Αφηρημένο

Ιστορικό

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης βρίσκεται σε μόνο ένα μικρό υποσύνολο (2-6%) των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη να δημιουργηθεί μια ορθολογική διαγνωστικό αλγόριθμο για να εντοπίσει αυτό το σπάνιο αλλά σημαντικό σύντηξης στον καρκίνο του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση των

EGFR /KRAS

μετάλλαξη και

ALK

αναδιάταξη σε συνολικά 360 χειρουργικά καρκίνων του πνεύμονα.

ALK

αναδιάταξη εξετάστηκε από 3 αναλύει: multiplex αντίστροφη μεταγραφή-PCR, φθορισμού

in situ

υβριδισμού (FISH), και ανοσοϊστοχημεία (IHC) με τη μέθοδο παρένθετα αντισώματος με ενισχυμένη πολυμερή. Ένα σύστημα βαθμολόγησης χρησιμοποιήθηκε για την IHC (iScore). Ένα σύνολο δοκιμής (202 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μη επιλεγμένων) χρησιμοποιήθηκε για την πρόταση μιας διαγνωστικής αλγόριθμο. Αυτός ο διαγνωστικός αλγόριθμος επικυρωθεί σε 158 ασθενείς με

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη αρνητικά αδενοκαρκίνωμα.

Αποτελέσματα

ALK

αναδιάταξη εντοπίστηκε σε 2 ασθενείς (1,0%) από το σύνολο των δοκιμών και οι δύο αδενοκαρκινώματα ήταν αρνητικά για

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις. Τα αποτελέσματα των ψαριών και RT-PCR ήταν εντελώς συμφωνημένα. Η υψηλότερη iScore 3 βρέθηκε μόνο στα 2 θετικές περιπτώσεις. Προτάθηκε Ένα διαγνωστικό αλγόριθμο: IHC προσυμπτωματικού ελέγχου για

ALK

αναδιάταξη ακολουθούμενη από επιβεβαιωτική FISH. Στο σύνολο επικύρωσης, 8 περιπτώσεις (5,1%) είχαν iScore 3 και ήταν θετικά για τα ψάρια, ενώ οι υπόλοιπες περιπτώσεις είχαν iScore 0 και ήταν αρνητικά για FISH.

Συμπεράσματα

Προβολή για

ALK

αναδιάταξη με IHC ακολουθείται από επιβεβαιωτική FISH είναι μια ορθολογική διαγνωστικό αλγόριθμο. Εάν χρειαστεί, οι ασθενείς μπορούν να επιλεγούν για τη διαλογή

ALK

αναδιάταξη από

EGFR

τους και

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης

Παράθεση:. Takamochi K, Takeuchi K , Hayashi Τ, Ω Σ, Suzuki Κ (2013) Μια Ορθολογική διαγνωστικό αλγόριθμο για την ταυτοποίηση των

ALK

Αναδιάταξη στον καρκίνο του πνεύμονα: Μια ολοκληρωμένη μελέτη της αντιμετωπίστηκαν χειρουργικά Ιάπωνες ασθενείς. PLoS ONE 8 (8): e69794. doi: 10.1371 /journal.pone.0069794

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 2 του Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 1 Αυγούστου του 2013

Copyright: © 2013 Takamochi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-ενισχύσεις για την Έρευνα του Καρκίνου από το Υπουργείο Υγείας, Εργασίας και Πρόνοιας της Ιαπωνίας (10103778, και από το Κάπνισμα Ίδρυμα Ερευνών και Μελετών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση να δημοσιεύει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Kengo Takeuchi καταβάλλεται μια αμοιβή για να χρησιμεύσει ως σύμβουλος του Nichirei που κατασκευάζει κιτ ανίχνευσης ALK και ως σύμβουλος της Mitsubishi, που αναφέρονται στο χειρόγραφο, και να λάβουν δικαιώματα για το κιτ. για δηλώθηκαν το υπόλοιπο συγγραφείς κανένας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

οι

Σημαντικές πρόοδοι στη μοριακή στοχευμένη θεραπεία για μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) έχουν γίνει τα τελευταία 10 χρόνια. Το 2004, ο προσδιορισμός των σωματικών μεταλλάξεων στο

επιδερμικού αυξητικού

υποδοχέα του παράγοντα (

EGFR

) γονιδίου παρείχε την πρώτη γεύση από μια κλινικά σχετική ογκογονίδιο NSCLC [1], [2]. Επί του παρόντος, οι αναστολείς του EGFR κινάσης τυροσίνης (TKIs), όπως gefitinib και erlotinib, είναι οι θεραπείες πρώτης γραμμής για ασθενείς με προχωρημένο

EGFR

μεταλλαχθεί NSCLC. Το 2007, το πρώτο ογκογονίδιο σύντηξης, η

εχινοδερμάτων microtubule- σχετίζονται πρωτεΐνες όπως 4

(

EML4

) –

αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης

(

ALK

) γονίδιο, ταυτοποιήθηκε σε NSCLC [3].

EML4

–

ALK

είναι ένα ογκογόνο οδηγού και ενεργοποιεί καθοδικά μονοπάτια σηματοδότησης. Μια πρόσφατη δοκιμή φάσης Ι έδειξαν μια δραματική απάντηση στην αναστολέα ALK (crizotinib) στο

EML4

–

ALK

-θετικό NSCLCs: το συνολικό ποσοστό ανταπόκρισης ήταν 57% και το ποσοστό ελέγχου της νόσου ήταν 90 % [4]. Αυτό οδήγησε σε ταχεία έγκριση της crizotinib από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία του προχωρημένου NSCLC με

ALK

αναδιατάξεις. Φάσης 3 κλινικές δοκιμές βρίσκονται σε εξέλιξη στην οποία οι κλινικές εκβάσεις των ασθενών crizotinib-σε σύγκριση με αυτούς που έλαβαν καθιερωμένες θεραπείες πρώτης και δεύτερης γραμμής σε προχωρημένο

ALK

-θετικό NSCLCs.

EGFR

μετάλλαξη είναι μια σχετικά συχνή μετάλλαξη οδηγό σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και βρίσκεται στο 10% περίπου των λευκών ασθενών και σε πάνω από το 40% των ασθενών της Ανατολικής Ασίας [5]. Ωστόσο,

ALK

ανακατατάξεις έχουν βρεθεί μόνο σε ένα μικρό υποσύνολο των NSCLC (2-5%) και περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (4-6%), ανεξάρτητα από τη φυλή [6] – [14]. Διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιούνται σήμερα για την αναγνώριση

ALK

ανακατατάξεις: αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR), φθορισμού

in situ

υβριδισμού (FISH), και ανοσοϊστοχημεία (IHC). Οι μέθοδοι αυτές έχουν διαφορετικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα και απομένει να προσδιοριστεί ποια είναι η καλύτερη μέθοδος για τη διαλογή μεγάλης κλίμακας της

ALK

αναδιάταξη στον καρκίνο του πνεύμονα σε ένα κλινικό περιβάλλον.

Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να δημιουργηθεί μια ορθολογική διαγνωστικό αλγόριθμο για να εντοπίσει αυτό το σπάνιο αλλά σημαντικό αναδιάταξη στον καρκίνο του πνεύμονα σε τακτική κλινική πρακτική. Εδώ, θα υποβάλει έκθεση σχετικά με ποιες μεθόδους και ποιοι συνδυασμοί θα πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ακριβή διάγνωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σε δείγματα αποθηκεύονται στον ιστό τράπεζα, με την έγκριση του διοικητικού συμβουλίου θεσμικής αναθεώρησης (IRB) της Juntendo Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο τράπεζα ιστών, προκειμένου να συλλέξει δείγματα για μελέτες που θα πρέπει να εγκριθεί από το IRB στο μέλλον, λάβαμε γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς πριν από τη χειρουργική επέμβαση για τη συλλογή και την αποθήκευση των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης. Το περιεχόμενο αυτής της μελέτης κρίθηκαν ηθικά αποδεκτή, και η IRB ενέκρινε τη χρήση των δειγμάτων που αποθηκεύονται στην τράπεζα ιστών, χωρίς να λάβει νέα ενημερωμένη συγκατάθεση.

Test Set

Μεταξύ Μαρτίου 2010 και το Φεβρουάριο του 2011 , 231 ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε εκτομή πνευμονικού. Κατεψυγμένα και σταθεροποιημένα με φορμαλίνη δείγματα (FFPE) ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από 202 ασθενείς με NSCLCs (148 αδενοκαρκινώματα, 39 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, 6 αδενοχοληδωτό καρκινώματα, 4 μεγάλων κυττάρων νευροενδοκρινικών καρκινώματα, 3 μικρά κυτταρικά καρκινώματα, και 2 πλειομορφικές καρκινώματα) χρησιμοποιήθηκαν ως μια σειρά δοκιμών για τον εντοπισμό

ALK

αναδιάταξη. Όλες οι περιπτώσεις εξετάστηκαν από πολλαπλή RT-PCR (χρησιμοποιώντας κατεψυγμένα υλικά), τα ψάρια, και IHC (χρησιμοποιώντας FFPE ιστούς). Ερμηνείες αυτών των μοριακών αναλύσεων για

ALK

αναδιάταξη έγιναν ανεξάρτητα, χωρίς τη γνώση των αποτελεσμάτων της κάθε εξέτασης. Προτείναμε ένα διαγνωστικό αλγόριθμο για την αναγνώριση του

ALK

αναδιάταξη με βάση το συνδυασμό των σημαντικών παθολογικών και μοριακών προγνωστικών και τις χρήσιμες διαγνωστικές μεθόδους.

επικύρωσης που

Στη συνέχεια, το προτεινόμενο διαγνωστικό αλγόριθμο για

ALK

αναδιάταξη ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα επιπλέον 158 διαδοχικούς ασθενείς με

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη αρνητικά αδενοκαρκίνωμα που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή μεταξύ Μαρτίου 2011 και Απρίλιο 2012.

ALK

αναδιάταξη αναλύσεις έγιναν για όλα τα δείγματα τόσο από FISH και ανοσοϊστοχημείας. Ερμηνείες των ψαριών και IHC έγιναν ανεξάρτητα, χωρίς τη γνώση των αποτελεσμάτων της κάθε εξέτασης.

ALK

αναδιάταξη αξιολογήθηκε επίσης με RT-PCR για

ALK

θετικές περιπτώσεις με FISH ή IHC, όταν επαρκή δείγματα RNA που εξάγεται από ιστούς όγκων ήταν διαθέσιμα.

Και στις δύο ομάδες , περιπτώσεις θετικά για

ALK

αναδιάταξη με FISH και /ή με πολλαπλή RT-PCR ορίστηκαν να ALK-θετική. Ούτε χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, ούτε θεραπεία με μοριακό στόχο χρησιμοποιώντας EGFR-TKIs ή αναστολέα ALK έγινε προεγχειρητικά σε οποιοδήποτε από τους ασθενείς σε αυτή τη μελέτη.

ALK

Multiplex RT-PCR

στο χειρουργείο, 3-5 mm

3 κύβους του φρέσκου ιστού καρκίνου του πνεύμονα αποκόπηκαν και τοποθετήθηκαν αμέσως σε 1.0 ml αντιδραστηρίου RNAlater RNA Σταθεροποίηση (Qiagen, GmbH, Γερμανία, Hilden) για 24-48 ώρες στους 4 ° C για τη σταθεροποίηση του RNA. Στη συνέχεια, τα δείγματα όγκων φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Ολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένες τομές ιστού σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Multiplex RT-PCR πραγματοποιήθηκε για ανίχνευση

EML4

–

ALK

παραλλαγές σύντηξης, όπως την παραλλαγή 1, 2, 3α, 3β και [15]. Εάν οποιαδήποτε PCR προϊόντα άλλα από αυτά τα 4 παραλλαγές ταυτοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης, αλληλουχίες τους εξετάστηκαν από 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

ALK

FISH

ανάλυση FISH έγινε σε τομές ιστών 4 μm FFPE χρησιμοποιώντας το

ALK

σπάσει-εκτός ανιχνευτές [Vysis LSI ALK (2p23) Διπλή χρώμα, Break Εκτός Αναδιάταξη Probe? Abbott Molecular, Chicago, IL, USA] και 3

«

(κόκκινο) και 5

«

(πράσινο) τα σήματα που χωρίζονται από ≥2 διαμέτρους σήμα θεωρήθηκαν διάσπαση (Σχήμα 1). Δείγματα θεωρήθηκαν θετικά για

ALK

αναδιάταξη όταν πάνω από το 15% των καρκινικών κυττάρων αποδεικνύεται διάσπαση σήματα ή σήματα ενιαίο κόκκινο. Τουλάχιστον 50 καρκινικά κύτταρα εξετάστηκαν ανά δείγμα.

Διακριτές κόκκινο (παχύ βέλος) και πράσινο (λεπτό βέλος) διαλύεται σήματα υποδεικνύουν την

ALK

αναδιάταξη, και ένα σήμα σύντηξης (κεφαλή βέλους) αντιπροσωπεύει άγριου τύπου

ALK

γονίδιο.

Η

ALK IHC

Είμαστε προετοιμασμένοι τομές ιστών 4 μm FFPE για ανάλυση IHC, και τοποθετήθηκαν σε πλάκες σιλανίου με επικάλυψη . ALK Detection Kit (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan), η οποία βασίζεται στη μέθοδο παρεμβαλλόμενες πολυμερές αντίσωμα με ενισχυμένη (iAEP) [16] και περιλαμβάνει τον κλώνο 5A4 ως το πρωτογενές αντίσωμα αντι-ALK, χρησιμοποιήθηκε για IHC. Αυτή η εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος επιτρέπει την αξιόπιστη ανίχνευση των διαφόρων τύπων των πρωτεϊνών σύντηξης ΑΙΚ σε δείγματα ιστού FFPE, ενώ είναι συνήθως δύσκολο να ανιχνευθούν EML4-ALK με τη συμβατική μέθοδο IHC λόγω του ασθενή δράση του

EML4

υποκινητή ότι οδηγεί την έκφραση του

EML4

–

ALK

mRNA

όγκου κυττάρων στο κυτταρόπλασμα που βάφτηκαν ισχυρότερη από κύτταρα αρνητικού ελέγχου ορίστηκαν ως IHC θετική.. Ημι-ποσοτική εκτίμηση έγινε με αξιολόγηση του ποσοστού των IHC-θετικών κυττάρων όγκου. ALK IHC βαθμολογίες με χρήση της μεθόδου iAEP (iScore) αποδόθηκαν ως εξής: 0 = καμία χρώση κύτταρα? 1 = 0-50% χρώση κυττάρων όγκου? 2 = 50-80% χρωματισμένο καρκινικά κύτταρα ή & gt? 80% χρωματισμένο καρκινικά κύτταρα με σημαντική μεταβλητότητα της έντασης χρώσης ( «μοτίβο συμβούλιο πούλι»)? 3 = & gt? 80% χρωματισμένο καρκινικά κύτταρα, χωρίς να σημειώνονται διακυμάνσεις της χρώσης ένταση

EGFR

και

KRAS

Αναλύσεις Μετάλλαξη

Το γονιδιακό DNA εξήχθη από. 3-5 mm

3 κύβοι των κατεψυγμένων δειγμάτων νωπών καρκίνο του πνεύμονα ιστών από χειρουργικά δείγματα. Το νουκλεϊκό οξύ (ΡΝΑ-LNA) μέθοδος πεπτιδίου νουκλεϊκού οξέος-κλειδωμένη σφιγκτήρα PCR [17] χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό

EGFR

μεταλλάξεις. Η PNA-μεσολάβηση μέθοδος σύσφιξης PCR [18] χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό

KRAS

μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13. Μοριακή ανάλυση για το

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις και η

ALK

αναδιάταξη διεξήχθησαν σε Mitsubishi Chemical Corporation Medience στο Τόκιο, Ιαπωνία

Στατιστικές αναλύσεις

κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες όπως η ηλικία, το φύλο, καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο προεγχειρητική ορού επίπεδο. (CEA) , ιστολογία, παθολογικές στάδιο, το μέγεθος του όγκου, κομβική θέση, λεμφικό διαπερατότητας και την εισβολή των αιμοφόρων αγγείων συγκρίθηκαν μεταξύ του συνόλου δοκιμής και του συνόλου επικύρωσης και μεταξύ των ασθενών με

ALK

-θετικό και

ALK

-αρνητικοί αδενοκαρκινώματα. Chi-square test ή ακριβής δοκιμασία Fisher χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Ένα

P

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο στατιστικού λογισμικού SPSS (έκδοση 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Αποτελέσματα

Συγκρίσεις κλινικοπαθολογοανατομικών και μοριακών χαρακτηριστικών των ασθενών μεταξύ της δοκιμής σύνολο και το σύνολο επικύρωσης συνοψίζονται στον πίνακα 1. Υπήρχαν περισσότεροι ασθενείς με παθολογικό στάδιο Ι της νόσου στο σύνολο επικύρωσης από το σύνολο ελέγχου (

P

= 0,004). Το ποσοστό των ασθενών με όγκο μεγαλύτερο από 30 mm (

P

= 0.015) και σε ασθενείς με όγκους με λεμφικού διαπερατότητας (

P

= 0.023) ή αγγειακή διήθηση (

P

= 0.011) ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα δοκιμής σε σύγκριση με το σύνολο επικύρωσης.

η

Πρόταση της ορθολογικής διάγνωσης Αλγόριθμος για

ALK

Αναδιάταξη

em

ALK

αναδιάταξη ταυτοποιήθηκε σε 2 δείγματα (1,0%) από το σύνολο των δοκιμών και οι δύο περιπτώσεις ήταν αδενοκαρκίνωμα (2/148 αδενοκαρκινώματα? 1,4%).

ALK

αναδιάταξη ταυτίστηκε με συνέπεια από όλες τις 3 μεθόδους. Τα αποτελέσματα ήταν εντελώς συμφωνημένα μεταξύ RT-PCR και FISH. iScores ήταν 3 στα 2 ALK-θετικές περιπτώσεις, 2 σε 1 αρνητική περίπτωση, και 1 σε 2 αρνητικές περιπτώσεις (Σχήμα 2).

ALK

ανακατατάξεις και

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν σε αμοιβαία αποκλειστικό τρόπο, όπως αναφέρεται σε πολλά έγγραφα [6], [7], [9], [ ,,,0],12], [13], [19]. Ως εκ τούτου, θεωρείται ότι η διαγνωστική διαδικασία

ALK

αναδιάταξη θα μπορούσε να απλοποιηθεί ως εξής: εξέταση με IHC με τη μέθοδο iAEP ακολούθησε επιβεβαιωτική FISH στο

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη . -αρνητική αδενοκαρκινώματα πνεύμονα

Ρ3 και Ρ7 (Α και Β, αντίστοιχα), τα αδενοκαρκινώματα με βλεννώδες μοτίβο ηθμοειδή, έδειξε iScore 3 (Ε και F, αντίστοιχα)? Ν1 (C), πλακώδες καρκίνωμα έδειξαν iScore 1 (G)? Ν3 (D), μικροκυτταρικό καρκίνωμα έδειξαν iScore 2 (Η).

Η

Η επικύρωση μιας προτεινόμενα διαγνωστικά Αλγόριθμος για

ALK

Αναδιάταξη

158

EGFR

και

εντοπίστηκαν KRAS

μετάλλαξη αρνητική αδενοκαρκινώματα, 8 περιπτώσεις (5,1%) με iScore 3 και 150 περιπτώσεις με iScore 0. FISH ήταν θετικά σε όλες τις 8 iScore 3 περιπτώσεις και αρνητική σε άλλες περιπτώσεις. Η παρουσία του

ALK

αναδιάταξη αξιολογήθηκε με RT-PCR σε 5 από τα 8 αληθινών θετικών περιπτώσεων. Όλες οι 5 περιπτώσεις ήταν θετικά με RT-PCR. Τα αποτελέσματα αυτά συνοψίζονται στο Σχήμα 3. Οι συσχετίσεις των IHC και FISH σε όλους τους 360 ασθενείς (δοκιμή και επικύρωση σετ) φαίνονται στον Πίνακα 2.

Η

Τα κλινικοπαθολογοανατομικών Χαρακτηριστικά του ALK-θετικών Αδενοκαρκίνωμα

Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά του αδενοκαρκινώματος σύμφωνα με

ALK

αναδιάταξη κατάσταση συνοψίζονται στον πίνακα 3. Αν και το μέγεθος του όγκου ήταν μικρότερη (

P

= 0,034), ALK-θετικό αδενοκαρκινώματος έδειξε πιο επιθετική βιολογικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με ALK-αρνητικά αδενοκαρκίνωμα: πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου (

P

= 0,014) και πιο συχνή εμπλοκή λεμφαδένα (

P

= 0,002).

ALK

ανακατατάξεις βρέθηκαν μόνο σε αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας? Ωστόσο, διάφορα κυρίαρχα ιστολογικές υποτύπων παρατηρήθηκαν μεταξύ τους. Δεν υπάρχει συγκεκριμένη μορφολογικό χαρακτηριστικό για ALK-θετικό αδενοκαρκινώματα εντοπίστηκε σε περιπτώσεις μας. Επιπλέον, εντός του όγκου ιστολογική ετερογένεια παρατηρήθηκε επίσης σε κάθε όγκου (Πίνακας 4).

Η

Συζήτηση

Μια ακριβής, αξιόπιστη, επαναλήψιμη μέθοδο για την ανίχνευση του

ALK

αναδιάταξη είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των ασθενών με NSCLC που είναι υποψήφιοι για θεραπεία με αναστολέα ALK (crizotinib), ένα φάρμακο που έχει δείξει δραματική κλινική ανταπόκριση σε πρόσφατη κλινική δοκιμή [4]. Επειδή η συχνότητα εμφάνισης

ALK

αναδιάταξη είναι χαμηλή σε NSCLC ασθενείς μη επιλεγμένα (2-5%) [6] – [14], είναι απαραίτητο να διευκρινίσει κλινικοπαθολογοανατομικών και μοριακά χαρακτηριστικά του ALK-θετικού καρκίνου του πνεύμονα για τη βελτίωση της διαλογής αποδοτικότητα.

ALK

αναδιάταξη έχει αναφερθεί ότι συνδέεται με μικρότερη ηλικία του ασθενούς, ποτέ ή φως ιστορικό καπνίσματος, και το αδενοκαρκίνωμα ιστολογίας [7] – [9], [12] – [14], [19]. Επιπλέον, οι περισσότεροι ALK-θετικό καρκίνο του πνεύμονα είναι αμοιβαία αποκλειόμενες να

EGFR

και

KRAS

μεταλλάξεις [6], [7], [9], [12], [13], [19 ]. Στην παρούσα μελέτη, το ποσοστό ανίχνευσης των

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης αυξήθηκε από 1,0% (2/202 ασθενείς με μη επιλεγμένων καρκίνο του πνεύμονα) στη δοκιμή που σε 5,1% (8/158 ασθενείς με

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη αρνητικά αδενοκαρκίνωμα) στο σύνολο επικύρωσης. Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι εξετάζει ιστολογία και

EGFR

και

KRAS

καταστάσεις μετάλλαξη εμπλουτίζει την ALK-θετικό πληθυσμό με ελάχιστο κίνδυνο για μια ακατάλληλη αποκλεισμό δυνητικά θετικούς ασθενείς.

Σε μας σειρά, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ηλικία και την κατάσταση του καπνίσματος μεταξύ ALK-θετικών και ALK-αρνητικούς ασθενείς. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι τα κλινικά χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία και το κάπνισμα κατάσταση, δεν θα πρέπει να χρησιμοποιείται για την επιλογή των ασθενών για τη διαλογή ΑΙΚ. Ιστολογικά, στερεά, κυψελοειδή, πρότυπο ανάπτυξης ηθμοειδή με ή χωρίς σφραγίδα χαρακτηριστικά κύτταρο δακτυλίου έχουν αναφερθεί ότι είναι τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του ALK-θετικών καρκίνων του πνεύμονα [7], [14], [19]. Ωστόσο, βρήκαμε καμία συγκεκριμένη μορφολογικό χαρακτηριστικό για ALK-θετικά αδενοκαρκινώματα, και οι περισσότεροι ήταν ιστολογικά ετερογενείς, δηλαδή ένα μίγμα των διαφόρων μοντέλων ανάπτυξης (Πίνακας 3). Ως εκ τούτου, τα μορφολογικά χαρακτηριστικά και δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για την προ-επιλογή.

Αν και προσδιορισμός FISH έχει χρησιμοποιηθεί για την εγγραφή τους ασθενείς με ALK-θετικούς όγκους σε κλινικές δοκιμές [4], ένα πραγματικό χρυσό τυποποιημένη μέθοδος για τον προσδιορισμό

ALK

αναδιάταξη δεν έχει τεκμηριωθεί. Μέχρι σήμερα, έχουν υπάρξει μόνο λίγες αναφορές εξέταση

ALK

αναδιάταξη στον καρκίνο του πνεύμονα ταυτόχρονα με IHC, FISH, και RT-PCR, επιτρέποντας έτσι την άμεση σύγκριση αυτών των προσδιορισμών [20]. Στην παρούσα μελέτη, ταυτόχρονα εκτελείται IHC, FISH, και RT-PCR για όλους τους ασθενείς του συνόλου δοκιμής, και εκτελείται τόσο IHC και FISH για όλους τους ασθενείς του συνόλου επικύρωσης. Τα 10 θετικά και 350 αρνητικά αποτελέσματα σε ψάρια ήταν εντελώς συνδυάζεται με iScore 3 και 0, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, επιβεβαιωτική FISH θα μπορούσε να παραλειφθεί στις περιπτώσεις με iScore 3 ή 0, ενώ θα μπορούσε να απαιτηθεί σε περιπτώσεις με iScore 2 ή 1. Αν μια περίπτωση με μη αδενοκαρκίνωμα κρίνεται iScore 3, επιβεβαιωτική δοκιμή θα πρέπει να γίνει. Lung καρκίνους χωρίς

ALK

αναδιάταξη μερικές φορές εμφανίζει θετικότητα σε εξαιρετικά ευαίσθητο αντί-ALK IHC, όπως iAEP, ειδικά σε περιπτώσεις με διαφοροποίηση νευροενδοκρινική (μικρό-κυττάρων, μεγάλο κύτταρο-νευροενδοκρινών, και άλλα καρκινώματα με εστιακά νευροενδοκρινή διαφοροποίηση) [21].

στην παρούσα μελέτη, ανοσοϊστοχημική ταυτοποίηση των ALK-θετικού καρκίνου του πνεύμονα διεξήχθη σύμφωνα με ένα σύστημα βαθμολόγησης. Το σύστημα, iScore, αναπτύχθηκε για αντι-ΑΙΚ ανοσοϊστοχημεία με τη μέθοδο iAEP. Χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή των ασθενών στην κλινική δοκιμή ενός αναστολέα ALK (AF802 /CH5424802) με ένα ποσοστό αντικειμενικής ανταπόκρισης 93,5%, υποδεικνύοντας την κλινική χρησιμότητα της μεθόδου iAEP (το σύστημα βαθμολόγησης που χρησιμοποιείται στην κλινική δοκιμή δεν έχει ακόμη κληθεί iScore σε ο χρόνος της δοκιμής, αλλά ήταν η ίδια σε κριτήρια βαθμολόγησης) [22]. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα της IHC, FISH και προσδιορισμούς RT-PCR ήταν εντελώς συμφωνημένα μέσω διαφόρων παραλλαγών στην παρούσα μελέτη, ενώ μια μελέτη που χρησιμοποιεί άλλες ρυθμίσεις σε IHC και RT-PCR έδειξε ότι τα αποτελέσματα των 3 δοκιμασιών συμφωνούσαν στην παραλλαγή 3 της EML4-ALK αλλά όχι στην παραλλαγή 1 [20]. ποσοστά ALK-θετικότητα στην παρούσα μελέτη, 2,8% στο σύνολο του πληθυσμού και 5,1% στην ομάδα του

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη αρνητικά αδενοκαρκινώματα είναι συνεπείς με εκείνες που ελήφθησαν κατά την προηγούμενη πολλά σπουδές. Από την άποψη της ALK-αρνητικών περιπτώσεων, σε όλες τις περιπτώσεις με iScore 0, 1 ή 2 βρέθηκαν αρνητικά για

ALK

αναδιάταξη, με αποτέλεσμα μια αρνητική προγνωστική αξία 100%. Στο σύνολό τους, αντι-ALK IHC με τη μέθοδο iAEP κρίνεται από iScore είναι ένα κλινικά-επικυρωμένη αξιόπιστο κύριο εργαλείο ελέγχου.

Το σύστημα iScore μπορεί να είναι παρόμοια με εκείνη για HER2 στον καρκίνο του μαστού [23]. Ωστόσο, σε αντίθεση με το ποσοστό των διφορούμενων αποτελεσμάτων σε HER2 IHC που απαιτούν επιβεβαιωτική FISH (~ 10%), το ποσοστό των iScore 2 και 1 ήταν μόνο 0,83% (3 360) στην παρούσα μελέτη. Επιπλέον, στις περιπτώσεις που με iScore 3, σχεδόν όλα τα κύτταρα του όγκου ανοσοχρωματίστηκε, η οποία είναι συνεπής με την άποψη ότι όλα τα καρκινικά κύτταρα του

ALK

αναδιατάσσονται καρκίνους λιμάνι

ALK

γονίδια σύντηξης, αν και η κατώτερο όριο των θετικών κυττάρων όγκου καθορίστηκε σε 80% για iScore 3. σε αντίθεση με άλλα συστήματα βαθμολόγησης για αντι-ΑΙΚ IHC, ένταση χρώσης, το οποίο μπορεί να είναι ένας λιγότερο αντικειμενικός δείκτης από θετικό ρυθμό των κυττάρων του όγκου, δεν είναι βασικά εξετάζεται iScore, με εξαίρεση την οι περιπτώσεις δείχνουν «μοτίβο συμβούλιο πούλι». Αυτά τα χαρακτηριστικά της iScore να είναι εύκολο για τους ερευνητές να σκοράρει τα δείγματα χρωματίστηκαν για ALK με τη μέθοδο iAEP.

RT-PCR είναι θεωρητικά η πιο αξιόπιστη δοκιμασία για την ανίχνευση μεταγραφές μεταλλαγμένα, διότι μπορεί να αποδείξει την άμεση απόδειξη της μετατόπισης [ ,,,0],3], [15], [24]. Ωστόσο, σε NSCLC, υπάρχουν πολλές παραλλαγές του

EML4

–

ALK

σύντηξης, και

ALK

μπορεί μερικές φορές να έχουν άλλους εταίρους σύντηξης, όπως

ΜΟΚ

[25],

KIF5B

[16], [26] και

KLC1

[27]. Ως εκ τούτου, η RT-PCR μπορεί να χάσετε

ALK

συγχωνεύσεις που δεν έχουν δοκιμαστεί ειδικά για. Ως εκ τούτου, από τις 3 αναλύσεις, πιστεύουμε RT-PCR δεν θα πρέπει να πραγματοποιείται μόνο του όταν ένας ιστός είναι διαθέσιμο για IHC ή FISH.

Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και το μέγεθος του

ALK

-θετικό αδενοκαρκίνωμα ήταν σημαντικά μικρότερο από

ALK

-αρνητικοί αδενοκαρκίνωμα, το ποσοστό συμμετοχής λεμφαδένων ήταν σημαντικά πιο συχνές. Αυτή η παρατήρηση ήταν συνεπές με μια μελέτη κοόρτης μεγάλης κλίμακας διερεύνηση της κλινικοπαθολογοανατομικών επιπτώσεις της

ALK

αναδιάταξη σε χειρουργικά ο καρκίνος του πνεύμονα [28]. Όπως Paik

et al.

Περιγράφεται [28],

ALK

-θετικό αδενοκαρκινώματα μπορεί να κάνει μετάσταση στους λεμφαδένες νωρίς, παρά το μικρό μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου.

διαγνωστικές μας αλγόριθμος προτάθηκε με βάση τα δεδομένα χρησιμοποιώντας χειρουργικά δείγματα. Ως εκ τούτου, είναι απολύτως χρήσιμη για να ληφθεί η

ALK

κατάσταση για περαιτέρω θεραπευτική σχεδιασμού σε ασθενείς με μετεγχειρητική υποτροπές. . Sakairi

et al

[29] ανέφερε ότι

EML4

–

ALK

αξιολόγηση γονίδιο σύντηξης με IHC, FISH, και RT-PCR ήταν δυνατή με τη χρήση μικρών δειγμάτων που λαμβάνονται από ενδοβρογχικούς υπερηχογραφικό έλεγχο διαβρογχική αναρρόφηση με βελόνα από λεμφαδένες με μεταστατικούς όγκους. Ως εκ τούτου, ο αλγόριθμος μας είναι πολύ πιθανό να εφαρμόζεται σε ασθενείς με προχωρημένη ή ανεγχείρητο νόσο για τους οποίους είναι συνήθως διαθέσιμα μόνο μικρά δείγματα (βιοψία ή κυτταρολογική εξέταση).

Εν περιλήψει, όσο αντι-ALK ανοσοϊστοχημεία εκτελείται με μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδος όπως iAEP και το αποτέλεσμα χρώση είναι κατάλληλα ερμηνεύεται, ο έλεγχος για

ALK

αναδιάταξη με IHC ακολουθείται από επιβεβαιωτική FISH είναι ένα αξιόπιστο διαγνωστικό αλγόριθμο (Σχήμα 4). Επιπλέον, εάν αυτό είναι αναγκαίο, στένωση καθόδου σε ασθενείς με

EGFR

και

KRAS

μετάλλαξη αρνητικά αδενοκαρκινώματα φαίνεται ορθολογική, με αποτέλεσμα ελάχιστο κίνδυνο για μια ακατάλληλη αποκλεισμό δυνητικά θετικούς ασθενείς.

Για υποθέσεις με iScore 3 ή 0, επιβεβαιωτική FISH ή RT-PCR μπορεί να παραλειφθεί. Ωστόσο, αν μια υπόθεση με μη αδενοκαρκίνωμα κρίνεται iScore 3, επιβεβαιωτική δοκιμή θα πρέπει να γίνει. Lung καρκίνους χωρίς

ALK

αναδιάταξη μερικές φορές εμφανίζει θετικότητα σε εξαιρετικά ευαίσθητο αντί-ALK IHC, όπως iAEP, ειδικά σε περιπτώσεις με διαφοροποίηση νευροενδοκρινική (μικρό-κυττάρων, μεγάλο κύτταρο-νευροενδοκρινών, και άλλα καρκινώματα με εστιακά νευροενδοκρινή διαφοροποίηση) .

Η