Αφηρημένο

γιώτα πολυμεράσης Ανθρώπινο DNA (pol ι) διαθέτει υψηλή επιρρεπής σε λάθη λειτουργίες αντιγραφής του DNA και εκτελεί σύνθεση translesion DNA. Μπορεί να είναι εξειδικευμένη και αυστηρά ρυθμιζόμενη σε φυσιολογικά κύτταρα θηλαστικών. Απορύθμιση των pol ι μπορεί να συμβάλει στην απόκτηση ενός φαινοτύπου μεταλλάκτη. Ωστόσο, υπάρχουν μερικές αναφορές που περιγράφουν τη μεταγραφή του ρυθμιστικού μηχανισμού pol ι, και υπάρχει διαμάχη σχετικά με το ρόλο της στην καρκινογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, εκτελέσαμε το πείραμα διαγραφή και το σημείο-μετάλλαξη, EMSA, Chip, παρεμβολή RNA και ανάλυσης κηλίδος western για να αποδείξει ότι c-Jun ενεργοποιούνται από κινάση c-Jun Ν-τερματικό (JNK) ρυθμίζει τη μεταγραφή ροΙ ι σε φυσιολογικούς και καρκινικά κύτταρα. πρωτεΐνη ομάδα Pigmentosum ξηροδερμίας C (XPC) και αταξία-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη σχετική πρωτεΐνη (ATR) προωθούν την ενεργοποίηση νωρίς JNK σε απόκριση σε βλάβη του DNA και κατά συνέπεια αυξάνει την έκφραση του ροΙ ι, υποδεικνύοντας ότι η νέα ρόλος του μονοπατιού σήματος JNK εμπλέκεται σε βλάβη του DNA απάντηση. Επιπλέον, σχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα c-Jun, η υπερέκφραση του Ροΐ ι συσχετίζεται θετικά με το βαθμό κλινικής όγκου σε 97 δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης και μπορεί να συμβάλει στην hypermutagenesis. Το υπερεκφρασμένο pol ι-εμπλέκεται μεταλλαξογονία εξαρτάται από JNK /c-Jun μονοπάτι σε καρκινικά κύτταρα κύστης εντοπισμό από το ειδικό φάσματα μετάλλαξης. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι απορύθμιση των pol ι από JNK /c-Jun εμπλέκεται στην καρκινογένεση και προσφέρουν μια νέα κατανόηση του ρόλου του Πολ ι ή c-Jun σε μεταλλαξιγένεση

Παράθεση:. Yuan F, Xu Ζ, Γιανγκ Μ, Wei Q, Zhang Υ, Yu J, et al. (2013) υπερεκφράζεται DNA πολυμεράσης Γιώτα Ρυθμιζόμενη από JNK /c-Jun Συμβάλλει στην Hypermutagenesis στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (7): e69317. doi: 10.1371 /journal.pone.0069317

Επιμέλεια: Spencer B. Gibson, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα, Καναδά

Ελήφθη: 7 Μαρ 2013? Αποδεκτές: 12 Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26 Ιουλ 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (30770460) και του Στρατού Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (06H026). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cells χρησιμοποιούν οδούς επιδιόρθωσης του DNA για να διορθώσει αποτελεσματικά τα επιβλαβή αποτελέσματα της βλάβης του DNA. Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, δεν είναι όλα ζημιά μπορεί να επισκευαστεί άμεσα και διαθεσιμώς, η οποία επάγει την διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Για να ξεπεραστεί αυτό το μπλοκάρισμα να συνεχίσει τη σύνθεση της αυξανόμενης αλύσου του DNA, τα κύτταρα χρησιμοποιούν τους μοριακούς μηχανισμούς που επιτρέπουν τη σύνθεση του DNA translesion (TLS) για να προκύψει [1], [2]. TLS γίνεται από εξειδικευμένο πολυμεράσες του DNA, συμπεριλαμβανομένων πολυμεράσες Υ-οικογένειας DNA (pol ι, pol κ, pol η και REV 1), τα οποία παρουσιάζουν συνήθως υψηλά ποσοστά σφάλματος κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του DNA. Έχει αποδειχθεί ότι pol ι έχει τη χαμηλότερη πιστότητα στη διαδικασία TLS σε πολλούς τύπους αλλοιώσεων DNA

in vitro

και pol ι μπορούν επίσης να αναπαράγουν άθικτα DNA με χαμηλή πιστότητα [3].

Όπως αφορά τις επιρρεπής σε λάθη χαρακτηριστικά αντιγραφής του DNA του pol ι, απορύθμιση της pol ι μπορεί να συμβάλει στην απόκτηση του φαινοτύπου μεταλλάκτη που, μαζί με ελαττωματική έλεγχο του κυτταρικού κύκλου ή άλλων οδών γονιδιώματος σταθερότητα, θα μπορούσε να διευκολύνει για να επιταχυνθεί η εξέλιξη του όγκου. Έχουμε προηγουμένως ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού υπερεκφράζουν πρωτεΐνη ι pol, η οποία οδηγεί σε υν-επαγόμενης hypermutagenesis [4]. pol ι εμπλέκεται επίσης στην UV-επαγόμενη μεταλλαξογονία σε λέμφωμα και XPV κυτταρικές σειρές Burkitt [5], [6]. Επιπλέον, pol ι ήταν προκαταρκτικές βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε διάφορες πρωτογενείς ιστούς όγκων, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, της μήτρας, του στομάχου και του ορθού, αλλά υπάρχει έλλειψη του πολύτιμου κλινικών αποδείξεων [7]. Ωστόσο, ο ρόλος του Πολ ι στην καρκινογένεση παραμένει ασαφής και υπό συζήτηση [8] και μερικές αναφορές ανησυχούν για το ρυθμιστικό μηχανισμό του Πολ ι ή το δυναμικό μηχανισμό απορρύθμισης των pol ι στον καρκίνο. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να κάνουμε τις προσπάθειές μας για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ρύθμισης και για να καθορίσει την καρκινογένεση ρόλο του Πολ ι

in vivo

.

Ένα σημαντικό σηματοδοτικό μονοπάτι ενεργοποιείται σε απάντηση σε κυτταρικό στρες είναι ο ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ). Τρεις σημαντικές ΜΑΡΚ έχουν περιγραφεί: ο εξωκυτταρικό σήμα ρυθμιζόμενη κινάση (ERK), c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) και ρ38 μονοπατιών ΜΑΡΚ. Στόχοι της JNK οδού περιλαμβάνουν την πρωτεΐνη ενεργοποιητή 1 (ΑΡ-1) ομάδα παραγόντων μεταγραφής, όπως ο Jun, Fos και ATF μέλη της οικογένειας [9]. Παρ ‘όλα αυτά, c-Jun φωσφορυλιώνεται από ειδικά JNK παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε ποικίλες λειτουργίες του ΑΡ-1 συμπλόκου [10]. JNK μπορεί να ενεργοποιηθεί από κυτταρικά σήματα στρες που προκύπτει από φλεγμονώδεις κυτοκίνες και παράγοντες βλάβης του DNA, ενώ ΑΡ-1 μπορεί να επηρεάσει την απόκριση βλάβη κυτταρικό DNA με τη ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς ανταπόκρισης βλάβη του DNA [11], [12], [13]. Ο πρώην στοιχεία έχουν επίσης δείξει ότι η c-Jun συμβάλλει στην μεταμόρφωση και την ανάπτυξη όγκων και έχει ταξινομηθεί ως πρωτο-ογκογονιδίου [14]. JNK ενεργοποίησης έχει αποδειχθεί ως μια προϋπόθεση για την ανάπτυξη διαφόρων καρκίνων [15], [16], [17]. Ωστόσο, καμία μελέτη δεν έχει ακόμα αναφερθεί ότι αποσαφηνίζει το ρόλο της JNK /c-Jun μονοπάτι στο TLS και βλάβες στο DNA που προκαλούνται από hypermutagenesis. Επιπλέον, οι περισσότερες εκθέσεις που περιγράφουν την σηματοδότηση για την ενεργοποίηση του μονοπατιού JNK μετά από βλάβη του DNA έχουν επικεντρωθεί στην μεμβράνη των υποδοχέων που συνδέονται με την ενεργοποίηση της JNK. Ο τρόπος με τον οποίο μηχανισμών αντιμετώπισης των βλαβών του DNA συμβάλλει στην ενεργοποίηση JNK στον πυρήνα είναι προς το παρόν ασαφές.

Οι μελέτες μας παρέχει την απόδειξη ότι JNK /c-Jun οδός διαδραματίζει κρίσιμο μεταγραφή ρυθμιστικό ρόλο του Πολ ι. Τα δεδομένα που παρέχει, επίσης, μια νέα αντίληψη ότι JNK /c-Jun μονοπάτι εμπλέκεται σε TLS και hypermutagenesis. Διαπιστώσαμε ότι JNK /c-Jun μονοπάτι μπορεί να ενεργοποιηθεί με το κλειδί πρωτεΐνες βλάβες του DNA, XPC και ATR. Επιπλέον, η υπερέκφραση του pol ι βρέθηκε να σχετίζεται με την έκταση της φωσφορυλίωσης c-Jun στην κύστη καρκινικούς ιστούς και να σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου και hypermutagenesis που προσδιορίζονται από την ειδική φάσματα μετάλλαξης. Προτείνεται ότι απορυθμισμένη pol ι από JNK /c-Jun μπορεί να λειτουργήσει ως μεταλλάκτη. Ως εκ τούτου, γιώτα πολυμεράση DNA μπορεί να είναι μια πιθανή ένδειξη και στόχος για αντικαρκινική θεραπεία σε κακοήθη όγκο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η έρευνα εγκρίθηκε από την ηθική του σκάφους της ΝΔ Νοσοκομείο στην Τρίτη Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο (KY201016), και όλους τους συμμετέχοντες παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση.

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας

Τ24, κύτταρα καρκινώματος της ουροδόχου κύστης RT4 και τα κύτταρα ΗΕΚ293 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, McCoy 5Α ή ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS και ένα μίγμα των αντιβιοτικών, αντίστοιχα. Οι αναστολείς της JNK (SP600125), ρ38 (SB203580) και ERK1 /2 (PD98059) (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων για 2 ώρες. Η έκθεση των κυττάρων και πλασμιδίων σε υπεριώδες φως (254 nm) επιτεύχθηκε με ένα CL-1000 υπεριώδη σταυροσυνδέτη.

Κλινικά δείγματα και ανοσοϊστοχημεία

δείγματα ιστού ουροθηλιακά καρκίνωμα ελήφθησαν από 97 ασθενείς από την διουρηθρική της ουροδόχου κύστης εκτομή του όγκου και ριζική κυστεκτομή στο Νοσοκομείο Southwest. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 2008 και 2010. Οι ιστοί ανατεθεί παθολογική βαθμούς καρκινώματος ουροθηλιακά Ι, ΙΙ ή ΙΙΙ, σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ (1973). Οι, τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά αλκοολών, και υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη μέθοδο της ανοσοϋπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης. Ένα αντίσωμα ι αντι-pol (LS-B296? Διάρκεια ζωής Βιοεπιστημών, Seattle, WA, USA) και ένα αντίσωμα αντι-pc-Jun (SC-822? Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε αραιώσεις 1:200 και 1:100, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν και βαθμολογήθηκαν με εκτίμηση της ισχύος του σήματος αντίσωμα και εκτίμηση του ποσοστού των θετικά χρωματισμένων κυττάρων ουροθηλιακό καρκίνωμα [18]. Πέντε τυχαία πεδία του άποψη επιλέχθηκαν, και 100 κύτταρα ανά πεδίο αναλύθηκαν. Βαθμολόγησης εκτελέστηκε τυφλή, χωρίς κλινικά δεδομένα. Το σκορ έγινε καταλογογραφηθεί ως 1 βαθμολογία (ποσοστό θετικά χρωματισμένων κυττάρων & lt? 25%), 2 σκορ (25-50%), 3 σκορ (50-75%) και 4 βαθμολογία (& gt? 75%), αντίστοιχα. Εν τω μεταξύ, το σήμα λεκέ βαθμολογήθηκε ως ασθενές (1 βαθμολογία), μέτρια (2 σκορ) και ισχυρής (3 βαθμολογία), αντίστοιχα. Το ποσοστό βαθμολογίας πολλαπλασιάζοντας το σκορ σήμα ήταν το τελικό σκορ. Το τελικό σκορ ορίστηκε χαμηλό επίπεδο (& lt? 6 βαθμολογίας) και έντονο επίπεδο (& gt? 8 βαθμολογίας).

Δυτική

δοκιμασία κηλίδος

ίσες αναλογίες της κάθε κυττάρων κυτταρολύματος αναλύθηκαν με SDS-PAGE [19]. Τα αντισώματα που περιέχονται αντι-Pol ι (ab1324? Abcam, Inc., Cambridge, UK), αντι-XPC (ab6264? Abcam), αντι-ATR (SC-1887? Santa Cruz), αντι-c-Jun (SC- 44x? Santa Cruz), αντι-pc-Jun (SC-822? Santa Cruz), αντι-ρ-ΜΚΚ4 (BS4168? Bioworld, St. Louis Park, MN, USA), αντι-ρ-ΜΚΚ7 (4171? Cell Signaling τεχνολογία, Boston, MA, USA), αντι-ρ-JNK (SC-6254? Santa Cruz), αντι-ΙΝΚ (9252? Cell Signaling Technology), αντι-MKP-1 (SC-1102? Santa Cruz), και αντι -GAPDH (KC-5G4? Kangchen, Σαγκάη, Κίνα). Η έκφραση πρωτεΐνης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ SuperSignal West Pico (NCI4106? Pierce, Rockford, IL, USA). Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Το επίπεδο της έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικά με τη χρήση λογισμικού Scion εικόνα πυκνότητας (Scion Corporation, Frederick, MD).

Κατασκευή pGL3-

ΠΟΛΗ

διαγραφή και κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξιγένεση

το -2751 /+ 63, -1832 /+ 63, -1299 /+ 63, -685 /+ 63, -275 /+ 63, -208 /+ 63, -160 /+ 63 και -126 /+ 63 του DNA θραύσματα ανθρώπινης

ΠΟΛΗ

γονίδιο (σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής) ενισχύθηκαν από ΗΕΚ293 γονιδιωματικό DNA μέσω PCR. Μεταλλαξιογόνες εκκινητές σχεδιάστηκαν για την ιστοσελίδα c-Jun δέσμευσης στο πλαίσιο -275 /+ 63 με μια αναντιστοιχία 2 bp (με έντονα γράμματα και υπογραμμισμένα)? προς τα εμπρός: 5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 ‘και να αντιστραφεί: 5′-CTGCAACCTCTGCCTCCCGGATTCAAGC-3’. Τα ενισχυμένα προϊόντα PCR στη συνέχεια εισάγεται ο

ΚρηΙ

και

HindIII

θέσεις του pGL3-βασικό φορέα (Promega, Madison, WI, USA). Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA (Invitrogen, Σαγκάη, Κίνα).

Δοκιμασίες

Παροδική επιμόλυνση και λουσιφεράση

Τα κύτταρα (1 χ 10

5), είτε επιμολύνθηκαν με διαφορετικές υποκλωνοποιημένο πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης και pSV-β-γαλακτοσιδάσης ή συλλογικά επιμολυσμένα με pcDNA3.1-c-Jun με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine (Invitrogen). Οι pGL3-βασικό και κενούς φορείς pcDNA3.1 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Δοκιμασίας Λουσιφεράσης (E1500? Promega). Η pSV-β-gal (E2000? Promega) αναλύθηκε ως έλεγχος. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν, και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

ηλεκτροφορητικής δοκιμασίες μετατόπισης κινητικότητας

Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αλλά με ορισμένες τροποποιήσεις [20]. Τα ολιγονουκλεοτίδια σημάνθηκαν με βιοτίνη άκρο 3 ‘του DNA Labeling Kit (89818? Pierce). Τα επισημασμένα με βιοτίνη 29 oligos bp (5’-TGAGCCGGTATTGCGTCACTGTTGCCCAC-βιοτίνης-3 ‘? ΑΡ-1 που μοιάζει με θέση σύνδεσης αναφέρεται στην υπογραμμισμένη) και τα μεταλλαγμένα δίκλωνο 29 oligos bp (5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3’? Θέσης μετάλλαξης έντονη γραφή και υπογραμμισμένο) χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή για ειδική σύνδεση. Μη σημασμένα ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν για τον ανταγωνισμό. Το κιτ LightShift Χημειοφωταυγές EMSA (20148? Pierce) χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση των αντιδράσεων. Τα επισημασμένα oligos (20 fmol) επωάστηκαν με πυρηνικά εκχυλίσματα (4 μg) από κύτταρα ΗΕΚ293. Μετά την ηλεκτροφόρηση σε μη μετουσιωτικό 6% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, η γέλη ξηράθηκε και υποβλήθηκε σε χημική φωταύγεια. δοκιμασίες υπερμετατόπισης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αντι-c-Jun αντίσωμα (SC-44x? Santa Cruz) και IgG ποντικού. (SC-2025? Santa Cruz)

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης

τσιπ πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, μετά εγκάρσια σύνδεση με 1% φορμαλδεΰδη, τα κύτταρα ΗΕΚ293 λύθηκαν και υπερηχήθηκε. Πριν από την ανοσοκαταβύθιση με IgG ποντικού ή c-Jun (sc-44x, Santa Cruz) αντισώματα, ένα μικρό κλάσμα της χρωματίνης διασώθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος εισόδου. Η ειδική στόχευση θραύσμα DNA μετρήθηκε με ειδικούς εκκινητές (εμπρόσθιος: 5′-GCCGGTATTGCGTCACTGTT-3 ‘? Αντίστροφος: 5′-CAGAGTGACACGCATGCCAAGGAATCG-3’) για να ενισχυθεί το -236 /-61 περιοχής

POLI

γονίδιο.

Βιοπληροφορική ανάλυση

Περίπου 3.000 bp του 5 ‘πλευρική περιοχή του

POLI

αλληλουχία ελήφθη με τη χρήση του αλγόριθμου BLAST του Εθνικού Κέντρου πληροφοριών Βιοτεχνολογίας (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/και https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc). θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικού παράγοντα ταυτοποιήθηκαν με TRANSFAC επαγγελματική 8.1 του λογισμικού (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html). Μια ανάλυση πρόβλεψη υποστηρικτής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ηλεκτρονική βάση δεδομένων (https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)

πειράματα παρεμβολής RNA

c-Jun siRNA (SC-29223.? Santa Cruz), η οποία είναι μια ομάδα 4-στόχο ειδική 19-25 nt siRNAs, ATR siRNA (SC-29763? Santa Cruz), η οποία είναι μια ομάδα 3-στόχων ειδικών 19-25 nt siRNAs ή τον έλεγχο siRNA-α (SC- 37007? Santa Cruz) αραιωμένο σε μέσο επιμόλυνσης (SC-36868? Santa Cruz) μετασκευάστηκε σε κύτταρα με το αντιδραστήριο επιμόλυνσης (SC-29528? Santa Cruz). XPC-ειδικό shRNA (5′-GGATGAAGCCCTCAGCGAT-3 ‘) [22] και μη ειδικό έλεγχο shRNA συντέθηκαν και εισάγεται σε ένα φορέα λεντοϊού (Genechem, Σαγκάη, Κίνα), τότε τα μολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. Τα πειράματα ανεξάρτητα προσχηματισμένα τουλάχιστον τρεις φορές.

Ανίχνευση UVC μεσολάβηση μεταλλάξεις στο

SUPF

γονίδιο ανταποκριτή

Το πλασμίδιο pSupFG1 έχει περιγραφεί προηγουμένως [23], [ ,,,0],24]. Εν συντομία, το πλασμίδιο UV-κατεστραμμένο (10 μg) διαμολύνθηκε σε κύτταρα προεπεξεργασμένα με ή χωρίς SP600125. Το πλασμιδικό DNA απομονώθηκε μετά από 48 ώρες και μετατρέπεται σε ένα

E. coli

SY204 (lacZ πορτοκαλί) στέλεχος μέσω ηλεκτροπόρωσης στα 1800 V /20 mF. Η συχνότητα μετάλλαξης στο

SUPF

γονιδίου αναφοράς προσδιορίστηκε ως ο αριθμός των μεταλλαγμένων αποικιών (λευκό) σε πλάκες άγαρ διαιρώντας τον αριθμό των συνολικών αποικιών. Το φάσμα μετάλλαξη του

SUPF

γονιδίου σε λευκές αποικίες καταδείχθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τέσσερις φορές.

Real-time PCR

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ και μεταγράφηκε ανάστροφα για να δημιουργήσει cDNA (Invitrogen). καμπύλες Amplification παρήχθησαν με παρακολούθηση του φθορισμού του SYBR Green (Invitrogen). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση περιελάμβανε τα εξής: ΜΚΡ-1 προς τα εμπρός, 5′-GTACATCAAGTCCATCTGAC-3 ‘και αντίστροφος, 5′-GGTTCTTCTAGGAGTAGACA-3′? GAPDH προς τα εμπρός, 5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3 ‘και αντίστροφος, 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν, και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα συλλέχθηκαν τουλάχιστον εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SE). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων για πυκνομετρία μοριακής έκφρασης αναλύθηκαν με t-test του Student. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ της έκφρασης pol ι και παθολογικής ποιότητας των καρκινικών ιστών κύστης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ chi-square. Η συσχέτιση μεταξύ pol ι και της έκφρασης ρ-c-Jun αναλύθηκε με διμεταβλητή δοκιμή. λογισμικό SPSS13.0 χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή της στατιστικής ανάλυσης (p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική). Τα δεδομένα Ανοσοστύπωμα, EMSA και την ανάλυση των μαρκών είχε ως εκπρόσωπος της τουλάχιστον τρεις με πέντε ανεξάρτητες μελέτες με επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Αποτελέσματα

c-Jun είναι ένας κρίσιμος παράγοντας της μεταγραφής για

ΠΟΛΗ

γονίδιο

Λαμβάνοντας υπόψη τα πειραματικά στοιχεία έδειξαν ότι η αλλοιωμένη έκφραση pol ι μπορεί να σχετίζεται με hypermutagenesis και καρκινογένεση, έχουμε κατ ‘αρχάς να διευκρινίσει μηχανισμό ρύθμισης της μεταγραφής του. Για να χαρτογραφήσει την ελάχιστη δραστηριότητα υποκινητή και τις ρυθμιστικές αλληλουχίες, αναλύσαμε τα ανθρώπινα

POLI

γονίδιο από τη βιοπληροφορική και προσδιόρισε το βασικό υποκινητή του

POLI

γονίδιο με ένα υποθετικό AP-1

cis

-element. Μια σειρά διαγραφών στο 5 ‘πλευρικό περιοχή του

ΠΟΛΗ

γονίδιο υποκλωνοποιήθηκαν σε pGL3-βασικό φορέα (α λουσιφεράσης φορέα αναφοράς). Οι εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα 1. Οι δραστηριότητες αυτών των κατασκευασμάτων αξιολογήθηκαν με βάση την δραστικότητα της λουσιφεράσης μετά από παροδική επιμόλυνση σε κύτταρα ΗΕΚ293, ένα κοινά χρησιμοποιούμενο κύτταρα γραμμή ως κύτταρα εργαλείο. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η ελάχιστη

POLI

προαγωγός βρίσκεται στην περιοχή -275 /+ 63 (Εικ. 1Α). Περαιτέρω αναλύσεις έδειξαν ότι η περιοχή (-275 /-208) περιέχει ένα υποθετικό ΑΡ-1 που μοιάζει με δεσμευτική

cis

-element (TGCGTCA) στη θέση -228, το οποίο είναι παρόμοιο με το εξαιρετικά εξελικτικά συντηρημένη ΑΡ- 1 αλληλουχία δέσμευσης του TGAGTCA (Εικ. 1Β).

(Α) η δραστικότητα λουσιφεράσης των διαγραφών του 5 ‘πλευρικής περιοχής του

ΠΟΛΗ

γονίδιο ομαλοποιήθηκε με β-

gal

δραστηριότητα. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει τη μέση ± SD για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Σχηματική αναπαραστάσεις του περιφερικού

POLI

περιοχή του υποκινητή. (C) Μεταγραφική δραστηριότητες της διαγραφής ή μετάλλαξη του

POLI

υποκινητή. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την pGL3-275 /+ κατασκεύασμα 63MU pGL3-275 /+ 63 και (ρ & lt? 0,01? Έλεγχος τ). (D) Δοκιμασία EMSA. δοκιμασία (Ε) chip. Mouse IgG σαν αρνητικό δείγμα αναφοράς. Το DNA εισόδου ή καθόλου DNA που προστέθηκε ήταν το καθένα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός και μάρτυρα, αντίστοιχα.

Η

Επιπλέον, για να διευκρινίσει το ρυθμιστικό μεταγραφικό ρόλο αυτής της δέσμευσης

cis

-element , πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση μεταλλαξιγένεσης της περιοχής του

POLI

γονίδιο -275 /+ 63. Ένας φορέας που ορίζεται pGL3-275 /+ 63MU (ένα μεταλλαγμένο ΑΡ-1 που μοιάζει με μοτίβο πρόσδεσης) δομήθηκε με δύο σημειακές μεταλλάξεις (TGCcaCA). Περιέργως, η δραστικότητα λουσιφεράσης ήταν σοβαρά εξασθενημένη σε pGL3-275 /+ 63MU (Εικ. 1 C, αριστερή στήλη). c-Jun παίζει έναν κεντρικό ρόλο σε διάφορες λειτουργίες του συμπλόκου ΑΡ-1, ως εκ τούτου, έχουμε συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς ΗΕΚ293 κυττάρων με τα κατασκευάσματα και pcDNA3.1-c-Jun να προσδιοριστεί αν c-Jun θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την

ΠΟΛΗ

υποκινητή. Το αποτέλεσμα της συν-επιμόλυνσης αποκάλυψαν ότι λουσιφεράσης η πιο σημαντικά ενεργοποιείται σε pGL3-275 /+ 63, αν και pGL3-275 /+ 63MU και παρατηρήθηκε pGL3-208 /+ 63 πρέπει να αυξηθεί επίσης (Εικ. 1 C, δεξιά στήλη) . Είναι πιθανό ότι η αλληλουχία μπορεί να περιέχει επιπλέον ρυθμιστικά στοιχεία ελέγχεται έμμεσα από υπερεκφρασμένης c-Jun που δεν προσδιορίζονται από τη μελέτη μας. Παρ ‘όλα αυτά, τα δεδομένα μας εξακολουθούν να δείχνουν ότι η c-Jun αποτελεσματικά μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή του

POLI

γονίδιο

μέσω

το AP-1

cis

-element στη θέση -228.

για να βεβαιωθείτε ότι η c-Jun συνδέεται άμεσα με το μοτίβο στο

ΠΟΛΗ

υποκινητή, πραγματοποιήσαμε EMSA χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα ΗΕΚ293. Ένα μετατοπιστεί ταινία ήταν ειδικά που παράγονται και ανάλυση υπερμετατόπισης με ένα αντίσωμα αντι-c-Jun έδειξε ότι η ζώνη που περιέχουν πραγματικά c-Jun πρωτείνης (Σχ. 1D). Για να ληφθεί απόδειξη του c-Jun απευθείας σύνδεση με την περιοχή

in vivo

, Chip πραγματοποιήθηκε επίσης με ένα αντίσωμα αντι-c-Jun να καθιζάνει χρωματίνη από κύτταρα ΗΕΚ293 (Εικ. 1 Ε). Σε συνδυασμό με τα παραπάνω ευρήματα, c-Jun φαίνεται να συνδέεται άμεσα με το

ΠΟΛΗ

υποκινητή και συστατικά ενεργοποιούν την έκφραση του Πολ ι στα κύτταρα ΗΕΚ293.

Η υπερέκφραση του pol ι είναι εξαρτάται από ενεργοποιείται JNK /c-Jun

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι πολυμεράσες translesion DNA, συμπεριλαμβανομένων pol ι, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση της βλάβης του DNA. Μέχρι σήμερα, οι ορισμένους τύπους βλάβης του DNA η οποία είναι σε θέση να παρακαμφθεί από pol ι είναι ακόμα ασαφείς και αμφιλεγόμενες. Εξετάσαμε DNA βλάβη που προκαλείται από την έκφραση του ροΙ ι, η οποία δεν παρατηρήθηκε να επάγεται από ορισμένους τύπους βλάβης του DNA, συμπεριλαμβανομένων σισπλατίνη, μπλεομυκίνη και ετοποσίδη (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Ωστόσο, πολλοί αποδείξεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι ένα από τα κυρίαρχα χαρακτηριστικά του pol ι είναι η τάση να ενσωματώσει εσφαλμένα τα νουκλεοτίδια απέναντι ορισμένους τύπους βλαβών του DNA, οι οποίες περιλαμβάνουν διμερή κυκλοβουτανίου πυριμιδίνης και 6-4 πυριμιδίνης παραμόρφωση πυριμιδόνης φωτογραφία προσαγωγού βλάβης κατόπιν UV [8 ], [25]. Το πιο σημαντικό, έχουμε αποδείξει ότι pol ι μπορεί να προκληθεί σημαντικά κατά τη UV ζημία σε προηγούμενη μελέτη [4].

Για να καθοριστεί ο ρόλος των JNK /c-Jun στην pol ι-μεσολάβηση TLS, επιλέξαμε UV ακτινοβολία (UVC 254 nm) ως λειτουργία μελέτη της βλάβης του DNA. Για να προσδιορίσετε αν UV-επαγόμενης έκφρασης pol ι ελέγχεται από τη δραστηριότητα της JNK /c-Jun, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση του Πολ ι γρήγορα που προκαλείται από την έκθεση των κυττάρων ΗΕΚ293 με UVC φως 30 J /m

2 (α μεσαίο κατάλληλη δόση [26]) και παρέμεινε αυξημένη για 2-8 ώρες, η οποία ήταν η ταυτόχρονη με την ενεργοποίηση του c-Jun και JNK εξής UV ακτινοβολία (Εικ. 2Α). Η δραστηριότητα προαγωγέα του κατασκευάσματος pGL3-275 /+ 63 ήταν επίσης αυξημένη περίπου 3 φορές μετά από 2 ώρες UV ζημία στην ίδια δόση (Εικ. 2Β).

(Α) Η κινητική της pol ι, ρ -JNK και pc-Jun έκφρασης κάτω από τη UV ζημία στα κύτταρα ΗΕΚ293. (Β) Η επίδραση της UV ζημία σχετικά με τη δραστηριότητα του

POLI

περιοχή του υποκινητή. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την pGL3-275 /+ κατασκεύασμα 63MU pGL3-275 /+ 63 και (ρ & lt? 0,01? Έλεγχος τ). ** Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα κύτταρα που κατεργάστηκαν με ή χωρίς UV (ρ & lt? 0,01). (Γ) Η έκφραση του ροΙ ι, c-Jun και ρ-c-Jun σε RT4 και Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα. Η έκφραση του ροΙ ι παρατηρήθηκε σε κύτταρα (D) ΗΕΚ293, Τ24 και RT4 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις SP600125 καλλιεργήθηκαν για επιπλέον διαφορετικά χρονικά διαστήματα? κύτταρα (Ε) ΗΕΚ293 αντιμετωπίζονται με PD98059 ή SB203580? κύτταρα (F) ΗΕΚ293 σε επεξεργασία με ή χωρίς SP600125 και UV? κύτταρα (G) ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με siRNA-c-Jun επί 48 ώρες. Η μη-ειδική siRNA χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο. Πυκνομετρικές τιμές που αναφέρονται κάτω από κάθε πίνακα.

Η

Υπό το φως των ευρημάτων, επιδιώξαμε να επιβεβαιώσει εάν JNK /c-Jun είναι ο βασικός παράγοντας ρύθμισης της έκφρασης pol ι στο γενικό μηχανισμό. Συγκρίναμε την διαφορετική έκφραση του ροΙ ι, c-Jun και ρ-c-Jun σε RT4 (μια καλά διαφοροποιημένη κυτταρική γραμμή από χαμηλού βαθμού όγκου) και Τ24 (μια κυτταρική γραμμή που παριστάνεται μια υψηλού βαθμού επεμβατική όγκου) καρκινικών κυττάρων κύστης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, η έκφραση του ροΙ ι σε κύτταρα Τ24 ήταν αξιοσημείωτη υψηλότερη από ότι σε RT4, ενώ η έκφραση του c-Jun και της δραστηριότητας του ρ-c-Jun ενισχύθηκαν επίσης. Τα χρονικά ή δοσοεξαρτώμενη αναστολές της ροΙ Ι παρατηρήθηκαν σε ΗΕΚ293, Τ24 και RT4 καρκινικών κυττάρων κύστης προ-θεραπεία για 2 ώρες με ένα JNK-ειδικό αναστολέα (SP600125) (Εικ. 2D), αν και η έκφραση του ροΙ ι σε ΗΕΚ293 κύτταρα φάνηκε να αυξάνει κατά 48 ώρες. Μπορεί να είναι η αναστολή της SP600125 με τη δραστηριότητα της JNK που διαρκεί μόνο για 48 ώρες, οι οποίες προκαλούν την έκφραση του ροΙ Ι ανακτάται σε 48 ώρα μετά την αγωγή SP600125. Ως μάρτυρας, η έκφραση της βασικής pol ι δεν παρατηρήθηκε μεταβολή σε κύτταρα ΗΕΚ293 προεπεξεργασία με PD98059 και SB203580 (ειδικός αναστολέας της ERK και p38, αντίστοιχα) (Σχ. 2Ε). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της JNK /c-Jun μονοπάτι δεν είναι υπεύθυνη μόνο για την έκφραση pol ι σε κανονικά κύτταρα, αλλά επίσης συμβάλλει στο δυναμικό απορύθμιση του pol ι σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Δείξαμε επίσης ότι JNK /c-Jun επίσης ρυθμίζουν άμεσα την βασική και UV-επαγόμενη έκφραση του Πολ ι. Όταν τα κύτταρα ΗΕΚ293 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με SP600125 (20 μΜ), η έκφραση του ροΙ ι μειώθηκε στις 4 ώρες μετά την έκθεση υν 30 J /m

2 (Σχ. 2F). Και c-Jun knockdown μείωσε σημαντικά το βασικοκυτταρικό και UV-επαγόμενη έκφραση του ροΙ ι (Σχ. 2G). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του Ροΐ ι σε μεγάλο βαθμό εξαρτάται από την ενεργοποιημένη οδό JNK /c-Jun.

ATR και XPC προώθηση ρ-ΙΝΚ να ρυθμίζουν την έκφραση pol ι σε απόκριση σε υν βλάβη

το εύρημα μας από πάνω μας ώθησε να εξετάσει την ανάντη σηματοδότησης ΜΑΡΚ. Ένας ρόλος του DNA σηματοδότηση απόκριση βλάβη έχει προκύψει, η οποία μπορεί, εκτός από την πολύ γνωστή έμμεση μεμβράνη ή κυτταροπλασματική σηματοδότηση, ενεργοποιούν το μονοπάτι ΜΑΡΚ μέσω πυρηνικών σηματοδότηση [27]. Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει την υπόθεση ότι JNK /c-Jun μονοπάτι υπεύθυνο για έκφραση pol ι υν-επαγόμενης μπορεί επίσης να ρυθμίζεται από την απόκριση βλάβης DNA. Αξιολογήσαμε τη δράση των πρωτεϊνών απόκριση βλάβης DNA XPC και ATR σχετικά με το βαθμό φωσφορυλίωσης της JNK και της έκφρασης ροΙ ι με βλάβη UV. Με siRNA-ATR ή shRNA-XPC, η σιωπή ΗΕΚ293 και κύτταρα Τ24 δύο εξέφρασαν χαμηλότερα επίπεδα pol ι μετά από τη UV ζημία, και π-JNK ήταν αντίστοιχα μειωμένη. Αντίθετα, με την απουσία της βλάβης UV, η έκφραση του ροΙ ι ή π-JNK ήταν δεν μεταβάλλονται σημαντικά από ATR και της αναστολής XPC, αν και παρατηρήθηκε η π-ΙΝΚ να αυξηθεί ελαφρώς κατά shRNA φακοϊό σύστημα (Σχ. 3Α, 3Β, 3C και 3D). Αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να εξηγηθεί από την πιθανή ειδική αντίδραση κυτταρικό στρες του λεντοϊού συστήματος. Έτσι, ATR και XPC εμπλέκονται σε UV-επαγόμενη σηματοδότηση της JNK, οι οποίες ρυθμίζουν την έκφραση του ροΙ ι σε φυσιολογικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα κύστης.

έκφραση πρωτεΐνης ερευνήθηκε σε διαφορετικά κύτταρα με διαφορετική μεταχείριση. (Α) κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με siRNA-ATR. κύτταρα (Β) ΗΕΚ293 μολυνθεί με shRNA-XPC. κύτταρα (C) Τ24 επιμολυσμένα με siRNA-ATR. κύτταρα (D) Τ24 μολύνθηκαν με shRNA-XPC. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση της έκφρασης του ΜΚΡ-1 σε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα κύτταρα ΗΕΚ293 με siRNA-c-Jun, siRNA-ATR ή shRNA-XPC? επίπεδα GAPDH mRNA προσδιορίστηκαν ως ένας εσωτερικός έλεγχος. * Στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με κύτταρα ΗΕΚ293 με ή χωρίς αγωγή (ρ & lt? 0,01? T-test του Student). (F) ΜΚΡ-1 έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα ΗΕΚ293 σε επεξεργασία με siRNA-ATR ή shRNA-XPC. Η μη ειδική siRNA ή μη-ειδική shRNA-lentivirus χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο. Πυκνομετρικές τιμές που αναφέρονται κάτω από κάθε πίνακα.

Η

Στο κανονιστικό δίκτυο ΜΑΡΚ, JNK είναι φωσφορυλιωμένη και ενεργοποιείται από τις MAPKKs διπλής ειδικότητας, συμπεριλαμβανομένων ΜΚΚ4 /SEK1 και ΜΚΚ7. Παρατεταμένη δράση JNK έχει αποδοθεί στην εξασθενημένη αποφωσφορυλίωση της JNK ΜΑΡ κινάσης με φωσφατάση 1 (MKP-1) [28]. Να εκτιμήσει πώς ATR και XPC ενεργοποιούν το μονοπάτι JNK, ερευνήσαμε αν ΜΑΡΚΚ σηματοδότηση ρυθμίζονται από ATR και XPC σε απάντηση UV ζημία. Έχουμε καθορίζεται πρώτα την έκταση της φωσφορυλίωσης UV που προκαλείται από ΜΚΚ4 και ΜΚΚ7. Σε σχέση με τα κύτταρα άγριου τύπου, δεν υπάρχει σαφής μεταβολή παρατηρήθηκε για την έκφραση της ρ-ΜΚΚ4 ή ρ-ΜΚΚ7 σε ATR- και XPC-σιγήσει κύτταρα ΗΕΚ293 και Τ24? Αυτό μπορεί να μειώσει την πιθανή εμπλοκή της ATR και XPC σε απευθείας ενεργοποίηση ΜΑΡΚΚ σηματοδότησης (Εικ. 3Α, 3Β, 3C και 3D), ενώ η έκφραση του ΜΚΡ-1 ήταν σημαντικά αυξημένη στο ATR- και XPC-σιγήσει κύτταρα ΗΕΚ293 μετά από βλάβη UV (Σχ. 3Ε και 3F). Συλλογικά άλλα αποτελέσματα, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη απάντηση βλάβες στο DNA ATR και η επιρροή XPC JNK οδού και ρυθμίζουν τη μεταγραφή του Πολ ι με τη μείωση του ανασταλτικού σήματος MKP-1 αντί για την ενεργοποίηση ΜΚΚ4 και ΜΚΚ7

Η αυξημένη έκφραση του Πολ. ι συνδυάζεται με δραστικότητα του c-Jun και κακοήθεια στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης ανθρώπινο

ουροθηλιακά κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε πολλούς τύπους αντιδραστηρίων βλάβης του DNA οι οποίες είναι παρούσες στα ούρα από βιομηχανικές αρωματικές αμίνες, ο καπνός του τσιγάρου και την αφομοίωση των χημικών φάρμακα [29]. Δυσλειτουργία της απόκρισης βλάβης του DNA έχει ενοχοποιηθεί ως κρίσιμος παράγοντας που διέπουν την εμφάνιση της γενετικής αστάθειας στην ουροφόρων καρκινογένεση. Επιπλέον, pol ι οποίων είναι η τάση να ενσωματώσει εσφαλμένα τα νουκλεοτίδια απέναντι αλλοιώσεων του DNA ανώμαλη έκφραση σε πολλούς καρκίνους, αν και οι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Κατά συνέπεια, κάναμε μια προσπάθεια να διαπιστωθεί αν pol Ι παίζει το δυναμικό μεταλλαξιογόνες ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης η οποία είναι υψηλή ετερογένεια και υποτροπής [29]. Εξετάσαμε την έκφραση του Pol ι σε ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης 97 με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. pol ι πρωτεΐνη εντοπισμένη κυρίως σε πυρήνες, και παρατηρήθηκε μια μικρή ποσότητα στο κυτταρόπλασμα. Αυτό το αποτέλεσμα έδειξε ότι η έκφραση pol ι ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους της ουροδόχου κύστης υψηλής ποιότητας από ό, τι σε όγκους χαμηλής κακοήθειας (Σχ. 4Α). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι υπήρχε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης pol ι και το παθολογικό βαθμό ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης (Πίνακας 2? P & lt? 0,01). έκφραση pol ι παρατηρήθηκε επίσης να είναι αυξημένα σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τις πλευρές καρκίνωμα ιστούς με κηλίδωση Western (Εικ. 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του ροΙ ι μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της κακοήθειας και την εξέλιξη των ουροφόρων καρκινωμάτων.

(Α) ροΙ Ι πρωτεΐνη εκφράζεται μη φυσιολογικά σε διαφορετικό βαθμό όγκου σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ. Α1 είναι Ι-βαθμού του όγκου? Α2 είναι ΙΙ βαθμού του όγκου? Α3 είναι ΙΙΙ βαθμού όγκου (× 400 μεγέθυνση). (Β) Η έκφραση του Πολ ι σε 5 ζεύγη των πλευρών καρκινώματος της ουροδόχου κύστης και καρκινικούς ιστούς. «Ν» εκπροσωπήθηκε πλευρές καρκίνωμα ιστού, «C» εκπροσωπήθηκε καρκινικό ιστό. Πυκνομετρικές τιμές που αναφέρονται κάτω από κάθε πίνακα. (C) Εκπρόσωπος περιπτώσεις της αντιστοιχίας του Πολ ι και την έκφραση p-c-Jun στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. C1 και C2 αντιστοίχως έδειξαν την υψηλή έκφραση του ροΙ ι και ρ-c-Jun σε ζεύγη απλή. C3 και C4 ήταν η χαμηλή έκφραση σε άλλα ζεύγη (× 100 και 400 × μεγέθυνση).

Η

Για να προσδιορίσετε αν η υπερέκφραση του Πολ ι αποτελέσματα από την κακή ρύθμιση της c-Jun ενεργοποίηση της JNK /

in vivo

, αναλύσαμε της αντιστοιχίας των αυξημένων ι pol και ανώμαλη δραστικότητα c-Jun στους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Έχουμε επιλέξει τυχαία 41 ιστούς παραφίνης όγκου της ουροδόχου κύστης από συνολικά 97 δείγματα ασθενών. Το επίπεδο της p-c-Jun ήταν ως επί το πλείστον σε συμφωνία σχετικά με την έκφραση του Pol ι (Εικ. 4C). Η έκφραση της p-c-Jun συσχετιζόταν θετικά με την έκφραση αυξημένα pol ι σε καρκίνους της ουροδόχου κύστης (Πίνακας 3? R = 0,662, p & lt? 0,01). Το αποτέλεσμα ενισχύει το συμπέρασμα ότι c-Jun ρυθμίζει θετικά την έκφραση pol ι και προτείνει ότι ανώμαλη pc-Jun συμβάλλουν στην απορρυθμισμένη έκφραση pol ι εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Η

Η υπερέκφραση του pol ι ενεργοποιημένου από JNK /c-Jun προωθεί UV που προκαλείται από hypermutagenesis στα κύτταρα Τ24

Για να αξιολογηθεί η σημασία της υπερέκφραση του Πολ ι και pc-Jun

in vivo

, εξετάσαμε τη δυνατότητα hypermutagenic ρόλο στην καρκινικών κυττάρων κύστης.