Αφηρημένο

Εξωσώματα είναι μικρές εξωκυττάρια κυστίδια μεμβράνης της ενδοκυτταρικής προέλευσης που απελευθερώνεται από πολλά κύτταρα που θα μπορούσαν να βρεθούν στα περισσότερα υγρά του σώματος. Οι κύριες λειτουργίες εξωσωμάτων είναι κυτταρική επικοινωνία και την κυτταρική αποβλήτων καθαρισμού. Η μελέτη αυτή διεξήχθη για να προσδιοριστεί η συμμετοχή των εξωσωμάτων στη ρύθμιση της ευαισθησίας του καρκίνου του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή στη σισπλατίνη (DDP). Όταν DDP προστέθηκε σε κύτταρα Α549, εξωσώματα έκκριση ενισχύθηκε. Προσθήκη των εκκρίνονται εξωσωμάτων σε άλλα κύτταρα Α549 αύξησε την αντίσταση αυτών των Α549 κυττάρων σε DDP. Κατά την έκθεση του Α549 σε DDP, τα επίπεδα έκφρασης αρκετών miRNAs και mRNAs φέρεται που σχετίζονται με την ευαισθησία DDP αλλάξει σημαντικά σε εξωσώματα? Αυτές οι αλλαγές μπορεί να μεσολαβήσει την αντίσταση των κυττάρων Α549 σε DDP. Τα εξωσώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα Α549 κατά την διάρκεια της έκθεσης DDP μείωσε την ευαισθησία άλλων Α549 κυττάρων σε DDP, η οποία μπορεί να προκαλείται από miRNAs και ανταλλαγή mRNAs από εξωσώματα μέσω κύτταρο-προς-κύτταρο επικοινωνία. Αν και ο λεπτομερής μηχανισμός της αντίστασης παραμένει ασαφής, πιστεύαμε ότι η αναστολή του σχηματισμού εξωσωμάτων και η απελευθέρωση θα μπορούσε να παρουσιάσει μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα στο μέλλον

Παράθεση:. Xiao Χ, Yu S, Li S, Wu J , Ma R, Cao H, et al. (2014) Εξωσώματα: μειωμένη ευαισθησία του Καρκίνου του Πνεύμονα Α549 κύτταρα με Cisplatin. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10.1371 /journal.pone.0089534

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Οκτώβρη 2013? Αποδεκτές: 22 του Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Xiao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81372396) και το Six Talent Peak των ανθρώπινων υποθέσεων Hall στην επαρχία Jiangsu (Νο 40). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζονται με την Caner λέξη και μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου του πνεύμονα. Ασθενείς με μια τέτοια επιθετική όγκου έχουν ένα χαμηλό ποσοστό πενταετούς επιβίωσης λιγότερο από 20%, η οποία είναι πιο πιθανό να οφείλεται μεταστατική νόσο κατά τον χρόνο της διάγνωσης. Παρά το γεγονός ότι αρκετά φάρμακα στόχους, όπως erlotinib και cetuximab θα μπορούσε να αυξήσει τη συνολική επιβίωση των ασθενών με NSCLC, πλατίνα διπλή χημειοθεραπεία παραμένει η πιο σημαντική θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο NSCLC.

Platinum (DDP) είναι ένας παράγοντας DNA που βλάπτουν ότι θα μπορούσε να εισέλθει στα κύτταρα του όγκου και να προκαλέσει aquation και υδρόλυση για να σχηματιστεί αντιδραστικά είδη λευκόχρυσου [1]. Aquated DDP αναγνωρίζει γενικά DNA ως πρωταρχικό στόχο και αλληλεπιδρά με το DNA, που οδηγεί στο σχηματισμό του διακλαδική ή /και ενδοκλωνικά διασταυρωμένες συνδέσεις [2]. Το σύστημα απόκρισης βλάβη του DNA (DDR) και οδοί ποικίλο σηματοδότησης ενεργοποιούνται [3], και τα επίπεδα έκφρασης του RNA που θα μπορούσε να επηρεαστεί ανάλογα [4]. Πολλοί ασθενείς εμφανίζουν είτε έμφυτη έλλειψη ευαισθησίας στο φάρμακο ή DDP-αναισθησία υποτροπιάζουσα της ασθένειας μετά από μια αρχική περίοδο θεραπείας. Πολλαπλές μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ευαισθησίας καρκινικών κυττάρων σε DDP? Αυτοί οι μηχανισμοί περιλαμβάνουν ενδοκυτταρική συσσώρευση και εκροή των DDP [5], την ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA, ανοχή σε επιδιορθώθηκε βλάβες του DNA [6], και η ρύθμιση πολλών γονιδίων [7].

Εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια εξωκυττάρια μεμβράνη, η οποία θα μπορούσε να εκκρίνεται από πολλά είδη κυττάρων όγκου και υπάρχουν στα περισσότερα σωματικό υγρό [8], [9]. Ανεξάρτητα από την καταγωγή, εξωσωμάτων έχουν παρόμοιες συνθέσεις πρωτεϊνών, οι οποίες μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις μεγάλες ομάδες: γνήσιο πρωτεΐνες σχεδία, κυτταροσκελετού όπως οι πρωτεΐνες και οι πρωτεΐνες θερμικού σοκ [10]. Οι εσωτερικές κυστίδια που σχηματίζεται από την προς τα μέσα εκβλάστηση των κυττάρων είναι γνωστή ως πολυκυψελιδωτών ενδοσώματα (MVE). Η σύντηξη του MVE με τη μεμβράνη του πλάσματος οδηγεί στην απελευθέρωση των εσωτερικών κυστιδίων γνωστή ως εξωσώματα [11]. Τα εξωσώματα μπορούσαν να ταξιδέψουν σε περιβάλλοντα κύτταρα ή απομακρυσμένους ιστούς για να εμφανιστεί λειτουργίες όπως άνοση διέγερση, ανοσοκαταστολή [12], η επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της ανοχής [13] – [15], μεταφορά γενετικού υλικού [10] και την απομάκρυνση σκουπιδιών [16]. Τα εξωσώματα περιέχουν μια σημαντική ποσότητα του RNA και μπορούν να μεταφερθούν από το ένα κύτταρο στο άλλο [10], συμβάλλοντας έτσι στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση του καρκίνου και την ανάπτυξη του καρκίνου [13], [14], [17], [18]. Ωστόσο, για το καλύτερο της γνώσης μας, η συμμετοχή εξωσωμάτων στη ρύθμιση της ευαισθησίας των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε DDP παραμένει άγνωστη.

Μόλις εκτεθεί σε DDP, τα καρκινικά κύτταρα συνήθως να προσαρμοστούν στο μικροπεριβάλλον και να προσαρμοστεί στην διέγερση. Δεδομένου ότι τα εξωσώματα αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην επικοινωνία των κυττάρων, υποθέσαμε την πιθανή εμπλοκή εξωσωμάτων στη ρύθμιση των κυττάρων Α549 αποκρίσεων σε DDP. Συγκεκριμένα, εξωσώματα απελευθερώνονται από κύτταρα Α549 κατά την διάρκεια της έκθεσης DDP μπορεί να μεταβάλλει την ευαισθησία των περιβαλλόντων κυττάρων να DDP. Επιπλέον, exosomal RNAs μπορεί να μεταφερθεί από το ένα κύτταρο στο άλλο [10]. Ως εκ τούτου, εμείς υποτίθεται ότι ορισμένοι miRNAs και mRNAs φέρεται να συνδέεται με την αντίσταση DDP θα μπορούσαν να μεταφερθούν από το ένα κύτταρο στο άλλο από εξωσώματα. MiR-21, miR-98, miR-133b, miR-138, miR-181 και miR-200c [19] – [24] σύμφωνα με πληροφορίες που σχετίζονται με τη ρύθμιση ευαισθησίας DDP, ενώ ERCC1, BRCA1 και RRM1 [25] – [27 ] είχαν σχέση με την αντίσταση DDP. Για να ελέγξετε τις υποθέσεις μας, επιλέχθηκαν αυτά τα miRNAs και mRNAs να μελετήσει προκαταρκτικά συμμετοχή τους στη διαδικασία της αντίστασης DDP.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός Εξωσώματα Κυκλοφόρησε από Α549 κύτταρα

Για να εξασφαλιστεί η επιτυχής απομόνωση εξωσωμάτων, τα συλλεγέντα εξωσώματα παρατηρήθηκαν με ΤΕΜ (ηλεκτρονικό μικροσκόπιο) και αναλύθηκαν με στύπωμα Western (Σχήμα 1Α). συστάδες Μικροκάψουλας εμφάνισαν στρογγυλά κυστίδια μέτρηση 30-100 nm σε διάμετρο (Σχήματα 1Β, 1C). Το Σχήμα 1D δείχνει την έκφραση του CD63, ενός τετρασπανίνη μέλος της οικογένειας που εντοπίζεται σε exosomal εσωτερική κυστιδίων, ως διπλή ζώνη σε εξωσώματα και ως ένα ελαφρύ μπάντα στα κύτταρα.

(Α) εξωσωμάτων μέθοδος απομόνωσης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. (Β, Γ) Η μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εικόνα των εξωσωμάτων. Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια μετρώντας από 30nm έως 100 nm σε διάμετρο. (D) στυπώματος Western CD63 και β-ακτίνη σε εξωσώματα και κυττάρων.

Η

Cellular Επίδραση κυττάρων Α549 σε Cisplatin

αξιολόγηση δόσης-απόκρισης εκτελέστηκε σε αυτή τη μελέτη. Μία συγκέντρωση 3 μg /mL DDP επιλέχθηκε για το πρωτόκολλο μας αφού αυτή η δόση προκάλεσε το θάνατο περίπου 50% των κυττάρων Α549 (Σχήματα 2Α, 2Β). Για να δοκιμαστεί η επίδραση του DDP για την απελευθέρωση εξωσωμάτων, εξωσωμάτων ήταν ποσοτικά με BCA? η τυπική καμπύλη πρωτεΐνη δείχνεται στο Σχήμα 2C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, η ποσότητα εξωσωμάτων απελευθερώνεται από κάθε κυττάρου κατά τη διάρκεια της έκθεσης DDP ήταν υψηλότερη από ότι υπό κανονικές συνθήκες, γεγονός που δείχνει μια σημαντική αύξηση της εξωσώματα απελευθερώνονται από κύτταρα Α549 κατά την έκθεση σε DDP.

(Α) δόση σχέση απόκρισης μεταξύ της βιωσιμότητας των κυττάρων Α549 (%) και τη συγκέντρωση της σισπλατίνης (1-10 μg /mL) για 48 ώρες. (Β) Η μικροσκοπική εικόνα των Α549 κυττάρων σε επεξεργασία με 0 και 3 μg /mL σισπλατίνης. Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 100 ×. (C, D) Ποσότητα εξωσωμάτων προσδιορίζεται μέσω της τυπικής BCA καμπύλη και αυξημένη έκκριση εξωσωμάτων κανονικοποιήθηκαν ως προς τους αριθμούς κυττάρων μετά από έκθεση των κυττάρων Α549 σε σισπλατίνη. (Ε) Διαφορική επιπέδων έκφρασης των έξι miRNAs στα κύτταρα μετά από έκθεση των κυττάρων Α549 σε σισπλατίνη. (F) διαφορική επίπεδα έκφρασης των δύο miRNAs σε εξωσώματα μετά από έκθεση των κυττάρων Α549 σε σισπλατίνη. (G) Διπλώστε-αλλαγές στην έκφραση του miR-21 και miR-133b σε εξωσώματα είναι υψηλότερα από εκείνα στα κύτταρα. Μπάρες δείχνουν μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις. * Υποδηλώνει p & lt?. 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου

Η

Για να προσδιορίσετε αν εξωσώματα μπορούσε πληροφορίες μεταφοράς, οι εκφράσεις των έξι miRNAs που προτείνονται στο παρόν έγγραφο εντοπίστηκαν σε κύτταρα και εξωσώματα. Όλα τα έξι miRNAs μπορούσε να ανιχνευθεί σε κύτταρα, ενώ μόνο miR-21 και 133b θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε εξωσώματα (η τιμή Ct των τεσσάρων άλλων miRNAs υπερέβαινε το 40). Για να δοκιμαστεί η επίδραση των DDP στα επίπεδα έκφρασης των miRNAs σε κύτταρα και εξωσώματα, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των έξι miRNAs ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα και εξωσώματα κατά την έκθεση του Α549 κυττάρων σε DDP. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2Ε και 2F, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21, miR-133b, miR-98, miR-181 αυξήθηκαν σε κύτταρα ενώ οι εκφράσεις του miR-21 και 133b αυξήθηκε σε εξωσώματα. Διπλώστε-αλλαγές στην έκφραση του miR-21 και miR-133b σε εξωσώματα ήταν επίσης υψηλότερα από εκείνα στα κύτταρα (Σχήμα 2G).

Εξωσώματα Μειώστε την ευαισθησία των κυττάρων Α549 σε DDP

Για να προσδιορίσετε εξωσώματα πρόσληψη από τα κύτταρα Α549, εξωσώματα σημάνθηκαν με έκανε και συν-επωάστηκαν με κύτταρα Α549 για 3 ώρες, μετά τις οποίες μικροσκοπία φθορισμού διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, εξωσώματα μπορεί να απορροφηθεί από τα περιβάλλοντα κύτταρα. Για να καθοριστεί εάν εξωσώματα θα μπορούσε να επηρεάσει την ευαισθησία του Α549 να DDP, εξωσώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα Α549, υπό φυσιολογικές συνθήκες και υπό συνθήκες DDP συλλέχθηκαν και προστίθεται στα κύτταρα. Όπως φαίνεται στις Εικόνες 3Α και 3C, εξωσώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα Α549 υπό έκθεση DDP θα μπορούσε να μειώσει την ευαισθησία άλλων Α549 κυττάρων σε DDP, ενώ οι εξωσώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα Α549, υπό κανονικές συνθήκες είχε μικρή επίδραση επί της ευαισθησίας των κυττάρων Α549 σε DDP. Επειδή εξωσώματα απελευθερώνονται από κύτταρα Α549 υπό κανονικές συνθήκες δεν επηρεάζουν την ευαισθησία του γύρω από τα κύτταρα για να DDP, έχουμε εκλεγεί για να μελετήσουμε τη λειτουργία εξωσωμάτων που απελευθερώνεται από τα κύτταρα Α549 μόνο βάσει της έκθεσης DDP.

(Α) Προεπεξεργασία των κυττάρων Α549 με εξωσώματα απελευθερώνονται κατά τη διάρκεια της σισπλατίνης (3 μg /mL) έκθεση μειώνει την ευαισθησία των κυττάρων σε σισπλατίνη κατά περίπου 20% σε σύγκριση με εκείνους χωρίς προκατεργασία για 48 ώρες. (Β) Η πρόσληψη εξωσώματα (κόκκινο) από κύτταρα Α549 μετά από επώαση για 3 ώρες έγινε ορατή με μικροσκοπία. bar Κλίμακα: 50 μm. (Γ) Η μικροσκοπική εικόνα των Α549 κυττάρων καλλιεργημένων υπό τέσσερις προϋποθέσεις [ελέγχου, εξωσώματα, DDP (3 μg /mL), εξωσώματα + DDP] για 48 ώρες. Εικόνες ελήφθησαν σε μεγέθυνση 100 ×. * Στην (Α) δείχνει p & lt? 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου

Η

Εξωσώματα Επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs Κυτταρικής και mRNAs

Για να ελέγξετε πιθανές εναλλαγές στις εκφράσεις των miRNAs και mRNAs στα κύτταρα. ως αποτέλεσμα της εξωσωμάτων που απελευθερώνεται από τα κύτταρα Α549 κατά την διάρκεια της έκθεσης DDP, ανιχνεύθηκαν τα επίπεδα έκφρασης αυτών των miRNAs και mRNAs μετά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε εξωσώματα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, το επίπεδο έκφρασης της miR-21 αυξήθηκε ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-98, 133Β, 138, 181α και 200c μειώνεται. Το Σχήμα 4Β δείχνει μια αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του ERCC1, BRCA1, και RRM1. Επιπλέον, όπως φαίνεται στα Σχήματα 4C και 4D, αφού τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DDP, τις σχετικές πολλαπλών μεταβολών αυτών miRNAs και mRNAs σε κύτταρα προκατεργάστηκαν με εξωσώματα ποικίλουν από τις σχετικές πολλαπλές μεταβολές που παρατηρούνται σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό κανονικές συνθήκες.

Τα επίπεδα έκφρασης του miRNAs (Α) και (Β) mRNAs υπό κανονικές συνθήκες με και χωρίς προεπεξεργασία εξωσωμάτων. Fold-αλλαγές στην έκφραση του (C) miRNAs και (Δ) mRNAs υπό σισπλατίνη με και χωρίς προεπεξεργασία εξωσωμάτων. Μπάρες δείχνουν μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις. * Υποδηλώνει p & lt?. 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου

Η

Συζήτηση

Για το καλύτερο της γνώσης μας, η μελέτη μας είναι η πρώτη που αποδεικνύει τη συμμετοχή εξωσώματα στη ρύθμιση της ευαισθησίας του Α549 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα να DDP. Βρήκαμε ότι η έκθεση των κυττάρων σε Α549 DDP θα μπορούσε να προκαλέσει τα κύτταρα να απελευθερώσουν περισσότερο από ό, τι εξωσώματα σε κανονικές συνθήκες και ότι η αλληλεπίδραση αυτών των εξωσωμάτων με άλλα κύτταρα Α549 μπορεί να αυξήσει την αντίσταση αυτών των Α549 κυττάρων σε DDP. Η μελέτη μας αποδεικνύει, αφενός, ότι όταν τα κύτταρα Α549 εκτίθενται σε DDP, τα επίπεδα έκφρασης των πολλών miRNAs και mRNAs με πληροφορίες που σχετίζονται με την αλλαγή του ευαισθησία DDP σημαντικά σε εξωσώματα και ότι αυτές οι αλλαγές πιθανώς διαμεσολαβούν την αντίσταση DDP των κυττάρων Α549.

Μόλις εκτίθενται σε DDP, τα καρκινικά κύτταρα να προσαρμοστούν στις αλλαγές στο περιβάλλον για να επιβιώσουν. Τα μονοπάτια σύστημα αντιμετώπισης βλάβης (DDR) και ποικίλο σηματοδότηση του DNA, στη συνέχεια, που προκαλείται. Μερικά κύτταρα μπορούν να επισκευάσουν αυτή τη ζημιά και να περάσει μέσα από τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, ενώ άλλα κύτταρα είναι σε θέση να επισκευάσει τις βλάβες και, συνεπώς, υφίστανται κυτταρικό θάνατο από απόπτωση ή κυτταρική γήρανση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, περίπου το ήμισυ των κυττάρων πέθαναν κατά την έκθεση των κυττάρων Α549 έως 3 μg /mL DDP, ενώ τα περιεχόμενα και κυτταρικές διεργασίες των κυττάρων που επιβιώνουν τροποποιήθηκαν στο μεταγραφικό επίπεδο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, τα επίπεδα έκφρασης του miR-21, miR-133b, miR-98 και miR-181α ανιχνεύθηκε σε αυτό το χαρτί ποικίλει. περιεχόμενα RNA σε εξωσώματα φέρεται να διαφέρει από το RNA των κυττάρων δότη [10], και η διαφορική έκφραση του miRNAs exosomal εξαρτώνται τόσο από την προέλευση των κυττάρων και του περιβάλλοντος. Σχήμα 2G δείχνει ότι η υπό θεραπεία DDP, τα επίπεδα διαφορική έκφραση των miRNAs στην εξωσωμάτων διέφεραν από εκείνα στα κύτταρα. Και όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε και 2F, κυτταρική miRNAs εκφράσεις ήταν διαφορετικές από miRNAs exosomal εκφράσεις. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ποικίλει σε κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από διαφορετικές συνθήκες, γεγονός που δείχνει ότι miRNAs περιεχόμενα σε εξωσώματα μπορεί να ρυθμιστεί ανάλογα για τη βιολογική κατάσταση των κυττάρων.

Κατά τη διάρκεια της έκθεσης DDP, εξωσώματα απελευθερώνονται από κάθε επιζώντα κύτταρο αυξηθούν και μερικά από τα DDP εξάγεται από αυτά τα εξωσώματα [16]. Exosomal miRNAs στη συνέχεια μεσολαβεί σε κύτταρο-προς-κύτταρο επικοινωνία [10]. Σχήμα 3Β, 4Α και 4Β δείχνουν ότι εξωσώματα που μεταφέρουν τα μηνύματα μπορεί να δεσμεύεται από τη γύρω κύτταρα και κυτταρικά περιεχόμενα μεταβάλλεται αναλόγως. Αυτά τα μηνύματα μπορεί να περιέχουν πληροφορίες του επικείμενου κινδύνου, και η περιεκτικότητα σε εξωσώματα εξαρτάται πάντα από την κατάσταση όπου τα εξωσώματα απελευθερώνονται. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα δεύτερο κύκλο του DDP, τα μεταγραφικά επίπεδα επηρεάστηκαν. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, 4D και, κύτταρα προκατεργάστηκαν με εξωσώματα έδειξε κάποια προετοιμασία για τον δεύτερο κύκλο της θεραπείας DDP και μεταγραφικές επίπεδα επάγεται σε κύτταρα διέφεραν.

Όταν εκτίθενται σε DDP, Α549 κύτταρα διεγείρονται και το επίπεδο έκφρασης του miR-21 αυξήθηκε. Επειδή το επίπεδο έκφρασης του miR-21 σε εξωσώματα αυξήθηκε επίσης σημαντικά και εξωσώματα μπορούν να προσλαμβάνονται εκλεκτικά από τα περιβάλλοντα κύτταρα, έχουμε υποθέσει ότι θα μπορούσε να μεσολαβήσει εξωσώματα περισσότερο miR-21 σε άλλα κύτταρα. Στην πραγματικότητα, παρατηρήθηκε μια αύξηση στο επίπεδο έκφρασης του miR-21 σε άλλα κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η υπερέκφραση του miR-21 [19] μειώνει την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε DDP. Όταν εκτεθεί σε DDP για μια ακόμη φορά, τα κύτταρα έλαβαν μια δεύτερη διέγερση και ανταποκρίθηκαν λιγότερο έντονα. Τα επίπεδα έκφρασης του miR-21 αυξήθηκε, αλλά όχι τόσο σημαντικά όσο στην πρώτη αλλαγή. Το επίπεδο έκφρασης του miR-133b επίσης αυξήθηκε μετά τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με DDP. Εξωσώματα διαμεσολάβηση miR-133b μπορεί να δεσμεύεται από τη γύρω κύτταρα και επηρεάζουν τα μεταγραφικά επίπεδα των άλλων κυττάρων. Ως προς άφθονη της εξωτερικής miR-133b θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από τα κύτταρα, η έκφραση του miR-133b σε κύτταρα θα μπορούσε να ανατροφοδοτηθεί να μειώνεται. Η κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης του miR-133b [28], έχει αποδειχθεί ότι μειώνει την ευαισθησία των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε DDP. Μετά από ένα δεύτερο κύκλο θεραπείας DDP, κύτταρα με την κακή έκφραση του miR-133b απάντησε και το επίπεδο έκφρασης του miR-133b προφανώς αυξηθεί.

Πολλοί ερευνητές έχουν εκφράσει διάφορες απόψεις σχετικά με την λειτουργία των εξωσωμάτων στον επηρεασμό κυτταρικές αποκρίσεις σε διέγερση, και αυτές οι λειτουργίες εξωσωμάτων έχουν πάντοτε εξαρτάται από τον τύπο της διέγερσης. Μαρία Eldh et al. υποστήριξε ότι εξωσώματα επηρεάζουν την ανταπόκριση των κυττάρων-δεκτών σε ένα εξωτερικό ερέθισμα άγχους μεσολαβώντας RNAs από το ένα κύτταρο στο άλλο [29]. Claire Corcoran et al. Βρέθηκε ότι εξωσώματα συμβάλλει στη μερική κυψελοειδούς επικοινωνίας, με αποτέλεσμα στη μεσολάβηση docetaxel αντοχής σε δευτερεύοντα κύτταρα [15]. Η μελέτη μας κατέδειξε περαιτέρω εξωσωμάτων συμμετοχή στη ρύθμιση της ευαισθησίας των Α549 κυττάρων με DDP κατά τη διάρκεια της έκθεσης DDP και ότι αυτή η επίδραση είναι πιθανόν να ρυθμίζεται από εξωσώματα. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετές ελλείψεις και αδυναμίες σε αυτό το έργο, και ο λεπτομερής μηχανισμός της αντίστασης DDP θα ερευνηθεί περαιτέρω στην επόμενη μελέτη μας.

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι εξωσώματα απελευθερώνονται από κύτταρα Α549 εκτέθηκαν σε DDP μπορούσαν να επικοινωνήσουν με άλλα κύτταρα και επηρεάζουν την αντίσταση αυτών των κυττάρων να DDP. Αν και λεπτομερής μηχανισμός παραμένει ασαφής, πιστεύουμε ότι η αναστολή του σχηματισμού εξωσωμάτων και η απελευθέρωση θα μπορούσε να παρουσιάσει μια νέα στρατηγική για τη μελλοντική θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

κύτταρα από το καλά χαρακτηρισμένο ανθρώπινου πνεύμονα καρκίνος κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος Α549 (Shanghai Cellular Research Institute, Κίνα) διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Nanjing Kaiji Biology, Κίνα) συμπληρωμένο με 10% FBS (ορό εμβρύου μόσχου, Hyclone Laboratories, USA ) στους 37 ° C και υπό 5% CO

2. Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε πυκνότητα κυττάρου 6 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο, και η αξιολόγηση της δόσης-απόκρισης της DDP σε κύτταρα Α549 εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μία μέτρηση κυττάρων κιτ-8 (CCK-8? Dojindo , Κουμαμότο, Ιαπωνία).

Απομόνωση και Χαρακτηρισμός των εξωσώματα Κυκλοφόρησε από Α549 κύτταρα

Για να μειωθεί η επίδραση εξωσωμάτων στο FBS, FBS είχε εξαντληθεί εξωσωμάτων με υπερφυγοκέντρηση σε 200.000 χ g στους 4 ° C για 16 ώρες (Beckman 70 Ti δρομέα). Αφού αφέθηκε κύτταρα να συνδεθούν όλη τη νύκτα, το μέσο αντικαταστάθηκε με μέσο RPMI-1640 και 10% εξωσωμάτων-εξαντλημένο FBS. Μετά από 48 ώρες, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε για να συλλέξει εξωσώματα. Εξωσώματα απομόνωση (Εικόνα 1Α) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια υπερφυγόκεντρο Beckman (70 Ti δρομέα) και λύση καθίζηση εξωσωμάτων ExoQuick-TC (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA, USA).

Εξωσώματα διαλύονται σε 200 μλ φωσφορικό άλας ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Beyotime Biotechnology, Κίνα). Η μορφολογία και το μέγεθος σωματιδίων εξωσωμάτων διαλυμένο σε PBS χαρακτηρίστηκαν μέσω ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου εκπομπής (ΤΕΜ, JEM-2100, JEOL, Tokyo, Japan). Ολικό κυτταρικό και exosomal πρωτεΐνες αντίστοιχα εκχυλίζονται από τα κύτταρα και εξωσώματα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό SDS λύσης (250 ηΜ Tris-HCL, ρΗ 7,4, 2,5% SDS). Πρωτεΐνες (10 mg /ml) διαχωρίστηκαν σε πηκτές 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανοσοαποτύπωση περιλαμβάνονται CD63 (Σύστημα Biosciences, Mountain View, CA, USA) και β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). Χρησιμοποιώντας ενισχυμένη λύση χημειοφωταύγειας (ECL kit, Pierce), ταινίες πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας XRS Μοριακής Image ChemiDoc + (Bio-Rad).

Πρόσληψη Εξωσώματα και Κυτταρικής Βιωσιμότητας Ανάλυση

Τα σφαιρίδια εξωσωμάτων επαναιωρηματοποιήθηκαν σε 1 mL phosphatebuttered αλατούχο (PBS) που περιείχε 5 μg /mL είχε (Biotium, USA) για 30 λεπτά. Το επαναιωρημένο διάλυμα υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση σε 200,000 χ g για 2 ώρες, και οι PBS-επαναιωρήθηκαν σφαιρίδια προστέθηκαν στα κύτταρα Α549. απεικόνισης φθορισμού διενεργήθηκε εν συνεχεία με συνεστιακή μικροσκόπηση.

Για να εκτιμηθεί η επίδραση του εξωσωμάτων στην ευαισθησία των κυττάρων σε DDP, 6 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων με RPMI- 1640 που περιέχει 10% εξωσωμάτων-εξαντλημένο FBS. Μετά από 24 ώρες, εξωσώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα Α549, υπό κανονικές και DDP επεξεργασμένο συνθήκες προστέθηκαν στα αντίστοιχα κύτταρα σε μια αναλογία 5: 1 (εξωσώματα συλλέχθηκαν από 5 mL υπερκειμένου προστέθηκαν σε κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 mL του μέσου καλλιέργειας) για 3 h. Ο ίδιος όγκος PBS χωρίς εξωσωμάτων προστέθηκε σε κύτταρα που χρησιμοποιούνται ως ομάδα ελέγχου. Για προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας, 3 μg /mL DDP εφαρμόσθηκε στα φρέατα επί 48 ώρες και η συνολική βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων-8 (CCK-8).

Απομόνωση RNA και Ανάλυση

Exosomal RNAs απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης mirVana microRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) και εκλούεται σε 100 μL του διαλύματος θερμαίνεται έκλουσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Cellular RNAs ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Trizol® μεθοδολογία εκχύλισης (Invitrogen, Paisley, UK) και εκλούεται σε 30 μι DDH

2O.

miRNA ήταν stem-loop αντίστροφη μεταγραφή (RT) με το κιτ της αντίστροφης μεταγραφής miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας TaqMan miRNA δοκιμασίας (Applied Biosystems). Ο συνδυασμός του γονιδίου-ειδικό ανιχνευτή (miR-21, 000.397? MiR-98, 000.577? MiR-133b, 002.247? MiR-138, 002.284? MiR-181, 000.480? MiR-200c, 002.300) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για TaqMan miRNA δοκιμασία για την ανίχνευση του επιπέδου έκφρασης miRNAs σε κύτταρα? συνθετικά μη-ανθρώπινα miRNA [

Caenorbabditis elegans

miR-39 miRNA (cel-miR-39)? Takara Bio Inc., Τόκιο, Ιαπωνία] εμπλουτίστηκε για να εξομαλύνει την ένταση εξωσωμάτων κατά την έναρξη της απομόνωσης του RNA.

Προσαρμοσμένη TaqMan χαμηλής πυκνότητας σειρά RT-PCR (Confinder Bio., Κίνα) εφαρμόστηκε για την ανίχνευση του mRNA έκφραση και GAPDH επελέγη ως εσωτερικό έλεγχο. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7900 Sequence D λογισμικό συστήματος εσωτερικού ανίχνευσης (Applied Biosystems).

Στατιστική Ανάλυση

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση ± SD. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ κατά τη σύγκριση των δύο ομάδων (PASW Στατιστικά 18.0), και η P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική