Αφηρημένο

Ιστορικό

Sirtuin 1 (SIRT1) ενεργεί ως βασικός ρυθμιστής της ομοιόστασης του αγγειακού ενδοθηλίου, αγγειογένεση και ενδοθηλιακή δυσλειτουργία. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός για την αγγειογένεση καρκίνωμα πνεύμονα SIRT1 μεσολάβηση παραμένει άγνωστη. Εδώ, αναφέρουμε ότι η δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου αδενίνης 1 (NAD1) -εξαρτώμενη αποακετυλάσης SIRT1 μπορεί να λειτουργήσει ως εγγενές αρνητικός ρυθμιστής της Delta-σαν συνδέτη 4 (DLL4) /Notch σηματοδότηση στο καρκίνωμα πνεύμονα Lewis (LLC) ξενομόσχευμα προερχόμενα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ( καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs).

Κύρια Ευρήματα

SIRT1 ρυθμίζει αρνητικά Notch1 ενδοκυτταρική περιοχή (N1IC) και Notch 1 γονιδίων στόχων HEY1 και HEY2 σε απάντηση Delta-όπως συνδέτη 4 (DLL4) διέγερση. Επιπλέον, SIRT1 αποακετυλιωμένη και καταπιεσμένες N1IC έκφρασης. Ποσοτική χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (qChIP) δοκιμασία ανάλυσης και γονιδίου αναφοράς απέδειξε ότι SIRT1 δεσμεύεται σε μία ιδιαίτερα διατηρημένη περιοχή, η οποία βρίσκεται περίπου στα -500 bp ανοδικά της μεταγραφικής θέσης έναρξης της Notch 1, και καταστέλλεται η μεταγραφή Notch 1. Αναστολή της ανάπτυξης των ενδοθηλιακών κυττάρων και της βλάστησης την αγγειογένεση DLL4 σηματοδότησης /Notch ενισχύθηκε σε SIRT1-σιγήσει καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται ΕΚ και διασώθηκε από αναστολέας Notch DAPT. In vivo, μια αύξηση της προ-αγγειογόνος δράση παρατηρήθηκε στην Matrigel βύσματα από ενδοθηλιακά-ειδικά SIRT1 knock-in ποντίκια. SIRT1 ενισχυμένη επίσης νεοαγγείωση όγκου και την ανάπτυξη του όγκου των LLC ξενομοσχευμάτων.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η SIRT1 διευκολύνει ενδοθηλιακών κυττάρων διακλάδωση και τον πολλαπλασιασμό να αυξηθεί η πυκνότητα των πλοίων και την προώθηση της ανάπτυξης των όγκων του πνεύμονα μέσω ρύθμισης προς τα κάτω της DLL4 /Notch σηματοδότηση και αποακετυλίωση της N1IC. Έτσι, η στόχευση δραστηριότητα SIRT1 και /ή έκφραση του γονιδίου μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο μηχανισμό για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Xie Μ, Liu Μ, He, C-S (2012) SIRT1 Ρυθμίζει Ενδοθηλιακά Notch Σηματοδοσίας στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (9): e45331. doi: 10.1371 /journal.pone.0045331

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 24 Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 21 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Σεπ, 2012

Copyright: © Xie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Επιστήμη και την Τεχνολογία Σχεδιασμού Έργου της επαρχίας Guangdong, Κίνα (αριθμός 83050) και το Ιατρικό Επιστημονικό Ίδρυμα Ερευνών της επαρχίας Guangdong, Κίνα (αριθμός A2009265). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η νικοτιναμίδη αδενίνη δινουκλεοτίδιο (NAD) εξαρτώμενη δεακετυλάσης Sir2 ρυθμίζει διάρκεια ζωής σε πολλούς οργανισμούς ως απάντηση σε θερμιδικό περιορισμό [1]. Θηλαστικών ομόλογα Sir2 περιλαμβάνουν μία οικογένεια από επτά πρωτεΐνες, οι οποίες αναφέρονται ως sirtuins (τα κατηγορίας III αποακετυλασών ιστόνης (HDAC) SIRT1-SIRT7), και έχουν χαρακτηρισθεί ως βασικοί ρυθμιστές διαφόρων σημαντικές φυσιολογικές διεργασίες που σχετίζονται με το μεταβολισμό και αντοχή στο στρες [ ,,,0],2].

Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι SIRT1 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής των αγγειακών ενδοθηλιακών ομοιόσταση, συμβάλλοντας ειδικά με την αγγειογένεση, αγγειακού τόνου, και των ενδοθηλιακών λειτουργιών [3]. Αξιοσημείωτα, SIRT1 εκφράζεται έντονα στο αγγειακό σύστημα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των αιμοφόρων αγγείων, όπου ελέγχει την αγγειογόνο δραστικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η απώλεια της SIRT1 ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων και των αγγείων, η οποία οδηγεί στην αναστολή της βλάστησης αγγειογένεσης και η διακλάδωση μορφογένεση των ενδοθηλιακών κυττάρων [4].

Το μονοπάτι Notch ρυθμίζει πολλές αποφάσεις της κυτταρικής τύχης /γενεαλογίας σε πολυκύτταρους οργανισμούς κατά την κανονική εμβρυογένεση και μεταγεννητική ανάπτυξη [5]. Κατά την πρόσδεση του συνδέτη Notch με τον συγγενή υποδοχέα της, ένας καταρράκτης πρωτεολυτικής διάσπασης εκκινεί στο intramembrane περιοχή του υποδοχέα. Το τελικό στάδιο διάσπασης καταλύεται από το σύμπλεγμα πρωτεΐνης γ-σεκρετάσης και οδηγεί στην απελευθέρωση του δραστικού Notch ενδοκυττάρια περιοχή. Αυτό το θραύσμα πρωτεΐνης στην συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα και λειτουργεί ως συμπαράγοντας για τη ρύθμιση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων Notch [6]. Εκτός από τους υποδοχείς Notch 1 και Notch4, αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν επίσης Jagged 1, Delta-σαν συνδετήρα 1 (DLL1), και το ενδοθηλιακό κυττάρου-ειδικό DLL4 [7]. Zhang et al. ανέφεραν ότι η αδρανοποίηση ενός μόνο αλληλόμορφου DLL4 οδήγησε σε εμβρυϊκή θνησιμότητα, υποδηλώνοντας ότι η σηματοδότηση DLL4 /Notch είναι απαραίτητη για την αγγειακή ανάπτυξη. έκφραση DLL4 είναι σε μεγάλο βαθμό περιορίζεται στο ενδοθήλιο των αναπτυσσόμενων αιμοφόρων και της κορυφής κύτταρα των αναπτυσσόμενων αρτηριών, όπου λειτουργεί για τη ρύθμιση του αριθμού των κυττάρων άκρου για τον έλεγχο της βλάστησης σκάφος και διακλάδωσης [8].

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταβολές στη δραστηριότητα Notch μπορεί να έχει σοβαρές επιπτώσεις στα ενδοθηλιακά συμπεριφορά και το σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμιση και την προσαρμογή των ενδοθηλιακών αποκρίσεων Notch στην αγγειογένεση καρκίνου του πνεύμονα. Στην παρούσα μελέτη, απομονώσαμε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα από καρκίνωμα πνεύμονος Lewis (LLC) υποδόρια ξενομοσχεύματα σε ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικών SIRT1 knock-in C57BL /6J ποντικούς. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα με έλλειψη δραστηριότητας του SIRT1 ευαισθητοποιούνται να σημειώνω σηματοδότησης, με αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του γονιδίου-στόχου Notch και μειωμένη επιμήκυνση φυτρώνουν σε απάντηση DLL4 διέγερση. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η σηματοδότηση Notch είναι δυναμικά ρυθμίζεται από ακετυλίωση και δείχνουν ότι SIRT1 δρα ως ένα ροοστάτη για να τελειοποιήσουν τις απαντήσεις των ενδοθηλιακών Notch.

Αποτελέσματα

Απομόνωση του πνεύμονα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από Αγγειακό ενδοθηλιακά κύτταρα (καρκίνου του πνεύμονα-προερχόμενο ECs)

Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs απομονώθηκαν από LLC υποδόρια ξενομοσχεύματα σε ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικών SIRT1 knock-in C57BL /6J ποντικούς [9] (Εικ. 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, το καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs αποδειχθεί χαρακτηριστική μορφολογία πλακόστρωτα και εξέφρασε CD31, μια εταιρεία κατασκευής των ώριμων ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, αυτά ECs εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του ΕΚ-ειδικών ενδοθηλιακής συνθετάσης νιτρικού οξειδίου (eNOS) αλλά όχι Ε-καδερίνης (Εικ. 1 C). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η LLC xenogaft ήταν αποτελεσματικά εμπλουτισμένο σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για την μετέπειτα πειράματα in vitro.

LLC ξενομοσχεύματα αποκόπηκαν από ποντικούς εγχύθηκαν υποδορίως στη ραχιαία πλευρά με κύτταρα LLC (3 χ 10

6 αιωρούνται σε 50 μL PBS) για 30 ημέρες . Μετά την απομάκρυνση προφανές νεκρωτικό ιστών ή επιπλέον λιπαρά συνθέσεων, οι αλεσμένοι ιστοί έδαφος επί πάγου με ένα γυάλινο μύλο και στη συνέχεια διηθείται μέσω κελί σουρωτήρια να εξαλειφθούν τα υπολείμματα ιστού. (Α) Οι καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs CD31 εκφράζουν απομονώθηκαν από την μονού κυτταρικού εναιωρήματος με ανοσομαγνητικό διαλογής, όπως αποδεικνύεται από μικροσκόπιο σάρωσης, και καλλιεργήθηκαν in vitro. (Β) CD31 ανιχνεύθηκε στα απομονωμένα καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμού. CD31 χρώση αντισώματος των πνευμόνων καρκίνου που προέρχονται από μεμβράνες ΕΚ εμφανίζεται με κόκκινο χρώμα, και χρώση των πυρηνικών DAPI εμφανίζεται με μπλε χρώμα. (Γ) Η συνολική πρωτεΐνη απομονώθηκε από εμπλουτισμένο καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs, κύτταρα bEnd.3 (θετικός έλεγχος), και MLE-12 κύτταρα (αρνητικός έλεγχος). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι eNOS και Ε-καδερίνης, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Επίδραση της υποξία σε έκφρασης SIRT1 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs

έκφραση SIRT1 εκτιμήθηκε στον πνεύμονα του καρκίνου που προέρχεται από ECs, και όπως φαίνεται στο Σχ. S2A, SIRT1 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε αυτά τα κύτταρα. Επειδή υποξία είναι ένα χαρακτηριστικό των περισσότερων όγκων, εξετάσαμε την έκφραση SIRT1 κάτω από διαφορετικές συνθήκες υποξίας σε αυτά τα κύτταρα με χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT1 αυξήθηκαν σε χρονο-εξαρτώμενο τρόπο και έφτασε το μέγιστο σε 8 ώρες μετά την έκθεση στον πνεύμονα καρκίνος προερχόμενο ECs σε υποξία (σχ. 2Α). Για να καθοριστεί εάν αυτές οι μεταβολές στα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT1 κατά την υποξία ήταν λόγω των αλλαγών στο γονίδιο SIRT1 μεταγραφή, μετρήσαμε τα επίπεδα SIRT1 mRNA χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα δεδομένα μας αποκάλυψε τα παρόμοια ευρήματα, όπως παρατηρείται στην έκφραση της πρωτεΐνης SIRT1 (Εικ. 2Β). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν την επίδραση της υποξίας στην έκφραση SIRT1 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs.

(Α) ανάλυση Western blot της SIRT1 στον πνεύμονα του καρκίνου που προέρχεται από ECs εκτέθηκαν σε υποξία (2% O

2) για ο εμφανιζόμενος χρόνος χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον SIRT1. (Β) Τα επίπεδα SIRT1 mRNA, όπως μετράται με πραγματικού χρόνου RT-PCR, ολικού RNA που λαμβάνεται από καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs εκτέθηκαν σε υποξία (2% O

2) για την υποδεικνυόμενη χρονική περίοδο. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων από κάθε χρονικό σημείο διεξήχθη εις τριπλούν. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

SIRT1 ρυθμίζει αρνητικά N1IC από αποακετυλίωση και Controls γονίδια Notch Target σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs

Κατά την μετατόπιση προς τον πυρήνα, η ενδοκυτταρική περιοχή του Notch 1 (N1IC) αλληλεπιδρά με την δέσμευση του DNA-πρωτεΐνης CSL (ονομάζεται για CBF1 σε θηλαστικά, Su (H) στη Drosophila, και Lag-1 στο Caenorhabditis elegans), η οποία οδηγεί στη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου Notch 1 στόχων. Επειδή N1IC υπόκειται σε ταχεία ουβικιτίνη μεσολαβεί αποικοδόμηση και ακετυλίωση μπορεί να βλάψει την ουβικουϊτινίωση [10], εξετάσαμε την επίδραση της SIRT1 επί N1IC έκφραση και διαπίστωσε ότι η απενεργοποίηση του SIRT1 οδήγησε σε αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης N1IC σε απόκριση προς διέγερση DLL4 (Εικ. 3Α). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι SIRT1 ρυθμίζει αρνητικά Notch σηματοδότηση στα ενδοθηλιακά κύτταρα όταν ενεργοποιούνται τα σήματα DLL4 /Notch 1.

(Α) Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή SIRT1 siRNAs για 48 ώρες και καλλιεργήθηκαν σε η απουσία ή η παρουσία DLL4 για επιπλέον 6 ώρες. Στη συνέχεια, η έκφραση της πρωτεΐνης N1IC ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση στυπώματος Western. siRNA μεσολάβηση αποκλεισμός της δραστηριότητας SIRT1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα αύξησε τα ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης N1IC. (Β) Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επιμολύνθηκαν με HA-N1IC, pcDNA-SIRT1, pcDNA-SIRT1 H363Y, ή pcDNA3 (4 μg /μL το καθένα) για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 5 ηΜ ΝΑΜ για επιπλέον 12 h. Στη συνέχεια, τα κυτταρικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western με ένα αντι-λυσίνη ακετύλιο (άνω πάνελ) ή αντι-ΗΑ αντίσωμα (κάτω πίνακας). (Γ) Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs είχαν τριπλό επιμολύνθηκαν με N1IC, το p300 ακετυλοτρανσφεράση, και αυξανόμενες ποσότητες SIRT1, και τα κύτταρα λύθηκαν 48 ώρες αργότερα. Συγκρίσιμα επίπεδα N1IC ανοσοκαταβυθίστηκαν και καθάρισε για ακετυλιωμένα υπολείμματα λυσίνης (IP: HA και ΙΒ: αντι-ακετυλο? Ανώτερο πλαίσιο). Η κηλίδωση επανελέγχθηκε για το ΗΑ, η οποία κατέδειξε περίπου ίσα επίπεδα ΗΑ-N1IC (IP: HA και IB: HA? Κατώτερο πάνελ). (D) Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επιμολύνθηκαν με N1IC, το p300 ακετυλοτρανσφεράση, και αυξανόμενες ποσότητες SIRT1 μαζί με τον ανταποκριτή λουσιφεράσης Renilla και του πλασμιδίου pGL3-CBF που περιέχει ένα γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης πυγολαμπίδας για 24 ώρες. Στη συνέχεια, η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν προς την δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla (μέση ± SD? N = 3). ανάλυση (Ε) qChIP της SIRT1 πληρότητας στην περιοχή εγγύς υποκινητή Notch 1 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. SIRT1 που καταλαμβάνει μια συγκεκριμένη περιοχή στο -500 bp του τόπου Notch 1. SIRT1 ανοσοκατακρημνίστηκε (ΙΡ) με ορούς αντι-SIRT1 (SIRT1 IgG) ή προ-άνοσοι οροί (κανονική IgG, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος) (μέση τιμή ± SEM? N = 3). * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. ρεπόρτερ αποτελέσματα του προσδιορισμού γονιδίου (F) λουσιφεράσης. pGL3, pGL3-Notch 1 -500 να 400 (N + 400), ή pGL3-Notch 1 + 400 να 1,750 (Ν + 1 750) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293 με ή χωρίς SIRT1. * P & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM. (G) Η έκφραση των γονιδίων στόχων Notch HEY1 και HEY2 αξιολογήθηκαν στον έλεγχο siRNA- και SIRT1 siRNA επιμολυσμένα καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs, που στη συνέχεια μορφομετατρέπονται με άδειο φορέα ή N1IC για έως και 48 ώρες. SIRT1 ανεπάρκεια ενδοθηλιακά κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά αυξημένες HEY1 και δραστικότητα HEY2 σε απόκριση προς N1IC υπερέκφραση. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (H) Καρκίνος του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή SIRT1 siRNAs και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO ή 20 mM ΝΑΜ για 24 ώρες, ακολουθούμενη από επώαση με Matrigel για επιπλέον 5 ώρες. Στη συνέχεια, ο σχηματισμός σωλήνων αξιολογείται χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο φάσης. Τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα αποτελέσματα πυκνότητας. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν SIRT1 ρυθμίζει αρνητικά N1IC μέσω αποακετυλίωσης.. Εν συντομία, οι διαφορετικές εκδοχές του ΗΑ-tagged N1IC (ΗΑ-N1IC) εκφράστηκαν σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs με φορείς που κωδικοποιούν είτε SIRT1 ή ένα μεταλλαγμένο SIRT1 λείπει αποακετυλάσης δραστηριότητα (SIRT1 H363Y). Κυτταρικά εκχυλίσματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ και ανιχνεύεται με ένα ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι ακετυλ-λυσίνη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του ΗΑ-ακετυλιωμένης N1IC ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα που εκφράζουν την πλήρη SIRT1, σε σύγκριση με τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε κύτταρα που εκφράζουν SIRT1 H363Y (Σχ. 3Β). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 nm ΝΑΜ, η SIRT1 μεσολάβηση αναστολή της N1IC ακετυλίωση ανακουφίστηκε. Επιπλέον, η επιμόλυνση του πνεύμονα καρκίνου του προερχόμενου ECs με N1IC, το p300 ακετυλοτρανσφεράση, και αυξανόμενες ποσότητες SIRT1 αποκάλυψε ότι p300 ήταν ικανή ακετυλιώσεως N1IC (Σχ. 3C) και ενίσχυση της δραστικότητας μεταγραφικής N1IC (Σχ. 3D). Ωστόσο, η προσθήκη του SIRT1 κατάργησε την ακετυλιωμένη μορφή της N1IC και σημαντικά μειωμένη δραστικότητα N1IC επάγεται από ρ300. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η αποακετυλάσες δραστηριότητα του SIRT1 μείωσε την αφθονία των ακετυλιωμένων N1IC. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του SIRT1 από SRT1720 ή SRT2183 (ενεργοποιητές της NAD

+ – εξαρτώμενη δεακετυλάσης) μειώνεται η ενδογενής N1IC επίπεδα πρωτεΐνης (Εικ. S1 Α), και αναστέλλοντας τη δράση δεακετυλάσης της SIRT1 με την νικοτιναμίδη αναστολέα sirtuin (NAM) αυξημένη ενδογενή επίπεδα N1IC στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικ. S1B).

για να ορίσετε το μηχανισμό με τον οποίο SIRT1 καταστέλλει N1IC έκφρασης, εξετάσαμε την πρόσληψη του SIRT1 στον τόπο Notch 1 σε απάντηση DLL4 διέγερση χρησιμοποιώντας ανάλυση qChIP. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο τόπος Notch 1 πιστεύεται ότι περιέχουν πάνω από 20 εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές [11]. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι SIRT1 συνδεδεμένο με μία υψηλά διατηρημένη περιοχή, η οποία βρισκόταν σε περίπου -500 bp ανοδικά της μεταγραφικής θέσης έναρξης του Notch 1 (Σχ. 3Ε). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η SIRT1 μπορεί να ελέγχει άμεσα Notch 1 έκφρασης μέσω της σύνδεσης με την περιοχή εγγύς υποκινητή της Notch 1. Για τον προσδιορισμό της λειτουργικής συνέπεια της SIRT1 δέσμευση στον τόπο Notch 1, λουσιφεράση κατασκευάσματα ανταποκριτή που περιέχει γονίδιο αναφοράς Notch 1 επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι SIRT1 ανέστειλε σημαντικά δραστηριότητα ανταποκριτή Notch 1 όταν η θέση σύνδεσης SIRT1 ήταν παρούσα (Εικ. 3F, N + 400), το οποίο δεν παρατηρήθηκε όταν η θέση σύνδεσης SIRT1 ήταν απούσα (Εικ. 3F, N + 1,750). Αυτό επιβεβαιώνεται περαιτέρω παρατήρηση μας ότι SIRT1 κατασταλεί Notch 1 μεταγραφή μέσω της σύνδεσης με τον υποκινητή Notch1.

HEY1 και HEY2 είναι άμεση γονιδίων στόχων του μονοπατιού σηματοδότησης Notch κατά τη διάρκεια της αγγειακής ανάπτυξης [12]. Να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση της SIRT1 στην HEY έκφρασης, έκφραση SIRT1 είχε σιγήσει στο καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs από siRNA, και η έκφραση των HEY1 και HEY2 προσδιορίστηκε. Αξίζει να σημειωθεί ότι, SIRT1 ανεπάρκεια καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs που υπερεκφράζουν N1IC εμφανίζεται ένα σημαντικά βελτιωμένο επίπεδο HEY1 και τη δραστηριότητα HEY2 (Σχ. 3G). Ομοίως, η αποσιώπηση της SIRT1 σημαντικά ενισχυμένη HEY1 και έκφραση HEY2 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs σε απόκριση προς διέγερση DLL4, ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές σε μη διεγερμένα καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs (Εικ. S1c). Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η ρύθμιση SIRT1 των γονιδίων στόχων Notch εξαρτιόταν από DLL4 διέγερση. Επιπλέον, η ενισχυμένη αποκρισιμότητα σε Notch DLL4 της SIRT1 ανεπάρκεια καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs καταργήθηκε με την προσθήκη του αναστολέα DAPT γ-σεκρετάσης (Εικ. S1c). Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση του SIRT1 σηματοδότησης μέσω της χρήσης της μικρών μορίων SRT1720 ή SRT2183 ανέστειλε DLL4 μεσολάβηση επαγωγή HEY1 και έκφραση HEY2, υποδεικνύοντας ότι SIRT1 αρνητικά διαμορφωμένο DLL4 /Notch 1 σηματοδότηση στον πνεύμονα του καρκίνου που προέρχεται από ECs (Εικ. S1D).

SIRT1 ρυθμίζει την αγγειογενετική δραστηριότητα της καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs

Η αναστολή της ανάπτυξης των ενδοθηλιακών κυττάρων από DLL4 σηματοδότησης /Notch ενισχύθηκε σε SIRT1-σιγήσει καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ενδοθηλιακά και διασώθηκε από αναστολέα Notch DAPT (Εικ. S2A). Στο τελευταίο στάδιο της αγγειογένεσης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα αυτο-συναρμολόγηση μέσα σε σωλήνες για να σχηματίσουν νέα αιμοφόρα αγγεία [13]. Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι επιδράσεις του SIRT1 επί νεοαγγείωση εξετάζοντας σχηματισμό σωλήνα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Η, σωληνοειδή σχηματισμό ανεστάλη σημαντικά σε SIRT1-σιγήσει καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. Ομοίως, ο σχηματισμός σωλήνα σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επίσης καταστέλλεται όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα αποακετυλάσης ΝΑΜ SIRT1. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το SIRT μεσολάβηση ρύθμιση της λειτουργίας των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα τρισδιάστατα in vitro δοκιμασίες αγγειογένεσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κολλαγόνο γέλη-embedded ενδοθηλιακά σφαιροειδή που είχαν επιμολυνθεί με τον έλεγχο ή SIRT1 siRNAs. Όπως φαίνεται στο Σχ. S2B, οι σωρευτικές μήκη βλαστάρι του σφαιροειδή σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs επιμολυσμένα με SIRT1 siRNA ήταν σημαντικά μικρότερη από ότι στα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα. Επιπλέον, η θεραπεία με DAPT κατήργησε την αναστολή της αγγειογόνου απόκρισης σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs που επάγεται μέσω SIRT1 αποσιώπηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι SIRT1 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της ενδοθηλιακής λειτουργίας αγγειογόνου.

Επίδραση της SIRT1 επί Tumor νεοαγγείωση σε LLC Ξενομοσχεύματα

για να διερευνήσουν το ρόλο της SIRT1 στην αγγείωση in vivo, μια δοκιμασία βύσματος Matrigel εκτελέστηκε. Σε αντίθεση με τα βύσματα ελέγχου C57BL /6J ποντικούς, τα βύσματα SIRT1 knock-in διαγονιδιακά ποντίκια που εμφανίζεται ένα φωτεινό κόκκινο χρωματισμό, η οποία έδειξε ότι SIRT1 είχε επάγεται σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων. Το επίπεδο της αιμοσφαιρίνης, η οποία είναι ενδεικτική της έκτασης της αγγειογένεσης, ήταν υψηλότερη στο Matrigel βύσματα από SIRT1 διαγονιδιακά ποντίκια από εκείνες από τον έλεγχο C57BL /6J ποντικούς (Σχ. 4Α). Για να διερευνηθεί η επίδραση του γονιδίου SIRT1 για αγγείωση όγκου και την ανάπτυξη του όγκου, τα κύτταρα LLC εγχύθηκαν υποδορίως σε SIRT1, SIRT1 H363Y, και άγριου τύπου C57BL /6J ποντικούς. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο όγκος του όγκου LLC στις SIRT1 knock-in διαγονιδιακά ποντίκια ήταν 115% εκείνου που παρατηρήθηκε στα ποντίκια ελέγχου 30 ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων του όγκου. Σε αντίθεση, η ανάπτυξη του όγκου στα διαγονιδιακά ποντίκια SIRT1 H363Y μειώθηκε και ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στα ποντίκια άγριου τύπου. Επιπλέον, στα διαγονιδιακά ποντίκια SIRT1, η ανάπτυξη του όγκου μειώθηκε όταν η δραστικότητα αποακετυλάσης του SIRT1 αποκλείστηκε με τη χορήγηση της κατηγορίας III νικοτιναμιδίου αναστολέα HDAC (Εικ. 4Β). Κατόπιν αξιολόγησης του δείκτη πυκνότητας μικροαγγείων με χρώση αντισώματος CD31, την ενίσχυση της ανάπτυξης του όγκου παρατηρείται στην SIRT1 knock-in διαγονιδιακά ποντίκια συσχετίστηκε με αύξηση των αγγείωση του όγκου. Επιπλέον, η θεραπεία αντι-Dll4 αποκάλυψε ότι η μειωμένη ανάπτυξη του όγκου συσχετίστηκε με εμφανή μείωση σε όγκο αγγειακή πυκνότητα (Σχ. 4C).

(Α) SIRT1 προάγει την αγγειογένεση in vivo. βύσματα Matrigel εγχύθηκαν υποδορίως εντός των κοιλίες του ελέγχου ή SIRT1-διαγονιδιακά ποντίκια, και τα βύσματα εκχυλίζονται 7 ημέρες αργότερα για να προσδιοριστεί η έκταση της αγγείωσης. Η ποσότητα της αιμοσφαιρίνης που υπάρχει στα βύσματα ποσοτικοποιήθηκε ως δείκτης του σχηματισμού των λειτουργικών αιμοφόρων αγγείων (μέση ± SD? N = 10 για κάθε ομάδα). * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Β) Αλλαγές στα διάμεσα μεγέθη όγκου μετριέται σε άγριου τύπου (έλεγχος) C57BL /6J, SIRT1, ή SIRT1 (H363Y) ποντίκια μετά από εμβολιασμό με κύτταρα LLC για την αναφερόμενη χρονική περίοδο. * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τους ποντικούς SIRT1. (Γ) Μικροφωτογραφίες της χρώσης CD31 IHC στα τμήματα του LLC ξενομοσχευμάτων (μεγέθυνση, χ 200) από τον άγριο τύπο, SIRT1 ή SIRT1 (H363Y) ποντικούς. Όταν οι όγκοι ξενομοσχεύματος όγκου έφθασε περίπου 100 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδα ελέγχου (n = 8) ή την πειραματική βραχίονα (μονοκλωνικό αντίσωμα DLL4? N = 10). Τα πεδία υψηλής μεγέθυνσης (Χ 400) αναλύθηκαν για μέτρηση της πυκνότητας μικροαγγείων χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (μέση ± SD? N = 10 για κάθε ομάδα). * Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τους ποντικούς SIRT1. Οι μέσες όγκοι του όγκου στην άγριου τύπου, SIRT1 και SIRT1 (H363Y) ποντικούς μετρήθηκαν σε 4 εβδομάδες μετά τη θεραπεία. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη επεκτείνει τον ρόλο της SIRT1 να περιλαμβάνουν την ειδική διαμόρφωση του αγγειογενετικής δραστηριότητας σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Για να εξεταστεί η επίδραση της SIRT1 στην αγγειογένεση καρκίνου του πνεύμονα, δημιουργήσαμε μοντέλα ξενομοσχεύματος LLC με ενδοθηλιακού κυττάρου-ειδικά SIRT1 και έκφραση H363Y SIRT1 σε διαγονιδιακά ποντίκια. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα επιτυχώς απομονώθηκαν από τα ξενομοσχεύματα LLC του SIRT1 διαγονιδιακών ποντικών χρησιμοποιώντας CD31 συζευγμένα με μαγνητικά σφαιρίδια, καθώς και μια σειρά από βήματα για την απομάκρυνση όλων των μολυσματικών κυττάρων όγκου και λευκοκύτταρα. Ο αποκλεισμός της λειτουργίας SIRT1 καταργηθεί το σχηματισμό ενδοθηλιακού σωλήνα και το σχηματισμό βλαστών in vitro, η οποία καταργήθηκε με αναστολέα Notch. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SIRT1 μεσολάβηση ρύθμιση του μονοπατιού Notch σε ενδοθηλιακά κύτταρα μπορεί να ρυθμισθεί.

Στις μελέτες μας, SIRT1 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. Επιπλέον, υποξία έχει δειχθεί ότι είναι ένας από τους σημαντικότερους ωθήσεις για την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων σε κακοήθεις όγκους [14]. Zhang et al. έδειξαν ότι επειδή HIC1 (υπερμεθυλιωμένο στον Καρκίνο 1) συνδεδεμένο με τον προαγωγό SIRT1, η επακόλουθη μείωση της πρόσληψης CtBP μειώθηκε μεταγραφική καταστολή και επαγόμενη έκφραση SIRT1 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα [15]. Υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να ανατεθεί ρύθμιση SIRT1 κατά την υποξία μέσω αλλαγές στην έκφραση γονιδίων SIRT1 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. Για τις γνώσεις μας, αυτή ήταν η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει ότι η έκφραση SIRT1 αυξάνει σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο κατά τη διάρκεια της υποξίας στα ενδοθηλιακά κύτταρα όγκου.

επόμενο ρώτησε αν SIRT1 αλληλεπιδράσει με ιδιαίτερη μεταγραφική εταίρους σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα για να διαμεσολαβούν συγκεκριμένες επιδράσεις του. Γκουαρανί et al. [16] στο παρελθόν έδειξαν ότι η ακετυλίωση της N1IC για διατηρημένων λυσινών ελέγχεται το εύρος και τη διάρκεια των απαντήσεων Notch μέσω μεταβληθεί ο κύκλος εργασιών πρωτεΐνη N1IC. SIRT1 συνεργάτες με N1IC και λειτουργεί ως δεακετυλάσης N1IC να αναστέλλει την ακετυλίωση προκαλείται από N1IC σταθεροποίησης. Συνέπεια, τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης ότι SIRT1 απακετυλιωμένος και καταπιεσμένη N1IC έκφρασης, η οποία οδήγησε σε αυξημένη αγγειογενετική βλάστηση και tubulogenesis ρυθμίζονται από την αγγειογενετική σηματοδοτικό μονοπάτι SIRT1-εξαρτώμενη. Το πιο σημαντικό, δείξαμε για πρώτη φορά ότι SIRT1 προσελήφθη σε μία εντόνως διατηρημένη περιοχή που βρίσκεται στο -500 bp ανοδικά του Notch 1 έναρξης μεταγραφής τοποθεσία, η οποία πρότεινε ότι SIRT1 θα μπορούσε να συνδεθεί απευθείας με τον υποκινητή Notch 1, αναστέλλοντας έτσι την έκφραση του γονιδίου. Σημειώσεων, SIRT1 ρυθμίζεται αρνητικά Notch1 μέσω αποακετυλίωσης, έτσι αλλαγές σε μεταγραφικό επίπεδο του Notch μπορεί επίσης να παίζουν ρόλο στη μείωση της δραστηριότητας Notch επηρεάζονται από SIRT1. Αυτό πρέπει να είναι αποφασισμένη περαιτέρω.

HEY είναι έλικα-βρόχος-έλικα (bHLH) μεταγραφικός καταστολέας. Τα μέλη της οικογένειας HEY θεωρείται γονιδίων στόχων του Notch 1 σηματοδότησης στο ενδοθήλιο, επειδή η έκφρασή τους μπορεί να επάγεται από Notch 1 [12]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την ικανότητα του SIRT1 να ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που ελέγχονται από N1IC, όπως HEY1 και HEY2. Σε συμφωνία με τις εκθέσεις από Mulligan et al. [17], τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι SIRT1 ρυθμίζεται αρνητικά την έκφραση των HEY1 και HEY2 σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs. Επιπλέον, Takara et al. απέδειξαν ότι SIRT1 αλληλεπιδρά λειτουργικά με τις τριχωτές και ενισχυτή-of-διάσπαση καταστολείς bHLH [18]. Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι επιδράσεις του SIRT1 στην Notch απόκριση με διαμεσολάβηση κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου, ερευνήσαμε σχηματισμός φυτρώνουν σε καρκίνο του πνεύμονα που προέρχονται από ECs και διαπίστωσε ότι η απενεργοποίηση του SIRT1 εξασθενημένη σχηματισμού φυτρώνουν και επιμήκυνση. Αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν με την προσθήκη o του DAPT αναστολέα Notch 1, γεγονός που υποδηλώνει ότι SIRT1 ρυθμίζει ενδοθηλιακών αγγειογενετική λειτουργίες ρυθμίζοντας σηματοδότηση Notch. Ωστόσο, η απενεργοποίηση της SIRT1 δεν εμπόδισε εντελώς σχηματισμό βλαστών. Έτσι, υποθέσαμε ότι, εκτός από την Notch1, μυθιστόρημα παράγοντες μεταγραφής SIRT1 ρυθμιζόμενων μπορούν επίσης να συμμετέχουν στην αγγειακή ανάπτυξη, αν και οι μελλοντικές μελέτες που απαιτούνται για την αντιμετώπιση του ρόλου αυτών άγνωστο ρυθμιστικών αρχών στον καρκίνο του πνεύμονα.

Γκουαρανί et al. ανέφεραν ότι P300 μπορούσε να συνδεθεί με N1IC και να λειτουργεί ως συν-ενεργοποιητή στο υποκινητές Notch ρυθμίζεται [16]. Επιπλέον, η μελέτη μας έδειξε ότι p300 δεν ήταν μόνο σε θέση να ακετυλίωση N1IC αλλά θα μπορούσε επίσης να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή του. Το πιο σημαντικό, SIRT1 ανέστειλε την ακετυλιωμένη μορφή της N1IC και σημαντικά μειωμένη δραστικότητα N1IC παρουσία ρ300. Αντίθετα, η θεραπεία με το ΝΑΜ αναστολέα δεακετυλάσης οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην έκφραση N1IC mRNA. Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η δραστηριότητα της δεακετυλάσης SIRT1 αλλάξει την ενδοθηλιακή Notch καταρράκτη σηματοδότησης με αποακετυλίωση N1IC και ανταγωνίζονται P300. Hansson et al. έδειξε ότι MAML1 (Notch συνενεργοποιητή) θα μπορούσε να ενισχύσει p300 autoacetylation και ενεργοποίηση ρ300 μεταγραφικό [19]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι SIRT1 αλληλεπιδρά φυσικά με και καταστέλλει p300 μετενεργοποίηση σε NAD-εξαρτώμενο τρόπο. SIRT1 καταστολή του p300 έχει δειχθεί ότι συμβαίνει μέσω αποακετυλίωσης δύο κατάλοιπα λυσίνης (1020 και 1024) στο πλαίσιο του p300 πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή (CRD1) [20]. Επειδή P300 είναι ένα gating μεταγραφικό συμπαράγοντα, αποακετυλίωση και την καταστολή των ρ300 με SIRT1 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα σημαντικό σημείο ολοκλήρωσης κατά το μεταβολισμό και την κυτταρική διαφοροποίηση.

Κατά την πρόσδεση ενός συνδέτη διαμεμβρανικής από την Delta /Jagged οικογένειες, Notch διαμεμβρανική υποδοχείς γενικά παρέχουν ενδείξεις που καθοδηγούν τις αποφάσεις των κυττάρων-μοίρα. Ειδικότερα, DLL4 απαιτείται για την αγγειακή ανάπτυξη και εκφράζεται ισχυρά στα καρκινικά αγγεία [21]. Επιπλέον, η μελέτη του SIRT1 knock-in ποντίκια έδειξαν ότι SIRT1 λειτούργησε να διατηρηθεί η ικανότητα νεοαγγείωσης σε απόκριση σε διέγερση DLL4 στο αγγειακό ενδοθήλιο του όγκου. Για να προσδιοριστεί η λειτουργία του κατά τη διάρκεια της DLL4 αγγειογένεσης όγκου στα διαγονιδιακά ποντίκια SIRT1, εμείς μείωσε το επίπεδο DLL4 υπάρχει σε ένα μοντέλο όγκου ποντικού χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-DLL4. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αναστολή της σηματοδότησης DLL4-Notch οδήγησε σε αυξημένη πυκνότητα αγγειακού όγκου. Παραδόξως, αυτή η αγγειακή φαινότυπο υπερανάπτυξη είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Μία πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι η υπερβολική διακλάδωση καταλήγει σε ένα εξαιρετικά χαοτική αγγειακό δίκτυο που δεν έχει την ιεραρχία απαραίτητη για την αποτελεσματική κατευθυντική ροή του αίματος. Μελέτες έδειξαν ότι Perfusion αγγείωσης hypersprouting όγκου ήταν μη λειτουργικές [6], η οποία προτείνει ότι το μπλοκάρισμα της σηματοδότησης DLL4-Notch θα μπορούσε να οδηγήσει σε σκάφος όγκος «abnormalization» και ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου. Σε ενδοθηλιακά κύτταρα, SIRT1 ρυθμίζει την μεταγραφική δραστικότητα του Foxo1 και ρ53, και ενεργοποιεί την ενζυματική δραστικότητα της ενδοθηλιακής συνθάσης μονοξειδίου του αζώτου (eNOS). Δεδομένης της πληθώρας των κατάντη παράγοντες στοχεύονται από SIRT1 για αποακετυλίωσης, SIRT1 έχει υποτεθεί ότι δρουν ως βασικός ρυθμιστής πολλών οδών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όγκου και αγγείωση [22]. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι pharmacological- ή μοριακή βάση αποκλεισμός της δραστηριότητας SIRT1 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη και νέα προσέγγιση για τον αποκλεισμό της προόδου του όγκου.

Συλλογικά, η μελέτη μας αποδεικνύουν μία νέα ρόλο για SIRT1, οπότε SIRT1 δρα ως κύτταρο- αυτόνομη αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης Notch, και τα αποτελέσματα αυτά προσδιορίσει την αναστρέψιμη ακετυλίωση N1IC ως βασικός μοριακός μηχανισμός με τον οποίο οι απαντήσεις Notch μπορεί να διαμορφωθεί δυναμικά. SIRT1 αναστέλλει την ακετυλιωμένη μορφή της N1IC και ελαττώνει σημαντικά N1IC δραστηριότητα που επάγεται από Ρ300, περιορίζοντας έτσι την απόκριση σηματοδότησης DLL4 /Notch και την αναστολή της αγγειογένεσης των όγκων (Σχ. 5). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο αποκλεισμός της δραστηριότητας SIRT1 και /ή την έκφραση του γονιδίου μπορεί να παρέχει νέες ευκαιρίες για τη θεραπεία κατά του καρκίνου.

μελέτης δείχνουν μας ότι η Delta-όπως συνδέτη 4 (DLL4), η οποία εκφράζεται έντονα στα αγγειακά κύτταρα κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης των όγκων, προσδένεται στον υποδοχέα Notch 1 και ξεκινά πρωτεολυτικές διασπάσεις. Η τελική διάσπαση intramembrane καταλύεται από γ-σεκρετάσης οδηγεί στην απελευθέρωση του δραστικού Notch 1 ενδοκυτταρική περιοχή (N1IC), που μετατοπίζεται εντός του πυρήνα και στρατολογεί την MAML1 πρωτεΐνη και ακετυλτρανσφεράσες ιστόνης (καπέλα, όπως P300) στο σύμπλεγμα CSL. Αυτό πρόσληψη οδηγεί στην ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων Notch 1 HEY1 και HEY2. Επιπλέον, p300 ακετυλιώνει N1IC και ενισχύει την μεταγραφική δραστικότητα του ενώ SIRT1 αναστέλλει την ακετυλιωμένη μορφή της N1IC και σημαντικά μειώνει N1IC δραστηριότητα που επάγεται από Ρ300, περιορίζοντας έτσι την απόκριση σηματοδότησης DLL4 /Notch και την αναστολή της αγγειογένεσης του όγκου.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι εργασίες των ζώων διεξήχθη υπό τις οδηγίες του ιδρύματος της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ και εγκρίθηκε από την επιτροπή Χρήση για φροντίδα των ζώων. Εγκρίθηκε επίσης λαμβάνεται από την επιτροπή δεοντολογίας της Guangzhou Ινστιτούτο Ερευνών του αναπνευστικού Νοσημάτων (ID. 2009-2130).

Αντιδραστήρια και

in vitro

κυττάρων Θεραπείες

Νικοτιναμίδιο και Ν – [Ν- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-αλανυλ] -S- φαινυλγλυκίνης τ-βουτυλεστέρα (DAPT) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (USA). SRT2183 και SRT1720 αγοράστηκαν από Sirtris Pharmaceuticals (USA). DLL4 αγοράστηκε από την R &? D Systems (USA). Οι ομάδες ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα αντίστοιχα οχήματα. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-DLL4 (ένα ανθρώπινο IgG1 ισοτύπου που αντιδρά σταυρωτά με ανθρώπινη και ποντικού DLL4, 1 μg /mL) ήταν ένα δώρο από MedImmune, LLC (ΗΠΑ).

Μοντέλα ξενομοσχεύματος

C57BL /6J ποντίκια (θηλυκά, ηλικίας 6-8 εβδομάδων, βάρους 15-22 g) αγοράστηκαν από την Σαγκάη Slac Laboratory Animal Co., Ltd (Κίνα). Ενδοθηλιακών κυττάρων ειδικά SIRT1-knock-in ή SIRT1 (H363Y) -transgenic C57BL /6J ποντίκια που παρέχονται από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών. Για τη δημιουργία εξειδικευμένου ενδοθηλίου SIRT1 ή SIRT1 (H363Y) -transgenic ποντικούς, SIRT1 cDNA ανθρώπινου (NCBI ref: NM_012238.4) ή SIRT1 (H363Y) cDNA συνδέθηκε με το ποντίκι VE-καδερίνη προαγωγό, και οι προκύπτοντες κλώνοι αναφέρονται ως VE-S.