Αφηρημένο

Η κλασική χημειοθεραπεία για όγκους του εγκεφάλου είναι τεμοζολομίδη (ΤΜΖ), ωστόσο, όπως πολλοί όπως 50% των όγκων του εγκεφάλου είναι σύμφωνα με πληροφορίες ΤΜΖ ανθεκτικά αφήνοντας ασθενείς χωρίς χημειοθεραπευτικό επιλογή. Πραγματοποιήσαμε σειριακό έλεγχο της ΤΜΖ κυτταρικές σειρές ανθεκτικές αστροκύτωμα, και προσδιόρισε ενώσεις που είναι κυτταροτοξικά σε αυτά τα κύτταρα. Η πιο κυτταροτοξική ένωση ήταν ένα ανάλογο του θειοβαρβιτουρικού οξέος που αναφέρεται ως CC-I. Υπάρχει μια δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξική δράση του CC-Ι σε κύτταρα ανθεκτικά ΤΜΖ αστροκύτωμα. Ο κυτταρικός θάνατος φαίνεται να λαμβάνει χώρα μέσω απόπτωσης. Μετά την έκθεση CC-Ι, υπήρξε μια αύξηση στα κύτταρα αστροκύτωμα στο S και G2 /M φάσεις. Σε

in vivo

χωρίς θύμο αδένα (

nu

/

nu

) άτριχων ποντικών μοντέλα υποδόρια και ενδοκρανιακή όγκων, CC-Ι ανέστειλε πλήρως την ανάπτυξη του όγκου, χωρίς ηπατική ή νεφρική τοξικότητα. αναλύσεις μοριακής μοντελοποίησης και τη δραστηριότητα του ενζύμου δείχνουν ότι η CC-Ι αναστέλλει επιλεκτικά τοποϊσομεράσης ΙΙα παρόμοια με άλλα φάρμακα της κατηγορίας του, αλλά κυτταροτοξικές επιδράσεις της στα κύτταρα αστροκύτωμα είναι ισχυρότερη από αυτές τις ενώσεις. Η κυτταροτοξική δράση του CC-Ι είναι ισχυρότερη σε κύτταρα που εκφράζουν μη μεθυλιωμένη O

μεθυλοτρανσφεράσης 6-μεθυλγουανίνη (MGMT), αλλά εξακολουθεί να είναι τοξικό για τα κύτταρα με μετουσιωμένο MGMT. CC-Ι μπορεί επίσης να ενισχύσει την τοξική δράση της ΤΜΖ στο αστροκύτωμα, όταν οι δύο ενώσεις συνδυάζονται. Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει μια ένωση που είναι αποτελεσματική ενάντια αστροκυτώματα συμπεριλαμβανομένων των ανθεκτικών ΤΜΖ αστροκυτώματα τόσο της κυτταρικής καλλιέργειας και

in vivo

μοντέλα όγκων του εγκεφάλου. Η ενισχυμένη κυτταροτοξικότητα της CC-Ι και το προφίλ ασφαλείας της οικογένειας αυτής των φαρμάκων θα μπορούσε να παρέχει ένα ενδιαφέρον εργαλείο για την ευρύτερη αξιολόγηση ενάντια στους όγκους του εγκεφάλου

Παράθεση:. Lee SY, Slagle-Webb Β, Rizk Ε, Patel Α, Miller PA, Sung SS, et al. (2014) Χαρακτηρισμός της Ενωσης Νέων Αντικαρκινική για Αστροκυτώματα. PLoS ONE 9 (9): e108166. doi: 10.1371 /journal.pone.0108166

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: May 19, 2014? Αποδεκτές: 19 Αύγ 2014? Δημοσιεύθηκε: 25 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτείται εν μέρει από μια επιχορήγηση με το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός R21CA167406 στο SL. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από το Ίδρυμα Pardee Έλσα U. και την Tara Leah Witmer Κληροδότημα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Connor είναι μερική ιδιοκτήτης του NuHope LLC η οποία έχει οικονομικό συμφέρον στην ανάπτυξη των ενώσεων για τη θεραπεία όγκοι του εγκεφάλου που ήταν αρχικά σε διαλογή χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές που επιλέγονται για HFE γονότυπο. Lee έχει συνάψει συμφωνία δικαιωμάτων με NuHope LLC. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο λογαριασμός γλοιώματα για το 28% του συνόλου της πρωτογενούς εγκεφάλου και του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) όγκους, και 80% των γλοιωμάτων είναι κακοήθεις [1]. Μεταξύ γλοιώματα, γλοιοβλάστωμα (πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, αστροκύτωμα βαθμού IV, GBM) είναι η πιο κοινή κακόηθες γλοίωμα. Το ποσοστό θνησιμότητας των πρωτογενών κακοήθων εγκεφάλου και όγκων του ΚΝΣ είναι υψηλό? περίπου 22.620 νέων ενηλίκων περιπτώσεις κακοήθους εγκεφάλου και καρκίνους του ΚΝΣ το 2013 [1] και 13.700 θάνατοι το 2012 [2]. Η διάμεση επιβίωση για τους ασθενείς GBM ήταν 14,6 μήνες και η 2 χρόνια επιβίωση των ασθενών με GBM ήταν 10,4% για την ακτινοθεραπεία μόνο και μόνο 26,5% που υποβάλλονται σε συνδυασμένη θεραπεία θεραπεία τεμοζολομίδη (ΤΜΖ) και ακτινοβολία [3].

Η τρέχουσα τυπική θεραπεία για GBM είναι συνολική εκτομή ακολουθούμενη από μόνη ακτινοθεραπεία ή συνδυασμό με ΤΜΖ χημειοθεραπεία [4], [5]. ΤΜΖ είναι ένα από του στόματος παράγοντα αλκυλίωσης που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία του καρκίνου του εγκεφάλου,

π.χ.

, GBM και ολιγοδενδρογλοίωμα [6]. Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του μελανώματος, του καρκίνου του προστάτη, παγκρεατικό καρκίνωμα, σάρκωμα μαλακών ιστών, και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [7] – [11]. ΤΜΖ αναστέλλει την αναπαραγωγή των κυττάρων με αναστολή της αντιγραφής του DNA [12] και έχει μοναδικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με άλλους αλκυλιωτικούς παράγοντες. Για παράδειγμα, χορηγείται από το στόμα, διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, είναι λιγότερο τοξικό από ό, τι άλλοι αλκυλιωτικοί παράγοντες, και δεν χημικά DNA διασταυρούμενη σύνδεση. Ωστόσο, αν και ΤΜΖ είναι η τρέχουσα χημειοθεραπευτική πρότυπο για τη θεραπεία όγκων του εγκεφάλου και άλλων καρκίνων, όσο το 50% των όγκων του εγκεφάλου είναι ανθεκτικοί σε θεραπεία ΤΜΖ [13], [14]. Επιπλέον, σχεδόν όλοι οι όγκοι τελικά επανέλθει και η μεγάλη πλειοψηφία των επαναλαμβανόμενων όγκοι είναι ανθεκτικοί στη χημειοθεραπεία [15], [16]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών επιλογών συμπεριλαμβανομένων νέων φαρμάκων για τη θεραπεία ανθεκτικών όγκων του εγκεφάλου είναι επειγόντως αναγκαία.

Εκτός από τους παράγοντες αλκυλίωσης όπως ΤΜΖ, αναστολείς τοποϊσομεράσης είναι μια άλλη ομάδα των αντικαρκινικών φαρμάκων υπό αξιολόγηση. Οι τοποϊσομεράσες είναι σημαντικό πυρηνικό ένζυμα που ρυθμίζουν την τοπολογία του DNA, διατηρούν την γονιδιωματική ακεραιότητα και είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμός, μεταγραφή και χρωμόσωμα διαχωρισμού [17]. Υπάρχουν έξι ανθρώπινα ένζυμα τοποϊσομεράσης [18], καθώς και τρεις από αυτούς, τοποϊσομεράσης Ι, τοποϊσομεράσης ΙΙα και τοποϊσομεράσης IIβ, έχουν σημαντική συμμετοχή στον καρκίνο και τη χημειοθεραπεία του καρκίνου [19]. Η τοποϊσομεράσης Ι ένζυμο nicks και επανασυνδέει το ένα σκέλος του DNA διπλής όψης, και το ένζυμο τοποϊσομεράσης II παροδικά σπάει και κλείνει διπλής έλικας του DNA [20]. Οι αναστολείς της τοποϊσομεράσης Ι (π.χ., topotecan) έχουν χρησιμοποιηθεί σε ασθενείς με υποτροπιάζοντα καρκίνο των πνευμόνων μικρών κυττάρων, υποτροπιάζουσα κακοήθη γλοιώματα, επαναλαμβανόμενες όγκους εγκεφάλου παιδικής ηλικίας [21], [22]. Αν και οι αναστολείς τοποϊσομεράσης II μελετήθηκαν σε κύτταρα γλοιώματος [23] – [25], οι αναστολείς τοποϊσομεράσης II δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε ενήλικες με πρωτογενείς όγκους του εγκεφάλου λόγω της κακής διεισδυτικότητας τους στο ΚΝΣ. Ως εκ τούτου, τα μικρά μόρια με την ικανότητα να διεισδύουν στον εγκέφαλο θα ήταν ιδιαίτερα επιθυμητό για την αγωγή γλοιώματα

in vivo

.

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι τα ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος και ανθρώπινων γραμμών κυττάρων που εκφράζουν αστροκύτωμα συχνά εμφανιζόμενων πολυμορφισμούς στο γονίδιο HFE ήταν ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία και ακτινοβολία [26]. Το HFE γονιδιακό προϊόν εμπλέκεται στην ομοιοστασία του σιδήρου και τα κοινά HFE πολυμορφισμοί, H63D και C282Y, να οδηγήσει σε μια σειρά αλλαγών σε κύτταρα όπως αυξημένο στρες ενδοπλασματικό δίκτυο και αυξημένο οξειδωτικό στρες [27] – [29]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές αστροκύτωμα που προσδιορίζονται με τις HFE παραλλαγές γονιδίων και αντίσταση ΤΜΖ σε ενώσεις οθόνη από DIVERSet ένωση βιβλιοθήκης από ChemBridge (San Diego, CA) και βρήκε μια σειρά από αποτελεσματικές ενώσεις με παρόμοια χημειότυπος. Ταυτοποιήσαμε ένα ανάλογο μιας ένωσης θειοβαρβιτουρικού οξέως το οποίο έχει ισχυρή τοξική δράση στο ΤΜΖ-ανθεκτικά κύτταρα αστροκύτωμα. Αναφέρουμε εδώ τον χαρακτηρισμό του μολύβδου ένωσης στο

in vitro

κυτταρικής καλλιέργειας και

in vivo

μοντέλα όγκων του εγκεφάλου.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά

κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και τα άλλα συστατικά της κυτταρικής καλλιέργειας αγοράσθηκαν από τη Life Technologies (Grand Island, ΝΥ). Όλα τα συστατικά Array PCR παρασχέθηκαν από SABiosciences (Frederick, MD). ΤΜΖ αγοράστηκε από Oakwood Products Inc. (West Columbia, SC) και διαλύθηκε σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας ή 100% DMSO. Η ένωση μολύβδου-Ι χημειότυπος (CC-Ι) διατάχθηκε από ChemBridge Corporation (San Diego, CA). Η ένωση διαλύθηκε σε DMSO ως διάλυμα αποθέματος και αραιώνονται για το πείραμα. ένζυμα τοποϊσομεράσης Ι και κιτ δοκιμασίας ΙΙα διατάχθηκαν από TopoGen Inc. (Port Orange, Φλόριντα). Merbarone ελήφθη από την Calbiochem (San Diego, CA). Όλα τα άλλα χημικά που χρησιμοποιούνται αγοράστηκαν από την Sigma Co. (St. Louis, ΜΟ).

καλλιέργεια Ανθρώπινα αστροκύτωμα κυττάρων, τη θεραπεία και την κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

Ανθρώπινο αστροκύτωμα κύτταρα (SW1088-grade III, U87-MG-βαθμού IV, CCF-STTG1 βαθμού IV, T98G βαθμού IV, LN-18-βαθμού IV) είχαν παραγγελθεί από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco από την Life Technologies, Κατάλογος 11885) συμπληρωμένο με 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, 0.29 mg /mL Ε-γλουταμίνη, και 10% FBS. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας. Για τους προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας, οι ενώσεις που δοκιμάστηκαν παρασκευάστηκαν με την πρώτη αραίωση τους από το διάλυμα αποθέματος σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας. Οι ενώσεις εξετέθησαν στα κύτταρα για 3-6 ημέρες. Κυτταροτοξικότητα κυττάρων πραγματοποιήθηκε με MTS [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο] δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων (Promega, Madison, WI ) ή σουλφοροδαμίνη Β (SRB) στο τέλος της περιόδου καλλιέργειας κυττάρων.

Οξεία τοξικότητα αποφασιστικότητα

η οξεία τοξικότητα της CC-Ι προσδιορίστηκε σε αθυμικά γυμνά ποντίκια (στέλεχος 088 ή 490, Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ) σύμφωνα με την οξεία τοξικότητα διαδικασία του προγράμματος ανάπτυξης φαρμάκων ΝΙΗ με μικρή τροποποίηση. Για τον προσδιορισμό της οξείας τοξικότητας, συνολικά έξι θηλυκών ποντικών (ηλικίας 1-2 μηνών) ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 3 διαφορετικές δόσεις (π.χ. 20 mg /kg, 37,5 mg /kg, 50 mg /kg) του CC-Ι ή όχημα έλεγχος μία φορά την εβδομάδα και στη συνέχεια παρατηρήθηκαν για μια περίοδο 7-14 ημερών. Τα ποντίκια παρατηρήθηκαν καθημερινά για αλλαγές στο σωματικό βάρος, ορατού ή /και ψηλαφητή δερματική μόλυνση, παρουσία ασκίτη, κατανάλωση τροφής ή την κατάσταση της διατροφής, και περιποίηση ή εξασθενημένη κινητικότητα ή θανάτου για τον προσδιορισμό της οξείας τοξικότητας. Σε 7-14 ημέρες μετά την αγωγή, 0,5-1 ml αίματος συλλέχθηκε μέσω καρδιακής παρακέντησης της καρδιάς, ενώ τα ποντίκια ήταν κάτω από αναισθησία (κεταμίνη 100 mg /kg σωματικού βάρους /ξυλαζίνη 10 mg /kg βάρους σώματος, ενδοπεριτοναϊκώς) για την εξέταση της τοξικότητας αίμα . Όλα τα ζώα της μελέτης στεγάστηκαν σε ελεύθερα μικροβίων του περιβάλλοντος δωμάτια, καθώς και μεμονωμένα συστήματα φυσαλίδων. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν (IACUC # 2011-062) από τις επιτροπές φροντίδας ζώων και τη χρήση Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Πενσυλβάνια.

Η υποδόρια μοντέλο όγκου

Για να ελέγξετε την αντικαρκινική δράση της CC- έχω κατά της ανθρώπινης όγκου αστροκύτωμα, ένα-δύο μηνών θηλυκό ανοσοανεπάρκεια (

nu

/

nu

) γυμνά ποντίκια (στέλεχος 088, Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ) εμφυτεύθηκαν 10 × 10

6 κύτταρα ανά υποδορίως ποντίκι με ευαίσθητα ΤΜΖ SW1088 ή ανθεκτικά ΤΜΖ κύτταρα αστροκύτωμα CCF-STTG1. Όταν ο όγκος έφθασε περίπου 32-100 mm

3 σε μέγεθος, τα ποντίκια (η = 10 ή 11) χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. Το CC-Ι ενέθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε συγκέντρωση 25 mg /kg σωματικού βάρους σε έναν όγκο 200-300 μλ σε 12.5% ​​αιθανόλη μια φορά την εβδομάδα για 7 εβδομάδες. Η ομάδα ελέγχου έλαβε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) με τον ίδιο όγκο και σχήμα. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση με τη βοήθεια ενός παχυμέτρου για 7 εβδομάδες από έναν ερευνητή τύφλωσε με πειραματικές συνθήκες. Ο όγκος του όγκου (V) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο V =

μια

2/2 × b, όπου

μια

και

β

είναι ήσσονος σημασίας και βασικούς άξονες των εστιών του όγκου, αντίστοιχα. Το μέγεθος του όγκου, την υγεία, και η επιβίωση των ποντικών εμφανώς παρακολουθήθηκαν καθημερινά και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Εμείς δεν πάρει τις εικόνες των όγκων. Εμείς θα εξετάσει τη λήψη φωτογραφιών για τις επερχόμενες πειράματα. Για την παρακολούθηση της τοξικότητας των ενώσεων, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με κεταμίνη /ξυλαζίνη 100/10 mg /kg σωματικού βάρους ενδοπεριτοναϊκώς, και μετρήθηκε τοξικότητα ήπαρ και τους νεφρούς στο τέλος του πειράματος.

Ενδοκράνιο ξενομοσχεύματος μοντέλο

Θηλυκά γυμνά ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια (στέλεχος 088, Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ) που ζυγίζουν 20-30 g αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κεταμίνης-ξυλαζίνης 100 mg /kg-10 mg /kg σωματικού βάρους. Ανθρώπινα U87-MG και CCF-STTG1 αστροκύτωμα κυτταρικές σειρές εμφυτεύτηκαν για να δημιουργήσετε το ξενομόσχευμα όγκου στον εγκέφαλο. Εν συντομία, η κεφαλή πραγματοποιήθηκε σε οριζόντια θέση και 1 εκατομμύριο αστροκύτωμα κυττάρων σε ένα όγκο 10 μL ενέθηκαν αργά μέσα στην περιοχή κερκοφόρο κέλυφος χρησιμοποιώντας ένα μικρό συσκευή στερεοτακτική ζώο. Οι στερεοτακτικές συντεταγμένες που χρησιμοποιούνται για τα ξενομοσχεύματα είναι Ρ = 0,5, L = 1.7, Η = 3,8 mm. Τα κύτταρα αστροκυτώματος εγχύθηκαν αργά για 10 λεπτά για να αποφευχθεί αύξηση της ενδοκρανιακής πίεσης ή ανοδική διαρροή κυτταρικό εναιώρημα μέσα στην πίστα της βελόνας. Τα ζώα δόθηκαν βουπρενορφίνη (0,05-0,1 mg /kg σωματικού βάρους υποδόρια) για τον πόνο κατά τη διάρκεια και μετά την επέμβαση. Αυτό δόθηκε κάθε 8-12 ώρες για 24-48 ώρες μετά την επέμβαση. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε Τ1 σταθμισμένη απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI) δύο φορές? μία φορά για να καθορίσει ότι ένας όγκος είναι εγκατεστημένος στον εγκέφαλο (~ 3 εβδομάδες ένεση κυττάρων αστροκύτωμα) και στο τέλος του πειράματος. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν σε ημερήσια βάση και το σωματικό βάρος καταγράφηκε εβδομαδιαίως. Μόλις παρατηρήθηκε όγκου, τα ποντίκια (η = 12 ή 15) χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. CC-Ι (25 mg /kg σωματικού βάρους) ή PBS εγχύθηκε μία φορά την εβδομάδα ενδοπεριτοναϊκά. Η συνολική επιβίωση των ποντικών διεξήχθη με μια καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier. Τα ζώα θανατώθηκαν σύμφωνα με αποδεκτή μέθοδο της ευθανασίας, όπως ορίζονται από το American Veterinary Medical Association (AVMA) Κατευθυντήριες γραμμές για την Ευθανασία – Εγκρίθηκε Ευθανασία Μέθοδοι, το 2013. Όταν τα ζώα λαμβάνουν μια βαθμολογία κατάσταση του σώματος μικρότερο από 2, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με κεταμίνη /ξυλαζίνη 100/10 mg /kg σωματικού βάρους ενδοπεριτοναϊκώς, καθώς και μια δευτερεύουσα μέθοδος αυχενική εξάρθρωση. Στο τέλος του πειράματος, το πλάσμα συλλέχθηκε για ανάλυση των ήπαρ και τους νεφρούς τοξικότητα μετά από ευθανασία με κεταμίνη /ξυλαζίνη 100/10 mg /kg σωματικού βάρους ενδοπεριτοναϊκά.

Τ1 ζυγίζονται MRI εικόνες

Τ1 σταθμισμένη αντίθεσης MRI χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει την ανάπτυξη του όγκου χρησιμοποιώντας σύστημα 7Τ MRI (Bruker, Biospec GmbH, Ettlingen, Γερμανία). Οι παράμετροι απεικόνιση της σάρωσης Τ1 είναι TR /ΤΕ = 540 ms /11 ms, 8 κατά μέσο όρο, 192 × 192, 0,5 χιλιοστά πάχος τομής, και 3,2 εκατοστά

2 FOV. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή 1-2% ισοφλουράνης και τοποθετήθηκε σε μία θέση με τον εγκέφαλο που βρίσκεται στο κέντρο της σπείρας. Ενδοκρανιακή όγκος του όγκου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας γαδολίνιο ενισχυμένη Τ1 ζυγίζονται πολυτομική αξονική γρήγορο γύρισμα echo εικόνες. Από αυτές τις εικόνες το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το εργαλείο Περιοχή ενδιαφέροντος διατίθεται στο λογισμικό Paravision (Bruker Biospec, Ettlingen, Γερμανία).

ήπατος και νεφρική τοξικότητα

Το ήπαρ και νεφρική τοξικότητα (ολική χολερυθρίνη, άζωτο ουρίας αίματος (BUN), κρεατίνη, ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST), αμινοτρανσφεράση αλανίνης (ALT), και αλκαλική φωσφατάση) εκτιμήθηκε τόσο για υποδόρια μοντέλο όγκου και ενδοκρανιακής μοντέλο ξενομοσχεύματος χρησιμοποιώντας αναλυτή αυτοματοποιημένη χημεία (Roche Cobase MIRA) και κιτ που κατασκευάζεται από την Thermo Electron (Louisville, CO). Το αίμα λήφθηκε από τον έλεγχο ή την CC-Ι ένεση ποντίκια με κύτταρα αστροκύτωμα κατά τη λήξη του πειράματος.

Η απόπτωση δοκιμασία

Για την δοκιμασία απόπτωσης, το 3 × 10

6 του κύτταρα CCF-STTG1 καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις (~ 36 μΜ) του CC-Ι ή ακτινομυκίνη D (~ 80 ηΜ) ως θετικός έλεγχος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από έκθεση Trypsine-EDTA και πλύθηκαν σε ψυχρό PBS. Στη συνέχεια, 100 μι του κυτταρικού εναιωρήματος (~ 1 χ 10

6 κύτταρα) επωάστηκε με 1 μL 100 μg /mL ιωδιούχο προπίδιο κόκκινη χρωστική φθορίζουσα δέσμευσης νουκλεϊκού οξέος και 5 μL αννεξίνης V-FITC (Molecular Probes, Carlsbad, CA) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) της εκπομπής στα 530 nm (π.χ. FL 1) και & gt? 575 nm (π.χ. FL3). Τα κύτταρα που δεσμεύονται από αννεξίνης V απεικονίζουν πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων. Τα κύτταρα που αντιδρούν τόσο για αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο είναι νεκρωτικών κυττάρων.

Γονιδιακή έκφραση προφίλ

Χρησιμοποιήσαμε απόπτωση PCR Array (SABiosciences, Frederick, MD) για να καθοριστεί ποια γονίδια μεταβάλλονται με CC -I στο ΤΜΖ κύτταρα ανθεκτικά CCF-STTG1. Το PCR Array διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ολικό RNA εκχυλίστηκε από όχημα (0,1% DMSO) θεραπεύονται ή CC-Ι αγωγή κυτταρικών σειρών CCF-STTG1 χρησιμοποιώντας qPCR-Grade κιτ απομόνωσης RNA. Ένα μg RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου με αντίστροφη μεταγραφή με MMLV αντίστροφη μεταγραφάση. Στη συνέχεια, σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με αραιωμένο cDNA και κύριο μείγμα με φίλτρο ROX. Για την ανίχνευση του σήματος, η ΑΒΙ Prism 7900 Sequence Detector System προγραμματιστεί με ένα αρχικό στάδιο αποστείρωσης των 2 λεπτών στους 50 ° C, που ακολουθείται κατά 10 λεπτά μετουσίωση στους 95 ° C και στη συνέχεια 40 κύκλους για 15 δευτερόλεπτο στους 95 ° C, 1 λεπτό στους 60 ° C και 30 δευτερόλεπτο στους 72 ° C. Κάθε δείγμα αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν. δεδομένα Array PCR υπολογίστηκε από το κατώφλι ΔΔcycle (ΔΔ

Ct

) μέθοδος, τότε κανονικοποιημένο έναντι πολλαπλών γονιδίων οικοκυρική και εκφράζονται ως μέση πολλαπλάσια αλλαγές στην CC-I επεξεργασμένων δειγμάτων σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου έλαβαν όχημα.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα CCF-STTG1 καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε πυκνότητα 2-5 × 10

6 κύτταρα ανά φιάλη. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις CC-Ι σε νωπό μέσο καλλιέργειας κυττάρων. Μετά από 24-48 ώρες αργότερα, τα προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν και διάσπαση (1 × 10

6 κύτταρα ανά σωλήνα) για το πλύσιμο με ρυθμιστικό Hank, κατόπιν σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους -20 ° C. Για ημέρες χρώση του DNA, τα κύτταρα επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (100 μg /ml) και RNase Α (20 μg /ml) για 15 λεπτά στους 4 ° C (προστατεύεται από το φως). Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας BD FACS Calibur Κυτταρομετρία Ροής Analyzer.

τοποϊσομεράση χαλάρωση και decatenation δοκιμασία

χαλάρωση DNA και κινητοπλάστη DNA (kDNA) δοκιμασία decatenation διεξήχθη χρησιμοποιώντας τοποϊσομεράσης Ι ή II κιτ διαλογής φαρμάκων ή Topopoisomerase II κιτ δοκιμασίας (TopoGEN, Inc., Port Orange, FL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή [30]. Η τοποϊσομεράση ΙΙα decatenates kDNA το οποίο αποτελείται από εξαιρετικά catenated δικτύων κυκλικού DNA σε μια αντίδραση εξαρτώμενη από ΑΤΡ για να δώσουν ατομική minicircles του DNA. Εν συντομία, για δοκιμασία kDNA decatenation τοποϊσομεράση ΙΙα μεσολάβηση, το μίγμα της αντίδρασης 20 μL περιέχει ακόλουθα συστατικά? 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 0,5 mM διθειοθρεϊτόλη, 30 μg /mL λευκωματίνης βοείου ορού, 2 mM ΑΤΡ, 260 ng του kDNA, αρκετές συγκεντρώσεις ενώσεων, και 4 U της ανθρώπινης τοποϊσομεράσης ΙΙα. Η τελική συγκέντρωση του 0,5% (ν /ν) DMSO χρησιμοποιήθηκε επειδή αυτή η συγκέντρωση δεν επηρεάζει δραστικότητα της τοποϊσομεράσης ΙΙα. Η επώαση του μίγματος δοκιμασίας διεξήχθη στους 37 ° C για 30 λεπτά και τερματίστηκαν με την προσθήκη χρωστικής stop φόρτωσης 4 μL. Τα προϊόντα kDNA decatenation από το μίγμα αντίδρασης αναλύθηκε σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1% στα 100 V για 40 λεπτά, στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 0,5 μg /mL βρωμιούχο αιθίδιο σε ρυθμιστικό ΤΑΕ (4 mM βάση Tris /κρυσταλλικό οξικό οξύ [0,11% (ν /v)] /2 mM Na

2EDTA).

μοριακή μοντελοποίηση μελέτη

Οι μελέτες μοριακής μοντελοποίησης έγιναν με βάση την κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ του ανθρώπινου τοποϊσομεράσης ΙΙα συνδεδεμένο με L-πεπτιδίου σε 1,50 το ψήφισμα Α (ΠΠ κωδικός αναγνώρισης: 2q5a) [31]. Η θέση της L-πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να καθορίσετε τις διαστάσεις της θέσης δέσμευσης CC-Ι για τη μελέτη σύνδεσης. Σύνδεσης μεταξύ της τοποϊσομεράσης ΙΙα πρωτεΐνης και CC-Ι διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΚΑΘΟΔΟΥ (Grid Βασισμένο ρίζας σύνδεσης από Energetics, από Schrödinger, L.L.C.) [32], [33]. Το πεδίο δυνάμεων Jorgensen OPLS-2005 εργάστηκε στο πρόγραμμα GLIDE. Η γεωμετρία για κάθε μοντέλο βέλτιστη δέσμευση ελήφθη με καθόδου, το οποίο βασίζεται σε τεχνικές δειγματοληψίας Monte Carlo σε συνδυασμό με την ελαχιστοποίηση της ενέργειας. GLIDE SP (Κανονική λειτουργία Precision) χρησιμοποιήθηκε για να δέσει η ένωση CC-Ι που ακολουθείται από GLIDE XP (λειτουργία Extra ακριβείας). LigPrep Schrödinger χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία των 3D διαμορφώσεις των CC-Ι

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα που υποβλήθηκε σε στατιστική ανάλυση από τον φοιτητή

t-test

κατά τη σύγκριση δύο ομάδες. Χρησιμοποιήσαμε μονόδρομη ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ Tukey-Kramer για περισσότερο από δύο συγκρίσεις ομάδα για να προσδιοριστεί εάν οι διαφορές είναι σημαντικές. Για συγκρίσεις της χρονικής πορείας ή δεδομένα συγκέντρωση εκτελέσαμε επαναλαμβανόμενες μετρήσεις αμφίδρομη ΑΝΟνΑ ακολουθούμενη από την δοκιμή Tukey-Kramer. Οι διαφορές μεταξύ των μέσων θεωρείται στατιστικά σημαντική όταν η

σ

αξία είναι μικρότερη από 0,05. Η LC

50 (50% θανατηφόρος συγκέντρωση) των ενώσεων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας στατιστικού λογισμικού (GraphPad Prism 6) ως γενικός δείκτης της τοξικότητας μιας χημικής ουσίας. Στο

in vivo

μοντέλο όγκου του εγκεφάλου, τα δεδομένα όγκος του όγκου συνοψίζεται ως μέσες τιμές με τυπικά σφάλματα. Η επιβίωση ποντίκια συγκρίθηκε μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιώντας ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier με τεστ logrank.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση ενός κυτταροτοξική ένωση εναντίον ΤΜΖ κύτταρα ανθεκτικά αστροκύτωμα

προσέγγιση ελέγχου μας εντόπισε μια αναλογική θειοβαρβιτουρικού οξέος και δεδομένης της αναγνώρισης της χημειότυπος ένωσης-Ι (CC-Ι). Η δομή του CC-Ι φαίνεται στο Σχήμα 1Α. CC-Ι ήταν κυτταροτοξική τόσο στο ΤΜΖ ανθεκτική ανθρώπινο αστροκύτωμα κυτταρικές σειρές CCF-STTG1 και να ΤΜΖ ευαίσθητα SW1088 (Εικόνα 1Β). Η LC

50 CC-Ι SW1088, κυτταρικές σειρές CCF-STTG1 U87-MG και είναι 13,6 μΜ, 23,6 μΜ και 25,4 μΜ, αντίστοιχα.

(α) της δομής του CC-I. (Β) Η κυτταροτοξικότητα του CC-Ι σε

in vitro

. Ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές αστροκύτωμα καλλιεργήθηκαν με διαφορετικές δόσεις του CC-Ι για 3 ημέρες και στη συνέχεια η κυτταροτοξικότητα προσδιορίσθηκε με δοκιμασία SRB. Η LC

50 CC-Ι SW1088 κυτταρικές σειρές (13,6 μΜ) είναι σημαντικά διαφορετική με το LC

50 CC-Ι U87-MG και CCF-STTG1 κυτταρικές σειρές (23,6 μΜ και 25,4 μΜ) ( p & lt?. 0.001)

Η

Οξεία τοξικότητα του CC-Ι σε άτριχα ποντίκια

ενέσεις CC-Ι μία φορά την εβδομάδα σε 50 ή 75 mg /kg σωματικού βάρους ήταν θανατηφόρα μέσα σε 7 ημέρες. Μια φορά την εβδομάδα ένεση σε 35 mg /kg σωματικού βάρους ήταν ανεκτή. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται περίπου 70% της ανεκτής δόσης (25 mg /kg σωματικού βάρους) της συγκέντρωσης CC-Ι για την

in vivo μοντέλο όγκου

μελέτη.

Επίδραση

Αντι-όγκου του CC -I στον υποδόριο μοντέλο όγκου ποντικού

για να εξακριβωθεί η δράση κατά των όγκων του CC-Ι σε κύτταρα αστροκύτωμα, χρησιμοποιήσαμε την ανοσοανεπάρκεια μοντέλο υποδόριου όγκου γυμνού ποντικού με ένεση είτε ΤΜΖ ευαίσθητα SW1088 ή ΤΜΖ ανθεκτικά CCF-STTG1 κυτταρικές γραμμές. Τα ποντίκια με όγκους από την κυτταρική γραμμή CCF-STTG1 δεν έδειξε στοιχεία εξέλιξης του όγκου μετά τις ενέσεις CC-Ι, ακόμη και μετά τις ενέσεις έληξε (Σχήμα 2Α), ενώ στην ομάδα ελέγχου χωρίς θεραπεία το μέγεθος του όγκου αυξήθηκε θεαματικά κατά 7 εβδομάδες (ρ & lt? 0,0001) . Οι όγκοι σε ποντίκια από την SW1088 κυτταρική γραμμή επίσης απέτυχε να προχωρήσει κατά τη διάρκεια της περιόδου έγχυσης, αλλά ο όγκος προοδεύσει όταν οι ενέσεις CC-Ι διακόπηκαν (Σχήμα 2Α). Εμείς δεν πάρει τις εικόνες των όγκων. Εμείς θα εξετάσει τη λήψη φωτογραφιών για τις επερχόμενες πειράματα. Το σωματικό βάρος για τον έλεγχο ή CC-Ι αγωγή ποντίκια δεν μειώθηκε κατά την διάρκεια της πορείας της μελέτης (Σχήμα 2Β).

(Α) Ποντίκια εμφυτεύθηκαν με δέκα εκατομμύρια κύτταρα με την SW1088 ή κύτταρα CCF-STTG1. Το αρχικό μέγεθος του όγκου για τα κύτταρα CCF-STTG1 κυμάνθηκε 80 έως 100 mm

3. Τα κύτταρα SW1088 αυξήθηκε πιο αργά, έτσι ξεκίνησε θεραπεία CC-Ι, όταν οι όγκοι ανήλθε σε 30 mm

3. CC-Ι ενέθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε συγκέντρωση 25 mg /kg σωματικού βάρους μία φορά την εβδομάδα για 7 εβδομάδες (n = 7~10). Η ομάδα ελέγχου δόθηκε PBS στον ίδιο όγκο και σχήμα (n = 3-8). Ο όγκος σιγά-σιγά επανακάμπτει στο ΤΜΖ ευαίσθητη SW1088 αστροκύτωμα ένεση άτριχων ποντικών αλλά δεν επανεμφανιστούν στο ΤΜΖ ανθεκτικά CCF-STTG1 ένεση γυμνά ποντίκια όταν CC-Ι διακόπηκε (πέραν των 7 εβδομάδων). CC-I ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και δεν ήταν θανατηφόρος σε οποιαδήποτε από τις ομάδες θεραπείας. Ορισμένες γραμμές σφάλματος είναι πολύ μικρά για να είναι ορατά. (Β) Μέση σωματικό βάρος των ποντικών παρουσιάζεται σε γραμμάρια. Ορισμένες γραμμές σφάλματος είναι πολύ μικρά για να είναι ορατά.

Η

Anti-όγκου επίδραση της CC-Ι σε ενδοκρανιακή όγκων του εγκεφάλου μοντέλο

Μετά την ίδρυση της

in vivo

αποτελεσματικότητα και της ασφάλειας των CC-Ι έναντι ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών ΤΜΖ στο μοντέλο υποδόριου όγκου του εγκεφάλου, εξετάσαμε την ενδοκρανιακή μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος εγκεφάλου. U87-MG ή CCF-STTG1 κύτταρα αστροκυτώματος εγχύθηκαν στον εγκέφαλο ποντικού και σχημάτισαν όγκους (επαληθεύεται από MRI) ~ 3 εβδομάδες μετά την εμφύτευση (Σχήμα 3Α). Κανένας από τους ποντικούς ελέγχου άνευ αγωγής επέζησαν περισσότερο από 30 ημέρες, και η μέση επιβίωση ήταν 20 ημέρες. Εάν οι ποντικοί που υποβάλλονται σε θεραπεία με CC-Ι, ωστόσο το 64% (7/11) του όγκου U87-MG ποντικών που φέρουν ήταν ακόμη ζωντανοί σε 60 ημέρες και 89% (8/9) του όγκου CCF-STTG1 ποντίκια που έφεραν εξακολουθούν να ζουν σε 60 ημέρες (ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 3Β) και όχι του όγκου ήταν ορατή στην MRI (Σχήμα 3Α). Πέντε ποντικοί στην ομάδα όγκου U87-MG και έξι στην ομάδα όγκου CCF-STTG1 λαμβάνουν ενέσεις CC-Ι ήταν ζωντανοί 200 ημέρες μετά την ένεση του όγκου (137 ημέρες μετά την τελευταία ένεση CC-Ι). Όπως και με το μοντέλο συστημικής όγκου, δεν υπήρχε καμία ένδειξη του ήπατος ή των νεφρών τοξικότητα από CC-Ι σε ενδοκρανιακή ξενομοσχεύματος ποντικούς (Σχήμα 3C). Το σωματικό βάρος των ζώων δεν μειώνεται στα ζώα που έλαβαν CC-Ι (Σχήμα 3D).

(Α) εικόνες Εκπρόσωπος μαγνητική τομογραφία που λαμβάνονται με Τ1 MRI αντίθεσης (σύστημα απεικόνισης 7Τ MR) μετά το σχηματισμό ενδοκρανιακή όγκων (μία ή τρεις εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων αστροκύτωμα) ή μετά το σχηματισμό του όγκου που ακολουθείται από έγχυση του CC-Ι (25 mg /kg σωματικού βάρους) για 7 εβδομάδες. CC-Ι ανέστειλε πλήρως την ανάπτυξη του όγκου σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές αστροκύτωμα. γράφημα επιβίωσης (Β) Kaplan-Meier της ενδοκρανιακής ποντίκια όγκου του εγκεφάλου μετά τη χορήγηση της CC-I. CC-I επεκτείνει την επιβίωση των ποντικών σε σύγκριση με τους ποντικούς άνευ αγωγής (η = 9 ή 11) (ρ & lt? 0,0001). Κανένα από τα ποντίκια που έλαβαν PBS (έλεγχος) επιβίωσαν μετά από 30 ημέρες και η διάμεση επιβίωση όλων αυτών των ζώων ήταν 20 ημέρες (η = 3 ή 4). (C) του ήπατος και των νεφρών τοξικότητα των CC-I. Η τοξικότητα του ήπατος και των νεφρών (ολική χολερυθρίνη, άζωτο ουρίας αίματος (BUN), κρεατίνη, ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST), αμινοτρανσφεράση αλανίνης (ALT), και αλκαλική φωσφατάση) προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένο μηχάνημα αναλυτή χημείας (Roche Cobase MIRA) και κιτ που κατασκευάζεται από Thermo Electron. Αυτά τα δεδομένα δεν υποδεικνύουν ηπατική ή νεφρική τοξικότητα με CC-I σε γυμνά ποντίκια. Δεδομένα τοξικότητας εμφανίζονται ως μέσο ± SEM. (Δ) Μέσος όρος του σωματικού βάρους των ποντικών σε γραμμάρια.

Η

Η απόπτωση των CC-Ι στα κύτταρα ανθεκτικά αστροκύτωμα ΤΜΖ

Στη συνέχεια ρωτήσαμε αν η κυτταρικού θανάτου από CC-Ι της ΤΜΖ κύτταρα αστροκύτωμα ανθεκτικά CCF-STTG1 διαμεσολαβείται μέσω αποπτωτικό μονοπάτι. CC-I επαγόμενη απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κυτταρικές γραμμές CCF-STTG1 (Σχήμα 4Α). Η ποσότητα του CCF-STTG1 αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε 36 μΜ ήταν συγκρίσιμη με το θετικό έλεγχο απόπτωσης επαγωγέα, ακτινομυκίνη D. Υπάρχουν ενδείξεις νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο σε CCF-STTG1 μετά από έκθεση σε CC-I, αλλά λιγότερα κύτταρα σημάνθηκαν και σημασίας ήταν δεν επιτεύχθηκε μέχρι δύο φορές τη συγκέντρωση στην οποία παρατηρήθηκε για πρώτη φορά απόπτωση (Σχήμα 4Β).

ο κυτταρικός θάνατος παρακολουθήθηκε με αποπτωτικών και νεκρωτικών δείκτες κυττάρου μετά από έκθεση 48 ώρας CC-I σε κύτταρα CCF-STTG1. Ο κυτταρικός θάνατος προσδιορίσθηκε με τον ανασυνδυασμένο αννεξίνη V συζευγμένη σε φλουορεσκεΐνη, που ακολουθείται από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος φαίνεται στον πίνακα Α Πίνακας Β είναι νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο. Η ακτινομυκίνη D χρησιμοποιήθηκε σαν ένας θετικός έλεγχος για να επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετά τη θεραπεία CC-Ι αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα CCF-STTG1. Δεν υπήρχε έντονη δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο νεκρωτικό κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα CCF-STTG1 μέχρι την υψηλότερη συγκέντρωση. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Student

t

δοκιμής και εμφανίζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Ορισμένες γραμμές σφάλματος είναι πολύ μικρά για να είναι ορατά. Τα σύμβολα υποδεικνύουν μια σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο. (*** P & lt? 0.001)

Η

Η απόπτωση σειρά γονιδίων σε CC-Ι αντιμετωπίζονται ΤΜΖ ανθεκτικά CCF-STTG1 κύτταρα

Για να προσδιορίσετε ποια αποπτωτικό μονοπάτι ενεργοποιήθηκε από CC-Ι θεραπείας. , εκτελέσαμε προφίλ γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας στοχευμένες συστοιχίες για την απόπτωση. Το Ανθρώπινο απόπτωση μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου (TNF) γονίδια οδού έχουν τις μεγαλύτερες αλλαγές στην έκφραση γονιδίων στο CC-Ι κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν φορέα. CC-Ι (36 μΜ) αυξήθηκε TNF υπεροικογένειας μέλος 1, 2, 5, 6, και 9 καθώς και του υποδοχέα TNF υπεροικογένειας 5, 9, 10α από 30 να 700 φορές. Μεταξύ κασπάσης γονίδια οδού, μόνο κασπάσης 10 και κασπάσης 14 προκλήθηκαν. Η αναλογία φορές των αλλοιωμένων γονιδίων συνοψίζεται στον Πίνακα 1.

Η

Επίδραση της CC-Ι επί του κυτταρικού κύκλου της ΤΜΖ κύτταρα ανθεκτικά αστροκύτωμα

Για να κατανοήσουμε καλύτερα την κυτταροτοξική δράση της CC -I, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα CCF-STTG1 μετά τη θεραπεία CC-I. θεραπεία CC-Ι των κυττάρων CCF-STTG1 οδήγησε σε σημαντική μείωση στην φάση G0 /G1, και την αύξηση του S και G2 /M φάση σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α & amp? Β).

Τα κύτταρα CCF-STTG1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 18 ή 36 μΜ CC-Ι για 24 ή 48 ώρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και στη συνέχεια αναλύθηκαν για διανομή του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας έναν αναλυτή ΡΑΟδοαη. επεξεργασία CC-Ι αύξησε σημαντικά την S και G2 /M κυτταρικό πληθυσμό, αλλά μειώθηκε στην G0 /G1 φάση. Τα σύμβολα υποδεικνύουν μια σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τον έλεγχο. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001).

Η

τοποϊσομεράση ΙΙα αναστολή από CC-Ι

καθοριστεί αν CC-I μπορεί να δεσμεύσει ανθρώπινο ΙΙα τοποϊσομεράσης σε μια μελέτη μοριακής μοντελοποίησης. Τα δεδομένα μοριακής μοντελοποίησης μεταξύ της ανθρώπινης τοποϊσομεράσης ΙΙα και CC-εισηγήθηκα CC-I ταιριάζει μέσα στην κοιλότητα της ανθρώπινης τοποϊσομεράσης ΙΙα όπου θα μπορούσε να λειτουργήσει ως αναστολέας (Εικόνα 6Α). Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε χαλάρωση του DNA και προσδιορισμών decatenation kDNA να προσδιοριστεί η ικανότητα του CC-Ι να αναστέλλουν την τοποϊσομεράση ΙΙα δραστικότητα του ενζύμου. CC-Ι ανέστειλαν δραστικότητα τοποϊσομεράσης ΙΙα σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 23 μΜ, CC-Ι αναστέλλεται καταλύεται τοποϊσομεράσης ΙΙα kDNA decatenation (Εικόνα 6Β). Etoposide (VP16), ένα γνωστό δηλητήριο τοποϊσομεράσης II, ανέστειλε τοποϊσομεράση ΙΙα στο 1 mm αλλά όχι σε 0,1 mM συγκέντρωση (Σχήμα 6Β). Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν CC-Ι είναι ένας ειδικός αναστολέας της τοποϊσομεράσης ΙΙα χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία υπερελικωμένο χαλάρωση DNA. CC-I δεν ενίσχυσε την τοποϊσομεράση Ι μεσολαβούσας χαλάρωση του υπερελικωμένου DNA pHOT1 (Σχήμα 6C). Η καμπτοθεκίνη, ένα παρεμποδιστή τοποϊσομεράσης Ι, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την δοκιμασία και έδειξε την αναμενόμενη αναστολή της τοποϊσομεράσης Ι μεσολάβηση χαλάρωση DNA. Σε αντίθεση, CC-I εμφάνισε μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην τοποϊσομεράση ΙΙα μεσολάβηση χαλάρωση του υπερελικωμένου DNA pHOT1 (Σχήμα 6D). Η αποτελεσματική συγκέντρωση CC-I για τοποϊσομεράσης ΙΙα μεσολάβηση DNA χαλάρωσης για πρώτη φορά παρατηρήθηκε σε 11 μΜ.

(Α) Δομή του CC-Ι ελλιμενίζεται σε τοποϊσομεράσης ΙΙα (ΠΣΠ κωδικός 1ZXM). Η τοποϊσομεράση παρουσιάζεται ως καφέ χρώματος κορδέλα με υπολείμματα στην θέση σύνδεσης.