Αφηρημένο

Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με τη θνησιμότητα σε παγκόσμιο επίπεδο και στην πλειονότητα των περιπτώσεων διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια της νόσου. Σήμερα δεν υπάρχει αποδοτική δοκιμασία διαλογής για NSCLC, και η ανάπτυξη ενός τέτοιου τεστ είναι μια δημόσια υγεία επιτακτική. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το στήθος υπολογιστική διαλογή τομογραφία των ασθενών με υψηλό κίνδυνο καρκίνου του πνεύμονα μπορεί να αυξήσει την επιβίωση από την ασθένεια, ωστόσο, η αποτελεσματικότητα κόστος αυτών διαλογής δεν έχει τεκμηριωθεί. Σε αυτή τη φάση Ι /μελέτη βιοδεικτών II εξετάσαμε τη δυνατότητα χρησιμοποίησης του ορού miRNA ως βιοδείκτες της NSCLC χρησιμοποιώντας RT-qPCR να εξετάσει την έκφραση των 180 miRNAs σε ορούς από 30 θεραπεία NSCLC ασθενείς αφελείς και 20 υγιείς μάρτυρες. Δέκτης καμπυλών (ROC) και η περιοχή κάτω από την καμπύλη χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό εκφράζονται διαφορικά ζεύγη miRNA που θα μπορούσαν να διακρίνουν NSCLC από υγιείς ελέγχους. Οι επιλεγέντες υποψήφιοι miRNA περαιτέρω επικυρωθεί σε ορούς από επιπλέον 55 ασθενείς με NSCLC και 75 υγιείς μάρτυρες. Η εξέταση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs σε ορό από ένα πολυ-θεσμική ομάδα των 50 ατόμων (30 ασθενείς με NSCLC και 20 υγιείς μάρτυρες) εντοπίζονται διαφορικά εκφρασμένων miRNAs. Ένας συνδυασμός των δύο εκφράζονται διαφορικά miRNAs miR-15b και miR-27b, ήταν σε θέση να διακρίνει NSCLC από υγιείς μάρτυρες με ευαισθησία, ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV) και αρνητική προγνωστική αξία (NPV) 100% στο σύνολο εκπαίδευσης. Μετά από περαιτέρω δοκιμές σε επιπλέον 130 άτομα (55 NSCLC και 75 υγιείς μάρτυρες), αυτό το ζευγάρι miRNA προέβλεψε NSCLC με ειδικότητα 84% (95% CI 0,73 – 0,91), ευαισθησία 100% (95% CI? 0,93 έως 1,0), ΚΠΑ του 100%, και PPV 82%. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν αποδείξεις ότι miRNAs ορού έχουν τη δυνατότητα να είναι ευαίσθητη, οικονομικά αποδοτική βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του NSCLC. Περαιτέρω δοκιμές σε μία μελέτη Φάσης ΙΙΙ βιοδείκτη in είναι απαραίτητη για την επικύρωση των αποτελεσμάτων αυτών

Παράθεση:. Hennessey PT, Sanford Τ, Choudhary Α, Mydlarz WW, ​​Brown D, Adai AT, et al. (2012) Ορός microRNA βιοδείκτες για την ανίχνευση μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (2): e32307. doi: 10.1371 /journal.pone.0032307

Επιμέλεια: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Σεπτεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 26η Ιανουαρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Hennessey et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας SBIR επιχορήγησης # 1R43CA141786-01 και από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορήγησης # T32DC000027. Αυτές οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτείται επίσης εν μέρει από Asuragen, Inc. Οι ερευνητές στο Asuragen, Inc. που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη δεν επηρεάζονται από τη διαχείριση ή μέρη εκτός της ερευνητικής ομάδας τους και είχε αποκλειστικό έλεγχο του σχεδιασμού της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση να δημοσιεύει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δρ Ελίζαμπεθ Mambo, Tiffany Sanford, Ashish Choudhary, και ο Άλεξ Tamas Adai είναι υπάλληλοι της Asuragen, Inc. David Brown ήταν ένας υπάλληλος της Asuragen κατά το χρόνο η έρευνα διεξήχθη. Όλες αυτές οι επιστήμονες διεξήγαγαν την έρευνα που αναφέρεται στην παρούσα δημοσίευση ως μέρος της εργασίας τους με Asuragen. Δεν υπάρχει κανένα άμεσο οικονομικό όφελος για τους ερευνητές για τη δημοσίευση αυτού του χειρογράφου. Asuragen διεξάγει ανεξάρτητη εσωτερική επανεξέταση των χειρογράφων να διατηρήσει την επιστημονική ακεραιότητα και τη διαχείριση των συγκρούσεων συμφερόντων. David Brown σήμερα απασχολείται από miRNA Therapeutics, Inc. διηύθυνε την έρευνα που παρουσιάζεται σε αυτό το άρθρο, ενώ ο ίδιος ήταν ένας υπάλληλος της Asuragen, Inc. συμμετοχή του στην έρευνα παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο έληξε μετά έφυγε Asuragen, Inc. Η διοίκηση και οι ιδιοκτήτες των miRNA Θεραπευτικής δεν είχε κανένα ρόλο στην έρευνα που παρουσιάζεται σε αυτό το χειρόγραφο ή οποιαδήποτε επιρροή στην προετοιμασία των manuscript.This δεν μεταβάλλει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικά |

Εισαγωγή.

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με τη θνησιμότητα σε παγκόσμιο επίπεδο, και ήταν υπεύθυνος για 1.380.000 θανάτους το 2008 [1]. Το κάπνισμα είναι ο πρωταρχικός παράγοντας κινδύνου για καρκίνο του πνεύμονα, και εκτιμάται ότι το 20,8% των Αμερικανών ενηλίκων είναι ενεργοί καπνιστές [2]. Επί του παρόντος δεν υπάρχει επικυρωθεί, οικονομικά αποδοτική διαγνωστική εξέταση η οποία παρέχει αξιόπιστα μια διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα. Η ανάπτυξη μιας τέτοιας δοκιμής είναι μια δημόσια υγεία επιτακτική, καθώς η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα σχετίζεται με αύξηση έως και 92% 5-ετή επιβίωση [3]. Επειδή ο καρκίνος του πνεύμονα συνήθως δεν γίνει κλινικά εμφανής μέχρι να φτάσει σε ένα προχωρημένο στάδιο, είναι μεγαλύτερη από το 75% των καρκίνων του πνεύμονα διαγιγνώσκονται μετά η ασθένεια έχει ήδη τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό [4]. Λόγω της σημαντικής πλεονέκτημα επιβίωσης για την έγκαιρη ανίχνευση, υπήρξαν εντατικές προσπάθειες για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα σε πρώιμο στάδιο. Το έργο του Καρκίνου Δράσης Πρώιμη πνεύμονα (ELCAP) [5] και η Εθνική Δίκη προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα (NLST) [4] είναι προοπτικές μελέτες που προβλήθηκε καπνιστές υψηλού κινδύνου συμπτωμάτων χωρίς τη χρήση χαμηλής δόσης αξονική τομογραφία (CT) και τα προκαταρκτικά αποτελέσματα δείχνουν αυξημένη δυνατότητα να ανιχνεύει το πρώιμο στάδιο, ενδεχομένως ιάσιμη βλάβες [3]. Η NLST διεκόπη στις αρχές Νοεμβρίου του 2010, μετά τα προκαταρκτικά στοιχεία έδειξαν μείωση κατά 20,3% των θανάτων από καρκίνο του πνεύμονα στο σκέλος ελέγχου CT της δίκης [4], [6]. Ωστόσο, το υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών 96,4% που παρατηρήθηκε στην ομάδα χαμηλού CT δόση είναι πιθανό να εμποδίσει την υιοθέτηση του αξονική τομογραφία στον έλεγχο του πληθυσμού [6]. Επιπλέον, ερωτήματα σχετικά με τη σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας του προσυμπτωματικού ελέγχου βασισμένο σε αξονική τομογραφία για τον καρκίνο του πνεύμονα παραμένουν αναπάντητα [7], [8], [9], [10], [11]. Επίσης, υπάρχει κάποια ανησυχία ότι η επαναλαμβανόμενη έκθεση σε αξονική τομογραφία χαμηλής δόσης μπορεί να εκθέσει τους ασθενείς σε δυνητικά επιβλαβή επίπεδα της ακτινοβολίας που θα μπορούσε να οδηγήσει σε περισσότερες καρκίνους [12]. Αν και αξονική τομογραφία μπορεί να εντοπίσει αλλοιώσεις ύποπτες για καρκίνο του πνεύμονα, η διάγνωση ιστός είναι ο μόνος τρόπος για να καθοριστεί εάν ένα πνεύμονα βλάβη είναι καρκινικές. Μια μετα-ανάλυση των μελετών προσυμπτωματικού ελέγχου του καρκίνου του πνεύμονα 7 αξιολογηθεί χαμηλής δόσης ελικοειδούς σάρωσης CT ως διαγνωστική εξέταση για τον καρκίνο του πνεύμονα και διαπίστωσε ότι 14-55% των ασθενών υψηλού κινδύνου, με την ηλικία ≥40 και ≥20 ιστορικό καπνίσματος χρόνο πακέτο, ο οποίος είχε μια ύποπτη βλάβη στους πνεύμονες σε CT διαλογής, τελικά βρέθηκαν να έχουν καλοήθεις βλάβες του πνεύμονα μετά από να υποβληθεί σε επεμβατική διαδικασία για τη διάγνωση των ιστών [13]. Αυτό το υψηλό ποσοστό των επεμβατικών διαδικασιών για καλοήθη νόσο υπογραμμίζει την ανάγκη για πρόσθετες λεπτομέρειες διαλογής που μπορεί δυνητικά να μειώσει τον αριθμό των ασθενών που υποβάλλονται σε επεμβατικές διαδικασίες άσκοπα.

Εκτός από τις μεγάλες δοκιμές για την αποτελεσματικότητα της CT διαλογής για πνευμόνων τα καρκίνου, πολλές ομάδες διερεύνηση ενεργά τη δυνατότητα των βιοδεικτών με βάση το αίμα για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [14]. Κυκλοφορούν βιοδείκτες είναι ελκυστικές για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου, δεδομένου ότι είναι με βάση το αίμα δοκιμές που είναι ελάχιστα επεμβατική, σχετικά χαμηλού κόστους και εύκολα επαναλαμβανόμενη. Ορός microRNAs (miRNAs) είναι ελκυστικοί υποψήφιοι για να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες του καρκίνου. Ορός miRNA μπορεί να απομονωθεί αξιόπιστα από τον ορό και έχει αποδειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα σταθερό, ακόμα και κάτω από σκληρές συνθήκες, όπως πολλαπλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης και μεταβολές του ρΗ [15]. Πρόσφατες ελπιδοφόρες μελέτες δείχνουν ότι miRNAs στο πλάσμα θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο βήμα στη διαδικασία ελέγχου για τον καρκίνο του πνεύμονα, και για να αποφασίσει ποιοι ασθενείς στην οθόνη περαιτέρω με αξονική τομογραφία [16], [17], [18]. Σε μια προσπάθεια για την ανάπτυξη μη επεμβατική ανιχνεύσεις βιοδεικτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα, αξιολογήσαμε την έκφραση του miRNA εξάγεται από ορό που λαμβάνεται από προ-θεραπεία ασθενών NSCLC και του καρκίνου χωρίς υγιή άτομα, για τον εντοπισμό βιοδείκτες miRNA-based που είναι ικανά να διακρίνουν μεταξύ αυτών των ομάδων.

Μέθοδοι

Δείγμα Συλλογή

τα δείγματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη συλλέχθηκαν στο Πανεπιστήμιο του Rochester Medical Center από το Δρ Stephen Ahrendt ως μέρος μιας μελέτης προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα και στο The Johns Hopkins Hospital ως μέρος ενός πρωτοκόλλου προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Οι κλινικές πληροφορίες επίσης συλλέγονται για κάθε ασθενή κατά τον χρόνο της συλλογής αίματος. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από την εγγραφή στις μελέτες και οι μελέτες εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Rochester Medical Center Έρευνας Θέματα κριτική επιτροπή και το Johns Hopkins Hospital Institutional Review Board, αντίστοιχα. Αίματος από ασθενείς με NSCLC και υγιείς δότες συλλέχθηκε σε σωληνάρια πλαστικά ορού BD Vacutainer® Plus και μεταποιούνται σε ορό. Για όλους τους ασθενείς με καρκίνο, συλλέχθηκε αίμα κατά το χρόνο της διάγνωσης, αλλά πριν από την εκτομή του όγκου ή θεραπεία. Ο ορός αποθηκεύτηκε αμέσως στους -80 ° C μέχρι τον χρόνο της χρήσης. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας συλλογής, όλες οι εγγραφές έγιναν απο-προσδιορίστηκαν για να προστατέψουν την εμπιστευτικότητα των ασθενών. Ομάδες συγκεντρώθηκαν αναδρομικά από αυτές τις μεγάλες συλλογές των δειγμάτων ορού, σε μια προσπάθεια να συγκεντρώσει την ηλικία και το φύλο συνδυάζεται ομάδες με παρόμοια ιστορικό καπνίσματος και με την πρόωρη όγκους σταδίου για τους ασθενείς με καρκίνο (Πίνακας 1). Οι ασθενείς που ορίζονται ως έχει ένα ιστορικό καπνίσματος αν είχαν ιστορικό με συνέπεια το κάπνισμα για τουλάχιστον ένα έτος. Ένα δύο ουρά ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ Όλα τα δείγματα ορού διατηρήθηκαν στην τράπεζα ιστών του Johns Hopkins Hospital Division της Κεφαλής και Τραχήλου Cancer Research, χρησιμοποιώντας μια εφαρμογή διαδικτυακή βάση δεδομένων που παρέχονται από το νοσοκομείο Τμήμα Johns Hopkins της έρευνας Ογκολογίας του Συστήματα Πληροφορικής (RITS) (https://www.rits.onc.jhmi.edu/). Τα δείγματα απεστάλησαν στο Asuragen, Inc., Austin TX για απομόνωση του RNA και την αξιολόγηση των miRNA και ανάλυση δεδομένων.

Η

Εξαγωγή του ορού RNA

Ορός RNA (0,5 ml) εκχυλίζεται με ο Φαρμακογενωμική Group Services Asuragen χρησιμοποιώντας το mirVana PARIS Kit (Ambion, Austin, ΤΧ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αφού η οργανική εκχύλιση, η υδατική φάση φορτώθηκε στις στήλες που παρέχονται στο κιτ. RNA πλύθηκε και εκχυλίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το NanoDrop 1000 (NanoDrop, Wilmington, DE) και αποθηκεύεται στους -80 ° C. RNA αποδόσεις που επιτεύχθηκαν ήταν συνήθως 300-500 ng /mL ορού.

miRNA Ποσοτικοποίηση με RT-qPCR

Χρησιμοποιήσαμε προσδιορισμούς TaqMan RT-qPCR (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) για να εξετάσει το έκφραση των 181 miRNAs στο RNA των 50 ατόμων ορού, (30 ασθενείς με ΜΜΚΠ, και 20 χωρίς καρκίνο, υγιή άτομα). Όλα τα αντιδραστήρια, εκκινητές και ανιχνευτής αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) εκτελέστηκε σε 10 αντιδράσεις uL, που το καθένα περιέχει 1 χ RT ρυθμιστικού (Invitrogen, Carlsbad, CA), 250 μΜ κάθε dNTP (GE Healthcare, Piscataway, NJ), 2 μλ TaqMan RT εκκινητή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 4 μονάδες αναστολέα RNAse (Promega, Madison, WI), 10units MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA), και ~ 1 ng RNA ανά αντίδραση. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 16 ° C για 30 λεπτά, 42 ° C για 1 ώρα και 85 ° C για 5 λεπτά. Αντιδράσεις qPCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το ΑΒΙ Prism 7900 ΗΤ σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας 384 φρεατίων (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Για miRNA διαλογής, μία RT και qPCR αντίδρασης ανά δείγμα πραγματοποιήθηκε, ενώ για προσδιορισμούς επαλήθευση miRNA υποβάλετε διαλογής, δύο αντιδράσεις RT ακολουθούμενο από ένα κάθε qPCR πραγματοποιήθηκαν για καθένα από τα 130 δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση. Κάθε qPCR διεξήχθη σε 15 αντιδράσεις uL περιέχει 1 × Platinum Taq ρυθμιστικού (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 mM MgCl

2 (Invitrogen), 250 μΜ dNTPs, 2 υΐ TaqMan microRNA μείγμα εκκινητή προσδιορισμού /ανιχνευτή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 1 × ROX, (0,5 μονάδες Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA), και 2 μι cDNA από την αντίδραση RT.

δεδομένα

Ανάλυση

για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών για διάκριση NSCLC από υγιείς μάρτυρες, υπολογίσαμε πρώτα τη μήτρα τιμή ΔCt για κάθε δείγμα αφαιρώντας την τιμή αριθμού κύκλο κατωφλίου (Ct) για ένα miRNA από την τιμή Ct άλλου miRNA στο ίδιο δείγμα. η προσέγγιση μήτρα ΔΟΙ της λαμβάνοντας υπόψη το σύνολο των όλα τα διαφορικά εκφρασμένων ζεύγη miRNA όμως υπολογιστικά επαχθείς, αλλά έχει το πλεονέκτημα αποφυγής της ανάγκης για την επίκληση ρητή ομαλοποίηση. για τους 181 miRNAs αναλύονται ανά δείγμα, κάθε φορέας του δείγματος έδωσε 16.290 στοιχεία (), που αναφέρεται εδώ ως miRNA «diffpairs». [19 ], [20] Στη συνέχεια υπολογίσαμε τις άνισες τιμές ρ διακύμανση t-test και το AUC για την καμπύλη ROC για κάθε μία από τις diffpairs. Το σημείο αποκοπής για κάθε ΔCt επελέγη για τη μεγιστοποίηση το άθροισμα ευαισθησίας και εξειδίκευσης. Υποψήφιο miRNA ζεύγη για τον έλεγχο σε ένα άλλο σύνολο του δείγματος περαιτέρω επιλέγονται με βάση την ευαισθησία και ειδικότητα τουλάχιστον 80% η κάθε μία. Τα κριτήρια αυτά παρήγαγαν συνολικά 140 υποψήφια miRNA diffpairs (Σχήμα S1). Το σημείο αποκοπής που χρησιμοποιείται για κάθε diffpair miRNA στο σύνολο εκπαίδευσης εφαρμόστηκε στο σύνολο δεδομένων επικύρωσης.

Αποτελέσματα

Για να εντοπιστούν διαφορικά εκφραζόμενα miRNA σε NSCLC, αρχικά εξετάζονται οι οροί από ασθενείς 16 NSCLC και 20 υγιείς δότες για την έκφραση των 328 miRNA με τη χρήση RT-qPCR. Για να αποφευχθεί η εσφαλμένη ανίχνευση, έχουμε εξαλειφθεί πρώτα όλα τα miRNAs που είχαν διαγνωστεί μετά από 40 κύκλους qPCR σε όλα τα δείγματα, αφήνοντας μόνο 181 miRNAs. Ως εκ τούτου, έχουμε περιοριστεί περαιτέρω διαλογή των ορών από 30 ασθενείς με NSCLC και 20 υγιή άτομα μόνο στα 181 miRNAs που εκφράστηκαν σε ή κάτω από 40 κύκλους. Οι ασθενείς ταιριάζουν ως προς την ηλικία, το φύλο και το ιστορικό καπνίσματος. Μια δίπλευρη ακριβής τεστ του Fisher χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των ομάδων. Η μόνη στατιστικά σημαντική συσχέτιση ήταν μεταξύ του καρκίνου και του καπνίσματος (p = 0,015). Έγιναν προσπάθειες για την εξισορρόπηση της εκπροσώπησης των ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα και αδενοκαρκινώματα. Η πλειοψηφία των σετ εκπαίδευσης δείγματα (66,7%) ήταν αδενοκαρκίνωμα, ενώ το 33,3% ήταν πλακώδες καρκίνωμα. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των 30 ασθενείς με NSCLC και 20 υγιείς ασθενείς χωρίς ιστορικό καρκίνου φαίνεται στο Σχήμα 1 και στον Πίνακα 1. Αν και το εύρος των ηλικιών ήταν 20-75 χρόνια στα υγιείς ελέγχους, μόνο ένας δότης ήταν κάτω από 35 ετών.

Χρησιμοποιώντας το διαφορικά εκφρασμένων miRNA ανάλυση των δεδομένων κατά ζεύγη που περιγράφονται ανωτέρω, το σύνολο εκπαίδευσης δεδομένα για 181 miRNAs απέδωσε 16290 diff ζευγάρια, εκ των οποίων 140 υποψήφια miRNA ζεύγη διακρίνονται NSCLC από υγιείς μάρτυρες με ευαισθησία και ειδικότητα της τουλάχιστον 80% το καθένα (Βλέπε Σχήμα S1). Αρκετά ζευγάρια miRNA που αφορούν miRNAs-106α, miR-15b, miR-27b, miR-142-3p, miR-26b, miR-182, 126 #, let7g, αφήστε-7θ και miR-30e-5P παρουσίασαν αρνητική προγνωστική αξία ( NPV) και μια θετική προγνωστική αξία (PPV) από 100% (Πίνακας 1), υποδεικνύοντας αυτές miRNAs ως υποθετικές υποψήφιοι βιοδείκτη για τη διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα. Τα 140 υποψήφια ζεύγη miRNA αντιπροσώπευαν συνολικά 26 μοναδικές miRNAs. Κατά συνέπεια, RT-qPCR των 26 miRNAs πραγματοποιήθηκε σε RNA ορού από επιπλέον 55 ασθενείς με NSCLC (60% του σταδίου Ι, 24% του σταδίου ΙΙ, 12% Φάση ΙΙΙ και 4% Stage IV), και από 75 χωρίς καρκίνο, υγιή ελέγχους. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των 55 ασθενείς με NSCLC και 75 υγιείς ασθενείς χωρίς ιστορικό καρκίνου φαίνεται στο Σχήμα 1 και τον Πίνακα 1. ακριβές τεστ δύο ουρών Fisher χρησιμοποιούνται για την ανάλυση των ομάδων. Η μόνη στατιστικά σημαντική συσχέτιση ήταν μεταξύ του καρκίνου και του καπνίσματος (p = 0,005). Διαφορική έκφραση των υποψηφίων βιοδεικτών miRNA ζεύγη από το σύνολο εκπαίδευσης (Σχήμα S1) εξετάστηκε στο σύνολο της δοκιμής χρησιμοποιώντας την ίδια cut-off σημείο όπως εφαρμόστηκε στο σύνολο εκπαίδευσης. Τα αποτελέσματα έδωσαν 5 υποψήφιος βιοδεικτών με ευαισθησία και ειδικότητα των τουλάχιστον 75% (Πίνακας 2). Όλα τα 5 υποψήφια miRNA ζεύγη φαίνονται στον Πίνακα 2 ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ NSCLC και υγιείς μάρτυρες, όπως φαίνεται από τα ρ-τιμές & lt? 0.001. Διαφορική έκφραση του ζεύγους miRNA miR-15b /miR-27b παρουσιάζεται στο Σχήμα 2 για τόσο το σύνολο εκπαίδευσης και το σύνολο ελέγχου. Η κατανομή αυτού του ζεύγους miRNA απλώθηκε πάνω από ένα ευρύτερο φάσμα (& gt? 4 CTS) στους υγιείς μάρτυρες, ενώ η διανομή στα δείγματα NSCLC ήταν στενότερη με μια σειρά από ~ 2 Cts. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) του λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη (ROC) οικόπεδο (Εικ. 3) για αυτό το ζευγάρι miRNA ήταν 0,98 για τα δεδομένα των δοκιμών, με ευαισθησία και ειδικότητα 100% στο σύνολο εκπαίδευσης (Σχήμα S1) και ευαισθησία 100% (95% CI? 0,93 έως 1,0) και ειδικότητα 84% (95% CI 0,73 – 0,91) στο σύνολο της δοκιμής (Πίνακας 2 και Σχήμα 2). Η δεύτερη κατάταξη ζεύγος miRNA εμπλέκονται miR-15a και miR-27b, με ευαισθησία 87% και ειδικότητα 93% στο σύνολο εκπαίδευσης, ενώ η ευαισθησία και η ειδικότητα της στο σύνολο της δοκιμής ήταν 94% και 75% αντίστοιχα (Πίνακας 2). Αρκετά από τα ζεύγη miRNA στο σύνολο εκπαίδευσης είχε υποβέλτιστη απόδοση στο σύνολο ελέγχου είτε με την ευαισθησία ή /και ειδικότητα μικρότερη από 75%. Το ζευγάρι κορυφαίο υποψήφιο miRNA (miR-15b και 27b) διακρίνονται NSCLC από υγιείς μάρτυρες με NPV 100% και PPV του 82% στο σύνολο ελέγχου (Πίνακας 2). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν τις δυνατότητες των miRNA ορό βάση όπως διαλογή βιοδείκτες για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Διαφορικές τιμές έκφρασης υπολογίστηκαν ως η διαφορά των τιμών Ct για τις δύο miRNAs. Το κατώτατο όριο που υποδεικνύεται από την οριζόντια γραμμή επελέγη για τη μεγιστοποίηση της άθροισμα ευαισθησίας και ειδικότητας, όπως περιγράφεται στην ανάλυση των δεδομένων. Η ευαισθησία, η ειδικότητα, η θετική προγνωστική αξία (PPV), και αρνητική προγνωστική αξία (NPV) που λαμβάνονται με τη χρήση του διαφορική έκφραση των 2 miRNA εμφανίζονται ως πίνακες για το σύνολο εκπαίδευσης (στα δεξιά) και το σύνολο ελέγχου (στα αριστερά).

Απλή αναζήτηση

Συζήτηση

με αυτή τη διερευνητική φάση Ι /μελέτη βιοδεικτών II (όπως περιγράφεται από την Πρώιμη Ανίχνευση Δίκτυο Έρευνας (eDRN) (http: //edrn. nci.nih.gov)) μπορούμε διαλογή ορού από ασθενείς χωρίς ιστορικό καρκίνου, και οι ασθενείς με NSCLC, σε μια προσπάθεια να εντοπίσει miRNAs που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ανίχνευση του καρκίνου του πνεύμονα πρώιμο στάδιο. Εντοπίσαμε ένα ζευγάρι miRNA miR-15b /miR-27b, που ήταν σε θέση να διακρίνουν μεταξύ ορού από ασθενείς με NSCLC και του καρκίνου χωρίς υγιείς μάρτυρες, και με υψηλό βαθμό ευαισθησίας. Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν τα ευρήματα πρόσφατων μελετών που έχουν δείξει ότι κυκλοφορούν προφίλ miRNAs μπορεί να είναι χρήσιμα στη διαλογή για NSCLC, [16], [17] Ωστόσο, η μελέτη μας περιλαμβάνονται ουσιαστικά περισσότερο ασθενείς (180 συνολικά) από ό, τι οποιαδήποτε από αυτές τις προηγούμενες μελέτες. Ένα μειονέκτημα αυτών των βιοδεικτών είναι η χαμηλή εξειδίκευση του 84% στο σύνολο της δοκιμής. Το σχετικά υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών για τις δοκιμές αυτές θα μπορούσαν να θεωρείται απαράδεκτο για τη διαλογή του γενικού πληθυσμού. Ωστόσο, σε έναν πληθυσμό των καπνιστών σε υψηλό κίνδυνο για καρκίνο του πνεύμονα, μη αναγκαίο έλεγχο θα μετριαστεί από την ικανότητα της δοκιμής αυτής, με αρνητική προγνωστική αξία του 100%, να είναι σε θέση να αποκλείσει ένα μεγάλο αριθμό ασθενών από το να πηγαίνουν σε πιο ακριβά τρόπους ελέγχου, όπως ελικοειδή αξονική τομογραφία θώρακος. Παρά το γεγονός ότι τα στοιχεία αυτά είναι συναρπαστικό, περαιτέρω δοκιμές σε μια μεγάλη, προοπτική κοόρτης ως μελέτη Φάσης ΙΙΙ βιοδείκτη απαιτείται για να αξιολογήσει την κλινική χρησιμότητα αυτών των miRNA δεικτών ως πρώτη δοκιμή διαλογής γραμμή για NSCLC.

Οι δείκτες miRNAs που προσδιορίζονται σε αυτή τη μελέτη έχουν προηγουμένως εμπλακεί σε ανθρώπινες κακοήθειες. miR-15a και miR-15b έχουν δειχθεί να απο-ρυθμισμένο σε καρκίνο ανθρώπινου πνεύμονα [21]. Τόσο miR-15a και miR-15b έχουν δειχθεί να έχουν μια διαγνωστική και προγνωστική αξία σε χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [22], [23]. miR-27b βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστό πνεύμονα [24]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης miR-27b έχουν συσχετιστεί με τη διεισδυτικότητα του καρκίνου του μαστού [25] και με ρύθμιση της αγγειογένεσης [26]. Μια μελέτη στην οποία συμμετείχαν συνολικά 86 NSCLC και 57 έλεγχοι αποκάλυψαν πρόσφατα τέσσερα πάνελ miRNA στο πλάσμα, συμπεριλαμβανομένων miR-126, που διακρίνεται NSCLC από υγιείς μάρτυρες με ευαισθησία και ειδικότητα 73% και 96% αντίστοιχα [27]. Χρησιμοποιώντας το πλήρες αίμα, Keller και συνεργάτες [28] έδειξαν ότι το miR-126 και miR-98 ήταν μεταξύ των κορυφαίων miRNAs που θα μπορούσαν να διακρίνουν με NSCLC από υγιείς μάρτυρες. miR-126 εκφράζεται έντονα στον πνευμονικό ιστό και εμπλέκεται στη ρύθμιση του μόριο προσκόλλησης αγγειακού κυττάρου 1 (VCAM-I) [29]. Η ανώμαλη έκφραση του miR-126 έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση του NSCLC [30], [31]. Σε αυτή τη μελέτη, πολλά ζευγάρια που αφορούν miR-126 ήταν μεταξύ των πολλών υποψηφίων που προσδιορίζονται στο σύνολο εκπαίδευσης (Σχήμα S1), όμως μετά από περαιτέρω δοκιμές σε επιπλέον 130 δείγματα, όλες οι υποψήφιες ζεύγη miRNA-126 παρουσίασαν ευαισθησία μεγαλύτερη από 75% και η ειδικότητα ήταν μικρότερο του 75%. Άλλες πρόσφατες μελέτες από Foss και συνεργάτες [17] έδειξε ορού miR-1254 και miR-574-5p εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ NSCLC (n = 33) και των υγιών μαρτύρων (n = 42). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι διάφοροι παράγοντες επηρεάζουν την έκβαση των μελετών miRNA σε Biofluids, συμπεριλαμβανομένων διακυμάνσεις στο είδος δείγματος, π.χ. ολικού αίματος, πλάσματος ή ορού, αριθμοί των δειγμάτων, το σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή δειγμάτων, την απομόνωση RNA, τα χαρακτηριστικά του ασθενούς, τον αριθμό των miRNA εξετάζονται και οι τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται σε miRNA προφίλ, π.χ. αλληλούχιση solexa, RT-qPCR ή μικροσυστοιχιών τεχνολογίες. Επιπλέον, η τυποποίηση των μεθόδων απομόνωσης, κανονικοποίηση και τις μεθόδους ανάλυσης των δεδομένων είναι απαραίτητη προκειμένου να καταδείξει σαφή κλινική χρησιμότητα αυτών των υποθετικών δεικτών.

Παρά το γεγονός ότι τα στοιχεία αυτά είναι ενθαρρυντικά, το σύνολο της δοκιμής περιελάμβανε ένα σχετικά μικρό αριθμό δειγμάτων . Τελικά, αυτοί οι βιοδείκτες miRNA απαιτούν περαιτέρω επικύρωση σε μεγαλύτερες υποψήφιους ομάδες όπως μια μελέτη βιοδείκτη Φάσης ΙΙΙ, προκειμένου να επικυρώσει τα αποτελέσματα αυτά. Ενσωματώνοντας δείκτες miRNA με βάση το αίμα στο σπιράλ μελέτες CT μπορεί να βοηθήσει στη διερεύνηση της χρησιμότητας των miRNAs στον έλεγχο του καρκίνου του πνεύμονα. Αν και αυτό είναι μια διερευνητική φάσης Ι /ΙΙ μελέτη, οι ασθενείς επιλέχθηκαν κυρίως από χειρουργικές κλινικές, και σταθμίζονται έναντι ασθένειας σε πρώιμο στάδιο (το 60% του σταδίου Ι, 24% του σταδίου ΙΙ, 12% Φάση ΙΙΙ και 4% Stage IV). Αυτή η ασυμμετρία προς ασθένειας σε πρώιμο στάδιο, υποστηρίζει τη διερεύνηση αυτών των δεικτών σε μια δοκιμή φάσης ΙΙΙ ή IV με σκοπό τον προσδιορισμό της απόδοσης αυτών των δεικτών σε μια προοπτική τρόπο στην ανίχνευση πρώιμο στάδιο.

Η πρόσφατη διάδοση της χρησιμότητας του προσυμπτωματικού ελέγχου ελικοειδή αξονική τομογραφία θώρακος τομογραφίες για τη μείωση της θνησιμότητας από καρκίνο του πνεύμονα από τη δίκη NLST δίνει μεγάλη αξία για εντοπισμό των ατόμων υψηλού κινδύνου που θα μπορούσαν να επωφεληθούν από τον έλεγχο. Συμπληρωματική εξετάσεων ορού μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ένα εξαιρετικά αποδοτικό τρόπο σε σύγκριση με την απεικόνιση, και μπορεί να είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό πληθυσμών υψηλού κινδύνου που μπορούν να επωφεληθούν από το στήθος CT, ή να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με απεικόνιση για τον εντοπισμό νωρίς καρκίνων του πνεύμονα.

υπάρχει μεγάλη ανάγκη για βελτιωμένες προσυμπτωματικού ελέγχου για τον καρκίνο του πνεύμονα δεδομένου του μεγάλου αριθμού των ανθρώπων που πλήττονται κάθε χρόνο και το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας της νόσου όταν διαγιγνώσκεται σε μεταγενέστερα στάδια της. Υπάρχουν επί του παρόντος πολλές κλινικές δοκιμές που διεξάγονται για να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα των νέων θεραπειών για NSCLC, ωστόσο, η πλειοψηφία αυτών είναι μελέτες Φάσης ΙΙ και πρόσφατα μια σειρά από δοκιμές Φάσης ΙΙΙ έχουν αποτύχει να ανταποκριθεί πρωτογενή τελικά σημεία τους [32] Μέχρι σήμερα, βελτιωθεί προκειμένου να παρέχουν έγκαιρη ανίχνευση είναι η πιο πολλά υποσχόμενη λεωφόρος για τη μείωση της θνησιμότητας από NSCLC. Η μελέτη μας ενισχύει περαιτέρω το επιχείρημα ότι ο ορός miRNA έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως μια οικονομικά αποδοτική, μη επεμβατικό διαγνωστικό τεστ για NSCLC, και θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί ως πρώτη οθόνη γραμμή για να βοηθήσει διαστρωμάτωση ασθενείς υψηλού κινδύνου για περαιτέρω, πιο ακριβά ή επεμβατική διαλογής σχήματα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. έκφραση

Διαφορικές miRNA σε ορούς από ασθενείς με ΜΜΚΠ (καρκίνος) και των υγιών μαρτύρων (φυσιολογική) στο σύνολο εκπαίδευσης. Diff, διαφορική έκφραση μεταξύ των δύο miRNAs, που υπολογίζεται ως η διαφορά μεταξύ των τιμών Ct των δύο υποδεικνύεται miRNAs. PPV, θετική προγνωστική αξία? ΚΠΑ, αρνητική προγνωστική αξία? SENS, ευαισθησία? και SPEC, ειδικότητα. Η τιμή αποκοπής που χρησιμοποιείται για να επιτευχθεί η ενδεικνυόμενη ειδικότητα και ευαισθησία ενδείκνυται για κάθε ζεύγος diff miRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0032307.s001

(XLS)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες για την Ana Ward και Δρ. Gary Latham, Bernard Andrus, και Rolland Carlson για τις κρίσιμες παρατηρήσεις και τη βοήθειά τους στην προετοιμασία αυτού του χειρογράφου.