Αφηρημένο

αντίσταση των ναρκωτικών αποτελεί εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι το μονοπάτι σηματοδότησης της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα (IGF) είναι ένα νέο πιθανός στόχος να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να επικυρώσει IGF2 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο σε ανθεκτικά στα φάρμακα καρκίνου των ωοθηκών και για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της στόχευσης IGF2

in vivo

. Η ανάλυση των δεδομένων του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) στο ορώδες ομάδα του καρκίνου των ωοθηκών έδειξαν ότι η έκφραση του mRNA υψηλής IGF2 συνδέεται σημαντικά με κοντή διάστημα μέχρι την εξέλιξη της νόσου και του θανάτου, η κλινική δείκτες ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Σε ένα γενετικά ποικιλόμορφο πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, τα επίπεδα mRNA IGF2 μετρώνται σε κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές σε διάφορους παράγοντες σταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων συμπεριλαμβανομένων ταξόλης βρέθηκε να είναι σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τα ευαίσθητα κυτταρικές γραμμές φαρμάκου. Η επίδραση της IGF2 νοκ ντάουν για αντίσταση ταξόλη διερευνήθηκε

in vitro

και

in vivo

. Παροδικές IGF2 νοκ ντάουν ευαισθητοποιηθεί σημαντικά ανθεκτικοί στα φάρμακα κυττάρων στη θεραπεία ταξόλη. Ένα ανθεκτικό σε ΤβχοΙ ξενομόσχευμα καρκίνου των ωοθηκών μοντέλο, που αναπτύχθηκε από κύτταρα HEY-T30, επέδειξε ακραία αντοχή φαρμάκου, όπου η μέγιστη ανεκτή δόση του Taxol δεν καθυστερεί την ανάπτυξη του όγκου σε ποντίκια. Ο αποκλεισμός του IGF1R (ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας που μεταδίδει σήματα από IGF1 και IGF2) χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα δεν μετέβαλε την απόκριση σε ταξόλη. Ωστόσο, σταθερή IGF2 knockdown χρήση μικρής φουρκέτα RNA σε HEY-T30 αποτελεσματικά αποκατασταθεί ευαισθησία ταξόλη. Τα ευρήματα αυτά επικυρώνουν IGF2 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο σε ανθεκτικά φάρμακο για τον καρκίνο των ωοθηκών και δείχνουν ότι η άμεση στόχευση IGF2 μπορεί να είναι προτιμότερη στρατηγική σχέση με τη στόχευση IGF1R μόνη

Παράθεση:. Brouwer-Visser J, Lee J, K McCullagh, Cossio MJ, Wang Υ, Huang GS (2014) ινσουλίνη-Like Growth Factor 2 κατασιγάσει Επαναφέρει ταξόλη Ευαισθησία στο Drug Resistant καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (6): e100165. doi: 10.1371 /journal.pone.0100165

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Φλεβάρη του 2014? Αποδεκτές: 22η Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιουνίου, 2014

Copyright: © 2014 Brouwer-Visser et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης παρέχεται από τη National Cancer Institute-Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας του Παιδιού και Ανθρώπινης Ανάπτυξης (Κ12 HD00849) και το αμερικανικό Κογκρέσο των Μαιευτήρων και Γυναικολόγων, μέσω της απονομής του Προγράμματος Ανάπτυξης του αναπαραγωγικού Επιστήμονας στο GSH. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν τη χρήση των Albert Einstein Cancer Center Shared Resources (κυτταρομετρίας ροής πυρήνα, Ιστολογίας και Συγκριτική Παθολογία πυρήνα), που υποστηρίζεται από το National Cancer Institute Κέντρο Καρκίνου P30CA013330 χορήγηση στήριξης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία των γυναικολογικών θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες. Από τα μέσα της δεκαετίας του 1990, η καθιερωμένη θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών είναι χειρουργική cytoreduction και συστηματική χημειοθεραπεία, συνήθως ταξόλη και η πλατίνα [1]. Ωστόσο, η πλειοψηφία των ασθενών τελικά υποκύψει σε επαναλαμβανόμενες, προοδευτική ασθένεια που οφείλεται στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία

Εκτός από την καθιερωμένη τους ρόλους της στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη, τη γήρανση και καρκινογένεση [2] -. [6], μονοπατιού σηματοδότησης της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα (IGF) έχει πρόσφατα ενοχοποιηθεί στην αντοχή σε φάρμακα [7] – [11]. Όπως έχουμε ήδη αναφερθεί, προς τα πάνω ρύθμιση της ινσουλίνης αυξητικού παράγοντα 2 (IGF2) είναι μία οξεία κυτταρική απόκριση στη θεραπεία ταξόλη, και η έκφρασή της ρυθμίζει την απόκριση σε Taxol σε ανθεκτικά στα φάρμακα καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. [7]. Επειδή ταξόλη χρησιμοποιείται στην θεραπεία πρώτης γραμμής του καρκίνου των ωοθηκών, υποθέσαμε ότι οι υψηλές IGF2 θα συνδεόταν με ενδογενή κλινική αντοχή φαρμάκου, η οποία εκδηλώνεται ως μειωμένο χρόνο για την εξέλιξη της νόσου /υποτροπών σε ασθενείς. Υποστηρίζοντας την υπόθεση αυτή, πριν από τη μελέτη μας, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση των μικροσυστοιχιών ιστών έδειξε ότι η υψηλή έκφραση IGF2 στον ιστό του όγκου των ωοθηκών ήταν πράγματι προβλεπτική μειωθεί το διάστημα έως την πρόοδο /επανάληψης.

Με βάση αυτά τα εργαστηριακά και κλινικά δεδομένα, αποφασίσαμε ότι IGF2 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη βελτίωση της αντοχής στα φάρμακα στον καρκίνο των ωοθηκών, αλλά με τις γνώσεις μας, καμία προηγούμενη

in vivo μελέτες επικύρωσης

έχουν γίνει. Ως εκ τούτου, όπως περιγράφεται εδώ, πραγματοποιήσαμε μελέτες για την αξιολόγηση εάν η αντίσταση Taxol θα μπορούσαν να ξεπεραστούν

in vivo από

στόχευση IGF2. Εξετάσαμε την επίδραση του IGF2 knockdown επί όχι μόνο επιδράσεις ταξόλη, αλλά και η ανταπόκριση σε μη-ταξάνης μικροσωληνίσκων αλληλεπιδρούν φάρμακα, και άλλα φάρμακα που χρησιμοποιούνται συνήθως στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Για να επιβεβαιώσετε την κλινική σημασία των ευρημάτων μας, μια ανάλυση της ορώδες ομάδα των ωοθηκών καρκίνο του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) έγινε για να αξιολογήσει τη σχέση της έκφρασης IGF2 και τα κλινικά αποτελέσματα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ζώα έγιναν με την έγκριση της Επιτροπής Θεσμικών Animal Care and Use (πρωτόκολλο 20130604) του Albert Einstein College of Medicine του Πανεπιστημίου Yeshiva. Η Θεσμική Animal Welfare Assurance (A3312-01) για την εν λόγω διευκόλυνση είναι πλήρως διαπιστευμένο από την Ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) από τις 22 Φεβρουαρίου, 1983. Τα ζώα φροντίδα, σύμφωνα με τον νόμο περί προστασίας των ζώων και του ΝΙΗ «Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών ζώων».

γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

το καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές Α2780 [12] και HEY [13] (είδος δώρα από το Δρ Σούζαν Band Horwitz), και η κυτταρική γραμμή καρκινώματος ωοθηκών ΝΙΗ: OVCAR8 [14] (ένα ευγενές δώρο από τον Dr. David Goldman) αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640 (Life Technologies) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Life Technologies) και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη (Life Technologies) στους 37 ° C με 5% CO

2. Όλα φάρμακο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές δημιουργήθηκαν με τους συγγραφείς, εκτός HEY-Epo8 (δώρο από τον Dr. Susan Band Horwitz) που αναπτύχθηκε από τον Dr. C-P Huang Yang χρησιμοποιώντας εποθιλόνη Β [15]. Το ανθεκτικό σε ΤβχοΙ κυτταρική γραμμή HEY-T30 δημιουργήθηκε από ΗΕΥ κυττάρων, όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Η κυτταρική σειρά Α2780-Τ15 παρήχθη παρομοίως από Α2780 χρησιμοποιώντας επιλογή Taxol αλλά στην συνεχή παρουσία 15 μΜ βεραπαμίλη (Sigma). επιλέχθηκαν Α2780-B20 και HEY-Β20 για την αντίσταση στην ιξαβεπιλόνη (Ixempra Bristol-Myers Squibb), και OVCAR8-D30 με δισκοδερμολίδιο. Οι κυτταρικές γραμμές πιστοποιηθεί χρησιμοποιώντας την Genemarker 10 kit (Promega). Ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ταιριάζουν σε ευαίσθητες γραμμές τους και να δημοσιεύονται τα δεδομένα όταν αυτά είναι διαθέσιμα. Οι κυτταρικές γραμμές συνήθως ελέγχονται για μυκόπλασμα με MycoAlert (Lonza). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο φαρμάκου πολυμέσων για τουλάχιστον 18 ώρες πριν από τα πειράματα, εκτός από Α2780-Τ15, η οποία αναπτύχθηκε σε παρουσία 0.5 ηΜ ταξόλης. Κλινικά διαμορφωθούν ταξόλη (Hospira) αραιώθηκε 6 φορές σε 5% δεξτρόζη νερό (Hospira) σε τελική συγκέντρωση 1 mg /ml για τα πειράματα ξενομοσχεύματος. NVP-AEW541, ένας μικρός αναστολέας μοριακού κινάσης βάρος IGF1R, παρασχέθηκαν από τη Novartis Pharma AG [16]. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα για να IGF1R, IMC-Α12 (Cixutumumab) παρέχεται από Imclone, μια πλήρως ελεγχόμενη θυγατρική της Eli Lilly and Company.

IGF2 Γονιδιακή ανάλυση της έκφρασης σε κλινικά δείγματα του καρκίνου των ωοθηκών

Η cBioPortal για τον Καρκίνο Genomics χρησιμοποιήθηκε για να αποκτήσετε πρόσβαση στην γονιδιακή έκφραση και κλινικά δεδομένα από το Genome Atlas Πρόγραμμα Καρκίνου (TGCA) [17]. Το ερώτημα πραγματοποιήθηκε με τη χρήση όλων των ολοκληρωμένων όγκοι του συνόλου δεδομένων ωοθηκών υδαρής κυσταδενοκαρκινώματος (TCGA, Φύση 2011), το οποίο περιλαμβάνει 489 περιπτώσεις υψηλού βαθμού ορώδες καρκίνο των ωοθηκών. Για IGF2 mRNA έκφραση Z-score, ένα όριο 1,6 τυπικές αποκλίσεις πάνω από τη μέση τιμή που ορίζεται το IGF-υψηλής ομάδα? Όλες οι άλλες περιπτώσεις περιελήφθησαν στον IGF2-φυσιολογική ομάδα.

ποσοτική PCR

κυτταρολύματα ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας στήλες QIAshredder (Qiagen Inc., Valencia, CA) και το ολικό RNA απομονώθηκε από RNeasy Mini Kit (Qiagen). Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Fisher Thermo Scientific), δείχνοντας OD 260/280 αναλογία εύρος 2.3 έως 2.11. ακεραιότητα του RNA έγινε δειγματοληψία χρησιμοποιώντας μια Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies), που δείχνει ένα RIN σειρά βαθμολογία 9,8 έως 10. Συμπληρωματικό DNA έγινε εκτελώντας ανάστροφη μεταγραφή (RT) χρησιμοποιώντας το SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA για όλες τις κυτταρικές σειρές εκτός Α2780, Α2780-Τ15 και Α2780-Β20, για την οποία χρησιμοποιήθηκε 2 μg ολικού RNA. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα EP Eppendorf Mastercycler

realplex2

χρησιμοποιώντας μια μέθοδο 3 σταδίων (95C 10 λεπτά? Ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 20 δευτερόλεπτα? τότε για την τήξη καμπύλη 95C 15 δευτερόλεπτα, 60C για 95C επί 20 λεπτά). Κάθε αντίδραση χρησιμοποιείται 1 /20ο της αντίδρασης cDNA, προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές σε μια τελική συγκέντρωση 200 ηΜ και PowerSYBR (Applied Biosystems, Foster City, CA) αραιωμένο σε υπερκαθαρό νερό (Life Technologies) για τελική συγκέντρωση 1Χ σε τελική αντίδραση όγκος 10 μL. Εξόνιο εναύσματα διασταύρωση-που εκτείνονται (Πίνακας S1) επικυρώθηκαν από την ανάλυση των καμπυλών τήξης και της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης. Ένα σκορ έκφραση του mRNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο * 1000, όπου ΔΟ

t είναι η διαφορά σε C

t (όριο κύκλου) μεταξύ του γονιδίου ενδιαφέροντος και της εσωτερικής γονίδιο εξομάλυνση,

PPIB

( πεπτιδυλπρολύλ ισομεράση Β? κυκλοφιλίνη Β).

PPIB

επαληθεύτηκε να έχει σταθερά επίπεδα έκφρασης του mRNA της γονικής, ανθεκτικά στα φάρμακα, και επιμολύνονται κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων: HEY, HEY-T30, HEY-Β20, HEY-T30 shIGF2-p, HEY-T30 shIGF2 -v, HEY-T30 shScrambled, Α2780, Α2780-Τ15, Α2780-B20. Η μέση διαφορά σε C

t τιμές κατά την αξιολόγηση

PPIB

έκφραση σε κατά ζεύγη συγκρίσεις αυτών των κυτταρικών σειρών ήταν 0,2 (95% διάστημα εμπιστοσύνης του -0,1 περίπου 0.5). Πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση του mRNA σε σχέση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο [7]. Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε με το κιτ AllPrep mini (Qiagen). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν ώστε να καλύπτουν μία σύνδεση εξονίου-ιντρονίου και επικυρώθηκαν από την τήξη και την αποτελεσματικότητα ανάλυση καμπύλης. Αλβουμίνη (

ALB

) χρησιμοποιήθηκε για την εσωτερική εξομάλυνση. Με συστοιχία συγκριτική γενωμική υβριδισμού, Hey κύτταρα βρέθηκαν να έχουν δύο αντίγραφα του

IGF2

,

ABCB1

και

ALB

γονίδια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). παραλλαγή αριθμός αντιγραφής προσδιορίστηκε από qPCR γονιδιακού DNA χρησιμοποιώντας τη μέθοδο και τον καθορισμό HEY έως 2 αντίγραφα [18].

Κινητική της διάδοσης και κυτταροτοξικότητα Δοκιμασίες

Για κινητική πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6- φρεατίων. Κάθε 24 ώρες, δύο κοιλότητες που μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Scepter (Millipore). Για δοκιμασίες κυτοτοξικότητας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σειριακές αραιώσεις του φαρμάκου ενδεικνυόμενη, με μια σταθερή συγκέντρωση 1 μΜ NVP-AEW541 ή 10 μg /ml IMC-A12 εάν ενδείκνυται. Μετά από 72 ώρες κατεργασίας, ο σχετικός αριθμός των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Β Sulforhodamine [7]. Το IC

50 είναι η συγκέντρωση φαρμάκου που αντιστοιχεί σε μείωση 50% του αριθμού των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την καμπύλη δόσης-επίδρασης.

ELISA για Φωσφορυλίωση υποδοχέα

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο για 24 ώρες, στη συνέχεια τον ορό επί 12 ώρες πριν από τη διέγερση για 10 λεπτά με ανασυνδυασμένο IGF2 (50 ng /mL? Abcam) ή ινσουλίνη (50 ηΜ? Sigma), με ή χωρίς προκατεργασία των κυττάρων με NVP-AEW541 (1 μΜ) ή IMC-A12 (10 μg /ml) για 2 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας ΝΡ40 με βάση το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με PhosSTOP (Roche) και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma). Μετά πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση, η Duoset IC Human Phospho-IGF-1 R και φωσφο-Ινσουλίνη R (R &? Συστήματα D) χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή

Western Blot ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης

για την ανάλυση της φωσφορυλιωμένης και ολικής ΑΚΤ και ERK, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (15 έως 20 μg, ανάλογα με το πείραμα) φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα σε ένα τρις-γλυκίνης γέλη και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, τα οποία είχαν μπλοκαριστεί και επωάστηκαν όλη τη νύκτα με οι αναφέρεται πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα 1:1000 σε ρυθμιστικό αποκλεισμού (LI-COR Biosciences), εκτός από GAPDH χρησιμοποιείται σε 1:5000 αραίωση. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: phosphoAkt (Thr308) (Cell Signaling Technology 4056), phosphoAkt (Ser473) (Cell Signaling Technology 4060), ΑΚΤ1 (Cell Signaling Technology 2938), PhosphoERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling Technology 4370), ERK 1/2 (Cell Signaling Technology 4695), GAPDH (Cell Signaling Technology 2118), IGF2 (Abcam AB9574). Μετά δευτερογενούς αντισώματος (1:10 000 αντι-κουνέλι, LI-COR Βιοεπιστημών 926 – 32211) την επώαση, οι μεμβράνες σαρώθηκαν σε ένα σύστημα Οδύσσεια υπέρυθρης απεικόνισης (LI-COR Biosciences) σε μήκος κύματος 800 nm. Πυκνομετρία έγινε στα αρχεία TIFF μέτρηση ολοκληρωμένη πυκνότητα χρησιμοποιώντας ImageJ, διόρθωση για το φόντο και για την εξομάλυνση για να Ponceau χρώση της αντίστοιχης λωρίδας.

θεραπευτικές μελέτες σε Ξενομοσχεύματος φέρουν Ποντίκια

Γυναίκα αθυμικά γυμνά ποντίκια ( Harlan) μεταξύ ηλικίας 6 και 8 εβδομάδων δέχθηκαν υποδόρια ένεση με ένα εκατομμύριο των υποδεικνυόμενων κυττάρων, σε εναιώρηση εντός 100 μΙ OptiMEM. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με τη χρήση ψηφιακής δαγκάνες και ο όγκος υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον τύπο: (μήκος * πλάτος

2) /2. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως περιγράφεται στις λεζάντες σχήμα. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αναισθησία με ισοφλουράνιο ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση, όταν ξενομοσχεύματος τους έφθασε διαμέτρου 20 mm, ή στις καθορισμένες χρονικά σημεία για ανάλυση ξενομοσχεύματος. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρώση ξενομοσχεύματος τομές αξιολογήθηκαν από τον παθολογοανατόμο μελέτη (Y.W.). Ανοσοϊστοχημεία για IGF2 (Abcam ab9574) έγινε σε τομές παραφίνης-ενσωματωμένο φορμόλη σταθερό όπως περιγράφηκε προηγουμένως για ιστούς όγκων [7] και σκόραρε από τον παθολογοανατόμο μελέτη (YW).

IGF2 και IR Νοκ ντάουν

Η IGF2 και IR-στόχευση siRNA ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Life Technologies. Χρησιμοποιώντας RNAiMax Lipofectamine (Life Technologies), αντίστροφη διαμόλυνση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7] παράλληλα με μη στόχευση διαμόλυνση siRNA και πλαστή ελέγχους διαμόλυνση. RNA συλλέχθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για να επιβεβαιώσει knockdown με RT-qPCR (Σχ. S2A /D σε S1 File). Για τα κύτταρα HEY-T30, τα αποτελέσματα από την πρώτη σειρά ολιγονουκλεοτιδίων IGF2 siRNA δοκιμαστεί παρουσιάστηκε σε προηγούμενη δημοσίευση [7]? επικύρωση αυτών των ευρημάτων έγινε γι ‘αυτό το χειρόγραφο, χρησιμοποιώντας δύο νέες μοναδικές αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων αυθαίρετα ονομάζεται siIGF2-1 και siIGF2-2. Για κύτταρα Α2780-Τ15, χρησιμοποιήθηκαν δύο σειρές ολιγονουκλεοτιδίων, που αντιστοιχούν στο πρώτο siRNA που χρησιμοποιείται στην HEY-T30 (αυθαίρετα ονομάζεται siIGF2-3), καθώς και το νέο ολιγονουκλεοτίδιο siIGF2-1. Για σταθερή νοκ ντάουν χρησιμοποιώντας το BLOCK-iT επαγώγιμοι Η1 λεντοϊών RNAi System (Life Technologies), φορείς σχεδιάστηκαν για να εκφράσουμε shRNA στόχευση IGF2, ή ένα μη-στόχευσης ελέγχου (shScrambled). κύτταρα HEY-T30 επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο απευθείας ή με λεντοϊκούς σωματίδια, στη συνέχεια επιλέγονται με ζεοκίνη (ϋίβ Technologies). Οι κλώνοι των κυττάρων πλασμιδίου-επιμολυσμένα κύτταρα και λεντοϊού επιμολυσμένα εξετάστηκαν για IGF2 knockdown. Ο κλώνος με τη χαμηλότερη έκφραση mRNA IGF2 από κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για μεταγενέστερα πειράματα.

κυτταρικού κύκλου και απόπτωση Ανάλυση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στις λεζάντες σχήμα. Μετά από 16 ώρες, τα συγκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν. Για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% ψυχρά αιθανόλη για 1 ώρα, στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma) και 100 μg /ml RNase (Fisher Scientific Thermo) σε PBS. Για την ανάλυση απόπτωσης, η Βιολετί λογομετρικό Μεμβράνη Asymmetry Probe /Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μια ιώδης χρωστική ευερέθιστος 4′-Ν, Ν-διαιθυλαμινο-6- (Ν, Ν, Ν-δωδεκυλο-μεθυλαμινο-σουλφοπροπυλ) -μεθυλο-3-υδροξυφλαβόνη (F2N12S) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των αλλαγών ασυμμετρίας μεμβράνη που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της πρόωρης απόπτωση, με αποτέλεσμα μία μειωμένη αναλογία 585 nm έως 530 nm εκπομπή. Ταυτόχρονα, SYTOX (R) AADvanced χρησιμοποιήθηκε ως νεκρό κύτταρο λεκέ. Χρησιμοποιώντας μη χρωματισμένα κύτταρα και μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, περίφραξη της τεταρτημόρια προσδιορίστηκε? ζουν, αποπτωτικών και τα νεκρά κύτταρα ποσοτικά με τη χρήση FlowJo (Treestar).

Ναρκωτικών Ανάλυση εκροής

Διακόσιες χιλιάδες HEY HEY και-T30 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ζεστό PBS + 5% FBS . Όλα τα βήματα επώασης έγιναν σε 37 ° C στην θερμοκοιτίδα κυτταρικής καλλιέργειας. Verapamil (15 μΜ) ή NVP-AEW541 (1 μΜ) προστέθηκε και τα δείγματα επωάστηκαν για 1 ώρα. Στη συνέχεια, 50 μΜ της τουμπουλίνης Tracker Πράσινης αντιδραστήριο (Oregon Green 488 ταξόλη, δις-οξικό) (Life Technologies) προστέθηκε και τα δείγματα επωάστηκαν για 45 λεπτά. Τα κύτταρα σβωλοποιήθηκαν μετά επαναιωρήθηκαν σε PBS + 5% FBS, με βεραπαμίλη ή NVP-AEW541 εάν υποδεικνύεται, και επωάστηκαν για επιπλέον 20 λεπτά, πλύθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με TO-PRO-3 (Life Technologies). Τα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως χρησιμοποιώντας ένα FACSCanto II (BD) και FlowJo? TO-PRO 3-θετικά κύτταρα (νεκρά κύτταρα) περιορίστηκαν και τα υπόλοιπα κύτταρα γράφημα για να καθορίζουν την ένδειξη ταξόλη διατήρηση [19].

Στατιστική Ανάλυση

Για κάθε ανάλυση, τα δεδομένα ήταν από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι αριθμοί των επαναλήψεων ανά πείραμα που περιγράφεται στις λεζάντες σχήμα. Διαφορές μεταξύ μέσων δύο ομάδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το t-test. Για τις διαφορές μεταξύ τριών ή περισσοτέρων ομάδων, μονόδρομη ANOVA με Bonferroni post-test χρησιμοποιήθηκε. Για την ανάλυση των δύο ανεξάρτητων μεταβλητών, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ με Bonferroni post-test χρησιμοποιήθηκε. Για την ανάλυση επιβίωσης, χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία logrank. Όλες οι τιμές P είναι αμφίδρομες και η P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Συμπληρωματικό Μέθοδοι

Αρχείο S2 περιέχει τα υλικά και τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή των δεδομένων μετάλλαξης β-τουμπουλίνης (φαίνεται στο Σχ. . S1 του αρχείου S1) και το IGF2 Western blot δεδομένων (φαίνεται στο Σχ. S2E του S1 File).

Αποτελέσματα

προηγούμενη μελέτη μας της έκφρασης πρωτεΐνης IGF2 χρησιμοποιώντας μια μικροσυστοιχία ιστό επιθηλιακού ωοθηκικού όγκων έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης υψηλού ιστού IGF2 συνδέθηκαν με μια συντομευμένη διάστημα μέχρι την πρόοδο /επανάληψη [7]. Από τότε, τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης από 489 κλινικά σχολιασμένη σταδίου ΙΙ-IV υψηλής ποιότητας ορώδες δείγματα ωοθηκικού καρκίνου του έργου του καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) διατέθηκαν μέσω του cBioPortal για τον Καρκίνο Genomics [17]. Χρησιμοποιώντας αυτή την δικτυακή πύλη δεδομένων, ελέγξαμε μια σχέση της έκφρασης IGF2 και εγγενή αντοχή στα φάρμακα, όπου υψηλής IGF2 ορίστηκε ως 1,6 SD άνω του μέσου όρου, που αντιστοιχεί σε 94-95th εκατοστημόριο σε μια κανονική κατανομή. Με τη χρήση αυτής κομμένα σκορ, το μέγεθος του IGF2 υψηλής ομάδα προσεγγίζει το κλάσμα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών αναμένεται να έχουν εγγενώς ανθεκτικοί όγκοι φάρμακο, που εκδηλώνεται με την εξέλιξη κατά τη διάρκεια ή αμέσως μετά την ολοκλήρωση της χημειοθεραπείας. Στην ανάλυσή μας των δεδομένων TCGA, μπορούμε πράγματι διαπίστωσε ότι η έκφραση του mRNA υψηλής IGF2 στον ιστό του όγκου συσχετίζεται σημαντικά με μια συντομευμένη διάστημα έως την πρόοδο /υποτροπή, δηλαδή η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (Εικ. 1Α). Η διάμεση επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε αυτή την ομάδα ήταν & lt? 12 μηνών, ενδεικτικό της εγγενούς ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Υψηλή έκφραση του mRNA IGF2 συσχετίζεται επίσης με σημαντικά μειωμένη συνολική επιβίωση (Σχ. 1Β). Η πολυπαραγοντική ανάλυση δεν ήταν ενεργοποιημένο από αυτή την πύλη δεδομένων, ωστόσο, στην προηγούμενη δημοσίευση μας σημειώσαμε μια συσχέτιση της έκφρασης IGF2 με ανώτερο στάδιο και βαθμό [7].

έκφραση IGF2 και την επιβίωση του καρκίνου των ωοθηκών. Χρησιμοποιώντας το cBioPortal για τον Καρκίνο Genomics να αναλύσει τα δεδομένα από τη μελέτη του καρκίνου Γονιδιώματος Άτλαντα των ωοθηκών ορώδες κυσταδενοκαρκινώματος, συγκρίναμε την επιβίωση χωρίς εξέλιξη και τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με υψηλά επίπεδα του όγκου των IGF2 mRNA (μεγαλύτερη από 1,6 τυπικές αποκλίσεις πάνω από τη μέση τιμή? γκρι γραμμή) και εκείνοι με φυσιολογικά επίπεδα όγκου των IGF2 mRNA (όλους τους άλλους ασθενείς? μαύρη γραμμή). Οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα IGF2 mRNA είχε μειωθεί σημαντικά η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (Α) και τη συνολική επιβίωση (Β). (C) έκφραση IGF2 σε ευαίσθητες και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Με RT-qPCR, μετρήσαμε τα επίπεδα mRNA σε IGF2 ανθεκτικά έξι φάρμακο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών και τρεις κυτταρικές γραμμές καταγωγής τους. Όλες οι ανθεκτικοί στα φάρμακα κυτταρικές σειρές έχουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση του mRNA IGF2 σε σύγκριση με το ευαίσθητο κυτταρική γραμμή καταγωγής τους. Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SEM του σκορ έκφρασης IGF2 mRNA για τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κυτταρική σειρά, το καθένα γίνεται εις τριπλούν, και το σύμβολο πάνω από τη γραμμή υποδεικνύει την στατιστική σημασία συγκρίνοντας ότι ανθεκτική κυτταρική γραμμή με τη γονική ομόλογό του? * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001, **** p & lt? 0.0001 από την One-way ANOVA με Bonferroni posttest. (Δ) της έκφρασης ABCB1. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ABCB1 μετρήθηκαν με RT-qPCR στο HEY, HEY-T30, Α2780 και Α2780-Τ15. HEY-T30 έχει υψηλότερη έκφραση mRNA ABCB1 σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SEM του σκορ έκφρασης ABCB1 mRNA για τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κυτταρική σειρά, το καθένα γίνεται εις τριπλούν, (Ε) αριθμός αντιγράφου ABCB1 DNA. Με qPCR εκτελείται σε γονιδιωματικό DNA, HEY-T30 διαθέτει έξι φορές αύξηση του αριθμού αντιγράφων του DNA ABCB1 υποδεικνύοντας γονιδιακή ενίσχυση. Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SEM από δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις τριπλούν.

Η

προηγουμένως έδειξε ότι τα επίπεδα του mRNA IGF2 αυξάνουν κατά τη διάρκεια της οξείας θεραπείας ταξόλη, και υποθέσαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του IGF2 σχετίζεται με επίμονη επιζώντα κύτταρα που δημιουργούν ανθεκτικά στα φάρμακα υποτροπή της νόσου. Για τη μελέτη αντοχής φαρμάκου στο εργαστήριο, ταξόλη, καθώς και μη-ταξάνη σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων παράγοντες (MSAs), Ιξαβεπιλόνη, δισκοδερμολίδη και εποθιλόνη Β, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη έξι διακριτές ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Όπως προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου PCR, όλα τα μοντέλα MSA-ανθεκτική κυτταρική γραμμή είχαν αυξημένα IGF2 mRNA έκφρασης σε σχέση με τα ευαίσθητα γονική γραμμή τους (Σχ. 1 C). Δεδομένου ταξόλη είναι μακράν η πιο κλινικώς χρησιμοποιούμενη μεταξύ αυτών των φαρμάκων, τα επόμενα πειράματα εστιάζονται στις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ταξόλη HEY-T30 και Α2780-Τ15.

αξιολόγησε τα ανθεκτικά στα φάρμακα κυτταρικές γραμμές για άλλους μηχανισμούς αντοχής ταξόλης [ ,,,0],20], [21]. HEY-T30 έχει ABCB1 mRNA πάνω από την έκφραση (Εικ. 1 D) που συνδέονται με την γονιδιωματική ενίσχυση του

ABCB1

(Εικ. 1 Ε), ενώ HEY δεν έχει καμία αλλαγή αριθμού αντιγράφων του

ABCB1

. Αυτά τα ευρήματα επιβεβαιώθηκαν με συστοιχία συγκριτική γενωμική υβριδισμού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). επελέγη Α2780-Τ15 παρουσία βεραπαμίλης και δεν υπερεκφράζουν ABCB1 (Εικ. 1 D), και ούτε Α2780-Τ15 ούτε Α2780 έχει DNA αλλαγή αριθμού αντιγράφων του

ABCB1

(Εικ. 1 Ε). Εμείς δεν βρήκε καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ IGF2 και της έκφρασης ABCB1 στο πάνελ μας κυτταρικών σειρών (Εικ. S3 του αρχείου S1). της αλληλουχίας του DNA αποκάλυψε ότι Α2780-Τ15 έχει μία μετάλλαξη (γλυκίνη στην θέση 360 αλλάζει σε ένα ασπαρτικό οξύ) στην ταξόλη-θύλακα σύνδεσης του β-τουμπουλίνης (Εικ. S1A και S1B του αρχείου S1), ενώ HEY-T30 δεν έχει μια μετάλλαξη σε β-τουμπουλίνης.

HEY-T30 πολλαπλασιαστεί ομοίως σε ταξόλη-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης ή μέσα που περιέχουν χαμηλές συγκεντρώσεις ταξόλη (≤30 nM) (Εικ. 2Α). Α2780-T15 πολλαπλασιαστεί πολύ πιο αργά σε ταξόλη-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης σε σχέση με μέσα που περιέχουν ταξόλη (≤15 nM) (Εικ. 2Β), γεγονός που υποδηλώνει πιθανή ταξόλη εξαρτάται ανάπτυξης που σχετίζονται με β-τουμπουλίνης μετάλλαξη της. Όταν χαμηλής δόσης ταξόλη ήταν παρούσα, Α2780-T15 πολλαπλασιάστηκαν σε παρόμοιο ρυθμό όπως Α2780. Οι ανθεκτικές κυτταρικές σειρές έδειξαν διασταυρούμενη αντίσταση σε ιξαβεπιλόνη, μια MSA που μοιράζεται μια κοινή θέση δέσμευσης β-τουμπουλίνης με Taxol. Διευρυμένη προφίλ του HEY-T30 (Σχ. 2C, αριστερό πλαίσιο) έδειξε αντίσταση στην μικροσωληνίσκων αποσταθεροποίηση βινβλαστίνη ναρκωτικών και αντίσταση σε δοξορουβικίνη, αλλά παρόμοια ευαισθησία στη σισπλατίνη, σε σύγκριση με τη γονική HEY. Α2780-Τ15 (Σχ. 2C, δεξί πάνελ) ήταν εγκάρσια ανθεκτικά τόσο δοξορουβικίνη και CDDP, αλλά ήταν περισσότερο ευαίσθητη σε βινμπλαστίνη. Υπερευαισθησία σε φάρμακα μικροσωληνίσκους αποσταθεροποίηση έχει παρατηρηθεί προηγουμένως σε άλλο φάρμακο ανθεκτική κυτταρική γραμμή που φιλοξενεί ένα β-τουμπουλίνης μετάλλαξη που σχετίζεται με την εξάρτηση από τα ναρκωτικά σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων για τον πολλαπλασιασμό [22].

κινητική της διάδοσης των κυτταρικών σειρών. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση της ταξόλης σε πιάτα 6 φρεατίων, και τα κύτταρα από φρεάτια εις διπλούν υπολογίζονται κάθε 24 ώρες. (Α) ΗΕΥ-T30 κύτταρα παρουσία ή απουσία 30 ηΜ ταξόλη πολλαπλασιάζονται πιο αργά από ΗΕΥ κυττάρων (ρ & lt? 0,05, επανειλημμένων μετρήσεων Αμφίδρομο ANOVA, Bonferroni posttest). (Β) Α2780-Τ15 παρουσία 2 ηΜ και 15 ηΜ ταξόλη αναπτυχθούν παρομοίως με Α2780. Ωστόσο, σε περίπτωση απουσίας του Ταχοί, Α2780-T15 πολλαπλασιάζεται πιο αργά, γεγονός που υποδηλώνει την εξάρτηση ταξόλη (ρ & lt? 0,01, διπλής κατεύθυνσης ANOVA, Bonferroni posttest). Κάθε καμπύλη ανάπτυξης αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα το καθένα έχει διεξαχθεί εις διπλούν, το κάθε σημείο αναπαρίσταται ως η μέση τιμή ± SEM. (C) IC

50 των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε ευαίσθητες και ανθεκτικές κυτταρικές σειρές. Σε πλάκες 96-φρεατίων, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σειριακές αραιώσεις των υποδεικνυόμενων φαρμάκων και η συγκέντρωση του 50% αναστολή πολλαπλασιασμού (IC

50) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB κυτταροτοξικότητας. HEY-T30 είναι cross-ανθεκτικά σε ιξαβεπιλόνη και βινβλαστίνη. Υπάρχει μικρή διασταυρούμενη αντίσταση σε δοξορουβικίνη αλλά όχι σε CDDP. Α2780-T15 είναι διασταυρούμενη αντοχή σε ιξαβεπιλόνη, και σεμνά διασταυρούμενη αντοχή στη δοξορουβικίνη και CDDP, αλλά πιο ευαίσθητα στην βινβλαστίνη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με έξι αντίγραφα. Ρ-τιμές που υπολογίζονται από μη ζευγαρωμένο t-test. (D, E) Σύγκριση HEY-T30 και HEY απάντηση ξενομοσχεύματος σε ταξόλη. Μετά από την υποδόρια ένεση του HEY-T30 ή ΗΕΥ κύτταρα, τα ποντίκια χωρίστηκαν σε ομάδες αγωγής των 6 ζώων εκάστη. Όταν ο μέσος όγκος ξενομόσχευμα έφθασε 120 mm

3, Η αγωγή με ταξόλη χορηγήθηκε σε μέγιστη ανεκτή δόση (MTD) του 20 mg /kg ενδοπεριτοναϊκώς κάθε τρεις ημέρες για πέντε θεραπείες (ημέρες θεραπείας: 0, 3, 6, 9, 12 ), με αποτέλεσμα μια συνολική δόση 100 mg /kg. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν ενδοπεριτοναϊκές ενέσεις του αραιωτικού (5% δεξτρόζη σε νερό? D5W) σύμφωνα με το ίδιο χρονοδιάγραμμα. Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε τρεις ημέρες, και η μέση όγκοι του όγκου ± SEM για κάθε ομάδα παρουσιάζεται σε κάθε χρονικό σημείο. HEY ξενομοσχευμάτων ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία ταξόλη, η οποία ισχυρά κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 2D?. Διακεκομμένη μπλε γραμμή). ξενομοσχευμάτων HEY-T30 δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία ταξόλη (σχήμα 2Ε?. διακεκομμένη γραμμή πορτοκαλί) και αυξήθηκαν με παρόμοιο ρυθμό όπως αγωγή με όχημα ξενομοσχεύματα HEY-T30. HEY ταξόλη vs HEY D5W την ημέρα 19, σ & lt? 0.001? αταίριαστα t-test.

Η

Ένα κρίσιμο βήμα στη μετάφραση εργαστηριακά ευρήματα σε πιθανές θεραπείες για τους ασθενείς είναι η διεξαγωγή

in vivo

δοκιμές χρησιμοποιώντας μοντέλα ζώων. Δεδομένου ότι τα κύτταρα Α2780-Τ15 ήταν εξαρτάται από την ταξόλη για την ανάπτυξή τους, αλλά HEY-T30 δεν είχαν, αξιολογήσαμε HEY-T30 ως μοντέλο ξενομοσχεύματος για

in vivo

έλεγχο των θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Εμείς χορηγείται ταξόλη χρησιμοποιώντας το προηγουμένως προσδιορισθείσα μέγιστη ανεκτή δόση (MTD? Αθροιστική δόση των 100 mg /kg) [23] για την αξιολόγηση της αντίστασης στα φάρμακα

in vivo

. Η γονική HEY ανάπτυξη ξενομοσχεύματος ήταν αποτελεσματικά καταστέλλεται από την ταξόλη, υποδεικνύοντας ευαισθησία σε ταξόλη (Σχ. 2D). Σε αντίθεση, Taxol απέτυχαν να αναστείλουν την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος HEY-T30 σύγκριση με το όχημα (5% δεξτρόζη σε νερό? D5W) θεραπεία, δείχνοντας αντοχή φαρμάκου (Εικ 2Ε.)

Για να strategize τρόπο στόχευσης IGF2 μεσολάβηση φαρμάκου. αντίσταση, εξετάσαμε την έκφραση του υποδοχέα και ενεργοποίηση των ανθεκτικών και ευαίσθητων κυτταρικών γραμμών φαρμάκου. Προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες έδειξαν ότι IGF2 δέσμευσης επάγει αυτοφωσφορυλίωση του IGF1R και την ισομορφή υποδοχέα ινσουλίνης Α, IR-A [24], [25], με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του υποδοχέα και κατάντη σηματοδότησης σε μόρια τελεστή όπως ΑΚΤ. Επιπλέον, η υψηλή έκφραση /IGF1R IR-Α σχετίζονται με την αντίσταση σε αντι-IGF1R θεραπείες, όπως η σηματοδότηση μέσω IR-A μπορεί να παρακάμψει εξάρτηση από την IGF1R [26]. Έχουμε διαπιστώσει ότι η έκφραση IGF1R mRNA ήταν υψηλότερη σε HEY HEY και-T30, σε σύγκριση με Α2780 και Α2780-Τ15, χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ των ζεύγη ευαίσθητων και ανθεκτικών γραμμών (Σχ. 3Α). Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, τα επίπεδα IR-A ήταν χαμηλότερες σε HEY HEY και-T30 σε σύγκριση με το Α2780 και Α2780-Τ15. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR αναλύθηκε επίσης με διόρθωση για τις διαφορές στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης μεταξύ των σετ εκκινητών (Πίνακας S1 του αρχείου S1), με παρόμοια ευρήματα. Με κηλίδα Western, έκφραση πρωτεΐνης IGF1R και IR αντιστοιχούσε σε επίπεδα mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, HEY HEY και-T30 είχαν χαμηλότερες αναλογίες /IGF1R IR-A από Α2780 και Α2780-Τ15.

(Α) IGF1R mRNA των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών σειρών. Μετρημένη με RT-qPCR (n = 5 ανεξάρτητα πειράματα έκαστο γίνεται εις τριπλούν), τα επίπεδα mRNA IGF1R είναι όμοια όταν οι ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με γονικές κυτταρικές σειρές καταγωγής τους. Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SEM. (Β) IR mRNA των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών. Μετρημένη με RT-qPCR (n = 5 ανεξάρτητα πειράματα έκαστο γίνεται εις τριπλούν) IR-Α και ΙΚ-Β mRNA επίπεδα σε HEY-T30 είναι σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με Hey, ενώ παρόμοια επίπεδα που παρατηρήθηκαν κατά τη σύγκριση Α2780-Τ15 προς Α2780. Μπαρ δείχνουν την μέση τιμή ± SEM, **** p & lt? 0,0001? unpaired t-test. (C) φωσφο-IGF1R και φωσφο-IR ELISA σε HEY-T30. Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής όλη τη νύκτα, επωάστηκαν με 1 μΜ NVP-AEW541 ή 10 μg /ml IMC-A12 για 2 ώρες, διεγέρθηκαν με 50 ng /ml IGF2 ή 50 ηΜ ινσουλίνης για 10 λεπτά, υποβλήθηκαν σε λύση, και τα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων IGF1R και IR καθορίζεται από ELISA. Τόσο IGF2 και ινσουλίνη προκάλεσε 5- έως 6-πλάσια αλλαγή αυξημένα επίπεδα φωσφο-IGF1R που θα μπορούσε να κατασταλεί από NVP-AEW541 ή IMC-Α12. Οι αλλαγές σε φωσφο-IR μετά από διέγερση με IGF2 ή ινσουλίνη ήταν πολύ μικρότεροι (πολλαπλή μεταβολή & lt? 1,5). Ράβδοι απεικονίζουν μέση ± SEM επίπεδα φωσφορυλίωσης πολλαπλή μεταβολή τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις διπλούν. (D) Phospho-ΑΚΤ και φωσφο-ΕΚΚ κηλίδος Western. Τα κυτταρολύματα παρασκευάζονται όπως περιγράφεται στο (C) χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας φωσφορυλίωση ειδικών ΑΚΤ και αντισώματα ERK. IGF2-επαγόμενη φωσφορυλίωση ΑΚΤ σε θρεονίνη 308 και σερίνη 473 κατεστάλη από NVP-AEW541 και IMC-A12, ενώ η συνολική ΑΚΤ ήταν αμετάβλητη. Καμία επίδραση παρατηρήθηκε στα επίπεδα φωσφο-ΕΚΚ. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από δυο ανεξάρτητα πειράματα. Ίση φόρτωση πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με χρώση Ponceau και GAPDH ανοσοαποτύπωση. (Ε) Phospho-IGF1R και φωσφο-IR ELISA σε Α2780-Τ15. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν παρομοίως με (C). IGF2 και ινσουλίνη προκάλεσε 7-πλάσια και 10-πλάσια αύξηση των επιπέδων της φωσφο-IGF1R, αντίστοιχα, και αυτό θα μπορούσε να κατασταλεί από NVP-AEW541 ή IMC-Α12. Επίπεδα της φωσφο-IR μετά IGF2 ή διέγερση ινσουλίνης αυξήθηκε επίσης, 4-πλάσια και 9 φορές, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ.