Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι μηχανικές ιδιότητες της εξωκυττάριας μήτρας έχουν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Ωστόσο, δεν είναι σαφές σε ποιο βαθμό τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται στις αλλαγές των μηχανικών ιδιοτήτων (ακαμψία /δυσκαμψία) του μικροπεριβάλλοντος και πώς αυτή η απόκριση διαφέρει μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε ένα πρόσφατα αναπτυγμένο σύστημα πλάκα 96 φρεατίων που ντύνει εξωκυττάρια μήτρα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου-συζευγμένο που αυξάνουν σε ακαμψία κατά τουλάχιστον 50 φορές κατά μήκος της πλάκας. Αυτή η πλάκα χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το πώς οι αλλαγές στην ακαμψία της εξωκυττάριας ουσίας ρυθμίζουν τις βιολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων. Οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν εμπίπτουν σε μία από τις δύο κατηγορίες με βάση τον πολλαπλασιασμό τους σε υποστρώματα διαφορετικών ακαμψία: «εξαρτώμενος ακαμψία» (εκείνοι που εμφανίζουν μια αύξηση στην κυτταρική ανάπτυξη, όπως εξωκυτταρική ακαμψία αυξάνεται), και «ακαμψία ανεξάρτητα» (αυτών που αναπτύσσονται εξίσου και στις δύο μαλακά και δύσκαμπτος υποστρώματα). Κύτταρα τα οποία αναπτύχθηκαν καλά σε μαλακά πηκτώματα επίσης έδειξαν μειωμένη εξάπλωση και τη μετανάστευση υπό αυτές τις συνθήκες. Το πιο σημαντικό, σπορά των κυτταρικών γραμμών εντός των πνευμόνων γυμνών ποντικών αποκάλυψε ότι η ικανότητα των κυττάρων να αναπτύσσονται σε μαλακό πηκτώματα

in vitro

συσχετίζεται με την ικανότητα τους να αναπτύσσονται σε ένα περιβάλλον μαλακού ιστού

in vivo

. Το Α549 γραμμή καρκινώματος πνεύμονα απάντησε στον πολιτισμό στο μαλακό τζελ με την έκφραση του διαφοροποιημένα επιθηλιακά δείκτη E-cadherin και μείωση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Slug μεσεγχυματικά.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι μηχανικές ιδιότητες του περιβάλλοντος μήτρας παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και τις μορφολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω, η πολυφατνιακές μορφή της δοκιμασίας soft-πλάκα είναι ένα χρήσιμο και αποτελεσματικό συμπλήρωμα σε καθιερωμένα μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας 3-διαστάσεων

Παράθεση:. Tilghman RW, Cowan CR, Μιχ JD, Koryakina Υ, Gioeli D, Slack -Davis JK, et al. (2010) Matrix ακαμψία Ρυθμίζει ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και κυτταρικό φαινότυπο. PLoS ONE 5 (9): e12905. doi: 10.1371 /journal.pone.0012905

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 15 του Ιουλίου του 2010? Αποδεκτές: 24 Αυγούστου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπ, 2010

Copyright: © 2010 Tilghman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NIH-NCI CA40042 (National Institutes of Health-Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου) (www.nih.gov) και χρηματοδότηση από την Coulter Ίδρυμα Μεταγραφική Συνεργάτες Award (www.whcf.org) (JTP), ΝΙΗ HL092961 (DJT) και ΝΙΗ CA124706 (ΓΔ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο έλεγχος των επιθηλιακών κυττάρων διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού (ΕΚ) είναι κρίσιμη για την ομοιόσταση των ιστών [1], [2]. πολλαπλασιασμός ΕΚ ρυθμίζεται από πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις με το περιβάλλον μικροπεριβάλλον, συμπεριλαμβανομένης της έκθεσης σε παράγοντες ανάπτυξης, την επαφή με γειτονικά κύτταρα, και την προσκόλληση σε συστατικά της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) [3] – [6]. Μεταβολή των οδών σηματοδότησης που ρυθμίζουν την απόκριση σε αυτές τις μικροπεριβάλλον συνθήματα είναι ένα κρίσιμο γεγονός στη όγκου έναρξη, εξέλιξη και μετάσταση.

Οι μηχανικές ιδιότητες της ECM έχουν αναγνωριστεί ως σημαντικός παράγοντας που ρυθμίζει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των ένα πλήθος κυτταρικών τύπων και

in vitro

και

in vivo

. Συγκεκριμένα, η ακαμψία ( «ακαμψία») του ECM, που ορίζεται από ελαστικό συντελεστή του (

E

) σε μονάδες δύναμης ανά τομέα (Pa), επηρεάζει την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργικότητα των πολλών τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βλαστικών κυττάρων, ινοβλάστες, νευρογλοιακά κύτταρα, και καρδιομυοκύτταρα [7] – [11]. Επιπλέον, νοσηρές καταστάσεις συνοδεύονται συχνά από μια τοπική αύξηση στην ECM ακαμψία [12], [13]. εξέλιξης του καρκίνου σε μαλακούς ιστούς είναι κατά κανόνα συνδέονται με μια αύξηση στην ακαμψία λόγω της τοπικής συσσώρευσης ένα πυκνό, διασταυρωμένη μήτρα κολλαγόνου που επιτρέπει την ανίχνευση του όγκου από φυσική ψηλάφηση [14], [15]. Ως εκ τούτου, μη καρκινογενής επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία συνήθως διαμένουν στο μαλακό (

E

= 150 μονάδες pascal [Pa] ή N /m

2) μικροπεριβάλλον του μαστού, δείχνουν αυξημένο πολλαπλασιασμό όταν καλλιεργούνται σε πιο σκληρή μήτρες (

E

= 4500 Pa), μαζί με την αυξημένη μετανάστευση, επαυξημένης σηματοδότησης ΕΚΚ, και η απώλεια της κυτταρικής πολικότητας [16]. Αυτά τα χαρακτηριστικά θεωρούνται χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων και χαρακτηρίζονται ως αναπόσπαστο συστατικό μιας μετάβασης από μια σχετικά ήρεμη σε «κακοήθη» φαινότυπο, οδηγείται από μια τοπική αύξηση της ECM ακαμψίας [16].

Ο βαθμός και μεταβλητότητας στην οποία το ανθρώπινο καρκινικές κυτταρικές σειρές αποκρίνονται στις διακυμάνσεις μικροπεριβάλλοντος ακαμψία είναι ασαφής. Οι ινοβλάστες μετασχηματισμένα με ογκογόνο H-Ras εμφανίζεται πλέον αναστολή της ανάπτυξης σε μαλακό υποστρώματα [11]. Επιπλέον, οι ιδιότητες ανάπτυξης των κλωνικοί πληθυσμοί του καρκίνου κυτταρικής γραμμής του μαστού MDA-MB-231 διαφέρουν στην απόκριση σε ακαμψία, και συσχετίζεται με την ικανότητα να αναπτύσσεται στο μαλακό πνεύμονα ή άκαμπτο οστό

in vivo

[ ,,,0],17]. Αυτό υποδηλώνει ότι οι ιδιότητες ανάπτυξης ενός συγκεκριμένου καρκίνου κυτταρική γραμμή σε απόκριση προς υπόστρωμα ακαμψία μπορεί να προσδιοριστεί με γενετική ή επιγενετική σύνθεσή της.

Ανάλυση ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών εκτελείται γενικά χρησιμοποιώντας κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άκαμπτο πλαστικό, ή σε Matrigel ή μαλακό άγαρ, οι μηχανικές ιδιότητες του οποίου είναι ανεπαρκώς καθορισμένες ή /και δύσκολο να διαμορφώνουν. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε προσαρμόσει μια μέθοδο για την καλλιέργεια κυττάρων επί βιολογικώς σχετικό «μαλακό» υποστρώματα με τη χρήση ECM-συζευγμένο πολυακρυλαμιδίου (ΡΑ) πηκτώματα που μπορούν να καλύπτουν την περιοχή ακαμψία των 100 Pa-150000 Pa. Χρησιμοποιήσαμε ένα πρόσφατα αναπτύχθηκε δοκιμασίας 96-φρεατίων σύστημα ότι ντύνει PA πηκτές ποικίλης ακαμψίας σε προσαυξήσεις καθορίζονται από το χρήστη σε όλη την πλάκα. Αυτό το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το πώς οι αλλαγές στην ακαμψία της ECM ρυθμίζουν τις βιολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, καθώς και στην ανάπτυξη, τη μορφολογία, και μεταναστευτικές ιδιότητες. Οι κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν απέκλινε σε δύο κατηγορίες με βάση τα προφίλ πολλαπλασιασμό τους: «εξαρτάται ακαμψία» γραμμές γενικά παρουσίασαν αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων όπως εξωκυττάριο ακαμψία αυξάνεται, ενώ η «ακαμψία ανεξάρτητη» γραμμές αυξήθηκαν εξίσου καλά σε όλο το φάσμα δοκιμαστεί της δυσκαμψίας. Σημαντικά, τα κύτταρα τα οποία αναπτύχθηκαν καλά σε μαλακά πηκτώματα επίσης έδειξαν μειωμένη εξάπλωση και τη μετανάστευση υπό αυτές τις συνθήκες. Εκτιμήσαμε την ανάπτυξη των τεσσάρων αντιπροσωπευτικών κυτταρικών σειρών που επιλέγεται από αυτές τις δύο κατηγορίες

in vivo

με την εισαγωγή των κυττάρων στο μαλακό περιβάλλον ιστό του πνεύμονα. Οι δύο ακαμψία-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές (PC-3 και mPanc96) αναπτύχθηκαν καλά σε μαλακό (πνεύμονα) ιστό, ενώ η ακαμψία που εξαρτώνται από κυτταρικές γραμμές (Α549 και MDA-MB-231) δεν αναπτύχθηκαν καλά στον πνεύμονα. Το Α549 γραμμή καρκινώματος πνεύμονα ανταποκρίθηκαν στην καλλιέργεια σε μαλακά πηκτώματα με την έκφραση του διαφοροποιημένα επιθηλιακά δείκτη Ε-καδερίνης και μειώνοντας την έκφραση του παράγοντα Slug μεσεγχυματικά μεταγραφής. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι οι μηχανικές ιδιότητες του περιβάλλοντος μήτρας παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και τις μορφολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, και ότι η «προφίλ ακαμψία» είναι μια εγγενής ιδιότητα του κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή.

Αποτελέσματα

ακαμψία εξαρτώμενη ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του

Για να μετρηθεί η ανάπτυξη του καρκίνου κυτταρικών γραμμών ως συνάρτηση της ακαμψίας μήτρας προσαρμόσαμε ένα νέο 96-φρεατίων δοκιμασία σύστημα ( «soft-plate96″ ) που χρησιμοποιεί το κολλαγόνο ομοιοπολικά συζευγμένο με πηκτές πολυακρυλαμιδίου ως υποστρώματα στη θέση του άκαμπτου πλαστικού ECM με λεπτό υμένιο. Οι μαλακοί-πλάκες αποτελούνται από πέντε τμήματα, το καθένα περιέχει δύο στήλες του κολλαγόνου επικαλυμμένων γελών ΡΑ ενός συγκεκριμένου μέτρου ελαστικότητας (Εικ. 1), 150 Pa και 1200 Pa (συγκρίσιμη με του πνεύμονα και του μαστού), 2400 Pa και 4800 Pa ( συγκρίσιμο με ένα μαστικού όγκου) και 9600 Ρα (προσεγγίζοντας γραμμωτών μυών). Αυτά τα μέτρα ελαστικότητας επιλέχθηκαν με βάση τις δημοσιευμένες μετρήσεις της ακαμψίας των μαλακών ιστών και όγκων [7], [10], [16], [18], και σε προκαταρκτικά δεδομένα που δείχνουν ότι οι μεγαλύτερες αλλαγές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ακαμψία εξαρτώμενη σημειώθηκε μεταξύ 150 Pa και 4800 Pa (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Ένα τυπικό δοκιμασία ανάπτυξης 5-ημερών με ένα μαλακό-plate96 αποδίδει ένα «προφίλ ανάπτυξης», η οποία αντανακλά την επίδραση της ακαμψίας στον πολλαπλασιασμό της κυτταρικής σειράς.

προσδιορίζεται το προφίλ ανάπτυξης δεκατεσσάρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών με επίστρωση των κυττάρων στο μαλακό-plate96 και μετρώντας την αλλαγή φορές στον αριθμό κυττάρων μετά από πέντε ημέρες χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα χρωστική δέσμευσης DNA (Σχ. 2) . Επιπλέον, προσδιορίστηκαν τα προφίλ ανάπτυξης των μη καρκινογενής επιθηλιακά κύτταρα μαστού (MCF-10Α) και δύο γραμμές ινοβλαστών. Η ανάπτυξη των κυττάρων σε καθορισμένους μήτρες δημιουργείται μια ποιοτική «προφίλ ανάπτυξης» για κάθε κυτταρική γραμμή (Σχ. 1, 2). Τα προφίλ ανάπτυξης των κυτταρικών γραμμών έπεσε σε μία από δύο κατηγορίες: τα κύτταρα «ακαμψία εξαρτώμενη», τουλάχιστον 2-φορές αλλαγή στον αριθμό κυττάρων σε όλο το εύρος των εξωκυττάριων ακαμψίας δοκιμάστηκαν (π.χ., MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού και Α549 κύτταρα καρκίνου πνεύμονα), και τα κύτταρα «ακαμψία-ανεξάρτητος» η οποία αναπτύχθηκε εξίσου καλά σε όλο το φάσμα των δοκιμασμένων δυσκαμψίας μήτρας (π.χ., PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα και mPanc96 καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα) (Εικ. 2). Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ του σχήματος του προφίλ ανάπτυξης ακαμψία-εξαρτώμενη και τον ιστό προέλευσης, ή αν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν αρχικά από τον πρωτογενή όγκο ή από ένα μεταστατικό βλάβη.

Ο πίνακας είναι μια συλλογή από 5 Ημέρα δοκιμασίες ανάπτυξης για 17 κυτταρικές γραμμές. Στον πίνακα είναι αρχική πηγή των κυττάρων (που υποδεικνύεται με αναφορές βιβλιογραφίας), την ικανότητα να αναπτύσσονται σε 150 Pa και 9600 Pa υποστρώματα (από δοκιμασίες SoftPlate96), και το προφίλ ανάπτυξης μαλακού plate96 για κάθε κυτταρική γραμμή. Γκρι προφίλ δείχνουν ακαμψία που εξαρτώνται από τις γραμμές και μαύρο προφίλ δείχνουν ακαμψία ανεξάρτητες γραμμές. Η ανάπτυξη μετριέται ως εξής: – & lt? 1 φορές? + 1-5 φορές? ++ 5-10 φορές? +++ 10-15 φορές? ++++ 15-20 φορές? +++++ & Gt?. 20 φορές αύξηση στον αριθμό των κυττάρων πάνω από 5 ημέρες

Η

χαρακτηριζόμενη περαιτέρω δύο κυτταρικές σειρές οι οποίες έδειξαν ακαμψία εξαρτώμενη αύξηση (MDA-MB-231 και Α549) και δύο κυτταρικές γραμμές που έδειξε ακαμψία-ανεξάρτητη ανάπτυξη (mPanc96 και PC-3). Κάθε κυτταρική γραμμή κατέδειξε ισχυρή ανάπτυξη των κυττάρων σε άκαμπτα επικαλυμμένες με κολλαγόνο πλαστικό (Εικ. 3Α). Η ακαμψία κυττάρων που εξαρτώνται επέδειξαν 4-5 φορές αύξηση σε αριθμό με τις πιο άκαμπτα πηκτώματα (4.800 έως 9.600 Pa) σε σχέση με τα μαλακά (150 έως 1200 Ρα) γέλες (Σχ. 3Β, επάνω πάνελ). Αντίθετα, οι δύο ακαμψία-ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές καταδεικνύεται σχεδόν ισοδύναμους αριθμούς με τα μαλακά και άκαμπτα πηκτώματα (Σχ. 3Β, κάτω πάνελ). Για να καθοριστεί εάν η διαφορά ανάπτυξης σε μαλακό ή άκαμπτα υποστρώματα αντιπροσώπευε την επιλογή ενός πληθυσμού κυττάρων που εμφανίζουν προτιμησιακών ανάπτυξη σε διαφορετικά υποστρώματα, Α549 ή MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλαστικά ή 150 Pa υποστρώματα για 15 ημέρες. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία ανάπτυξης 5 ημερών σε ένα μαλακό-plate96. Καμία αλλαγή στο προφίλ ανάπτυξη μαλακών πλάκα παρατηρήθηκε μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια σε μαλακές επιφάνειες (Εικ. S1). Αυτά τα δεδομένα καθορίζουν σαφώς κυτταρική σειρά συγκεκριμένες διαφορές στην ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό έναντι άκαμπτα υποστρώματα και δείχνουν ότι το «προφίλ ακαμψία» είναι μια εγγενής ιδιότητα του κάθε κυτταρική σειρά.

Α.) Δοκιμασία ανάπτυξη 5 ημερών της τέσσερις καρκινικές κυτταρικές σειρές σε πλαστικά. Β) δοκιμασίες ανάπτυξης 5 ημερών των τεσσάρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών σε ένα μαλακό-plate96. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής επί του αριθμού των κυττάρων αρχικά επιστρώθηκαν. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0,05 vs. ανάπτυξη σε 9.600 Pa, όπως μετράται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey

Η

Ιδιότητες ακαμψία-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από κυτταρικές σειρές σε διάφορα υποστρώματα

εμείς αξιολόγησε κατά πόσο η μειωμένη ανάπτυξη της ακαμψίας κυττάρων που εξαρτώνται σε μαλακά πηκτώματα οφειλόταν σε ελαττώματα πρόσφυση στο υπόστρωμα, ένα μπλοκ σε κυτταρικό κύκλο, ή επαγωγή απόπτωσης. Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μαλακής plate96, αφέθηκαν να προσκολληθούν για έξι ώρες, και ο αριθμός των προσκολλημένων κυττάρων μετρήθηκε. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές που συνδέονται αποτελεσματικά στις κολλαγόνο πηκτές ανεξάρτητα από ελαστικότητας (Σχ. 4Α), υποδεικνύοντας ότι μικρότερους αριθμούς κυττάρων στα πηκτώματα μετά από πέντε ημέρες δεν οφείλεται στην έλλειψη προσκόλλησης κυττάρου.

Α.) Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα μαλακό-plate96 και το συνολικό αριθμό των κυττάρων ανά φρεάτιο μετρήθηκαν μετά από 6 ώρες προσάρτησης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως επί τοις εκατό προσκόλλησης στις πηκτές 150 Pa. Β) Α549 και PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 150 Pa ή 4.800 υποστρώματα γέλη Ρα για 5 ημέρες ακολουθούμενη από ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέσος όρος τουλάχιστον τριών πειραμάτων ± SEM. * P & lt?. 0.05

Η

Η έλλειψη σηματοδότησης πρόσφυση στο αγκυροβόλιο που εξαρτώνται από τα αποτελέσματα των κυττάρων σε ένα μπλοκ στο G1 /S σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου [19]. Κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε ένα πήκτωμα 150 Ρα για πέντε ημέρες έδειξε μια μικρή αλλά σημαντική συσσώρευση στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου με μια αντίστοιχη μείωση στο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (Εικ. 4Β), συνεπής με ένα μπλοκ κατά τη G1 /S σημείου ελέγχου. Σε αντίθεση, MDA-MB-231 κύτταρα παρουσίασαν καμία σημαντική αλλαγή στο προφίλ του κυτταρικού κύκλου τους, παρόμοια με την ακαμψία ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές PC-3 και mPanc96 (Εικ. 4Β). Ωστόσο, τόσο των κυτταρικών γραμμών που εξαρτώνται από την ακαμψία (Α549 και MDA-MB-231) εμφάνισαν σημαντική απόπτωση όταν καλλιεργούνται σε μαλακές πηκτές για πέντε ημέρες, ενώ η ακαμψία-ανεξάρτητο PC-3 και κυτταρικές σειρές mPanc96 δεν το έκανε (Σχ. 5A- ΣΙ). Καμία από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν σημαντική απόπτωση όταν καλλιεργείται στις πιο άκαμπτο (4800 Pa) γέλες. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το «προφίλ ακαμψία» των κυττάρων δεν αντικατοπτρίζει διαφορές στην προσκόλληση στη μήτρα, αλλά πιο πιθανό αντανακλά ακαμψία μεταβολές που εξαρτώνται από την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης των κυττάρων.

Α.) Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα της Α549 και MDA-MB-231 κύτταρα επιστρώνονται επί 5 ημέρες σε 150 Pa ή 4.800 υποστρώματα Pa γέλη. Όλες οι πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε) και TUNEL-θετικά κύτταρα σημαίνονται με φλουορεσκεϊνη (πράσινο). Bar = 100 μm. Β) Ποσοτικοποίηση της χρώσης TUNEL. Μέσος όρος 2 πειραμάτων ± SEM, με συνολική τουλάχιστον 400 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση.

Η

Η ικανότητα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών για να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό ιστό συσχετίζεται με τους μαλακής plate96 προφίλ

εκτιμηθεί αν η απόκλιση ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό υποστρώματα εκτεθεί από τις κυτταρικές σειρές ακαμψία-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από ήταν προβλεπτική της ικανότητας αυτών των κυττάρων να αναπτύσσονται σε ένα περιβάλλον μαλακού ιστού

in vivo

. Δύο ακαμψία εξαρτώμενη γραμμές (MDA-MB-231 και Α549) και δύο ακαμψία-ανεξάρτητες γραμμές (PC-3 και mPanc96) έχουν σταθερά μεταγωγή με ένα φακοϊό κωδικοποιεί GFP, και εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα των γυμνών ποντικών. Είτε 2-24 ώρες ή 14 ημέρες μετά την ένεση ο κυτταρικός πληθυσμός GFP-θετικά στα ομογενοποιήματα πνεύμονα προσδιορίσθηκε με κυτταρομετρία ροής και ιστοχημείας. Κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές παρουσίασαν σημαντικός αριθμός κυττάρων στους πνεύμονες μετά την έγχυση (Σχήμα 6Α, δεξί πάνελ?. Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Ωστόσο, μετά από δύο εβδομάδες οι πνεύμονες των ποντικών που ενέθηκαν με δύο ακαμψία εξαρτώμενη κυτταρικές σειρές (MDA-MB-231 και Α549) περιείχαν λιγότερα GFP-θετικά κύτταρα, σε σύγκριση με τους πνεύμονες των ποντικών που ενέθηκαν με ακαμψία-ανεξάρτητες κυτταρικές γραμμές (PC- 3 και mPanc96) (Σχ. 6Α, αριστερό πάνελ). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση τομών εγκλεισμένων σε παραφίνη των πνευμόνων δύο εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων mPanc96 έδειξε μικροαποικίες μέσα στις κυψελίδες, ενώ στους πνεύμονες των ποντικών που εγχύθηκαν με τα κύτταρα Α549 και MDA-MB-231 containied κανένα ανιχνεύσιμο μικροαποικίες (Σχ. 6Β, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, η αύξηση της δυσκαμψίας ανεξάρτητες γραμμές στον πνεύμονα συσχετίζεται με την αποτελεσματικότητα της ανάπτυξής τους επί των 1200 Pa πήγματα της δοκιμασίας SoftPlate96 (Εικ. 6C), μια ακαμψία παρόμοια με εκείνη του πνευμονικού ιστού (DJT, αδημοσίευτη παρατήρηση). Ο συσχετισμός μεταξύ σχετικών ρυθμών ανάπτυξης των κυττάρων σε μαλακό υποστρώματα, αλλά όχι άκαμπτο πιάτα, με την αύξηση των ιδίων κυτταρικών γραμμών στον πνεύμονα δείχνει ότι η ικανότητα των κυττάρων να αναπτύσσονται σε μαλακό πηκτώματα

in vitro

μπορεί να είναι ένας προγνωστικός της ικανότητάς τους να αναπτύσσονται σε μαλακό ιστό

in vivo

.

Α.) GFP-επισημασμένο MDA-MB-231, Α549, PC-3, ή κύτταρα mPanc96 σπάρθηκαν εντός των πνευμόνων του γυμνούς ποντικούς. (Αριστερά) Ο αριθμός των GFP-θετικών κυττάρων στον πνεύμονα προσδιορίσθηκε 4 ώρες και 14 ημέρες μετά την ένεση, και η μεταβολή του αριθμού των GFP θετικών κυττάρων στον πνεύμονα κατά τη διάρκεια των 14 ημερών σημείωσε. * Ρ & lt? 0,05 έναντι MDA-MB-231, όπως μετράται με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή του Tukey. (Δεξιά) GFP-επισημασμένο Α549 και κύτταρα mPanc96 σπάρθηκαν εντός των πνευμόνων και το ποσοστό των GFP-θετικά κύτταρα βαθμολογήθηκαν κατά διαστήματα επί 24 ώρες. Β) Ιστολογία του πνεύμονα ποντικού σε 14 ημέρες μετά την έγχυση των κυττάρων Α549 (αριστερό πάνελ) και κύτταρα mPanc96 (δεξί πάνελ). Τα βέλη δείχνουν μικρομεταστάσεων. Γ) Σύγκριση της ανάπτυξης των κυτταρικών γραμμών σε πλαστικά (από το Σχ. 3Α) και σε 1200 Pa υποστρώματα (που λαμβάνονται από το Σχ. 3Β).

Η

αυξημένο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του ακαμψία που εξαρτώνται κύτταρα συσχετίζεται με την εξάπλωση των κυττάρων

επόμενο εκτιμηθεί εάν πολλαπλασιασμό ακαμψία που εξαρτώνται από κυτταρικές γραμμές συσχετίζεται με την ικανότητα των κυττάρων να απλώνονται σε διάφορα υποστρώματα γέλη. Τόσο MDA-MB-231 και Α549 κύτταρα παρουσίασαν σημαντικές αυξήσεις σε κυτταρικό διασκορπισμό στην 4800 γέλες Pa σε σύγκριση με 150 γέλες Pa (Σχ. 7Α-Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν BxPC-3 κύτταρα, μία παγκρεατική γραμμή που εμφανίζει ένα συγκρίσιμο προφίλ ανάπτυξης σε MDA-MB-231 και Α549 κύτταρα (Εικ. 2), καλλιεργήθηκαν σε 150 Pa και 4800 πηκτώματα Pa (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον ότι, PC-3 κύτταρα (ακαμψία-ανεξάρτητο) ήταν σε θέση να εξαπλωθεί σε 150 γέλες Pa σε παρόμοιο βαθμό και στις γέλες 4800 Pa, ενώ τα κύτταρα mPanc96 (ακαμψία-ανεξάρτητο) δεν εξαπλωθεί αισθητά είτε μαλακά ή άκαμπτα υποστρώματα (Εικ . 7Α-Β). Η ικανότητα να εξαπλώνεται σε πιο άκαμπτα υποστρώματα συσχετίζεται επίσης με την ικανότητα των Α549 και MDA-MB-231 κυττάρων να μεταναστεύουν. Σε αντίθεση, αμφότερα τα κύτταρα mPanc96 PC-3 και απέτυχε να δείξει σημαντικές διαφορές στη μετανάστευση όταν απλώνονται σε μαλακό έναντι περισσότερο άκαμπτα υποστρώματα (Εικ. 7C). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι για ακαμψία εξαρτώμενη κυτταρικές γραμμές η ικανότητα των κυττάρων να εξαπλωθεί συσχετίζεται με αυξημένο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Για ακαμψία-ανεξάρτητο κύτταρα αυτές οι συμπεριφορές εμφανίζονται να είναι μη συζευγμένο.

Μικρογραφίες του Α549

Α.), MDA-MB-231, PC-3, και τα κύτταρα mPanc96 που απλώθηκαν σε 150 ή 4.800 υποστρώματα γέλη Ρα για 20 ώρες. Β) Τομείς των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν για 20 ώρες σε 150 ή 4.800 υποστρώματα Pa γέλη. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση φορές αύξηση πάνω από μια unspread κύτταρο ± SEM από τουλάχιστον 20 κύτταρα μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση. Γ) Α549, MDA-MB-231, PC-3, και τα κύτταρα mPanc96 απλώθηκαν επί 2 ώρες, κατόπιν γυρίστηκε για επιπλέον 18 ώρες. Η μέση ταχύτητα των κυττάρων ± SEM σε μm /hr προσδιορίστηκε από τον εντοπισμό και τη μέτρηση των διαδρομών των 15 κύτταρα ανά ακαμψία ανά κυτταρική σειρά. * P & lt?. 0.05

Η

κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) είναι ένα κρίσιμο συστατικό της σηματοδότησης της σηματοδότησης ιντεγκρίνης και έχει εμπλακεί στην ανίχνευση της ακαμψίας του ECM [20], [21]. δραστηριότητα ΡΑΚ, όπως μετράται με αυτοφωσφορυλίωση της επί tyrosine397, ήταν μόνο μέτρια ενεργοποιείται ως συνάρτηση της ακαμψίας μήτρας σε κύτταρα Α549, και δεν επηρεάσθηκε σημαντικά στις άλλες κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Εικ. S2). Αυτά τα δεδομένα τονίζουν ότι οι συμπεριφορές των διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών σε μαλακό ή άκαμπτα υποστρώματα δεν μπορεί απλώς να αποδοθεί σε μεταβολές στη γενική προσκόλληση σηματοδότηση μέσω της ενεργοποίησης της FAK.

Οι μηχανικές ιδιότητες του μικροπεριβάλλοντος ρυθμίζουν τα επιθηλιακά και μεσεγχυματικά ιδιότητες της Α549 κύτταρα

Η μετατροπή των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων σε κακοήθη, μεταστατικά ομολόγους συχνά συνεπάγεται την απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης και την απόκτηση μιας πιο μεταναστευτικών φαινότυπο – μια διαδικασία που ονομάζεται επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT). κύτταρα Α549 αναπτύσσονται σε μαλακό (150 Pa) τζελ για 5 ημέρες σχηματίζονται συστάδες χωρίς ορατές εστιακό συμφύσεις ή ίνες στρες (Εικ. 8Α). Σε αντίθεση, τα κύτταρα σε πιο άκαμπτο (4800 Pa και 19200 Ρα) πηκτές απλώθηκαν και περισσότερο διασπείρονται εμφανίζουν εξέχοντα ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις (Εικ. 8Α), όλα τα χαρακτηριστικά του φαινοτύπου μεσεγχυματικών. χρώση ανοσοφθορισμού ή ανάλυση κηλίδος western των κυττάρων που καλλιεργούνται στις 150 γέλες Pa ή 4800 ή 19200 γελών Pa παρουσίασαν σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης σε μαλακές επιφάνειες (Σχ. 8Β-C). Ωστόσο, καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση του μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη παρατηρήθηκε σε κύτταρα που αναπτύσσονται για τα διάφορα υποστρώματα (Εικ. 8C).

Α.) Κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες σε πηκτώματα με δυσκαμψίες 150 , 4800, ή 19200 Pa. τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για ακτίνη (πράσινο) και παξιλλίνης (κόκκινο). Τα βέλη δείχνουν εστιακές συμφύσεις. Β) τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πηκτώματα με δυσκαμψίες του 150 ή 19200 Pa. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για ακτίνη (πράσινο) και Ε-καδερίνης (κόκκινο). κύτταρα Γ) Α549 καλλιεργήθηκαν σε πηκτές PA για 3 ημέρες λύθηκαν και στυπώθηκε για την έκφραση της Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και ακτίνη. Δ) Τα σχετικά επίπεδα του Slug και Ε-καδερίνης mRNA σε κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πηκτές PA για 3 ημέρες όπως μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Ο καταστολέας μεταγραφής Slug είναι ένα μέλος της οικογένειας σαλιγκάρι των στοιχείων DNA δεσμευτικών που ρυθμίζει την έκφραση Ε-καδερίνης [22] και έχει αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμη για την ανάθεση ενός μεταστατικού φαινοτύπου σε ένα πειραματικό μοντέλο μελανώματος [23]. Ποσοτική RT-PCR ανάλυση των κυττάρων Α549 καλλιεργήθηκαν σε υποστρώματα διαφορετικών ακαμψιών αποκάλυψε μια ρύθμιση προς τα άνω του Slug mRNA όταν κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πιο άκαμπτες πηκτές (4800 και 19200 Ρα) σε σύγκριση με το μαλακό gel (150 Ρα) (Σχ. 8D). επίπεδα Slug mRNA αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα Ε-καδερίνης mRNA, οι οποίες ήταν χαμηλότερες σε κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε πιο άκαμπτες γέλες σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν στο μαλακό gel, συνεπής με τις αλλαγές που παρατηρούνται στην έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης (Εικ. 8Β-C) . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ακαμψία της μήτρας μπορούν να διαμορφώσουν Ε-καδερίνης και έκφραση Slug σε κύτταρα Α549. Είναι ενδιαφέρον ότι, MDA-MB-231 κύτταρα, ενώ επιδεικνύουν ακαμψία-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό, δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα του Ε-καδερίνης είτε 150 Pa ή 19.200 Ρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα κύτταρα, ενώ μορφολογικά παρόμοια με τα κύτταρα Α549 σε μαλακό και άκαμπτα υποστρώματα, δεν μεταβάλλουν την έκφραση αυτής της επιθηλιακής δείκτη όταν εκτίθενται σε ένα μαλακό μικροπεριβάλλον.

Συζήτηση

Οι μελέτες που αναφέρονται παραπάνω υπογραμμίζουν τη σημασία των μηχανικών ιδιοτήτων του ECM για τη ρύθμιση τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου και την επιβίωση. Επιπλέον, περιγράφουμε ένα αποτελεσματικό και ευέλικτο σύστημα προσδιορισμού για να προσδιοριστεί πώς οι αλλαγές στις ιδιότητες των κυττάρων επιρροή ακαμψία μήτρας. Ανάλυση των 14 καρκινικών κυτταρικών σειρών αποκάλυψε ότι η μεταβολή της ακαμψίας της μήτρας κολλαγόνου επικαλυμμένα μεταβάλλει εμφανώς την ανάπτυξη ορισμένων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ( «ακαμψία εξαρτώμενη» ανάπτυξης) ενώ έχει μικρή επίδραση επί άλλων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ( «ακαμψία ανεξάρτητη» ανάπτυξη ), η οποία αναπτύχθηκε δυναμικά, ακόμη και σε υποστρώματα με πολύ χαμηλή σκληρότητα. Τα χαμηλότερα ποσοστά αύξησης σε μαλακά πηκτώματα σε ακαμψία εξαρτώμενη κυτταρικές σειρές που προκαλούνται τουλάχιστον εν μέρει από την επιλεκτική μεταβολή στη πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και της διέγερσης απόπτωσης όταν κυτταρικές γραμμές απλώθηκαν σε μαλακό μήτρες. Επιπλέον, η ακαμψία που εξαρτώνται από τις γραμμές έδειξε αξιοσημείωτη μείωση στην κυτταρική εξάπλωση και τη μετανάστευση όταν απλώνονται σε μαλακό έναντι άκαμπτα υποστρώματα, και τουλάχιστον μία από τις κυτταρικές σειρές (Α549) εμφάνισε μια ακαμψία εξαρτώμενη ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης και αναστρέψιμη διαμόρφωση του επιθηλιακά και μεσεγχυματικά φαινότυπο. Τέλος, όταν εμβολιάζονται σε πνεύμονες ποντικού, ακαμψία εξαρτώμενη κυτταρικές σειρές δεν μεγαλώνουν καθώς και ακαμψία ανεξάρτητες γραμμές, υποδεικνύοντας μία συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας να αναπτύσσονται σε μαλακό μήτρες

in vitro

και πολλαπλασιαστική ικανότητα

σε vivo

στον πνεύμονα.

το μαλακό-plate96 πολλές εκβαθύνσεις δοκιμασίας αντιπροσωπεύει μια προσέγγιση σχετικά υψηλής απόδοσης για την εκτίμηση του ρόλου της ακαμψίας του υποστρώματος για τις ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων σε καλλιέργεια. Σε αυτό το σύστημα η μέθοδος της Pelham και Wang [24] έχει προσαρμοστεί για να παράγει ένα πλακός με πολλές εκβαθύνσεις στο οποίο το υπόστρωμα αποτελείται από πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου ποικίλης ακαμψίας που έχουν ενεργοποιηθεί για να παρέχει μια δεσμευτική επιφάνεια για πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας, π.χ., το κολλαγόνο. Στις μελέτες που περιγράφονται παραπάνω οι πλάκες σχεδιασμένη ώστε να περιλαμβάνει πέντε επίπεδα ελαστικότητας, που κυμαίνονται από 150 έως 9600 Pa, ωστόσο οι άλλες μορφές δημιουργούνται εύκολα. Το τελικό σημείο της δοκιμασίας σε μελέτες μας ήταν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά και άλλες παραμέτρους, π.χ., την επιβίωση των κυττάρων είναι εύκολα ρυθμιστεί. Όπως απεικονίζεται, το σύστημα δοκιμασίας παρέχει μία ταχεία και αναπαραγώγιμη μέθοδος για την αξιολόγηση του ρόλου της ακαμψίας μήτρας στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση.

Χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία έχουμε ρωτήθηκαν ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών με στόχο να προσδιοριστεί το πώς οι αλλαγές στις μηχανικές ιδιότητες του πολλαπλασιασμού μήτρας επιρροή των κυττάρων. Εννέα από τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν εξάρτηση από την ακαμψία της μήτρας για την ανάπτυξη, αυξάνεται σημαντικά καλύτερα σε άκαμπτο /άκαμπτος μήτρες ό, τι στις λιγότερο άκαμπτη /μαλακό μήτρες. Ακαμψία-ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές παρουσίασαν σχεδόν καμία μεταβολή στο ρυθμό ανάπτυξης σε όλο το εύρος της δυσκαμψίας που χρησιμοποιούνται στις πλάκες. Είναι αξιοσημείωτο ότι, όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ικανά να πολλαπλασιάζονται σε μαλακό υποστρώματα, ενώ φυσιολογικούς ινοβλάστες, λείο μυ και τα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζουν μια αυστηρή εξάρτηση από την ακαμψία της μήτρας για την ανάπτυξη [25]. Αυτό αντικατοπτρίζει πιθανώς την «ογκογόνο« μετασχηματισμός των καρκινικών κυτταρικών σειρών σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, τα γεγονότα που αντικατοπτρίζουν τις πολλαπλές μεταλλάξεις που χαρακτηρίζουν τα καρκινικά κύτταρα. Δεν είναι σαφές αυτή τη στιγμή εάν το προφίλ ακαμψία του καρκίνου κυτταρικές σειρές αντανακλά μία ή περισσότερες συγκεκριμένες μεταλλάξεις που αποκτώνται από ένα άτομο κυτταρική σειρά.

Είναι ενδιαφέρον ότι οι κυτταρικές σειρές οι οποίες απέδειξαν την ακαμψία που εξαρτάται από την ανάπτυξη και έδειξε ακαμψία που εξαρτώνται από τη διάδοση και τη μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας παράλληλα την ανάλυση μιας σειράς κυτταρικών γραμμών γλοιώματος πολλαπλασιάστηκαν επί φιβρονεκτίνης επικαλυμμένα πολυμερικά υποστρώματα καθορισμένων μηχανική ακαμψία [26]. Σε εξαιρετικά άκαμπτα υποστρώματα (& gt? 100 kPa) τα κύτταρα γλοιώματος εξαπλωθεί σε μεγάλο βαθμό, σχηματίζονται προεξέχοντα ίνες στρες και ωριμάζουν εστιακό συμφύσεις, και μετανάστευσαν γρήγορα. Ωστόσο, όταν καλλιεργούνται σε λιγότερο άκαμπτες μήτρες (τιμές συγκρίσιμες με φυσιολογικό ιστό εγκεφάλου), τα κύτταρα γλοιώματος εμφανίστηκε στρογγυλεμένες και απέτυχε να μεταναστεύσουν παραγωγικά, παρόμοια με τις κυτταρικές σειρές ακαμψία εξαρτώμενη περιγράφεται στις μελέτες μας. Είναι ενδιαφέρον, γλοίωμα κυτταρική κινητικότητα σε ιδιαίτερα συμβατή υποστρώματα διασώθηκε από φαρμακολογική αναστολή της actinomyosin που βασίζονται συσταλτικότητα, υποδηλώνοντας ότι η actinomyosin συσταλτικότητα μπορεί να είναι ένα κρίσιμο συστατικό της μηχανο συσκευής. Άλλες μελέτες έχουν εμπλέξει FAK, ERK, και το μικρό ΟΤΡάσης Rho στην ρύθμιση της ανάπτυξης σε απάντηση ακαμψία [16], ή μια αύξηση στα επίπεδα κυκλίνης D μετά από ενεργοποίηση Rac [25]. Rho ΘΤΡάσες και κατάντη στόχους τους, οι οποίες είναι κρίσιμες μεσολαβητές εξάπλωση των κυττάρων, τη μετανάστευση, και συσταλτικότητα [27], μπορούν να ενεργούν ως μηχανο μηχανήματα που ανταποκρίνονται στην ακαμψία του μικροπεριβάλλοντος. Για παράδειγμα, Rho και τελεστή Rho-κινάση του (ROCK) εμπλέκονται σε ένα βρόχο ανάδρασης που ρυθμίζει tubulogenesis σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε μαλακό 3-διαστάσεων μήτρες κολλαγόνου [28]. Όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πιο άκαμπτο, μήτρες υψηλής πυκνότητας, αυτός ο βρόχος ανάδρασης προκαλεί φωσφορυλίωση των FAK και ERK, με αποτέλεσμα την αύξηση στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό, πιθανώς με ΡΑΚ-εξαρτώμενη ενεργοποίηση Ras [20]. Ενώ αυτά τα πειράματα εμπλέκουν σαφώς το μονοπάτι Rho σε mechanotransduction σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, τα περαιτέρω πειράματα που απαιτείται για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της συσταλτικότητας και της δραστηριότητας ΟΤΡάσης Rho στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε μαλακό υποστρωμάτων, ιδιαίτερα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν μεταλλάξεις στο μονοπάτι Ras.

Όπως καταδεικνύεται στο παρόν έγγραφο, εξωκυτταρικό ακαμψία επηρεάζει την ανάπτυξη ορισμένων καρκινικών κυτταρικών σειρών, και την ικανότητα μιας κυτταρικής γραμμής να αυξάνονται σε μαλακό υπόστρωμα

in vitro

μπορεί να προβλέψει την ικανότητά του να αναπτύσσεται σε ένα μαλακό περιβάλλον

in vivo

. Επιπλέον, η απόκριση ενός κυττάρου γραμμής προς το εξωκυτταρικό ακαμψία

in vitro

μπορεί να προβλέψει την αντίδρασή της στην δεσμοπλαστικού απάντηση

in vivo

, δηλαδή, είτε σε αύξηση της ακαμψίας του μικροπεριβάλλοντος

in vivo

θα ευνοήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. μαλακή πλάκα προφίλ ανάπτυξης μιας κυτταρικής γραμμής μπορεί επίσης να προβλέψει την ευαισθησία του σε θεραπευτικά φάρμακα σε μαλακό ιστό. Για παράδειγμα, το DNA-σταυροσυνδέτη μιτομυκίνη C έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων πιο αποτελεσματικά σε άκαμπτα έναντι μαλακά υποστρώματα [29]. Επιπλέον, παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν επιθηλιακά δείκτες όπως Ε-καδερίνης και χαμηλότερα επίπεδα των μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη ανταποκρίνονται περισσότερο στη θεραπεία erlotinib [30], [31]. Επομένως, εάν μια κυτταρική σειρά (όπως Α549) ήταν να γίνει περισσότερο επιθηλιακά-όπως όταν καλλιεργούνται σε ένα μαλακό περιβάλλον, θα μπορούσε να προβλεφθεί να είναι πιο ευαίσθητα στις erlotinib. Η περαιτέρω μελέτη τόσο

in vitro

και

in vivo

θα χρειαστούν για να εξερευνήσετε την προβλεπτική ικανότητα του προσδιορισμού των μαλακών πλάκα στον καθορισμό απαντήσεις των καρκινικών κυττάρων στο

in vivo

μαλακών ιστών περιβάλλοντα και θεραπευτική δραστικότητα μέσα σε τέτοια περιβάλλοντα.

Cellular πλαστικότητα, ή η ικανότητα για τη μετάβαση εμπρός και πίσω ανάμεσα σε ένα άμισχα επιθηλιακών κυττάρων και των μεταναστευτικών μεσεγχυματικών κυττάρων, είναι μια καλά μελετηθεί φαινόμενο που είναι κρίσιμη για πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, περιλαμβάνουν την εμβρυονική ανάπτυξη, την επούλωση των πληγών, και την πρόοδο του καρκίνου. Ένα κοινό χαρακτηριστικό γνώρισμα για να EMT είναι μια ρύθμιση προς τα κάτω της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, κυρίως μέσω αναστολής της έκφρασης Ε-καδερίνης, και η απόκτηση ενός κινητικό φαινότυπο μαζί με αυξημένη έκφραση ορισμένων συστατικών υποδομής όπως βιμεντίνη. Ωστόσο, αυτή η μετάβαση δεν είναι πάντα πλήρης, καθώς υπάρχουν πολλά παραδείγματα κυττάρων τα οποία υποβάλλονται σε «μερική» ΕΜΤ στην οποία τα κύτταρα γίνονται κινητικά με παροδικά την απόκτηση ορισμένα αλλά όχι όλα τα χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών κυττάρων [32]. Αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα υφίστανται ΕΜΤ σε ένα πολύπλοκο και σταδιακό τρόπο, και δεν είναι απαραίτητες για την επίτευξη των μεταναστευτικών φαινότυπο όλα τα συμβάντα EMT.