως μεταβλητή αποτελεσματικότητα, να αναπτύξουν μετάσταση και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, και έχουν υψηλή τοξικότητα σε κανονικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, η αναζήτηση για την αποτελεσματική σχήματα με μέτρια αρνητικές επιπτώσεις για την χημειοπροληπτικές παρέμβαση του καρκίνου του προστάτη παραμένει η κορυφαία προτεραιότητα στην έρευνα για τον καρκίνο του προστάτη.

βιοενεργών συστατικών στα βότανα και τα φυτικά φάρμακα μπορεί να παρέχει αποτελεσματική και ασφαλή υποψήφιοι για χημειοπροφύλαξη και /ή τη θεραπεία του καρκίνου. Κλασική κινεζική ιατρική κείμενα περιέχουν εκτενή εμπειρική αρχεία των βοτανικών θεραπειών που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο και τα συστήματα σχετίζονται με τον καρκίνο. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις φόρμουλες υποψήφιος βοτανική συνιστώνται βασίζονται μόνο σε κλινικές παρατηρήσεις. Επιπλέον, αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις ήταν σχεδόν πάντα από την ανεξέλεγκτη, μελέτες παρατήρησης ή ανέκδοτες αναφορές περιστατικών. Μέχρι πολύ πρόσφατα, υπήρξε περιορισμένη προσπάθεια για την ανάπτυξη προκλινικές, μηχανιστική, επιστημονική αξιολόγηση των βοτανικών φυτικά προϊόντα ως προαπαιτούμενο για ανθρώπινες κλινικές μελέτες.

Το κινεζικό βότανο

Ampelopsis grossedentata

κατανέμεται ευρέως στο Νότια Κίνα και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία κρύο και tinea corporis. Περιέχει μια πλούσια πηγή φυτοχημικών με ampelopsin (ΑΜΡ, (2R, 3R) -3,5,7-τριυδροξυ-2- (3,4,5-τριυδροξυφαινυλ) -2,3-dihydrochromen-4-όνη) η κύρια φλαβονοειδών. AMP καλείται επίσης dihydromyricetin και έχει παρόμοια δομή με μυρικετίνη (3,5,7-τριϋδροξυ-2- (3,4,5-τριυδροξυφαινυλ) -4-χρωμενόνης), ένα φυσικό φλαβονοειδές που βρίσκεται στα σταφύλια, τα μούρα, φρούτα, λαχανικά, βότανα και άλλα φυτά με ορισμένες δραστηριότητες αντι-καρκίνου. Καθώς το μεγαλύτερο βιοενεργό συστατικό του

Ampelopsis grossedentata,

ΑΜΡ δείχθηκε να είναι κυρίως υπεύθυνη για τις αναφερόμενες βιολογικές δράσεις, συμπεριλαμβανομένης της υπογλυκαιμικής [2], αντι-οξειδωτική [3], [4] και το συκώτι [4], [5] δραστηριότητες. AMP ενίσχυσαν επίσης τη χημειοκίνηση και χημειοταξία επιδράσεις των ουδετερόφιλων κοκκιοκυττάρων και μονοκυττάρων [6].

ΑΜΡ έχει δειχθεί ότι κατέχουν ορισμένες δραστηριότητες αντι-καρκίνου. AMP ανέστειλε την ανάπτυξη [7] και εισβολή κυττάρων μελανώματος in vitro [8], [9], και ανέστειλε τη μετάσταση των όγκων μελανώματος in vivo [8], [9]. AMP ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα in vivo με αναστολή του πολλαπλασιασμού [10]. AMP είχαν αντι-αγγειογένεσης δραστικότητα αναστέλλοντας την έκκριση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγοντας (bFGF) από κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος in vitro και ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη των ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε ποντικούς [11]. AMP αντιστρέφεται επίσης πολυφαρμακευτικής αντίστασης σε κύτταρα λευχαιμίας in vitro εν μέρει μέσω μείωση της έκφρασης ρ-γλυκοπρωτεΐνης [12]. Από την άλλη πλευρά, η επίδραση του ΑΜΡ στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη δεν έχει μελετηθεί.

Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει συστηματικά AMP ως δυνητικό χημειοπροληπτική και θεραπευτικές υποψήφιος κατά την πρόοδο του καρκίνου του προστάτη από χρησιμοποιώντας τόσο in vitro και in vivo συστήματα, και για τη διαλεύκανση των υποκείμενων κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών των δράσεων ΑΜΡ. Τα αποτελέσματά μας παρέχονται πειραματικές αποδείξεις για να υποστηρίξει τη μελλοντική ανάπτυξη της AMP ως ένα αποτελεσματικό και ασφαλές υποψήφιο παράγοντα για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου του προστάτη.

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις της AMP, το σύνολο των φλαβονοειδών εκχύλισμα (TFE) και μυρικετίνη επί του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη και φυσιολογικό προστάτη επιθηλιακά κύτταρα (PrEC) in vitro

Αρχικά έγινε σύγκριση της δραστηριότητας μεταξύ AMP, TFE και μυρικετίνη στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη και PrEC. Η ανάλυση καθαρότητα ΑΜΡ με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) έδειξε ότι AMP καθαρότητα ήταν περίπου 95%, και ο αντιπρόσωπος χρωματογράφημα HPLC δείχθηκε στο Σχ. S1. Οι συγκεντρώσεις TFE υπολογίστηκαν με βάση το επίπεδο του ΑΜΡ, έτσι η διαφορά μεταξύ της δραστηριότητας TFE και AMP αποδίδεται σε άλλα φυτοχημικά σε TFE. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1 (Α, Β, C), ΑΜΡ και TFE έδειξε τις παρόμοιες δραστηριότητες στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη ή φυσιολογικά κύτταρα του προστάτη, γεγονός που υποδηλώνει ότι AMP είναι η κύρια βιοδραστικά φλαβονοειδή σε TFE. AMP ή TFE ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό κυτταρικής γραμμής LNCaP στο IC

50 περίπου 25 μΜ (Εικ. 1Α), και ότι από PC-3 κυτταρική γραμμή στο IC

50 περίπου 60 μΜ (Σχ. 1Β). Από την άλλη πλευρά, ΑΜΡ ή TFE έδειξε πολύ λιγότερη δραστηριότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων του προστάτη από εκείνη του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών (Εικ. 1 C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η AMP ή TFE μπορεί να έχουν μέτρια /ελάχιστη παρενέργεια.

Α: Οι δοσοεξαρτώμενη επιπτώσεις της AMP, TFE και μυρικετίνη στον πολλαπλασιασμό των ανδρογόνων ευαίσθητη LNCaP κυτταρική σειρά? Β: Οι δοσοεξαρτώμενη επιδράσεις του ΑΜΡ, TFE και μυρικετίνη επί του πολλαπλασιασμού των ανεξάρτητων από ανδρογόνο κυτταρική γραμμή PC-3? Γ: Οι επιπτώσεις δοσοεξαρτώμενη της AMP, TFE και μυρικετίνη στον πολλαπλασιασμό των PrEC. Οι τιμές είναι μέσοι ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις τριπλούν.

Η

Σε αντίθεση, μυρικετίνη έδειξαν περισσότερο ισχυρή δραστικότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των PrEC από εκείνη των LNCaP ή PC-3. Αν και μυρικετίνη ανέστειλε την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών στο IC

50s & gt? 60 μΜ (Εικ. 1Α, 1Β), είναι ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων PrEC στο IC

50 περίπου 35 μΜ (Σχήμα 1 C). Λόγω της ισχυρής αντικαρκινικής δραστηριότητας και ελάχιστη παρενέργεια του ΑΜΡ, χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αξιολόγηση.

Επιδράσεις της ΑΜΡ στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη in vitro

ΑΜΡ σε 25 και 50 μΜ αύξησε σημαντικά το κλάσμα των κυττάρων LNCaP σε φάση S από 20% σε 28% (Ρ & lt? 0,05) και 74% (Ρ & lt? 0.001), αντίστοιχα (Σχήμα 2Β).. Από την άλλη πλευρά, ΑΜΡ στα 25 και 50 μΜ αύξησε το κλάσμα του PC-3 κύτταρα σε φάση S από 22% σε 28% (Ρ & gt? 0,05) και 34% (Ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα (Εικ. 2Ε), και στο G2 /M φάσεις από 17% έως 23% (Ρ & lt? 0,05) και 24% (Ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα (Σχήμα 2F).

Α, Β, και Γ:. Η δοσοεξαρτώμενη επίδραση ΑΜΡ για την κατανομή των κυττάρων LNCaP σε G1 (Α), S (Β) και G2 /M (C) φάσεις? D, Ε και F: Η εξαρτώμενη από την δόση επίδραση του ΑΜΡ στην κατανομή των PC-3 κύτταρα σε G1 (D), S (Ε) και /φάσεις G2 Μ (F). Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις διπλούν. Μέσα στον πίνακα, η τιμή με ένα γράμμα είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου, A, P & lt? 0,05? b, p & lt? 0,01? c, ρ & lt?. 0.001

Η

Αρκετές σχετίζονται βιοδείκτες του κυτταρικού κύκλου, όπως κύκλο κυτταρικής διαίρεσης 2 (CDC2), cdc25C, κυκλίνη Β1 και εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 2 (CDK2), προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western ανάλυση. AMP σημαντικά μειωτικά επίπεδο πρωτεΐνης CDK2 σε κύτταρα LNCaP (Σχ. 3Β, 3C) και CDC2 επίπεδο πρωτεΐνης σε PC-3 κύτταρα (Σχ. 3Ε, 3F), αλλά όχι άλλων συναφών βιοδείκτες κυτταρικού κύκλου.

Α και D : Η δοσοεξαρτώμενη επίδραση του ΑΜΡ στην αναλογία της κατάτμησης DNA (υπο-G

0), ένας δείκτης της απόπτωσης, σε LNCaP (α) και 3-PC (D) κυτταρικές σειρές? Β και Ε: Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες κηλίδα Western που δείχνει τα αποτελέσματα του ΑΜΡ στα επίπεδα πρωτεΐνης της προόδου του κυτταρικού κύκλου και βιοδεικτών που σχετίζονται με την απόπτωση σε LNCaP (Β) και (Ε) κυτταρικές σειρές PC-3? C και F: Η ποσοτικοποίηση της σημαντικά μεταβληθεί επιπέδων πρωτεΐνης σε LNCaP (C) και κυτταρικές γραμμές PC-3 (F) με πυκνομετρία μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Οι εικόνες για ποσοτικό προσδιορισμό ήταν από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις διπλούν. Μέσα στον πίνακα, η τιμή με ένα γράμμα είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου, A, P & lt? 0,05? b, p & lt? 0,01? c, p & lt?. 0.001

Η

Επιδράσεις της AMP για την επαγωγή της απόπτωσης των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη in vitro

AMP επίσης σημαντικά αυξημένο καρκίνο του προστάτη το DNA των κυττάρων του κατακερματισμού, το σήμα κατατεθέν για την απόπτωση. ΑΜΡ στα 25 και 50 μΜ σημαντικά επαγόμενη DNA κατάτμηση των κυττάρων LNCaP κατά 15 φορές (Ρ & lt? 0.001) και 70 φορές (Ρ & lt? 0.001) αντίστοιχα (Εικ. 3Α) και κύτταρα κατά 86% 3 PC-(Ρ & lt? 0,05 ) και 270% (Ρ & lt?. 0.001), αντίστοιχα (Σχήμα 3D), σε σύγκριση με τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. LNCaP κύτταρα υπέστησαν περαιτέρω επεξεργασία με ΑΜΡ στα 25 και 50 μΜ και σχετίζονται με την απόπτωση μοριακοί βιοδείκτες προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. AMP επαγόμενη απόπτωση LNCaP και PC-3 κύτταρα που συνδέονται με προς τα κάτω ρύθμιση της Bcl-2 (Σχ. 3Β, 3C, 3Ε, 3F).

Η απόπτωση επαγωγή επίδραση του ΑΜΡ σε PC-3 κυτταρική γραμμή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας τη ροή αννεξίνη V-PI κυτταρομετρία δοκιμασία. AMP έδειξε τη δόση και χρονοεξαρτώμενη επιδράσεις στην επαγωγή PC-3 κυττάρου απόπτωση (Σχ. S2).

Επιδράσεις της AMP για τη μετανάστευση και την εισβολή του PC-3 κύτταρα και προς τα κάτω ρύθμιση του επιπέδου της πρωτεΐνης CXCR4 in vitro

PC-3 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της AMP για τη μετανάστευση του καρκίνου του προστάτη και των κυττάρων εισβολής. ΑΜΡ στα 25 και 50 μΜ ανέστειλε σημαντικά PC-3 κυτταρική μετανάστευση κατά 26% (Ρ & lt? 0,05) και 63% (Ρ & lt? 0,01), αντίστοιχα (Εικόνα 4Α.) Και εισβολή κατά 27% (Ρ & lt? 0,05) και 45% (Ρ & lt? 0,01), αντίστοιχα (Εικόνα 4Β).. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα των ΑΜΡ στο PC-3 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή συνδέθηκε με ρύθμιση προς τα κάτω του επιπέδου CXCR4 πρωτεΐνης (Σχ. 4C, 4D), ένα σημαντικό βιοδείκτη για τον καρκίνο των κυττάρων εισβολή και μετάσταση. Σύμφωνα με την πειραματική κατάσταση (θεραπεία 16-hr), ΑΜΡ δεν προκάλεσε PC-3 κυττάρων κυτταροτοξικότητα, όπως μετράται με την trypan blue δοκιμασίας (Εικ. S3). Αυτό υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες αντι-μεταναστευτικών και αντι-εισβολής δραστηριότητες της AMP δεν είναι δευτερευόντως λόγω cytotixicity της

Α:. Η δοσοεξαρτώμενη επίδραση της AMP για τη μετανάστευση των PC-3 κύτταρα? Β: Η δόση-εξαρτώμενο αποτέλεσμα ΑΜΡ για εισβολή του PC-3 κύτταρα? C: Η εξαρτώμενη από την δόση επίδραση του ΑΜΡ στα επίπεδα πρωτεΐνης CXCR4 σε κύτταρα PC-3? D: Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης CXCR4 σε PC-3 κύτταρα με πυκνομετρία μετά από κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις διπλούν. Μέσα στον πίνακα, η τιμή με ένα γράμμα είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου, A, P & lt? 0,05? b, p & lt? 0,01? c, ρ & lt?. 0.001

Η

Επιδράσεις της ΑΜΡ στην ανάπτυξη και μετάσταση του ανεξάρτητου από ανδρογόνο PC-3 όγκους του προστάτη και διαμόρφωση πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, την έκφραση και την απόπτωση CXCR4 και αγγειογένεση όγκου σε ποντικούς

ένα ορθοτοπικό PC-3 ζώο όγκου μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της ΑΜΡ για την πρόληψη της ανάπτυξης και της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη. AMP ανέστειλε τόσο την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου in vivo με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. ΑΜΡ στα 150 και 300 mg /kg σωματικού βάρους μείωσε το τελικό βάρος του όγκου κατά 28% (Ρ & gt? 0,05) και 52% (Ρ & lt? 0,05) αντίστοιχα (Εικ. 5Α), ανέστειλε λεμφαδένων μεταστάσεων κατά 27% (Ρ & gt? 0,05) και 43% (Ρ & gt? 0,05) αντίστοιχα (Εικ. 5Β), και ανέστειλε πνευμονικών μεταστάσεων κατά 57% (Ρ & gt? 0,05) και 86% (Ρ & lt? 0,05) αντίστοιχα (Σχ 5C.). Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των πνευμονικών μεταστάσεων που φαίνεται στο Σχ. S4. Από την άλλη πλευρά, οι θεραπείες ΑΜΡ δεν μετέβαλε σημαντικά τη συνολική πρόσληψη τροφής (Σχ. 5D) ή τελικό σωματικό βάρος (σχ. 5Ε).

Οι τιμές είναι μέση τιμή ομάδας ± SEM (η = 8 /ομάδα). Μέσα στον πίνακα, η αξία με ένα γράμμα είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου, A, P & lt?. 0.05

Η

Οι αναλύσεις των κυτταρικών δεικτών έδειξαν ότι η θεραπεία AMP επάγεται σημαντικά προστάτη απόπτωση των καρκινικών κυττάρων κατά 200% (Εικ. 6Α, Ρ & lt? 0.001), μειωμένη προστάτη του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων κατά 60% (Σχήμα 6Β, Ρ & lt?. 0.001) και ανέστειλαν την αγγειογένεση του όγκου του προστάτη κατά 58% (Εικ. 6C, Ρ & lt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι AMP ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη με την επαγωγή της απόπτωσης, τη μείωση του πολλαπλασιασμού, και την αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου του προστάτη in vivo. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυτταρικών βιολογικών δεικτών που φαίνεται στο Σχ. S5. Η θεραπεία AMP μείωσε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης CXCR4 κατά 30% σε όγκους του προστάτη (Σχήμα 6D, P & lt?. 0.05).

Οι τιμές είναι ομάδα μέσος όρος ± SEM (n = 8 /ομάδα). Μέσα στον πίνακα, η τιμή με ένα γράμμα είναι σημαντικά διαφορετική από εκείνη του ελέγχου, A, P & lt? 0,05? c, p & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η AMP ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη μέσω της επαγωγής της απόπτωσης που σχετίζεται με αρνητική ρύθμιση της Bcl2 έκφρασης, και κατέστειλε καρκίνου του προστάτη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CXCR4 in vitro. Η μελέτη των ζώων επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι AMP μείωσε σημαντικά το τελικό βάρος του όγκου που σχετίζεται με την επαγωγή απόπτωσης προστάτη καρκινικών κυττάρων, την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και τη μείωση του προστάτη αγγειογένεση όγκου, και αναστέλλεται σημαντικά μεταστάσεις πνεύμονα. Από την άλλη πλευρά, ΑΜΡ σε αποτελεσματικές δόσεις δεν παρουσίασαν σημαντικές δυσμενείς επιπτώσεις στην πρόσληψη τροφής ή το σωματικό βάρος. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη, για καλύτερο της γνώσης μας, που έδειξαν την ανασταλτική δράση του ΑΜΡ στην ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του προστάτη in vitro και σε μια κλινικά σχετική ορθοτοπικό πρότυπο όγκου.

Κινητή μελέτες έδειξαν ότι ο μηχανισμός AMP ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, ΑΜΡ συνελήφθη κύτταρα LNCaP σε φάση S (Σχ. 2Β) στο μέρος μέσω κάτω ρύθμιση του CDK2 (Σχ. 3Β, 3C), ένα ουσιαστικό βιοδείκτη για την G1 /μετάβαση S, ενώ συνέλαβε PC-3 κύτταρα σε S και G2 /M φάσεις (Σχ. 2Ε, 2F) που σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση του CDC2 (Εικ. 3Ε, 3F). CDC2, επίσης γνωστή ως CDK1 (εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση 1), παίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου. CDC2 συνήθως συνδυάζεται με κυκλίνη Β και ρυθμίζει την S και G2 /M φάση εξέλιξης. CDC2 έχει θεωρηθεί ως ένα ουσιαστικό μοριακός στόχος για τον σχεδιασμό των θεραπευτικών φαρμάκων κατά του καρκίνου [13]. Κάτω ρύθμιση των CDC2 μπορεί να παρέχει ένα σημαντικό μοριακό μηχανισμό που συλλαμβάνει AMP πρόοδο του κυτταρικού κύκλου από PC-3 κύτταρα σε S και G2 /M φάσεις. Ανάλυση των in vivo δείγματα όγκων επιβεβαίωσε επίσης ότι AMP ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου PC-3 σχετίζεται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 6Β).

Η επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη είναι επίσης ένας σημαντικός μηχανισμός με τον οποίο AMP αναστέλλουν η ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. AMP απόπτωση που επάγεται από κύτταρα καρκίνου του προστάτη in vitro (Εικ. 3Α, 3D) και in vivo (Σχ. 6Α). Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι η επαγωγή της απόπτωσης συνδέθηκε με προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης bcl-2 (Σχ. 3C, 3F). Bcl-2 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της απόπτωσης. Η έκφραση του bcl-2 είναι πιο συχνή σε υψηλής ποιότητας όγκων και μεταστάσεων σε σύγκριση με χαμηλότερης ποιότητας και μη μεταστατικό όγκους [14], [15]. αντίσταση απόπτωση συνδέεται με υψηλότερα επίπεδα του bcl-2 [15], [16], και προς τα κάτω ρύθμιση του bcl-2 ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη να υποστούν απόπτωση [17]. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση του bcl-2 θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό μοριακό μηχανισμό με τον οποίο AMP προκαλεί απόπτωση του καρκίνου του προστάτη.

Η αγγειογένεση είναι ένα κρίσιμο βήμα στην ανάπτυξη του όγκου [18]. Η ανάπτυξη όλων των συμπαγών όγκων εξαρτάται από την αγγειογένεση και την καταστολή των αιμοφόρων αγγείων του όγκου και προσφέρει μια νέα επιλογή για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου [19]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι AMP είχε αντι-αγγειογένεσης δραστικότητα αναστέλλοντας την έκκριση του προ-αγγειογόνο παράγοντα VEGF και bFGF από ανθρώπινα κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος in vitro [11]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι AMP ανέστειλε την ανάπτυξη των PC-3 προστατικού όγκου σχετίζεται με την αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου (Σχ. 6C). Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε μετρήσει το VEGF και τα επίπεδα bFGF in vivo, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν την προϋπόθεση πειραματικές αποδείξεις που υποστηρίζουν ότι ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους ΑΜΡ αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω αναστολής της αγγειογένεσης. Περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για τον προσδιορισμό των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών που ΑΜΡ αναστέλλει την αγγειογένεση των όγκων.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η AMP ανέστειλε την εισβολή in vitro και in vivo ικανότητα μετάστασης του μελανώματος Β16 [8]. Ωστόσο, δεν έχει μελετηθεί εάν AMP είχαν δραστικότητα αντι-μετάσταση στον καρκίνο του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η AMP είχαν ισχυρές δραστικότητες στην αναστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro και προστάτη μετάστασης καρκίνου στον ορθοτοπικό όγκο του προστάτη ζωικό μοντέλο που σχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CXCR4. CXCR4 εμπλέκεται σε διάφορες νόσους όπως η αγγειογένεση, μεταβολικές και νευρολογικές διαταραχές, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και σε διάφορες μορφές του μεταστατικού καρκίνου. CXCR4 είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την διεισδυτικότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού [20], [21], [22] και παίζει έναν κεντρικό ρόλο για την ανάπτυξη των κακοηθών νευρωνικών και νευρογλοιακών όγκων [23]. Οι αναστολείς CXCR4 προτείνονται για την θεραπεία των διαφόρων μορφών του μεταστατικού καρκίνου [24], [25], [26]. AMP έχει δειχθεί να είναι ένα μικρό μόριο ανταγωνιστής CXCR4 [27], [28]. Αν και δεν μελέτη αν CXCR4 ήταν άμεσο μοριακός στόχος για ΑΜΡ, οι μελέτες μας δείχνουν ότι ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους ΑΜΡ αναστέλλει μετάσταση καρκίνου του προστάτη μπορεί να είναι μέσω μειορρύθμιση της έκφρασης CXCR4 και λειτουργία. Περαιτέρω έρευνα σε εφαρμογή AMP ή /και τα παράγωγά του ως νέα αντι-μετάσταση για την καθυστέρηση ή /και πρόληψη της μετάστασης του καρκίνου θα μπορούσαν να έχουν σημαντικές επιπτώσεις για την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου.

Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα από τη μελέτη αυτή προβλέπεται κρίσιμης σημασίας πειραματικά στοιχεία που δείχνουν ότι η AMP μπορεί να είναι μια νέα αποτελεσματική και ασφαλής υποψήφιο παράγοντα για να αναστέλλουν την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Όλες οι διαδικασίες με ζώα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών ζώων στο Beth Israel Deaconess Medical Center με τον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου.

TFE, ΑΜΡ και μυρικετίνη

Μία διαδικασία εκχύλισης ιδιόκτητη εφαρμόστηκε για την εκχύλιση TFE από

Ampelopsis grossedentata

με περιεκτικότητα ΑΜΡ σε περίπου 80%. AMP καθαρίστηκε από TFE με παρασκευαστική HPLC? και η καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με αναλυτική HPLC αντίστροφης φάσης. Μυρικετίνη αγοράστηκε από LKT Laboratories (St. Paul, MN). HPLC ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει την ποιότητα των υλικών. Όλα τα υλικά διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) για μελέτες κυτταροκαλλιέργειας.

Culture των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη και τα ενδοθηλιακά κύτταρα

Δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανθρώπινης, ευαίσθητο σε ανδρογόνο LNCaP και ανδρογόνο-ανεξάρτητων PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα in vitro. Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη διατηρήθηκαν σαν καλλιέργειες μονοστοιβάδας σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 μmol L-γλουταμίνη /mL, 100 U πενικιλλίνη /ml και 100 μg στρεπτομυκίνη /mL σε 95% αέρα, 5% CO

2, και κορεσμένη με νερό ατμόσφαιρα. PrEC κύτταρα αγοράστηκαν από την Lonza (Walkersville, MD) και καλλιεργήθηκαν σε PrEGM συν EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkersville, MD) σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2.

Η ανάπτυξη των κυττάρων

Η επίδραση της ΑΜΡ, TFE και μυρικετίνη στην κυτταροτοξικότητα καρκινικών κυττάρων του προστάτη ή PrEC προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την κυτταρική Titer 96 Aqueous Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] . Η δοκιμασία προσδιορίζει τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων σε πολλαπλασιασμό, κυτταροτοξικότητα και τηςχημειοευαισθησίας. Όλες οι δοκιμασίες ανεξάρτητα επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές, κάθε εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με απαρίθμηση άμεση κύτταρο χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο.

Ανάλυση της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη του κυτταρικού κύκλου και του DNA του κατακερματισμού

Η επίδραση του θεραπεία AMP για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής ακολουθώντας τις διαδικασίες που περιγράφονται [30]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του ΑΜΡ, χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (σε τελική συγκέντρωση 50 μg /ml) και RNase (σε τελική συγκέντρωση 50 μg /ml), και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Χρωματισμένα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν με FACScan (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA) για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου και κατακερματισμένου DNA. Τα πειράματα ανεξάρτητα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, κάθε εις διπλούν.

αννεξίνης V και χρώση ΡΙ για

ανίχνευσης απόπτωσης

Η επίδραση του ΑΜΡ στην απόπτωση των PC-3 κύτταρα περαιτέρω προσδιορίστηκε με Annexin κιτ ανίχνευσης απόπτωσης V-ΡΙ (Chemicon International Inc, Billerica, ΜΑ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κιτ. Εν συντομία, θεραπεία PC-3 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυμα Annexin V και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά, ΡΙ προστέθηκε τότε για άλλα 5 λεπτών επώαση στο σκοτάδι. Τα αποπτωτικά κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον δύο φορές, κάθε εις διπλούν.

Δοκιμασίες

μετανάστευση κυττάρων του καρκίνου και την εισβολή

Ένα εναιώρημα κυττάρων PC3 (6000 κυττάρων για μετανάστευση και 30.000 κύτταρα για εισβολή) σε 250 μL ϋΜΕΜ άνευ ορού με AMP ή το όχημα (DMSO) φορτώθηκε σε ένα ένθετο ινονηκτίνη επικαλυμμένες για δοκιμασία μετανάστευσης ή ένα ένθετο επικαλυμμένα με Matrigel για δοκιμασία εισβολής (Biocoat, πλάκα 24 φρεατίων, 8 μm, Becton Dickinson). Κάθε ένθετο καλλιέργεια τέθηκε σε ένα φρεάτιο που περιέχει 750 μι ϋΜΕΜ με 5% FBS. Μετά από επώαση για 16 ώρες στους 37 ° C, τα κύτταρα στην κορυφή του ένθετα απομακρύνθηκαν προσεκτικά χρησιμοποιώντας ένα άκρο βαμβάκι, και τα κύτταρα στην κάτω πλευρά του ενθέτου μεμβράνης βάφτηκαν με Diff-Quick Stain διαλύματα (Dade Behring Inc., Newark, DE) και οι εικόνες συλλήφθηκαν. Τα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Όλες οι δοκιμασίες ανεξάρτητα εκτελείται τουλάχιστον τρεις φορές, κάθε μία εις τριπλούν.

Για να επιβεβαιώσετε ότι ο αντι-μεταναστευτικών και αντι-εισβολής δραστηριότητες της AMP δεν ήταν δευτερευόντως λόγω κυτταροτοξικότητα της για PC-3 κύτταρα, κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΜΡ (0, 25, και 50 μΜ) για 16 ώρες, και τους αριθμούς των κυττάρων μετρήθηκαν με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Το πείραμα εκτελέστηκε ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές, κάθε εις διπλούν.

Western ανάλυση κηλίδος

Για την μελέτη in vitro, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ΑΜΡ, λύματα κυττάρων παρασκευάστηκαν και πρωτεΐνη επίπεδα προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western ακολουθώντας τις διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως [31]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε κηλίδα Western έναντι ανθρώπινων αντιγόνων ήταν ως εξής: κυκλίνη Β1 (1:200), cdc2 (1:500) και bax (1:500) (Oncogene Research Products, Boston, ΜΑ), bcl-2 (1 :100), ρ21 (1:200) και p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Σέλεκ Chemicals, Houston, TX), CXCR4 (1:200) ( Ε & amp? συστήματα D, Inc, USA), και β-ακτίνη (1:10,000) (Merck Co., Darmstadt, Germany). Για την in vivo μελέτη, τα δείγματα όγκων τόσο στον έλεγχο και την AMP-αγωγή ομάδες συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot του επιπέδου της πρωτεΐνης CXCR4.

μελέτη των ζώων

Η δραστηριότητα χημειοπροληπτικές παρέμβαση της AMP για την την ανάπτυξη και μετάσταση του PC-3 όγκων προσδιορίσθηκε σε ένα ορθοτοπικό PC-3 ζώο όγκου μοντέλο. Αρσενικά σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια ποντικούς (6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από την Taconic (Germantown, ΝΥ), και στεγάστηκαν στην εγκατάσταση ζώων του Beth Israel Deaconess Medical Center σε περιβάλλον άνευ παθογόνου εξοπλισμένο με κουκούλες στρωτή ροή και τυπική κλουβιά βινύλιο με φίλτρα αέρα. Μετά από μία εβδομάδα εγκλιματισμού και προσαρμογής στην δίαιτα ΑΙΝ-93, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε μία από τις ακόλουθες τρεις πειραματικές ομάδες (σε κάθε ομάδα, η = 8) και προκατεργάστηκαν μέσω καθετήρα στομάχου ημερησίως για 2 εβδομάδες: (i) Έλεγχος: η όχημα (αραβοσιτέλαιο 100 μL)? (Ii) ΑΜΡ στα 150 mg /kg βάρους σώματος (BW)? και (iii) ΑΜΡ στα 300 mg /kg BW. Κάθε ποντικός στη συνέχεια εμφυτεύονται ορθοτοπικά με PC-3 κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα /50 μL) και συνεχίστηκε επί τις αντίστοιχες θεραπείες διάρκεια του πειράματος. Η πρόσληψη τροφής και το σωματικό βάρος μετρήθηκαν εβδομαδιαίως. Στο τέλος του πειράματος (8 εβδομάδες μετά PC-3 εμφύτευση κυττάρων), οι ποντικοί θυσιάστηκαν? πρωτογενείς όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Μια φέτα όγκου από κάθε ιστό πρωτοπαθούς όγκου προσεκτικά αποκόπηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμιστικό διάλυμα-εξουδετερωμένο φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε πάχος 4 μm για ανοσοϊστοχημεία. Όλες οι διαδικασίες με ζώα εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών ζώων στο Beth Israel Deaconess Medical Center με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου [32]. Η μελέτη των ζώων επαναλήφθηκε.

Η in situ ανίχνευση αποπτωτικών δείκτη

κύτταρα αποπτωτικά προσδιορίστηκαν με ένα τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση δεοξυουριδίνη τριφωσφορική-βιοτίνης nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας (Chemicon International Inc , Billerica, ΜΑ) ακολουθώντας περιγράφεται πρωτόκολλα μας [30], [33], [34]. Επελέγησαν έξι αντιπροσωπευτικές περιοχές του κάθε τμήματος χωρίς νέκρωση και οι δύο αποπτωτικά κύτταρα και συνολικών πυρήνων κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός στα 400 × μεγέθυνση. Η αποπτωτική δείκτης εκφράζεται ως το ποσοστό των θετικών αποπτωτικών καρκινικών κυττάρων σε ολικά κύτταρα του όγκου, και το αποτέλεσμα της θεραπείας επί της απόπτωσης εκφράστηκε ως το ποσοστό του ελέγχου.

Ανοσοϊστοχημική προσδιορισμός πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων

Ο δείκτης πολλαπλασιασμού αξιολογήθηκε με υπολογισμό της αναλογίας των κυττάρων με χρώση Κί-67, ακολουθώντας τις διαδικασίες στο εργαστήριο [31]. Τόσο Ki-67-θετικά πολλαπλασιαστικά κύτταρα και τα συνολικά κύτταρα όγκου μετρήθηκαν σε έξι μη-νεκρωτικές περιοχές του κάθε τμήματος χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός στα 400 × μεγέθυνση. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε ως το ποσοστό του Ki-67-θετικά κύτταρα όγκου στο σύνολο των κυττάρων του όγκου, και το αποτέλεσμα της θεραπείας επί του πολλαπλασιασμού εκφράστηκε ως το ποσοστό του ελέγχου.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της πυκνότητας μικροαγγείων (MVD )

MVD χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για την αγγειογένεση όγκων και ποσοτικοποιούνται με ανοσοϊστοχημική χρώση του Παράγοντα VIII παρακάτω προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο μας [30], [33], [34]. MVD υπολογίστηκε μετρώντας μικροαγγείων σε 200 × πεδία κάτω από οπτικό μικροσκόπιο σε έξι αντιπροσωπευτικές θέσεις χωρίς νέκρωση του κάθε τμήματος, καθώς και η επίδραση της θεραπείας επί της αγγειογένεσης εκφράστηκε ως το ποσοστό του ελέγχου.

Η στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ομάδα σημαίνει ± SEM και αναλύθηκαν για στατιστική σημασία με ανάλυση διακύμανσης [35] που ακολουθείται από προστατευμένη λιγότερο σημαντική διαφορά του Fisher βασίζεται σε δύο-side συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων με τη χρήση Statview πρόγραμμα 5.0 (SAS Institute, Inc. , Cary, NC). Ένα

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

Το αντιπροσωπευτικό χρωματογράφημα που δείχνει την καθαρότητα του ΑΜΡ με αναλυτική HPLC αντίστροφης φάσης. HPLC πειραματικές συνθήκες ήταν: Μέσο: Waters 2695 με αυτόματο δειγματολήπτη και η συστοιχία δίοδος φωτογραφία (PDA) από τον ανιχνευτή? στήλη HPLC: Phenomenox C-18 (5 μm εσωτερικής διαμέτρου, 10 × 250 mm)? Κινητό φάσεις: Α (H

2O με 0,1% οξικό οξύ) και Β (ακετονιτρίλιο)? Κλίση κατάσταση: 0-30 λεπτά, 5% Β έως 35% Β? 30-35 min, 35% Β έως 95% Β? 35-40 λεπτά, 95% Β έως 5% Β? 40-45 min, 5% Β? Ρυθμός ροής:. 1 ml /min

doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Αντιπροσωπευτικά FACS ιστογράμματα που δείχνει τον χρόνο-εξαρτώμενη επίδραση των θεραπειών ΑΜΡ (0, 20, και 50 μΜ) επί της απόπτωσης των PC-3 κύτταρα, όπως μετράται από τη ροή Αηηβχίη-ΡΙ κυτταρομετρία δοκιμασίας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0038802.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Η επίδραση του ΑΜΡ σε PC-3 κυτταροτοξικότητα κυττάρων, όπως μετράται με την δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΑΜΡ σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 16 ώρες, την ίδια στιγμή που χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή. Οι τιμές είναι μέση ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, το καθένα εις διπλούν. Οι τιμές είναι στατιστικά ασήμαντη ανάμεσα στις ομάδες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0038802.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.