Αφηρημένο

Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιητές μπορεί να εφαρμοστεί ως θεραπευτικά φάρμακα στην καταστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων . Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός καταστολής της λειτουργίας τους σε καρκινικά κύτταρα είναι ακόμα ασαφής. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ΑΜΡΚ ενεργοποιητές βλάψουν τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της μείωσης των DVL3, θετικός ρυθμιστής στην Wnt /σηματοδότησης β-κατενίνης και ένα ογκογόνο παίκτης του τραχήλου της μήτρας ογκογένεση του καρκίνου. Με Western Blot και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις, αποδείξαμε ότι DVL3 ήταν συχνά ρυθμίζεται αυξητικά και σχετίζεται σημαντικά με αυξημένη β-κατενίνης (

P

= 0,009) και CyclinD1 (

P

= 0,009) εκφράσεις για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας . Η αναγκαστική έκφραση DVL3 αυξημένα β-κατενίνης και της επαυξημένης τραχήλου ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, επαληθεύοντας ότι DVL3 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση /β-κατενίνης Wnt εμπλέκεται στην ογκογένεση του τραχήλου της μήτρας καρκίνου. Από την άλλη πλευρά, διαπιστώσαμε ότι η αυχενική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ήταν αξιόλογα καταστάλθηκε από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές και τέτοια αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης ήταν σε ταυτόχρονη με τη μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης DVL3 σε δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους. Εκτός αυτού, μειωμένη δραστηριότητα σηματοδότησης του mTOR μείωσε επίσης την έκφραση DVL3. Σε αντίθεση, συν-θεραπεία με την ένωση C (αναστολέας ΑΜΡΚ) θα μπορούσε να καταργήσει σημαντικά προκαλείται από τη μετφορμίνη μείωση DVL3. Επιπλέον, η συν-θεραπεία με AM114 ή MG132 (αναστολείς proteosomal) θα μπορούσε να αποκαταστήσει μερικώς την έκφραση DVL3 κάτω από τη θεραπεία με μετφορμίνη. Περαιτέρω

in vivo

δοκιμασία ουμπικουιτίνωση αποκάλυψε ότι η μετφορμίνη μπορεί να μειώσει DVL3 από την υποβάθμιση ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει τις πιθανές μοριακών μηχανισμών της ότι οι ενεργοποιητές ΑΜΡΚ την καταστολή του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, αλλοιώνοντας τη σύνθεση πρωτεϊνών DVL3 μέσω AMPK σηματοδότησης /mTOR και /ή εν μέρει την προώθηση της υποβάθμισης του πρωτεασώματος της DVL3.

Παράθεση: Kwan HT, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung σου, et al. (2013) ΑΜΡΚ ενεργοποιητές καταστολή του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των κυττάρων μέσω της αναστολής της DVL3 Mediated Wnt /β-κατενίνης Σηματοδοσίας δραστηριότητας. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10.1371 /journal.pone.0053597

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 22 Αύγ του 2012? Αποδεκτές: 30 Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 2, Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Kwan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Wong Ελέγξτε Εκείνη Φιλανθρωπικού Ιδρύματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι μια από τις πιο κοινές γυναικολογικούς καρκίνους παγκοσμίως. Μέχρι σήμερα, η πιο γνωστή αιτία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι ο ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV). Επίμονη HPV λοίμωξη προωθεί την ανάπτυξη προκαρκινικών αλλοιώσεων στον καρκίνο [1] του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, HPV λοίμωξη από μόνη της δεν είναι αρκετή για να μετατρέψει τα επιθηλιακά κύτταρα-ξενιστές για καρκινικά κύτταρα. Έτσι, άλλοι παράγοντες, όπως η αυξητική ρύθμιση των ογκογονιδίων και ανώμαλη ενεργοποίηση των σχετικών μονοπατιών σηματοδότησης, μπορεί να εμπλέκεται στην αυχενική καρκινογένεση [2]. Πρόσφατες αποδείξεις έδειξαν ότι ανώμαλη ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης είναι κρίσιμο εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου [3], [4], [5]. Η συσσώρευση β-κατενίνης είναι το σήμα κατατεθέν στην πρόκληση ανώμαλη ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης η οποία συνδέεται στενά με την καρκινογένεση του μήτρας τραχήλου [6], [7], [8], [9], και ιδιαίτερα στην επεμβατική του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα [10]. Έτσι, η στόχευση αυτή την οδό μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση στο μοριακό θεραπεία αυτής της ασθένειας.

AMP-ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση (ΑΜΡΚ) είναι ένας κύριος ρυθμιστής του κυψελοειδούς συστήματος ενέργειας [11]. Ενεργοποιημένος δραστηριότητα ΑΜΡΚ μειώνει μηχανιστική στόχος ραπαμυκίνης (mTOR) σηματοδότησης και αντίστοιχο p70S6 κινάσης της και δραστηριότητα 4Ε-ΒΡ1 [12], αναστέλλοντας έτσι την πρωτεϊνική σύνθεση [13], [14] και την κυτταρική ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι η χαμηλή δραστηριότητα ΑΜΡΚ ευνοεί την καρκινογένεση [15], [16]. Για το σκοπό αυτό, πολυάριθμες φαρμακευτικές ενεργοποιητές ΑΜΡΚ όπως Α23187, A769662, 5-αμινοϊμιδαζολο-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) και μετφορμίνη έχουν πρόσφατα δειχθεί ότι εξασκούν αποτελέσματα κατά του όγκου σε πολλές ανθρώπινους καρκίνους [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. Ιδιαίτερα, η μετφορμίνη έχει χρησιμοποιηθεί σε αρκετές συνεχιζόμενες κλινικές δοκιμές [24], [25], [26], [27]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί για τις επιπτώσεις κατά του όγκου αυτών των ενεργοποιητών ΑΜΡΚ δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί σαφώς.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι DVL3 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω και συσχετίστηκε με δραστικότητα /β-κατενίνης Wnt σε Καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Το πιο σημαντικό, είμαστε οι πρώτοι που παρέχουν αποδείξεις ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιητές αναστέλλουν τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω αλλοιώνοντας DVL3 μεσολάβηση σηματοδότηση /β-κατενίνης Wnt στην τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε ότι η αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών AMPK /mTOR μεσολάβηση και η ενίσχυση της αποδόμησης του πρωτεασώματος ήταν οι μοριακοί μηχανισμοί στη μείωση του DVL3 επιδεικνύεται από ενεργοποιητές ΑΜΡΚ. Τα ευρήματά μας εμπλέκουν τη σημασία της DVL3 στην αυχενική ογκογένεση του καρκίνου και να τονίσει την θεραπευτική αξία της στοχοθέτησης DVL3 από AMPK ενεργοποιητές στην αυχενική θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Πέντε τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa, SiHa, C33A, CaSki και C41) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (πιστοποίηση κυτταρικών σειρών έγινε με ανάλυση STR DNA προφίλ in-house) και δύο αθανατοποιημένων τραχήλου επιθηλιακών κυτταρικών γραμμών ( NC104 και NC105) [6] (δώρο από τον καθηγητή Γεώργιο. Τσάο, Τμήμα Ανατομίας, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε 37 ° C σε 5% CO2 σε ελάχιστο βασικό μέσο ή τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (Gibco-BRL, Gaithersburg) με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco).

πλασμίδια και διαμόλυνσης κυττάρων

ο GFP-tagged-DVL3 εκφράζουν το κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση της πρωτεΐνης GFP /DVL3 [28], ενώ το pEGFP-C1 πλασμίδιο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η pCMV2-Flag /DVL3 χρησιμοποιήθηκε για την δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης TOP /FOP, ενώ τόσο pSuper8XTOPFlash και κατασκευές pSuper8XFOPFlash ευγενικά από τον Dr. R. Moon (University of Washington, Ουάσιγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). LipofectAMINE

TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των κυττάρων σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Για τη σύσταση της GFP-DVL3 σταθερώς εκφράζοντα κύτταρα, επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με G418 για 2 εβδομάδες και επαληθεύεται με ανάλυση στυπώματος western.

εκχύλιση RNA και Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-ΡΟΡ

συνολικό RNA εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή κιτ αντιδραστηρίου (Applied Biosystems, Foster City). Η έκφραση του

DVL3

αξιολογήθηκε με ποσοτική έκφραση Δοκιμασίες TaqMan® Gene ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (Q-PCR) σε ένα ΑΒΙ PRISM σύστημα ™ 7500 (Applied Biosystems) με τη χρήση? ανθρώπινα

DVL3

(Δοκιμασία ID: Hs00610263_m1). Το ανθρώπινο

18S rRNA

(Δοκιμασία ID: Hs99999901_m1) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος

Πρωτεΐνη Εξόρυξη, Western και ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύει

Η πρωτεΐνη λύμα εκχυλίζεται. με λύση κυττάρων την κατακρήμνιση με 1χ ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10Χ ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA), 1:100 PMSF, αναστολέα πρωτεάσης και απεσταγμένο νερό). Για ανάλυση στυπώματος Western, τα δείγματα που περιέχουν μια σταθερή ποσότητα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, ΟΗ, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια κηλιδώθηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα για 30 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα? αντι-pp70S6kinase, αντι-p70S6 κινάσης, αντι-pAMPKα, αντι-AMPKα, αντι-CyclinD1 (Cell Technology σηματοδότηση), αντι-DVL1, αντι-DVL2, αντι-DVL3, αντι-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA) και αντι-β-κατενίνης (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξείδιο χράνου (Amersham Pharmacia Biotech, ΟΗ) χρησιμοποιήθηκε και οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham). Για ανοσοϊστοχημική ανάλυση, τον καρκίνο του τραχήλου συστοιχίας ιστού (CXC1021) (5 περιπτώσεις φυσιολογικού τράχηλου /τραχηλίτιδα και 97 περιπτώσεις καρκίνων του τραχήλου της μήτρας) (Pantomics Inc, CA, USA) χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση για DVL3, β-κατενίνης και CyclinD1. Οι τομές ανοσοχρωματίστηκαν με πρωτογενές αντι-DVL3 (1:200 αραίωση) (NB110-59941, Novus Biologicals, Littleton, CA USA), αντι-β-κατενίνης (BD Biosciences) (1:200 αραίωση) και αντι-CyclinD1 (1 :100 αραίωση) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). Η επώαση με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικοί έλεγχοι. τα επίπεδα έκφρασής τους βαθμολογήθηκαν με το χέρι από τον πολλαπλασιασμό του ποσοστού της αναλογίας των ανοσοθετικών περιοχής χρώσης (0-100%) και την ένταση της χρώσης (1, αδύναμη? 2, μέτρια? 3, έντονη? και 4, πολύ έντονη ). Η αναδίπλωση αλλαγή του κάθε γονιδίου υπολογίστηκε διαιρώντας το επίπεδο έκφρασης του κάθε δείγματος καρκίνου με τη μέση τιμή του επιπέδου έκφρασης του φυσιολογικού τράχηλου /τραχηλίτιδα. Το σημείο αποκοπής (αριθμός πτυχώσεις) του κάθε γονίδιο στη συνέχεια προσδιορίστηκε με τα επίπεδα έκφρασης της και η στατιστική σημαντικότητα. Όλα τμήμα ιστού εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο ερευνητές.

λουσιφεράσης Δοκιμασία

ΗΕΚ293 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με 0, 50, 100, και 200 ​​ng του pCMV2-Flag /DVL3 καθώς και είτε ως pSuper8XTOPFlash ή pSuper8XFOPFlash κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης. Όλες οι επιμολύνσεις ομαλοποιήθηκαν με pcDNA3.1 (+) φορέα. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega). αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκαν με

Renilla

λουσιφεράσης δραστηριότητα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και σε 3 ανεξάρτητα πειράματα.

In Vivo

Ουβικιτινίωση Δοκιμασία

Η διαδικασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Εν συντομία, C33A ή Hela κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών mm καλλιέργειας 100. Το pcDNA-ΗΑ (Ub)

8 ήταν παροδική επιμολύνθηκε στα παραπάνω τύπους κυττάρων αντίστοιχα χρησιμοποιώντας Lipofeactamin kit 2000 διαμόλυνσης (Invitrogen). Το κυτταρόλυμα συλλέχθηκε με τη χρήση ΝΕΤ ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl και 5 mM EDTA) με 1% ΝΡ40, ρΗ 8,0, 0,1 mM PMSF, και 1 mM Complete κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης TM (Roche)) στο κυτταρικό ίζημα. Ένα mg κυτταρολύματος επωάστηκε με 1 μα αντι-IgG και αντι-DVL3 (Santa Cruz) στους 4 ° C. Μετά την επώαση, 40 μΐ σφαιριδίων G Plus-αγαρόζης (Santa Cruz) Protein A /προστέθηκαν σε κάθε δείγμα και αναμίχθηκαν με περιστροφή όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά τη φυγοκέντρηση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν τέσσερεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ΝΕΤ, ακολουθούμενο από την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος που περιέχει DTT και έβρασαν για 10 λεπτά πριν από την ηλεκτροφόρηση. Οι αναστολείς πρωτεασώματος, MG132 και AM114, ελήφθησαν από την Calbiochem (La Jolla, CA).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ΧΤΤ) (Roche) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων για 5 ημέρες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Κλωνογόνος

δοκιμασία

Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 εβδομάδες. Μετά από 2 εβδομάδες, το μέσο απομακρύνθηκε και ακολούθησε επώαση με μεθανόλη για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες για 1 ώρα. Μετά την χρώση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS. Τριπλασιασμός του κάθε δείγματος και τρία ανεξάρτητα πειράματα και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε από το σύστημα Gel-Doc.

Ανάλυση δεδομένων

του Student t τεστ (για παραμετρικά στοιχεία) και το Mann- Whitney τεστ (για μη-παραμετρικά δεδομένα) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση. Η κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυση μεταξύ της έκφρασης των DVL3, β-κατενίνης, CyclinD1 και κλινικές παραμέτρους αναλύθηκε με crosstabs και Pearson Chi-Square test χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL). Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Ένα

P

-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική.

Αποτελέσματα

DVL3 συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα

Οι αναδυόμενες αποδείξεις έχουν δείξει ότι DVLs είναι σε θέση να ρυθμίζουν β-κατενίνης και την προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [30], κακόηθες μεσοθηλίωμα υπεζωκότα [31] και τον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου [32] κλπ Εξετάσαμε έτσι το πρότυπο έκφρασης του DVLs ( DVL1, DVL2 και DVL3) σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές με ανάλυση στυπώματος western. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι DVL3 αλλά ούτε DVL1 ούτε DVL2 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ένα πάνελ του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές σειρές (HELA, SiHa, CaSki, C33A και C41) όταν συγκρίνεται με αθανατοποιημένη τράχηλο κυτταρικές γραμμές (NC104 και NC 105) (Σχήμα 1Α ), γεγονός που υποδηλώνει ότι DVL3 είναι δεσπόζει αυξορρυθμίζεται τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Εξετάσαμε την επόμενη το επίπεδο του mRNA της

DVL3

σε αυτές τις κυτταρικές σειρές σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής (Q-PCR). Ομοίως, η

DVL3

επίπεδα mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερη σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τις κανονικές αθανατοποιημένη τράχηλο κυτταρικές σειρές (Εικόνα 1Β). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι DVL3 είναι η κύρια ισομορφή του DVLs συχνά πάνω ρυθμισμένα σε καρκίνους του τραχήλου κύτταρα.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι μόνο το επίπεδο της DVL3 αλλά όχι DVL1 και DVL2 ήταν σημαντικά ανάντη ρυθμίζεται σε τραχήλου κυτταρικές σειρές καρκίνου, σε σύγκριση με τις κανονικές τράχηλο κυτταρικές σειρές. (Β) σε πραγματικό χρόνο Q-PCR αποκάλυψε το mRNA της

DVL3

ήταν προφανώς υψηλότερη μεταξύ του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές σειρές καρκίνου, σε σύγκριση με τις κανονικές τράχηλο κυτταρικές σειρές. Η αξία των NC105 χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει άλλες κυτταρικές σειρές. (Γ) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι και οι δύο DVL3 και β-κατενίνης ήταν απορυθμίζεται επί του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με την κανονική τράχηλο δείγματα. DVL3 διανεμήθηκε στην κυτταροπλασματική περιοχή, ενώ β-κατενίνης βρισκόταν τόσο στην κυτταροπλασματική και πυρηνική περιοχές. (Μεγέθυνση: 20x) δοκιμασία (D) Luciferase ρεπόρτερ αποκάλυψε ότι παροδική επιμόλυνση του DVL3 εκφράζει πλασμίδιο θα μπορούσε να αυξήσει β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα σε κύτταρα ΗΕΚ293

Η

Η υπερέκφραση του DVL3 και β-κατενίνης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

για να μελετηθεί η σημασία της DVL3 και β-κατενίνης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, εξετάσαμε τις εκφράσεις του DVL3 και β-κατενίνης σε ένα τραχηλικό καρκίνο συστοιχίας ιστού (CX1021) χρησιμοποιώντας ανάλυση ανοσοϊστοχημική (IHC). Η ανοσοαντιδραστικότητα DVL3 παρατηρήθηκε μόνο στο κυτταρόπλασμα, ενώ β-κατενίνης εντοπίζεται σε δύο πυρήνες και κυτταροπλασματικές περιοχές των κανονικών και του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1C). ανάλυση IHC έδειξε ότι παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες αυξημένη εκφράσεις DVL3 και β-κατενίνης στα τμήματα του τραχήλου της μήτρας του όγκου σε σύγκριση με τις κανονικές τράχηλο τμήματα (Πίνακες 1 και 2). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η υψηλή έκφραση του DVL3 (rank & gt? 5 πτυχώσεις) συσχετίστηκε σημαντικά με το υψηλό επίπεδο της β-κατενίνης (rank & gt? 7 πτυχώσεις? P = 0,009) (Πίνακας 1). Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης DVL3 και άλλες κλινικές παραμέτρους, όπως τα στάδια όγκου (

P

= 0,369), διαβάθμιση (

P

= 0,658), μετάσταση (

P

= 0,243), β-κατενίνης (

P

= 0,009) και CyclinD1 (

P

= 0,009). Από την άλλη πλευρά, η προς τα πάνω ρύθμιση της β-κατενίνης (rank & gt? 7 πτυχώσεις) ήταν σημαντικά σχετίζεται με όγκους υψηλού βαθμού (

P

= 0.049) και υπερ-έκφραση της CyclinD1 (

P

= 0.009), αλλά δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση με τα στάδια όγκου (

P

= 0.189) και μετάσταση (

P

= 0,345) (Πίνακας 2). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση του DVL3 συσχετίζεται με β-κατενίνης η οποία εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Η

DVL3 ενισχύει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του τραχήλου κυττάρων

DVLs είναι σημαντικά μόρια μεταγωγής σήματος που μεσολαβούν δραστηριότητα σηματοδότησης /β-κατενίνης Wnt να ελέγχουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Για την αντιμετώπιση είτε DVL3 θα μπορούσε να προωθήσει δραστικότητα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης, η διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Η επιμόλυνση του DVL3 εκφράζουν πλασμιδίου σε κύτταρα ΗΕΚ293 αυξήθηκαν β-κατενίνης μεταγραφική δραστικότητα σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 D), υποδηλώνοντας ότι DVL3 είναι ένας θετικός ρυθμιστής της Wnt /β-κατενίνης καταρράκτη σηματοδότησης. Στη συνέχεια, να ερευνήσει εάν DVL3 προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του Wnt /β-κατενίνης οδού στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, του τραχήλου της μήτρας δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (C33A και SiHa) με σταθερά έκφραση του DVL3 καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας ανθρώπινα GFP-tagged DVL3 εκφράζουν πλασμίδιο. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι β-κατενίνης ήταν σημαντικά αυξημένα σε GFP-DVL3 σταθερών κλώνων σε C33A (C-G25 και C-G28) και SiHa (S-G18 και S-G20) (Σχήμα 2Α). Λειτουργικά, ΧΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων αποκάλυψε ότι η έκτοπη έκφραση DVL3 ενίσχυσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε GFP-DVL3 σταθεροί κλώνοι των SiHa (

P

& lt? 0,05) και C33A (

P

& lt? 0.001) κύτταρα (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, κλωνογονική δοκιμασία αποκάλυψε ότι υπήρχαν 2-3 φορές αύξηση στον αριθμό των αποικιών σε κύτταρα SiHa σταθερώς εκφράζουν GFP-DVL3 (S-G18 και S-G20) (

P

& lt? 0,05) και C33A κύτταρα (C-G25 και C-G28) (

P

& lt? 0,05) αντίστοιχα, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα τους (Σχήμα 2C). Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι DVL3 ενισχύει δραστηριότητα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης και προωθεί τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας.

(Α) κηλίδα Western έδειξε ότι σταθερώς υπερ-εκφράζουν GFP-DVL3 αυξημένη έκφραση του β-κατενίνης σε C33A (C-G25 και C-G28) και SiHa (S-G18 και S-G20). δοκιμασίας (Β) ΧΤΤ αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας με σταθερή έκφραση του GFP-DVL3 (C-G24 και C-G28?

P

& lt? 0,05) (S-G18 και S- G20?

P

& lt? 0,05). (Γ) κλωνογονική δοκιμασία έδειξε ότι δύο φορές και τρεις φορές ο αριθμός των αποικιών βρέθηκαν σε GFP-DVL3 εκτοπικά κύτταρα που εκφράζουν C33A (C-G25 και C-G28) (

P

& lt? 0,05) και κύτταρα SiHa (S -G18 και S-G20) (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου φορέα τους

η

ενεργοποιητές ΑΜΡΚ μείωση DVL3 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα

Πολλά. μελέτες έχουν δείξει ότι οι ενεργοποιητές ΑΜΡΚ μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκίνους, ιδιαίτερα σε καρκίνο του τραχήλου

in vitro

[21], [33], [34]. Επομένως, εξετάσαμε την επίδραση της ΑΜΡΚ ενεργοποιητές για την έκφραση του DVL3 και των σχετικών δραστηριοτήτων της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. θεραπεία AICAR οδήγησε σε σημαντική μείωση των επιπέδων DVL3 σε τρία τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α). Ένας άλλος ενεργοποιητής ΑΜΡΚ, Α23187, ενεργοποιεί ΑΜΡΚ μέσω ανάντη κινάσης του (CaMKK) με την αύξηση του κυτοσολικού επίπεδο ασβεστίου [20], επίσης μειωμένη έκφραση DVL3 σε κύτταρα C33A και SiHa με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3C). Για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης της Α23187 στην έκφραση DVL3, C33A και CaSki υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 1.25 μΜ Α23187 και συλλέγονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Μείωση του DVL3 παρατηρήθηκε μετά από 10 και 12 ώρες σε C33A και CaSki αντίστοιχα και κανένα DVL3 παρατηρήθηκε μετά από 12 και 24 ώρες και για τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον η μείωση της DVL3 διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές είναι μια καθολική διαδικασία, δύο γνωστούς ενεργοποιητές ΑΜΡΚ, A769662 και μετφορμίνη, χρησιμοποιήθηκαν. A769662 είναι ένα θειενοπυριδινικές που ενεργοποιεί ΑΜΡΚ μέσω της αλληλεπίδρασης με την α- και β-υπομονάδα της ΑΜΡΚ. Κατά A769662 θεραπεία, η έκφραση DVL3 καταργήθηκε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε SiHa και C33A (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, η μετφορμίνη είναι ένα πολύ κοινό ενεργοποιητή ΑΜΡΚ, καθώς και ένα πιθανό φάρμακο κατά του καρκίνου [22]. Κατά την θεραπεία της μετφορμίνης, αρκετές τραχήλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται διαφορική απόκριση σε μετφορμίνη και έδειξε εξάντληση των DVL3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 3Ε), μαζί με καμία μεταβολή στο επίπεδο του mRNA της

DVL3

σε C33A και HeLa (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση της DVL3 ρυθμίζονται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές συσχετίστηκε με μετα-μεταγραφική γεγονότα. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι η ΑΜΡΚ ενεργοποιητές μπορεί να μειώσει DVL3 και τέτοιο αποτέλεσμα είναι μια καθολική διαδικασία.

(Α) Κατά την επεξεργασία των AICAR, μείωση περίπου 80% του επιπέδου DVL3 παρατηρήθηκε μεταξύ των C33A, C41 και CaSki. (Β) Κατά την κατεργασία των A769662 σε διαφορετικές δόσεις (0, 50 και 100 μΜ), ένα 20-30% και 80% -100% μείωση του DVL3 σε SiHa και C33A μπορούσε να παρατηρηθεί αντίστοιχα. (Γ) Κατά την επεξεργασία με Α23187 σε διαφορετικές δόσεις (0, 1,25 και 2,5 μΜ) επί είκοσι ώρες, C33A και SiHa κύτταρα έδειξαν μείωση 80-90% της έκφρασης DVL3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (Δ) Κατά την κατεργασία των 1,25 μΜ Α23187, η μείωση του DVL3 μπορούσε να παρατηρηθεί μετά από 10 και 12 ώρες σε C33A και CaSki αντίστοιχα, ενώ περαιτέρω μείωση κατά 100% του DVL3 παρατηρήθηκε σε 12 και 24 ώρες και για τις δύο κυτταρικές σειρές. (Ε) Μετά την αγωγή μετφορμίνης, μείωση 60-80% των DVL3 παρατηρήθηκε σε Hela, SiHa, CaSki, C41 και C33A με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Η

(Α) σε πραγματικό χρόνο q- PCR ανάλυση κατέδειξε ότι η μετφορμίνη δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του

DVL3

έκφραση mRNA σε κύτταρα C33A και HeLa. (Β) Ανάλυση Western blot αποκάλυψε ότι η ένωση Γ μπορούσε υποχωρήσουν την μείωση του DVL3 διαμεσολαβείται από τη μετφορμίνη. (Γ) ΧΤΤ δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων έδειξαν σημαντική μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε C33A (

P

& gt? 0.001), SiHa (

P

& gt? 0.001) και κύτταρα HeLa (

P

& gt? 0.001) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μετφορμίνη σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (D) κλωνογονική δοκιμασία έδειξε μια αξιοσημείωτη μείωση του αριθμού των αποικιών που σχηματίστηκαν σε HeLa και C33A έλαβαν θεραπεία με μετφορμίνη σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

Η

ενεργοποίηση ΑΜΡΚ είναι ζωτικής σημασίας για τη μείωση της DVL3 διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές

Αν και το σημαντικό ρόλο της AMPK ενεργοποιητές είναι να ενεργοποιήσετε δραστηριότητα ΑΜΡΚ, πολυάριθμες αναφορές έχουν αποδεικνύεται ότι μερικοί ενεργοποιητές ΑΜΡΚ μπορεί να ασκήσει εκτός στόχου επιπτώσεις [35], [36]. Ως εκ τούτου, είναι ενδιαφέρον να εξεταστεί κατά πόσον οι ενεργοποιητές ΑΜΡΚ μεσολάβηση μείωση των DVL3 εξαρτάται αποκλειστικά και μόνο για τη δραστηριότητα σηματοδότησης ΑΜΡΚ. Χρησιμοποιήσαμε ένα ισχυρό αναστολέα ΑΜΡΚ, ένωση Γ, για να εξουδετερώσουν το αποτέλεσμα της μετφορμίνης στην ενεργοποίηση ΑΜΡΚ. Σταθερά, μείωση του DVL3 παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία μετφορμίνης στο C33A και SiHa (Σχήμα 4Β), όμως η μείωση της DVL3 ακυρώθηκε με τη προσθήκη της ένωσης C. (Σχήμα 4Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η μείωση των DVL3 διαμεσολαβείται από μετφορμίνη είναι κυρίως μέσω της δραστηριότητας σηματοδότησης ΑΜΡΚ.

ενεργοποιητές ΑΜΡΚ επηρεάσει τραχήλου της μήτρας πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω της μείωσης της δραστηριότητας /β-σηματοδότηση DVL3 και Wnt

Έχουμε κατέδειξε ότι η έκτοπη έκφραση της DVL3 θα μπορούσε να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Ως εκ τούτου, να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με την λειτουργία του απεμπλουτισμένου DVL3 στην ελαχιστοποίηση Wnt /σηματοδότηση β-κατενίνης και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκαλείται από AMPK ενεργοποιητές, C33A, SiHa και HeLa κύτταρα κατεργάστηκαν με μετφορμίνη και ρυθμούς πολλαπλασιασμού τους εξετάσθηκαν με προσδιορισμό ΧΤΤ. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η μετφορμίνη κατασταλεί σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε C33A (

P

& gt? 0.001), SiHa (

P

& gt? 0.001) και τα κύτταρα HeLa (

P

& gt? 0.001) (Σχήμα 4C). Επιπλέον, κλωνογονική δοκιμασία αποκάλυψε επίσης ότι ο αριθμός των αποικιών μειώθηκε κατά 20 και 50% στις C33A και κύτταρα HeLa αντίστοιχα (Εικόνα 4D). Αυτά τα ευρήματα πρόδηλο ότι η αναστολή της αυχενικής ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές οφείλεται στην μείωση του DVL3.

ΑΜΡΚ /mTOR δραστηριότητα είναι απαραίτητη για την εξάντληση των DVL3

ΑΜΡΚ ενεργοποιητές είναι σε θέση να ενεργοποιούν ΑΜΡΚ και ρυθμίζουν προς τα κάτω καταρράκτη της, όπως η μεταφραστικό έλεγχο της πρωτεϊνοσύνθεσης μέσω αναστολής του mTOR μονοπάτι [12], [13], [14]. Ως εκ τούτου, εμείς αιτιολογημένη την παρεμπόδιση της δραστηριότητας /mTOR ΑΜΡΚ μπορούν να μιμούνται τις επιδράσεις της ΑΜΡΚ ενεργοποιητές για τη μείωση των DVL3. Ένας αναστολέας mTOR (ραπαμυκίνη) χρησιμοποιήθηκε για να αναστέλλουν τη δράση του mTOR. Η ραπαμυκίνη καταστέλλει τη δραστηριότητα κινάσης του mTOR να αδρανοποιήσει p70S6K, καταργώντας με τον τρόπο αυτό ορισμένες πρωτεΐνες μετάφρασης [37]. Κατά την επεξεργασία των ραπαμυκίνη, DVL3 μειώθηκε σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές (C33A, C41, CaSki, HeLa και SiHa) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω, η αδρανοποίηση της p70S6K σε ταυτόχρονη με τη μείωση του DVL3 παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa και SiHa κατεργασία με 1 ηΜ ραπαμυκίνη (Σχήμα 5Α). Στο σύνολό τους, η μείωση της πρωτεϊνοσύνθεσης θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση DVL3 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές και ότι η μείωση των DVL3 διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές είναι κυρίως μέσω του /mTOR καταρράκτη σηματοδότησης ΑΜΡΚ.

(Α) Η ραπαμυκίνη αδρανοποιημένο p70S6 κινάσης δραστηριότητα και αποτυχημένες πρωτεϊνική σύνθεση του DVL3 σε όλες τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές (C33A, C41, CaSki, HeLa και SiHa) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. (Β) αναστολέας του πρωτεασώματος, AM114, αποκατέστησε την μειωμένη DVL3 διαμεσολαβείται από τη μετφορμίνη σε C33A. (C) αναστολέας του πρωτεασώματος, AM114, δεν θα μπορούσε να αποκαταστήσει τη μειωμένη DVL3 διαμεσολαβείται από τη μετφορμίνη σε SiHa και HeLa. (D)

In vivo

δοκιμασία ουμπικουιτίνωση έδειξε ότι DVL3 είχε υποβαθμιστεί ως πολυ-ουβικουιτινωμένης πρωτεΐνη DVL3 ((Ub) n-DVL3) στο μοντέλο C33A κυττάρων. C33A κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcDNA-ΗΑ (Ub)

8 πλασμίδιο. Τόσο MG132 ή AM114 και μετφορμίνη χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν το ποσό των polyubiquitinated προϊόντων πρωτεΐνης DVL3 ((Ub) n-DVL3). Τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντι-DVL3, και τα ανοσοϊζήματα ανιχνεύθηκαν με αντι-ΗΑ. Η ίδια μεμβράνη επανα-διερευνήθηκαν με αντι-DVL3 για την ανίχνευση της έκφρασης της DVL3.

Η

ενεργοποιητές ΑΜΡΚ προωθήσει επίσης την υποβάθμιση του πρωτεασώματος της DVL3

Πολλά στοιχεία έχουν δείξει ότι DVLs είναι σφιχτά ρυθμίζεται από πρωτεασώματος μηχανισμών υποβάθμισης στην οποία η απώλεια των παραγόντων που εμπλέκονται στα μονοπάτια ουμπικουιτίνωση οδηγεί σε συσσώρευση DVLs [28], [38]. Έτσι, αιτιολογημένη ότι η υποβάθμιση του πρωτεασώματος θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως εναλλακτικό μηχανισμό που δόθηκε στη ενεργοποιητές ΑΜΡΚ μεσολάβηση μείωση DVL3. Χρησιμοποιήσαμε AM114, ένας αναστολέας του πρωτεασώματος, για να καταστείλει ουμπικιτίνης /υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Μετά συν-θεραπεία με AM114 και μετφορμίνη, αποκαταστάθηκε έκφραση DVL3 παρατηρήθηκε σε C33A αλλά όχι σε SiHa και HeLa κύτταρα (Σχήμα 5Β και 5Γ). Η

in vivo δοκιμασία

ουβικιτινίωση Αποδείχθηκε περαιτέρω ότι DVL3 σε κύτταρα C33A μπορούσε να υποβαθμιστεί μέσω μονοπατιού ουβικουϊτίνης /πρωτεασώματος επειδή παρατηρήθηκε ο σχηματισμός DVL3-ουβικουιτινωμένης προϊόντα κατά την κατεργασία της μετφορμίνης και τέτοια DVL3-ουβικουιτινωμένης προϊόντα ενισχύεται περαιτέρω όταν συν-θεραπεία είτε με AM114 ή MG132 (Σχήμα 5D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αποικοδόμηση του πρωτεασώματος παίζει επίσης ένα ρόλο στην μείωση του DVL3 διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι DVL3 ήταν παρεκκλίνοντα υπερ-εκφράζεται και σημαντικά συσχετίζεται με αυξημένη β-κατενίνης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι DVL3 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μέσω ενεργοποίησης Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι /β-κατενίνης. Το πιο σημαντικό, ασχοληθήκαμε την πιθανή χρήση του ΑΜΡΚ ενεργοποιητές στη μείωση DVL3 και συνεπώς αναστέλλοντας την αυχενική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Άλλωστε, αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει τις πιθανές μοριακών μηχανισμών του πώς ΑΜΡΚ ενεργοποιητές βλάψουν τραχήλου ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μέσω της γειτονικής παρεμβολής μεταξύ ΑΜΡΚ και σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης.

ανώμαλη ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι έχει τεκμηριωθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του τραχήλου [39]. Πράγματι, ενδείξεις τοποθέτησης έχουν δείξει ότι DVLs οι οποίες είναι θετικοί ρυθμιστές της /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε μία ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. Οι υπερεκφράζεται DVLs συνδέονται στενά με την αυξημένη δραστικότητα /β-κατενίνης Wnt σε ανθρώπινους καρκίνους [31], [32], [47]. Ωστόσο, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους λειτουργικούς ρόλους του DVLs στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Εδώ, παρατηρήσαμε ότι DVL3, αλλά ούτε DVL1 ούτε DVL2, ήταν σημαντικά επάνω ρυθμισμένη και που σχετίζονται με την επαυξημένη δραστηριότητα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης και του τραχήλου της μήτρας ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Πολυάριθμες μελέτες έχουν αναφέρει ότι οι ανάντη κινάσες των ΑΜΡΚ, όπως LKB1, συχνά μεταλλάσσεται και να διαγραφεί στο πνεύμονα, του μαστού και του τραχήλου της μήτρας ειδικά [21], [48], [49], μειώνοντας έτσι τις δραστηριότητες ΑΜΡΚ για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Πράγματι, η χαμηλή δραστηριότητα ΑΜΡΚ είναι μια κοινή εκδήλωση που ευνοεί τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη [15], [16]. Έτσι, ΑΜΡΚ είναι ένα κρίσιμο στόχο στη θεραπεία του καρκίνου. Εμείς και άλλες ομάδες έχουν δείξει προηγουμένως ότι διάφορα ενεργοποιητές ΑΜΡΚ θα μπορούσε να καταστείλει τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη [21], [22], [50]. Πάντως, οι μοριακοί μηχανισμοί της καταστολής παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη. Προηγουμένως, η ομάδα Kohno έδειξε ότι η μετφορμίνη μείωσε το επίπεδο πρωτεΐνης του β-κατενίνης μέσω ρύθμισης εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση του αποικοδόμηση [51]. Αυτό μας έδωσε μια ένδειξη ότι η μετφορμίνη μπορεί να ρυθμίζει ανοδικά ρυθμιστές της Wnt /β-κατενίνης καταρράκτη σηματοδότησης. Εδώ, δείξαμε ότι η αξιοσημείωτη μείωση του DVL3 μπορούσε να προκληθεί από πολλαπλούς ενεργοποιητές ΑΜΡΚ, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιητές καθολικά μειώσει DVL3. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές σχετικά με την επίδραση κατά των όγκων της μετφορμίνης μέσω προς τα κάτω ρύθμιση του επιπέδου CyclinD1 στον καρκίνο του προστάτη και του καρκίνου του μαστού [52], [53], η μείωση της έκφρασης DVL3 είναι επίσης σε ταυτόχρονη με τα μειωμένα επίπεδα β- κατενίνης και κατάντη στόχο της, CyclinD1, το οποίο είναι υπεύθυνο για τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Παραδόξως, η μετφορμίνη επηρεάζει μόνο το επίπεδο της πρωτεΐνης του DVL3 αλλά όχι το mRNA του, αναφέροντας ότι η ρύθμιση της DVL3 διαμεσολαβείται από ΑΜΡΚ ενεργοποιητές στηρίζεται στη μετα-μεταγραφική τροποποίηση.

Όπως πολλούς ενεργοποιητές ΑΜΡΚ θα μπορούσε να μειώσει DVL3, έχουμε σκεφτεί ότι ΑΜΡΚ δραστηριότητα είναι απαραίτητη σε τέτοιες ρυθμίσεις. Για να δοκιμαστεί εάν ενεργοποιητές ΑΜΡΚ ασκούν τη δράση τους επί DVL3 μέσω της ενεργοποίησης του ΑΜΡΚ, ενός αναστολέα ΑΜΡΚ, ένωση Γ, συν-θεραπεία με μετφορμίνη σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα για να αντισταθμίσει την επίδραση της ενεργοποίησης ΑΜΡΚ. Όπως ήταν αναμενόμενο, η ένωση Γ υποχώρησαν τη λειτουργία της μετφορμίνης στην εξασθένηση της έκφρασης DVL3. Αυτά τα ευρήματα πρόδηλο ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιητές θα μπορούσαν να μειώσουν DVL3 μέσω ρύθμισης δραστικότητας ΑΜΡΚ, και τέτοια επίδραση δεν οφείλεται σε λειτουργίες εκτός στοχευμένη ΑΜΡΚ ενεργοποιητές ». Πράγματι,

δοκιμασίες in vitro

πολλαπλασιασμού κυττάρου αποκάλυψε επίσης ότι η χρήση του ΑΜΡΚ ενεργοποιητές (π.χ. μετφορμίνη) θα μπορούσε να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Παρέχουμε στερεό αποδείξεις ότι ΑΜΡΚ ενεργοποιητές, ειδικά μετφορμίνη, ασκούν μια προς τα κάτω ρύθμιση επίδραση επί DVL3 και ως εκ τούτου να μειώσει τα επίπεδα έκφρασης του β-κατενίνης και CyclinD1, και τελικά εξασθενεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Το πιο σημαντικό, είμαστε η πρώτη που δείχνει ότι η ΑΜΡΚ ενεργοποιητές ασκούν αντι-πολλαπλασιαστική δράση τους μέσω της μείωσης DVL3 και τη δραστηριότητα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης. ενεργοποίηση ΑΜΡΚ παίζει ένα ρόλο στην απαιτούμενη καταστολής της ανάπτυξης όγκων σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.