Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών, ένας από τους καρκίνους που σχετίζεται με φλεγμονή, είναι η πέμπτη κύρια αιτία του καρκίνου των θανάτων μεταξύ των γυναικών. Η φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον του όγκου συνδέεται με περιτοναϊκή διάχυση του όγκου και μαζική ασκίτη, τα οποία συμβάλλουν στην υψηλή θνησιμότητα στον καρκίνο των ωοθηκών. Όγκων καταστολέας ρ53 συχνά μεταλλάσσεται διαγραφεί ή σε επιθετική και υψηλής ποιότητας καρκίνο των ωοθηκών, πιθανώς επιδεινώνοντας την εξέλιξη του καρκίνου και την αύξηση της θνησιμότητας. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η επίδραση της ρ53 επί προφλεγμονωδών χημειοκίνες στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ένα PCR συστοιχία δικτύου χημειοκίνης αποκάλυψε ότι ωοθηκών καρκινικά κύτταρα με χαμηλή έκφραση ή μεταλλαγμένο ρ53 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών χημειοκινών όπως CXCL1, 2, 3 και 8. Η παροδική επιμόλυνση των p53 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών ρ53-ηυΙΙ μειωτικά προφλεγμονωδών χημειοκίνες που επάγεται από παράγοντα νέκρωσης όγκου-α (TNF), μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη εκφράζεται σε αφθονία στον καρκίνο των ωοθηκών. Περαιτέρω, αποκατάσταση ρ53 ή σταθεροποίηση μπλοκαριστεί δραστικότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ επαγόμενη από τον TNF και μειωμένη TNF-ενεργοποιημένη ΙκΒ. Αποκατάσταση των ρ53 αυξήθηκε ουβικουϊτινίωση της ΙκΒ, που προκύπτει από ταυτόχρονα μειωμένη δραστικότητα πρωτεασώματος που ακολουθείται από τη σταθερότητα της ΙκΒ. Μια ουμπικουιτίνωση PCR σειρά για την αποκατάσταση της p53 δεν αποκάλυψε καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση εκτός από την Mdm2, υποδεικνύοντας ότι η ισορροπία μεταξύ των p53 και Mdm2 είναι πιο σημαντική στη ρύθμιση του NF-κΒ σηματοδότηση παρά το άμεσο αποτέλεσμα της p53 σε γονίδια ουβικιτίνης που σχετίζονται με ή ΙκΒ κινασών. Επιπλέον, νουτλίνη-3, ένα συγκεκριμένο επαγωγέα σταθεροποίησης ρ53, αναστέλλεται προφλεγμονωδών χημειοκίνες με τη μείωση ΤΝΡ-ενεργοποιημένα ΙκΒ μέσω σταθεροποίησης ρ53. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ρ53 αναστέλλει προφλεγμονωδών χημειοκίνες στα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών, μειώνοντας την υποβάθμιση του πρωτεασώματος της ΙκΒ. Έτσι, η συχνή απώλεια ή μετάλλαξη του p53 μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου με την ενίσχυση της φλεγμονής στο μικροπεριβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Γιος DS, Kabir SM, Dong YL, Lee Ε, Adunyah SE (2012) ανασταλτική επίδραση του Ογκοκατασταλτικής p53 σε Προφλεγμονώδεις έκφρασης χημειοκινών στον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα από τη μείωση του πρωτεασώματος Υποβάθμιση της ΙκΒ. PLoS ONE 7 (12): e51116. doi: 10.1371 /journal.pone.0051116

Επιμέλεια: Ashok Kumar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2012 |

Copyright: © 2012 Son et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας NIAID SC1AI089073 (DS), NIGMS SC1 089.630 (EL), NCI U54CA163069-02 και NIMHD U54MD007593-04 (Α.Ε.) από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πέμπτη συχνότερη αιτία των θανάτων από καρκίνο μεταξύ των γυναικών, διότι είναι συνήθως ασυμπτωματική και συχνά διαγιγνώσκεται αργά έως ότου οι όγκοι έχουν εξαπλωθεί πολύ πέρα ​​από τις ωοθήκες [1]. Αν και η ακριβής αιτιολογία παραμένει άγνωστη, αύξουσες ενδείξεις δείχνουν ότι ο καρκίνος των ωοθηκών σχετίζεται με χρόνια φλεγμονή [2] – [3]. Ωοθηκών καρκινικό ιστό εκφράζει υψηλά επίπεδα CXCL1? Ομοίως, τα επίπεδα της CXCL1 πλάσμα είναι υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών από τους ελέγχους [4] – [5]. Σύνθετη (λιγότερο διαφοροποιημένη) τον καρκίνο των ωοθηκών υπερεκφράζουν επίσης CXCL8 στην κύστη ρευστά [6] και τα καρκινικά κύτταρα [7]. Ωοθηκών ασκητικό υγρό καρκίνωμα έχει επίσης βρεθεί να περιέχουν υψηλά επίπεδα CXCL8 [8]. Επιπλέον, η πακλιταξέλη-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ωοθηκών εκφράζουν αυξημένα CXCL8 σε σύγκριση με πακλιταξέλη-ευαίσθητα κύτταρα [9]. Φλεγμονώδη αντίδραση επάγει κυρίως προφλεγμονωδών χημειοκινών όπως CXCL1, 2 και 8 μέσω του NF-κΒ σηματοδότηση σε ωοθηκών επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα [10]. Επίσης προφλεγμονώδεις μικροπεριβάλλον του όγκου είναι γνωστό για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, αυτοί οι παράγοντες μαζί πιθανό συμβάλλουν στα κλινικά χαρακτηριστικά του καρκίνου των ωοθηκών που προκαλούν υψηλή θνησιμότητα, όπως περιτοναϊκή διάχυση του όγκου και η μαζική ασκίτη

Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο αυξορρύθμιση των προφλεγμονωδών χημειοκινών στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένει άγνωστη.? μια πιθανή αιτία είναι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ που προκύπτει από την απώλεια της καταστολής του όγκου ρ53. Γενετικές αλλοιώσεις σε p53 όπως μετάλλαξη και διαγραφής που παρατηρείται συχνά σε υψηλής ποιότητας κακοήθη καρκίνο των ωοθηκών [11]. Συσσωρευμένες στοιχεία δείχνουν ότι η ρ53 καταστέλλει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ) [12] – [14] ή ο ανταγωνισμός για μεταγραφική συνενεργοποιητές p300 /πρωτεΐνης CREB δέσμευσης (CBP) [15] – [17]. Είναι ενδιαφέρον, άλλοι έχουν βρει ότι η ρ53 προάγει ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [18] – [19]. Παρά αμφιλεγόμενα αποτελέσματα της ρ53 επί του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση, μεταλλάξεις ή διαγραφές της ρ53 μπορεί να επιδεινώσει την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών με βάση το γεγονός ότι τα ποντίκια με ανεπάρκεια για ρ53 είναι επιρρεπείς να αναπτύξουν καρκίνο του [20]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι η λειτουργική απώλεια της ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να αυξήσει την έκφραση των προφλεγμονωδών χημειοκινών από τον de-περιορίζοντας ΝΡ-κΒ σηματοδότηση.

Στη μελέτη αυτή αποκαθίσταται ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα να προσδιοριστεί η επίδρασή του επί προφλεγμονώδεις έκφραση χημειοκίνης σε απόκριση σε φλεγμονώδη ερεθίσματα. Περαιτέρω, ερευνήσαμε το μηχανισμό με τον οποίο αυτό μπορεί να συμβεί με τη μέτρηση αποικοδόμηση της ΙκΒ, τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος, και η έκφραση της Mdm2, ένας αρνητικός ρυθμιστής της ρ53 και μία λιγάση ουμπικουϊτίνης Ε3.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TNF και ανθρώπινης ρ53 κιτ DuoSet® IC ELISA ελήφθησαν από την Κ & amp? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Τα αντισώματα αγοράστηκαν από τους ακόλουθους πωλητές: p65, Mdm2 και β-ακτίνης από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) και ρ53, ρ21, φωσφορυλιωμένο ΙκΒ, ΙκΒ, ουβικιτίνη και ισομορφές ΙΚΚ από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Lipofectamine 2000, TRIzol®, M-MLV, Taq DNA πολυμεράση, και όλα τα μέσα υγρής καλλιέργειας αποκτήθηκαν από την Invitrogen (Grand Island, ΝΥ). Η PCR Array για προσαρμοσμένες ανθρώπινη χημειοκινών και πανταχού παρόντες δρόμους, εκκινητές PCR για CCL20, CXCL1, 2, 3, 8 και β-ακτίνη, και SYBR® Πράσινη Master Mix προήλθε από SABiosciences /Qiagen (Frederick, MD). Νουτλίνη-3 αγοράστηκε από την Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Χημειοφωταύγειας κιτ ανίχνευσης προήλθε από την GE Healthcare (Piscataway, NJ). Η έκφραση ρ53 και PNF-κΒ-Luc φορείς προήλθε από την BD Biosciences (Palo Alto, CA). Η Δοκιμασία σύστημα προσδιορισμού και Proteasome λουσιφεράσης ελήφθησαν από την Promega (Madison, WI).

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Οι ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών OVCAR-3, SKOV-3, CaOV -3 και TOV-21G αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Α2780 και IGROV-1 κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών με p53 ευγενικά από τον Dr. Andrew Godwin (Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase, Φιλαδέλφεια, PA) [21] και ο Δρ Khabele (Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, TN) [22], αντίστοιχα. Ανθρώπινα κύτταρα (περίπου 5 × 10

4 κύτταρα /ml) καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε νερό-κορεσμένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO-καλά 6 πλάκες

2 σε 24- ή με μέσο RPMI που περιείχε 10% FBS με πενικιλίνη (100 U /ml) /στρεπτομυκίνη (100 U /ml). Η επιφάνεια επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών κυτταρική σειρά ποντικού (ID8) παρασχέθηκε ευγενώς από τους Drs. Katherine Roby και Παύλου Terranova (Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Kansas City, KS) [23]. κύτταρα ID8 καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagles Medium (DMEM) που περιέχει 4% FBS συμπληρωμένο με πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. Μετά από ολονύκτια καλλιέργεια για να επιτρέψει την κυτταρική προσκόλληση προς τις πλάκες, το μέσο αφαιρέθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο χωρίς FBS την εξάλειψη των επιπτώσεων του ορού.

array PCR και πραγματικού χρόνου PCR

Μετά την απομόνωση ολικού RNA και την εξάλειψη γονιδιωματικό DNA, η αντίδραση RT πραγματοποιήθηκε στους 42 ° C για 15 λεπτά που ακολουθείται από 94 ° C για 5 λεπτά. Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, σε πραγματικό χρόνο PCR αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad CFX96 (Hercules, CA) υπό τις ακόλουθες πρόγραμμα ποδηλασίας σε δύο στάδια: 1 κύκλος στους 95 ° C για 10 λεπτά, και 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και στους 60 ° C για 1 λεπτό. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με βάση μια web-based PCR Array πρωτόκολλο Ανάλυση Δεδομένων (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) που παρέχονται από SABiosciences σε Qiagen (Frederick, MD).

Παροδική επιμόλυνση και λουσιφεράση δοκιμασίες

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών σε περίπου 50% συρροή σε 6 ή 24-φρεατίων πλύθηκαν μια φορά με φρέσκα μέσα χωρίς πρόσθετα και επιμολύνθηκαν παροδικά για 24 ώρες στους 37 ° C χρησιμοποιώντας διάλυμα Lipofectamine. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Αποτελέσματα και επωάστηκαν για 6 ώρες. Μετά από ξέπλυμα των κυττάρων με παγωμένο PBS και προσθήκη ρυθμιστικού λύσης (Promega, Madison, WI), λύματα κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο μικροπλάκας. Η δραστικότητα λουσιφεράσης, που εκφράζεται ως σχετικές μονάδες φωτός, ομαλοποιήθηκε να μετρώνται τα επίπεδα της πρωτεΐνης.

κηλίδος Western

Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, διαχωρίστηκαν σε SDS-πολυακρυλαμιδίου πηκτές, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης σύμφωνα με καθιερωμένες διαδικασίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Δέσμευση μη ειδικών πρωτεϊνών διεξήχθη με επώαση των μεμβρανών με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα Tween-20 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε αραίωση 1:1,000 εντός διαλύματος αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές με TBST για 10 λεπτά και επωάστηκαν για 1 ώρα με χρένο δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση σε 1:2,500 σε 5% γάλα /TBST. Οι μεμβράνες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές με TBST για 10 λεπτά και οι ζώνες κατέστησαν ορατές με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Μετά την απογύμνωση για 10 λεπτά με μεθανόλη που περιέχει μεμβράνη 3% Η

2O

2, β-ακτίνη ανιχνεύθηκε προκειμένου να χρησιμεύσει ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

Ανοσοκαθίζηση (ΙΡ) και ανοσοκηλίδωση (ΙΒ )

τα κυτταρικά λύματα (1000 μg ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης /ml) παρασκευάστηκαν και επωάστηκαν με 10 μΙ πρωτεύοντος αντισώματος για 2 ώρες στους 4 ° C. Στη συνέχεια, 20 μΙ πρωτεΐνης Α /G PLUS-Αγαρόζης προστέθηκε και κυτταρολύματα επωάστηκαν στους 4 ° C σε ένα ταλαντωτή για όλη τη νύχτα. Τα ιζήματα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση σε περίπου 1000 χ

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από προσεκτική απόρριψη υπερκειμένου, τα σφαιρίδια πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό RIPA με φυγοκέντρηση στα περίπου 1000 χ

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Μετά την τελική πλύση, τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 40 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος 2 Χ ηλεκτροφόρηση και έβρασαν για 2 λεπτά. Ηλεκτροφόρηση και ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Western Blot

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

δραστικότητα Ανθρώπινα ρ53 μετρήθηκε με την ανθρώπινη ρ53 κιτ ELISA (R &?. D Systems, Minneapolis, ΜΝ ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η οπτική πυκνότητα εκάστου φρεατίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας οριστεί σε 450 nm με διόρθωση μήκους κύματος στα 570 nm.

τηλέφωνα που βασίζονται πρωτεασώματος δοκιμασία

μετά από παροδική επιμόλυνση των ρ53 σε 24 φρεατίων πλάκες, τα κύτταρα επωάστηκαν με Αντιδραστήριο Προσδιορισμού την Promega πρωτεασώματος-Glo ™ τύπου χυμοθρυψίνης βάση τα κύτταρα (Promega, Madison, WI) για 10 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο μικροπλάκας.

Στατιστικά

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το αντιστοιχισμένο του Student

t-test

και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) όπως ενδείκνυται . Εάν στατιστική σημασία (p ≤ 0,05) καθορίστηκε με ΑΝΟνΑ, τα δεδομένα αναλύθηκαν περαιτέρω με σύγκριση ανά ζεύγος του Tukey για την ανίχνευση ειδικών διαφορές μεταξύ των αγωγών.

Αποτελέσματα

Υπογραφή δικτύου χημειοκίνης και ρ53 σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Ως προκαταρκτική δοκιμή του εάν η απώλεια της ρ53 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αυξάνει την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτοκινών, εξετάσαμε την έκφραση των χημειοκινών και ρ53 στις καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών ID8, OVCAR-3, SKOV-3 , Α2780, CaOV-3 και TOV-21G. Χρησιμοποιήσαμε μια σειρά PCR για το δίκτυο χημειοκινών, η οποία περιλαμβάνει γονίδια για χημειοκινών και των υποδοχέων χημειοκινών, και καθορίζεται κατά μέσο όρο τα κατώτατα όρια του κύκλου από & lt? 25 κύκλο & gt? 35 κύκλους. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν υψηλή έκφραση των χημειοκινών στις ακόλουθες κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών: CCL20 και 28, CXCL1, 2, 3 και 8 σε OVCAR-3 κύτταρα? CCL28 και CXCL1 σε SKOV-3 κύτταρα? CXCL1, 2 και 8 σε CaOV-3 κύτταρα? και CXCL2 σε κύτταρα TOV-21G (Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον Α2780 κύτταρα δεν εκφράζουν ή εκφράζονται χαμηλά επίπεδα σχεδόν όλα χημειοκινών σε σύγκριση με άλλες ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω, CCR1 και CXCR4 έχουν υψηλή έκφραση σε Α2780 και CaOV-3 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικόνα 1Β). Ακόμη και ρ53 άγριου τύπου κύτταρα IGROV-1 εκφράζεται εξαιρετικά CXCL3, CXCL14, CCR10 και CXCR4 (Σχήμα S1A).

(Α) Υπογραφή συνδετών χημειοκίνης και (Β) υποδοχέων χημειοκινών σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Μετά την απομόνωση ολικού RNA από κάθε κυτταρική σειρά, η σειρά PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο πλάκα συστοιχία PCR που περιέχει συμπληρωματικές αλληλουχίες για τα γονίδια του ανθρώπου χημειοκίνης. Διαφορετικά χρώματα δείχνουν τα όρια μέσης κύκλου κυμαίνεται έκφραση από & gt? 35 σε & lt? 25. (Γ) Η πρωτεϊνική έκφραση του p53 και Mdm2 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ρ53, Mdm2 και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάζεται. OV, OVCAR-3 κύτταρα? SK, SKOV-3 κύτταρα? Α, Α2780 κύτταρα? Ca, CaOV-3 κύτταρα? TOV, κύτταρα TOV-21G.

Η

Επιπλέον, αναλύσαμε τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 και Mdm2 στις ίδιες κυτταρικές σειρές. OVCAR-3 κύτταρα υψηλής έκφρασης πρωτεΐνη ρ53, ενώ ID8 και κύτταρα Α2780 εξέφρασαν σχετικά χαμηλότερα επίπεδα ρ53. Σαφώς, SKOV-3, CaOV-3, και TOV-21G κύτταρα δεν εκφράζουν ρ53. Εξετάσαμε επίσης την έκφραση του Mdm2, ένας αρνητικός ρυθμιστής της ρ53. Mdm2 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε Α2780 και OVCAR-3 κύτταρα σε αντίθεση με καμία έκφραση σε ID8 και CaOV-3 κύτταρα (Σχήμα 1 C). SKOV-3 και TOV-21G κύτταρα εξέφρασαν Mdm2 παρά την απώλεια του ρ53 (Εικόνα 1C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ρ53 είναι είτε απουσιάζει ή εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα στις περισσότερες κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν.

Επίδραση του ρ53 σε επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών

TNF είναι μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη εκφράζεται σε αφθονία στον καρκίνο των ωοθηκών [24]. Έχουμε επιλέξει SKOV-3 κύτταρα ως ρ53-ηυΙΙ μοντέλο καρκινικού κυττάρου ωοθήκης για τον εντοπισμό αποκρίνεται χημειοκίνες στον TNF. TNF ειδικά επαγόμενη χημειοκινών προφλεγμονώδεις όπως CCL20, CXCL1, 2, 3 και 8 (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, παροδικά επιμολυσμένα ρ53 σε SKOV-3 κύτταρα για να μετρηθεί η επίδραση της ρ53 επί επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών (Σχήμα 2Β). Αποκατάσταση των p53 σε SKOV-3 κύτταρα οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση των προφλεγμονωδών χημειοκινών, τόσο σε βασικά και τα επίπεδα του TNF που επάγεται (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η λειτουργική απώλεια της ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να αυξήσει την έκφραση των προφλεγμονωδών χημειοκινών, με αποτέλεσμα να φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

(Α) επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών σε SKOV-3 κύτταρα. Μετά την απομόνωση ολικού RNA, συστοιχία PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη πλάκα συστοιχία χημειοκίνης PCR. Διακεκομμένη γραμμή δείχνει 2-πλάσια αύξηση? Οι χημειοκίνες με αύξηση μεγαλύτερη από 2 φορές αναγνωρίζονται ως επαγόμενη από τον TNF χημειοκίνες. (Β) Επιβεβαίωση της έκφρασης πρωτεΐνης ρ53 μετά από παροδική επιμόλυνση σε SKOV-3 κύτταρα. Μετά την επιμόλυνση του κενού φορέα (ΕΜ) και φορέα έκφρασης p53 (p53), προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και έκφραση ρ53 επιβεβαιώθηκε με στύπωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Επίδραση του ρ53 σε επαγόμενη από τον TNF χημειοκίνες. Μετά από ολονύκτια επιμόλυνση φορείς, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF (10 ng /ml) για 1 ώρα και qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές για CCL2, CXCL1, 2, 3 και 8. β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος κανονικοποίηση. Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) σε κάθε ομάδα χημειοκινών (ANOVA και Tukey για συγκρίσεις κατά ζεύγη). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

Η

Επίδραση του ρ53 στη δραστικότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ και TNF-ενεργοποιημένη ΙκΒ

επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών όπως CCL20, CXCL1, 2, 3 και 8 περιέχουν εγγύς περιοχές κΒ σε υποστηρικτές τους (Εικόνα 3Α). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται ένα ΝΡ-κΒ-καθοδηγούμενο φορέα αναφοράς λουσιφεράσης για να επιβεβαιωθεί η συμμετοχή του ΝΡ-κΒ στην ανασταλτική επίδραση της ρ53 επί TNF και ρ65 (α υπομονάδα του ΝΡ-κΒ) επαγωγή της έκφρασης της χημειοκίνης. Έχουμε επιλέξει τρεις κυτταρικές γραμμές που ποικίλλουν από την άποψη της έκφρασης p53: SKOV-3 (ρ53 null), Α2780 (ρ53 άγριου τύπου) και τα κύτταρα OVCAR-3 (ρ53 μεταλλαγμένη) [25] – [26]. Ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53, ρ53 αποκατάσταση μείωσε σημαντικά ΤΝΡ και δραστικότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ ρ65 επαγόμενης (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η απώλεια της ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να αυξήσει χημειοκίνες προφλεγμονώδεις ενισχύοντας δραστηριότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ σε απόκριση φλεγμονώδη αντίδραση.

(Α) Νουκλεοτιδική αλληλουχίες των υποκινητών για επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών όπως CCL20, CXCL1 , 2, 3 και 8. Αυτοί οι υποκινητές των χημειοκινών περιέχουν μία θέση ΝΡ-κΒ στην εγγύς περιοχή, με εξαίρεση την CCL20, η οποία έχει δύο θέσεις του ΝΡ-κΒ στο απώτατο και εγγύς περιοχή. (Β) Επίδραση της p53 στη δραστηριότητα λουσιφεράσης NF-κΒ. Μετά την επιμόλυνση των φορέων ή συνδιαμόλυνση με ρ65, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF (10 ng /ml) για 4 ώρες. (C) Επίδραση της p53 σε TNF-ενεργοποιημένα ΙκΒ. Μετά την επιμόλυνση του κενού φορέα ή ρ53 σε SKOV-3 (ρ53 null), OVCAR-3 (ρ53 μετάλλαγμα) και Α2780 (ρ53 άγριου τύπου), τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF (10 ng /ml) για υποδεικνυόμενους χρόνους. β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένας εκπρόσωπος αποτέλεσμα φαίνεται? παρακάτω αριθμοί είναι οι τιμές της σχετικής πυκνότητας.

Η

Είμαστε ακόμη διερευνηθεί αν p53 επηρεάζει TNF-επαγόμενη ενεργοποίηση του ΙκΒ σε αυτά τα παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα. Παρά το γεγονός ότι η αποκατάσταση p53 δεν είχε αισθητό αποτέλεσμα επί του TNF-ενεργοποιημένα ΙκΒ σε 5 έως 30 λεπτά, μείωσε την ενεργοποίηση του ΙκΒ σε 1 έως 2 ώρες. Παρά ποικίλης έκφραση του ρ53, αυτή η μειωμένη επίδραση σε όψιμους χρονικά σημεία ήταν παρόμοια σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 3C). Μειωμένη ενεργοποίηση του ΙκΒ σε καθυστερημένη χρονικά σημεία υποδηλώνουν ότι η p53 είναι πιθανό να επηρεάσει τα γεγονότα που σχετίζονται με το NF-κΒ συγκρότημα (ΙκΒ-p65 /p52) και όχι προς τα ανάντη του NF-κΒ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Συμμετοχή p53 σε ΙκΒ υποβάθμιση

Ένας μηχανισμός με τον οποίο ρυθμίζεται ΙκΒ είναι από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος μετά από ουβικουϊτινίωση. Ερευνήσαμε αν ο μηχανισμός αυτός είχε εμπλακεί στην ικανότητά p53 να μειώσει την ενεργοποίηση ΙκΒ. Μετά από παροδική επιμόλυνση των p53, επιβεβαιώσαμε τη λειτουργία της ρ53 εξετάζοντας εάν η αυξημένη έκφραση του p21, ενός ισχυρού αναστολέα κινάσης που εξαρτάται από κυκλίνη ελέγχεται στενά από ρ53. Α2780 κύτταρα εκφράζουν συντακτικά p21 ενώ OVCAR-3 και SKOV-3 κύτταρα δεν εκφράζουν ρ21. Η υπερέκφραση της ρ53 αυξημένο επίπεδο πρωτεΐνης ρ21 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, ρ53 ενισχύεται σημαντικά η συσσώρευση ουμπικιτινομένων πρωτεϊνών σε ολόκληρη κυτταρολύματα (σχήμα 4Α), πιθανώς με διάρρηξη του συστήματος αποικοδόμηση. δοκιμασία ELISA αποκάλυψε ότι η αποκατάσταση της ρ53 αυξημένη δραστηριότητα της ρ53 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Β). Τα κύτταρα Α2780 άγριου τύπου ρ53 που εκφράζεται βασική δραστικότητα ρ53 ενώ ρ53 μεταλλαγμένη OVCAR-3 και ρ53 null κύτταρα SKOV-3 δεν έδειξε δραστικότητα ρ53 (Σχήμα 4Β). Για να προσδιοριστεί η αιτία αυτής της συσσώρευσης, μετρήσαμε δραστηριότητα του πρωτεασώματος και διαπίστωσε ότι μειώθηκε από υπερέκφραση της ρ53 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχήμα 4C). Επιπλέον, μετά από ανοσοκαταβύθιση της ΙκΒ, επιβεβαιώσαμε ότι η ρ53 αυξημένη ουβικιτινίωση της ΙκΒ (Εικόνα 4D). Συσσωρευμένα ουβικουιτινωμένης ΙκΒ από το ρ53 υποδηλώνει ότι μπλοκ ρ53 αποικοδόμηση του ΙκΒ, μειώνοντας τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(α) τις συσσωρευμένες επίδραση της ρ53 επί ubiquitylated πρωτεΐνες. Μετά από παροδική επιμόλυνση του ρ53 σε Α2780, OVCAR-3 και SKOV-3 κύτταρα, λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ουβικιτίνης, ρ21, ΙκΒ, ρ53 και β-ακτίνη (ως έλεγχος φόρτωσης). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάζεται. (Β) Η επιβεβαίωση της δραστικότητας της ρ53 μετά από παροδική επιμόλυνση του ρ53. ELISA πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. Σκούρο γκρι μπάρες δείχνουν σημαντικότητα (p & lt? 0,05, σε συνδυασμό Φοιτητών

t-test

) μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά. (Γ) Η επίδραση της p53 στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος. Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. Σκούρο γκρι μπάρες δείχνουν σημαντικότητα (p & lt? 0,05, σε συνδυασμό Φοιτητών

t-test

) μέσα σε κάθε κυτταρική σειρά. (D) Αποτελέσματα της p53 στην ουβικιτινίωση ΙκΒ. Ανοσοκατακρημνίστηκαν ΙκΒ ήταν ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας ουβικιτίνης αντισώματος. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάζεται.

Η

Επίδραση του ρ53 σε γονίδια που σχετίζονται με ουβικιτίνη

Η επίδραση της ρ53 σε γονίδια που σχετίζονται με ουβικιτίνη παρουσιάζεται στον πίνακα 1. αν και μειωμένη δραστηριότητα του πρωτεασώματος θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση των ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνες, αυξημένη έκφραση των γονιδίων ουμπικουϊτίνης που σχετίζονται μπορούσαν επίσης να συμβάλουν. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιώντας μία συστοιχία PCR ερευνήσαμε αν p53 επηρεάζει άμεσα τα γονίδια που σχετίζονται με ουμπικουϊτίνης όπως ένζυμα ουβικιτίνη ενεργοποίησης (Ε1), ένζυμα ουμπικουϊτίνης-σύζευξη (Ε2) και λιγάσες ουβικιτίνης-πρωτεΐνης (Ε3). Μια συστοιχία PCR για γονίδια ουβικιτινίωση αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση της ρ53 δεν είχαν άμεσες επιπτώσεις στην Ε1 ή Ε2 εκτός από ένα περίπου 2-φορές μείωση του UBE2E2 σε SKOV-3 κύτταρα. Αν και στην Α2780 και τα κύτταρα OVCAR-3, ρ53 υπερέκφραση προκάλεσε μία 2-3 φορές αύξηση στην ουβικιτίνη λιγάσες έκφραση CUL9 και RNF148, αντίστοιχα, σειρά PCR αποκάλυψε ότι αυτά τα γονίδια εκφράστηκαν σε χαμηλά επίπεδα. Είναι ενδιαφέρον ότι η ρ53 αυξημένη ειδικά την έκφραση του Mdm2, αρνητικός ρυθμιστής του καταστολέα όγκων ρ53 και μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης, σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αυξανόμενη επίδραση της ρ53 επί Mdm2 ήταν 1,53 φορές σε Α2780 κύτταρα, 5,41-φορές σε OVCAR-3 και 3.13-φορές σε SKOV-3 κύτταρα. Mdm2 ως ένα γονίδιο p53 επαγόμενο στα γονίδια ουμπικουϊτίνης που σχετίζονται είναι πιθανό να εμπλέκονται στην καταστολή δραστηριότητας p53 η οποία εξασθενεί NF-κΒ σηματοδότηση μέσω αυτορύθμισης αρνητικό βρόχο ανάδρασης.

Η

Επίδραση του p53 στην έκφραση mdm2, δέσμευση με συστατικά NF-κΒ και ΙΚΚ ισομορφές

με βάση Mdm2 mRNA p53 προκαλούμενη υποδεικνύεται από συστοιχία PCR (Πίνακας 1), επιβεβαιώσαμε την επόμενη την αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης με Mdm2 ρ53 σε Α2780, OVCAR-3 και SKOV -3 κύτταρα με στύπωμα Western (Σχήμα 5Α). Επειδή ΙκΒα είναι γνωστό ότι συνδέεται προς ρ53

in vitro

[27] και καταστέλλουν ρ53-εξαρτώμενη επιδράσεις [28], η υπερέκφραση της ρ53 θα μπορούσε να μειώσει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση με σύνδεση προς ρ65 και ΙκΒ. Ανοσοκαταβύθιση ρ53 έδειξε ότι η αποκατάσταση της ρ53 δεν είχε σημαντική επίδραση στην ρ53 δέσμευση σε είτε ρ65 είτε ΙκΒ (Σχήμα 5Β). Επειδή η απώλεια της ρ53 είναι γνωστό ότι ενισχύουν την δραστικότητα του ΙΚΚα ή ΙΚΚβ [12] – [13], μπορούμε διευκρινιστεί αν ρ53 εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του ΙΚΚ. Αν και κάθε κυτταρική γραμμή εξέφρασε μια ξεχωριστή συνδυασμό ισομορφών ΙΚΚ (ΙΚΚβ εκφράστηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, τα κύτταρα SKOV3 εκφράζεται IKKγ αντί του ΙΚΚα και IKKε δεν εκφράστηκε σε οποιαδήποτε κυτταρική γραμμή), η υπερέκφραση του p53 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση ΙΚΚ και φωσφορυλίωση σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά (Εικόνα 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ίσως κυρίαρχη επίδραση της ρ53 επί Mdm2 είναι πιο σημαντικό για την εξασθένιση του ΝΡ-κΒ σηματοδότησης παρά άμεσες επιπτώσεις στην upstreams ή συστατικά του ΝΡ-κΒ.

(Α) Επίδραση του ρ53 στην έκφραση MDM2. Μετά από παροδική επιμόλυνση του ρ53 σε Α2780, OVCAR-3 και SKOV-3 κύτταρα, λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για Mdm2? και β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Επίδραση της εκφράσεως ρ53 επί της σύνδεσης προς ρ65 και ρ53 ΙκΒ. Μετά από παροδική επιμόλυνση του ρ53, ανοσοκαταβυθίστηκαν (ΙΡ) ρ53 ανοσοστυπώθηκαν (IB) με χρήση ρ65 ή ΙκΒ αντίσωμα. (C) Επίδραση της p53 στην έκφραση των διαφόρων ισομορφών ΙΚΚ. Μετά από παροδική επιμόλυνση των p53, λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ΙΚΚα, ΙΚΚβ, IKKγ, IKKε? β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάζεται.

Η

Επίδραση του νουτλίνη-3, ένα συγκεκριμένο επαγωγέα σταθεροποίησης ρ53, σε επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών

απασχολούνται νουτλίνη-3 ως σταθεροποιητής p53 για να επιβεβαιωθεί η ανασταλτική δράση της ρ53 επί της έκφρασης της χημειοκίνης επαγόμενη από τον TNF. Νουτλίνη-3 δεν είχε επίδραση στην δραστικότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ επαγόμενη από τον TNF σε ρ53 null SKOV-3 κύτταρα αλλά μειωμένη δραστικότητα του σε ρ53-υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV-3 (Σχήμα 6Α). Συνεχώς θα διερευνηθεί κατά πόσον νουτλίνη-3 επηρεάζει TNF-ενεργοποιείται ΙκΒ σε p53-υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV-3. Νουτλίνη-3 μειωμένη TNF-ενεργοποιημένη ΙκΒ με σταθεροποίηση p53 όπως υποδεικνύεται με αύξηση του MDM2 (Σχήμα 6Β). Σταθεροποίηση της ρ53 με νουτλίνη-3 σε ρ53-υπερεκφράζεται κύτταρα SKOV-3 οδήγησε σε αρνητική ρύθμιση του ΤΝΡ-επαγόμενη χημειοκινών προφλεγμονώδεις (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η λειτουργική απώλεια της δραστικότητας της ρ53 σε καρκίνο των ωοθηκών μπορεί να αυξήσει την έκφραση των προφλεγμονωδών χημειοκινών, αυξανόμενη επιβάρυνση φλεγμονή στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ρ53 άγριου τύπου κύτταρα IGROV-1 για να επιβεβαιωθεί στην ανασταλτική επίδραση της νουτλίνη-3 επί ΤΝΡ-ενεργοποιημένα ΙκΒ. Νουτλίνη-3 μειώθηκε ΤΝΡ-ενεργοποιημένα ΙκΒ με σταθεροποίηση p53 όπως υποδεικνύεται με αύξηση του ρ21 και ΜΌΜ2 παρά χαμηλή βασική έκφραση της ρ53 (Σχήμα S1B). Αν και IGROV-1 κύτταρα εξέφρασαν υψηλά ΙΚΚα και ΙΚΚβ (IKKγ ήταν ταπεινός εκφράστηκε και IKKε δεν εκφράστηκε), νουτλίνη-3 δεν είχε επίδραση επί της φωσφορυλίωσης ΙΚΚ (Σχήμα S1c). Επιπλέον, διερευνήθηκε διαφορική επίδραση της nutine-3 επί ΤΝΡ-ενεργοποιημένα ΙκΒ μεταξύ άγριου τύπου ρ53 A2789 και ρ53 μεταλλαγμένα κύτταρα OVCAR-3. Νουτλίνη-3 μειωμένη TNF-ενεργοποιημένη ΙκΒ σε Α2780 κύτταρα άγριου τύπου ρ53 με σταθεροποίηση ρ53 που ακολουθείται από ρ21 και ΜΌΜ2 αύξηση (Εικόνα S2A). Από την άλλη πλευρά, νουτλίνη-3 δεν είχε καμία επίδραση σε OVCAR-3 κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη όπως υποδεικνύεται χωρίς αλλαγή του ρ53 και ΜΌΜ2 (Σχήμα S2B). Άλλοι συγγραφείς έδειξαν επίσης ότι νουτλίνη-3 σταθεροποιημένο ρ53 με αύξηση του ρ21 και ΜΌΜ2 σε άλλα κύτταρα άγριου τύπου ρ53, αλλά όχι σε κύτταρα μεταλλαγμένη p53 [29] – [30]. Νουτλίνη-3 δεν επηρέασε TNF-ενεργοποιείται ΙΚΚ και στα δύο κύτταρα (Εικόνα S2). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι τα λειτουργικά κέρδη της p53 είναι πιο σημαντικό για την εξασθένιση του NF-κΒ σηματοδότηση και όχι άμεσες επιπτώσεις στην upstreams του NF-κΒ.

(Α) Επίδραση της νουτλίνη-3 σχετικά με τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης NF-κΒ. Μετά την επιμόλυνση των φορέων ή συνδιαμόλυνση με ρ53, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με νουτλίνη-3 (10 μΜ) για 24 ώρες που ακολουθείται από TNF (10 ng /ml) για 4 ώρες. Διαφορετικά γράμματα υποδηλώνουν σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) σε κάθε ομάδα (ANOVA και Tukey για συγκρίσεις κατά ζεύγη). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE. (Β) Επίδραση των νουτλίνη-3 σε TNF-ενεργοποιημένα ΙκΒ. Μετά την επιμόλυνση του κενού φορέα ή ρ53 σε SKOV-3 κύτταρα, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με νουτλίνη-3 (10 μΜ) για 24 ώρες που ακολουθείται από TNF (10 ng /ml) για υποδεικνυόμενους χρόνους. β-ακτίνη χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα παρουσιάζεται. (C) Επίδραση της νουτλίνη-3 στην επαγόμενη από τον TNF χημειοκινών. Μετά από ολονύκτια επιμόλυνση φορείς, κύτταρα προκατεργάστηκαν με νουτλίνη-3 (10 μΜ) για 24 ώρες που ακολουθείται από TNF (10 ng /ml) για 1 ώρα και qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές για CCL2, CXCL1, 2, 3 και 8. β-ακτίνης χρησιμεύει ως έλεγχος κανονικοποίηση. Αστερίσκος υποδεικνύει σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05, σε συνδυασμό Φοιτητών

t

-test) σε σύγκριση με την παρουσία νουτλίνη-3. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SE.

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η ρ53 αναστέλλει προφλεγμονωδών χημειοκίνες στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Αυτή η επίδραση της p53 είναι πιθανό προέκυψε από εξασθενημένο NF-κΒ σηματοδότηση από μειωμένη υποβάθμιση του πρωτεασώματος της ΙκΒ και κυρίαρχο επιπτώσεις της p53 πάνω Mdm2.

Η έρευνα υποκινήθηκε από το γεγονός ότι η επιθετική και υψηλής ποιότητας καρκίνο των ωοθηκών, μια που σχετίζεται με φλεγμονή του καρκίνου, συχνά περιλαμβάνει μεταλλάξεις ή εξαλείψεις του ρ53 [11]. πρώτη συσχέτισης πείραμά μας αποκάλυψε ότι ρ53-μηδενική ή μεταλλαγμένα ωοθηκών καρκινικά κύτταρα υψηλής έκφρασης προφλεγμονωδών χημειοκινών, όπως CCL20, CCL28, CXCL1, 2, 3 και 8, η οποία συμφωνεί με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας [10]. Επιπλέον, CCR1, CCR10 και CXCR4 ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται σε Α2780 κύτταρα, CaOV-3 κύτταρα (Εικόνα 1Β) και IGROV-1 κύτταρα (Σχήμα S1A). Επειδή CCR1, CCR10 και CXCR4 δεν είναι ειδικοί υποδοχείς για τις προφλεγμονώδεις χημειοκινών που απελευθερώνεται από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αυτοί οι υποδοχείς είναι πιθανόν να αλληλεπιδρούν με χημειοκίνες που απελευθερώνονται από άλλους τύπους κυττάρων, όπως κυττάρων του ανοσοποιητικού και των ενδοθηλιακών κυττάρων στο μικροπεριβάλλον.

TNF επαγόμενη έκφραση του CCL20, CXCL1, 2, 3 και 8, αλλά όχι CCL28 που εκφράζεται υψηλά σε SKOV-3 και κύτταρα OVCAR-3 (Σχήμα 1Α και 2Α). Η έλλειψη επαγωγή CCL28 από τον TNF σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι σε αντίθεση με προηγούμενη έκθεση [31] – [32] ότι TNF και IL-1 αυξάνουν την έκφραση του CCL28 σε ανθρώπινα κύτταρα κερατινοκυττάρων και επιθήλιο του παχέος εντέρου. Στην πραγματικότητα, το επίπεδο CCL28 παρέμεινε αναλλοίωτο σε όλα τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών που εξετάστηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αυτή η διαφορά δείχνει ότι το δίκτυο χημειοκίνης είναι πιθανό να ρυθμίζονται διαφορετικά σε διάφορους τύπους κυττάρων.

Αποκατάσταση της ρ53 σε SKOV-3 κύτταρα ρ53-ηυΙΙ εξασθενημένη έκφραση των προφλεγμονωδών χημειοκινών στα δύο βασικά και επαγόμενη από τον TNF συνθήκες (Σχήμα 2C ). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η απώλεια ή μετάλλαξη του ρ53 που παρατηρείται συχνά στον καρκίνο των ωοθηκών συμβάλλει στην επαυξημένη χημειοκίνες προφλεγμονωδών στο μικροπεριβάλλον του όγκου, η οποία είναι γνωστό ότι διευκολύνει την πρόοδο του καρκίνου.

Επειδή οι υποκινητές του CCL20, CXCL1, 2, 3 και 8 περιέχουν θέσεις κΒ (Εικ. 3Α) και προφλεγμονωδών χημειοκίνες ρυθμίζονται από ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [10], τα αποτελέσματα της ρ53 επί της έκφρασης της χημειοκίνης πιθανό να συνεπάγεται αλλαγές των ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. Σε αυτή τη μελέτη, την αποκατάσταση της ρ53 εντός των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα και νουτλίνη-3, έναν σταθεροποιητή ρ53, καταργεί δραστικότητα επαγόμενη από τον TNF ΝΡ-κΒ προαγωγό (Σχήμα 3Β και 6Α). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν και έρχονται σε αντίθεση με τα προηγούμενα ευρήματα, καθώς έχουν βρεθεί αντικρουόμενες επιδράσεις της p53 στο NF-κΒ σηματοδότηση. Ορισμένα στοιχεία δείχνουν ότι η ρ53 ενεργοποιεί την p65 υπομονάδα του ΝΡ-κΒ μέσω της ριβοσωμικής S6 κινάση 1 [18] και ο TNF ενεργοποιεί ένα μεταγραφικά ενεργό σύμπλεγμα ρ65 και ρ53 σε στοιχεία απόκρισης κΒ, υποδεικνύοντας ότι μεταλλαγμένο p53 αντί απώλεια της ρ53 συμβάλλει όγκου εξέλιξη [19]. Από την άλλη πλευρά, συσσωρεύοντας απόδειξη υποδεικνύει μία αρνητική επίδραση του γονιδίου ρ53 επί ΝΡ-κΒ σηματοδότηση, σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μας. Η ρ53 μπορεί να καταστείλει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση διακόπτοντας έκφραση ΙΚΚ ως ανάντη του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση.