Αφηρημένο

Six1 είναι ένας από τους παράγοντες μεταγραφής που δρουν ως κύριος ρυθμιστές της ανάπτυξης και συχνά απορυθμίζεται σε καρκίνους. Ωστόσο, ο ρόλος του Six1 σε καρκίνο του παγκρέατος δεν είναι σαφής. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η σχετική έκφραση του mRNA Six1 αυξάνεται σε καρκίνο του παγκρέατος και συσχετίζεται με προχωρημένο στάδιο του όγκου.

In vitro

λειτουργικές δοκιμασίες καταδεικνύουν ότι αναγκαστική υπερέκφραση Six1 ενισχύει σημαντικά τον ρυθμό ανάπτυξης και πολλαπλασιασμού ικανότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Knockdown ενδογενούς Six1 μειώνει τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων δραματικά. Επιπλέον, Six1 προάγει την ανάπτυξη των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων σε μία δοκιμασία ξενομοσχεύματος. Δείχνουμε επίσης ότι η D1 γονίδιο που κωδικοποιεί κυκλίνης είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του Six1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Η υπερέκφραση του Six1 απορυθμίζει κυκλίνης D1 mRNA και της πρωτεΐνης, και ενισχύει σημαντικά τη δραστικότητα του προαγωγού D1 κυκλίνης σε κύτταρα PANC-1. Έχουμε αποδείξει ότι Six1 προωθεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιασμό με προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Six1 υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και μπορεί να συμβάλλει στην αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1

Παράθεση:. Li Ζ, Tian Τ, Lv F, Chang Υ, Wang Χ, Zhang L, et al. (2013) Six1 Προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος μέσω Η αναβάθμιση της κυκλίνης D1 έκφρασης. PLoS ONE 8 (3): e59203. doi: 10.1371 /journal.pone.0059203

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 23 Νοέμ 2012? Αποδεκτές: 12 Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από πόρους εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC, ΝΟ 81172118) και από επιχορηγήσεις από την Κίνα Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Επιστημών (με LZM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι η τέταρτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Έχει συχνά φτωχή πρόγνωση λόγω της έλλειψης αξιόπιστων νωρίς διαγνωστικών μεθόδων και αποτελεσματική θεραπεία [2]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη να βελτιωθεί η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της παγκρεατικής ογκογένεσης καρκίνου και να αναπτύξουν αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας.

Six1 είναι ένα θηλαστικό ομόλογο του γονιδίου sine oculis Drosophila και είναι εξαιρετικά διατηρημένη από Drosophila να ανθρώπους [3], [4]. Είναι εκφράζεται ευρέως σε πολλούς ιστούς κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης, ενώ η έκφραση του είναι χαμηλή ή απούσα στους περισσότερους ιστούς ενηλίκων [5]. Κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης, Six1 προάγει τον πολλαπλασιασμό προγονικών κυττάρων και την επιβίωση μέσω της ενεργοποίησης ή καταστολής της ένα ευρύ φάσμα των κατάντη γονιδίων στόχων [3], [6]. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή κατά την εμβρυογένεση μέσω επαγωγής μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) [7], [8]. Η σωστή έκφραση αυτού του γονιδίου είναι κρίσιμη για την ανάπτυξη των διαφόρων οργάνων όπως ο εγκέφαλος, το αυτί, το μάτι, των μυών, των νεφρών αισθητηριακές δομές, και κρανιοπροσωπικές δομές [7], [9], [10]. Εκτός από το ρόλο του Six1 στην πρόωρη ανάπτυξη, είναι συχνά misexpressed σε διάφορους όγκους όπως ο καρκίνος του μαστού [5], [11], όγκους Wilms ‘[12], ραβδομυοσαρκώματα [13], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [14], των ωοθηκών καρκίνος [15], [16], και του καρκίνου του τραχήλου [17], [18]. Το πιο σημαντικό, η misexpression της Six1 στον καρκίνο μπορεί να προκαλέσει αναπτυξιακά προγράμματα έξω από το πλαίσιο, συμβάλλοντας στην εμφάνιση του όγκου και της προόδου [19], [20]. Πρόσφατα, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του Six1 διευκολύνει την μετάσταση του καρκίνου του μαστού μέσω της σηματοδότησης ΤΟΡ-β, επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [21], και την επαγωγή της λεμφαγγειογένεσης μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του VEGF-C [22]. Η αναστολή της έκφρασης ενδογενούς Six1 καταστέλλει την ογκογένεση και τη μετάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [23].

Ωστόσο, ο ρόλος της Six1 στον καρκίνο του παγκρέατος είναι άγνωστη. Ο κρίσιμος ρόλος της Six1 στην έναρξη και την εξέλιξη πολλών καρκίνων μας ώθησε να μελετηθεί η λειτουργία του Six1 σε καρκίνο του παγκρέατος. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι Six1 υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος και συσχετίζεται με προχωρημένο στάδιο του όγκου. Χρησιμοποιώντας

in vitro

και

in vivo

λειτουργικές δοκιμασίες, δείχνουμε ότι η αναγκαστική υπερέκφραση Six1 προάγει παρεκκλίνοντα πολλαπλασιασμό, συμβάλλοντας στην παγκρεατική ογκογένεση. Μπορούμε επίσης καταδεικνύουν ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί D1 κυκλίνης είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του Six1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, δείχνουμε ότι Six1 προωθεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και πολλαπλασιασμό με προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης D1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Η συλλογή των δειγμάτων ιστού εγκρίθηκε και εποπτεύεται από την Επιτροπή Ερευνών Ηθικής του Πανεπιστημίου Zhengzhou. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς που παρέχονται δείγματα. Μελέτες σε ζώα και μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου εγκρίθηκαν και εποπτεύεται από την Research Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Zhengzhou.

Cell Culture

ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος του παγκρέατος PANC-1 (CRL-1469) και ΜΙΑ PaCa-2 (CRL-1420) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection ATCC (Rockville, MD, USA). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Hyclone, Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone, Logan, UT, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, και 0,1 mg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen , California, USA) σε 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C.

δείγματα ανθρώπινου ιστού

Πρωτογενής παγκρεατικού όγκου (n = 51) και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου (n = 13) συλλέχθηκαν μεταξύ 2005 και 2010, από τους ασθενείς με εκτομή πρωτογενή παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα στην Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο της Zhengzhou Πανεπιστήμιο. Το γειτονικό μη καρκινικό ιστό ελήφθη από ένα τμήμα των εκτομή δείγματα που ήταν η πλέον απομακρυσμένη από τον όγκο (πάνω από 5 cm). Οι ιστοί ήταν φλας καταψύχονται αμέσως μετά την επέμβαση. Δεν υπάρχει προηγούμενο τοπική ή συστηματική θεραπεία είχαν διεξαχθεί επί αυτών των ασθενών πριν την επέμβαση. Όλα τα δεδομένα όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, την τοποθεσία, το στάδιο, διαφοροποίηση, περινευρικό εισβολή και την κατάσταση των λεμφαδένων λήφθηκαν από τις αρχικές εκθέσεις παθολογίας. Παθολογική στάσης ενημερώθηκε σύμφωνα με την ισχύουσα αμερικανική μεικτής επιτροπής σχετικά με τις κατευθυντήριες γραμμές του καρκίνου. Η γονιδιακή έκφραση για Six1 λήφθηκε για κάθε παγκρεατικού όγκου, και όλα τα δείγματα μέση στο κέντρο. Τα δείγματα στη συνέχεια διαιρούνται σε δύο ομάδες για περαιτέρω ανάλυση: δείγματα στα οποία η έκφραση Six1 ήταν πάνω από το μέσο όρο (Six1 «υψηλή»), και τα υπόλοιπα δείγματα (Six1 «χαμηλή»). Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς και η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Ηθικής του Πανεπιστημίου Zhengzhou (Zhengzhou, Κίνα).

πλασμίδια Προετοιμασία και Καθιέρωση Γραμμές Σταθερό τηλέφωνο

Six1 cDNA του Ανθρώπου ήταν ενισχύθηκε από ανθρώπινο σκελετικό μυ με αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής (RT-PCR). Ανθρώπινα μυϊκό ιστό σκελετικού ελήφθη από το κανονικό περιβάλλοντα ιστό περιθώριο των δειγμάτων εκτομή σάρκωμα. Η λεπτομερής κατάσταση αντίδραση του PCR διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενη έκθεση [5]. Το cDNA Six1 στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε εντός του πλασμιδίου pcDNA4 /TO (Invitrogen, California, USA). pCMV-κυκλίνης D1 λήφθηκε από Sevicebio (Wuhan, Κίνα). pcDNA4 /TO-Six1 και pCMV-κυκλίνης D1 καθαρίστηκαν σε μεγάλη κλίμακα χρησιμοποιώντας το κιτ EndoFree πλασμίδιο Maxi (Qiagen, Germany) για επιμόλυνση. κύτταρα PANC-1 ή ΜΙΑ PaCa-2 εμβολιάστηκαν σε πλάκα έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με pcDNA4 /TO-Six1 από χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή (Invitrogen, California, USA). Εικοσιτέσσερις ώρες μετά επιμολύνσεις τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν και επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 100 μg /ml ζεοκίνη για 2 εβδομάδες, και στη συνέχεια πήρε σταθερές κυτταρικές σειρές ο pcDNA4 /TO-Six1.

παρεμβολή RNA

Για μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των Six1 ή κυκλίνη D1, οι ακόλουθες αλληλουχίες siRNA αγοράστηκαν από Ribobio Εταιρείας, Guangzhou, PRChina). Οι αλληλουχίες της Six1 στοχευμένη siRNA είναι 5′-AGAACGAGAGCGUACUCAA-3 ‘ή 5′-GGGAGAACACCGAAAACAA-3′? η αλληλουχία της κυκλίνης D1 στοχευμένη siRNA είναι 5’-GTTCATTTCCAATCCGCCC-3 ‘ή 5′-GCCGAGAAGUUGUGCAUCUUU-3’. PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, αναπτύχθηκαν σε 50% συρροή και επιμολύνθηκαν με siRNA ή ελέγχου σκαρφάλωμα siRNA (που παρέχεται από Ribobio Company, Guangzhou, Κίνα) διπόλων χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen, Καλιφόρνια, ΗΠΑ ) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. 20 ηΜ siRNAs χρησιμοποιήθηκαν ανά φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν για άλλες 48 έως 72 ώρες πριν τη συγκομιδή για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και ανάλυση ανοσοστυπώματος.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy μίνι σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen, Germany). Η ποσότητα και η καθαρότητα του απομονωμένου RNA ποσοτικοποιήθηκε με ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) σε μήκη κύματος 230, 260, και 280 nm. Μόνο δείγματα RNA με μία αναλογία 260/280 από 1,9 να 2,1 και μία αναλογία 260/230 από 2,0 να 2,5 ήταν αποδεκτές για περαιτέρω ανάλυση. Η ακεραιότητα του συνολικού RNA εκτιμήθηκε με απεικόνιση των ριβοσωμικού RNA 18S μοτίβα και 28S σε ένα πήκτωμα μετουσίωσης αγαρόζης (Qiagen, Germany). Και οι ευκρινείς, καθαρές ταινίες 28S και 18S rRNA και ένας λόγος 28S /18S των δύο θεωρείται ότι είναι καλής ποιότητας RNA. Το πρώτο-κλώνος cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το Σύστημα Σύνθεσης SuperScript® III First-Strand σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, California, USA). Ποσοτική PCR έγινε χρησιμοποιώντας SYBR Green βαφής σε 7300 Real-time PCR σύστημα Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Εν συντομία, 10 μΙ RNA μίγμα /εκκινητή παρασκευάστηκε σε στείρο 0.2 κ.εκ. σωληνάριο ως εξής: 0.5 μg ολικού RNA, 1 μΙ ολιγο (άΤ)

20 (50 μΜ), 1 μΐ 10 mM dNTP αναμειγνύεται και DEPC-επεξεργασμένο νερό σε ένα τελικό όγκο των 10 μL. Το μίγμα στη συνέχεια επωάστηκε στους 85 ° C για 5 λεπτά και ψύχονται επί πάγου για τουλάχιστον 1 λεπτό πριν την προσθήκη 10 μΙ cDNA Synthesis Mix (2 μί 10 χ RT ρυθμιστικού, 4 μL 25 mM MgCl

2, 2 μί 0.1 Μ DTT, 1 μλ RNaseOUT ™ και 1 μL SuperScript® III ανάστροφη μεταγραφάση). Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής 20 μλ επωάστηκε στους 50 ° C για 30 λεπτά, που ακολουθείται από 85 ° C για 5 λεπτά. πρότυπο RNA απομακρύνθηκε με προσθήκη 1 μΐ ΚΝάσης Η και επώαση στους 37 ° C για 20 λεπτά. Ποσοτική PCR έγινε χρησιμοποιώντας SYBR Green βαφής σε 7300 Real-time PCR σύστημα Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Η ποσοτική PCR διεξήχθη με 12,5 μι 2 χ SYBR Green PCR βασικού μείγματος (Tiangen Biotech, Beijing, Κίνα), 1 μι cDNA template, 200 ηΜ κάθε εκκινητή ενίσχυσης και DEPC-επεξεργασμένο νερό σε ένα τελικό όγκο 25 μL. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν σε 96 φρεατίων οπτική πλάκα στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 94 ° C για 15 s και 60 ° C για 30 s. Ο κύκλος όριο (C

T) δεδομένων καθορισμένη χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις όριο. Το C

T ορίζεται ως ο αριθμός κλασματικών κύκλος στον οποίο ο φθορισμός διέρχεται το σταθερό κατώφλι. Τα δεδομένα PCR πραγματικού χρόνου αναλύθηκε με συγκριτικές C

μέθοδος T [24]. Ολες οι αντιδράσεις έτρεξαν εις διπλούν και αποστειρωμένο νερό δοκιμάστηκε μαζί με το δείγμα ως αρνητικό έλεγχο. Ηλεκτροφόρηση πηκτής διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί η αποκλειστική ενίσχυση του αναμενόμενου προϊόντος PCR. Primer σύνολα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως ακολούθως: για γονιδιακή Γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH), 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 ‘και 5′-GGCTG TTGTCATACTTCTCATGG-3′? για Six1, 5’-AAGGAGAAGTCGAGGGG TGT-3 ‘και 5′-TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT-3′? για κυκλίνη D1, 5’-GCTGCGAAGT GGAAACCATC-3 ‘και 5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3’

Η ανάλυση των μικροσυστοιχιών Δεδομένων

βάση δεδομένων Oncomine Καρκίνος μικροσυστοιχιών [25] (http:. //www .oncomine.org) χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη του γονιδίου έκφρασης Six1 σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παγκρέατος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. δεδομένα γονιδιακής έκφρασης ελήφθησαν επίσης από NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) βάση δεδομένων (αριθμοί πρόσβασης GSE15471, GSE32676 και GSE28735? https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [27] – [29]. δεδομένα έκφρασης για Six1 και κυκλίνη D1 ήταν λογαριθμικά μετασχηματισμένες, διάμεσος επίκεντρο ανά συστοιχία, και η τυπική απόκλιση ήταν κανονικοποιημένα σε έναν ανά συστοιχία.

Ανάλυση Western Blot

ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως εμείς περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2, 0,5% Triton Χ-100, μίγμα αναστολέα φωσφατάσης (1 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4 και 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό), και ένα μίγμα αναστολέα πρωτεάσης (1 mM PMSF, 2 μg /ml απροτινίνη, 1 μg /ml λευπεπτίνης και 1 μg /ml πεπστατίνη α)]. Τα προϊόντα λύσης clarifed με φυγοκέντρηση στα 10.000 χ g για 20 λεπτά. Πρωτεΐνες (10-25 μα) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε ρυθμιστικό ΤΒδ-Τ (20 mM Tris-HCI, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl και 0.05% Tween-20) που περιείχε 5% (w /v) μη λιπαρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν με αντισώματα για Six1, κυκλίνη Α, κυκλίνη Β1, κυκλίνη Ε, GAPDH (όλα από την Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), Phospho-Rb (# 8516, Cell Signaling Technology), Rb (# 9313, Cell Signaling Technology ) και κυκλίνης D1 (# 2926, Cell Signaling Technology) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη SuperSignal West Femto μέγιστη ευαισθησία Υποστρώματος Trial Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Οι εικόνες μπάντα με ψηφιακή λήψη και ποσοτικά με ένα σύστημα απεικόνισης FluorChem FC2 (η Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

ΜΤΤ και τον αριθμό των κυττάρων Δοκιμασία

Ένα χιλιάδες κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 -Καλά πλάκες καλλιέργειας και επωάζονται στους 37 ° C για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Στη συνέχεια, το 20 μί ΜΤΤ (τετραζολίου βρωμιούχο, 5 mg /mL, GE Healthcare) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και 150 μλ DMSO προστέθηκε σε διαλυτοποίηση των κρυστάλλων για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και η απορρόφηση στα 570 nm διαβάστηκε με αναγνώστη πλάκας ELISA (Μοντέλο 680, Bio-Rad, CA). Για την καταμέτρηση των κυττάρων, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων επωάστηκαν στους 37 ° C για διαφορετικές χρονικές περιόδους και στη συνέχεια απομακρύνθηκε με θρυψινοποίηση, και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε σε αιμοκυτταρόμετρο με χρήση trypan blue χρώση. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Ενσωμάτωσης BrdU

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ BrdU (BD Biosciences, Mountain View, CA) για 30 λεπτά και σταθερό σε 70% αιθανόλη , και στη συνέχεια πλένονται με PBS, επαναιωρήθηκαν και επωάστηκαν με 4 Ν HCL και 0,5% Triton Χ-100 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα εξουδετερώθηκε με 0.1 Μ βορικό νάτριο πριν να επισημανθούν με FITC-συζευγμένο αντίσωμα BrdU (BD Biosciences, Mountain View, CA) και επωάστηκαν με 50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (Sigma Chemical Company, St. Louis, ΜΟ ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή πριν να αναλυθούν από ένα Becton Dickinson FACStar Plus κυτταρόμετρο ροής.

αποικίας Δοκιμασία σχηματισμού

Εξακόσια κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων. Μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) σε μεθανόλη για 10 λεπτά. Οι αποικίες (διαμέτρου άνω των 50 μm) μετρήθηκαν απ ‘ευθείας στην πλάκα. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίστηκε από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Δοκιμασίες Reporter

κύτταρα Panc-1 καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων στα 100.000 κύτταρα /φρεάτιο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν υπό συνήθεις συνθήκες καλλιέργειας. Στα 80% con fl uency, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης (Six1 ή κενό φορέα), πλήρους μήκους ανθρώπινη κυκλίνη D1 προαγωγό (-1745D1 /LUC, -1745 να 155) [31] και της Renilla reniformis φορέα έκφρασης λουσιφεράσης pRL-ΤΚ (Promega, Madison, WI, USA). Η μοριακή αναλογία της PRL-ΤΚ στο διάνυσμα pGL3-ανταποκριτή ήταν 1: 10. Στη συνέχεια, οι λουσιφεράσης μετρήθηκαν με τη χρήση του Luciferase Reporter σύστημα διπλών Assay (Promega, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα λύθηκαν μετά από 48 ώρες με 500 μΙ 1 χ Passive Lysis Buffer (Promega) ανά φρεάτιο, επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. 50 μΐ υπερκείμενο αναμίχθηκε με 50 μΙ αντιδραστηρίου Dual-Glo Ι (Promega) και FL φωτιά φωταύγεια y λουσιφεράσης μετράται σε ένα GloMax® 20/20 φωτόμετρο (Promega, Madison, WI, USA). 50 μΙ Dual-Glo αντιδραστήριο II (Promega) προστέθηκε και προσδιορίστηκε φωταύγειας λουσιφεράσης της Renilla. Σχετικές μονάδες φωτός υπολογίστηκαν ως FL ΚβηϊΙΙθ /φωτιά y φωταύγεια από φρεάτια εις τριπλούν και κανονικοποιούνται με τον αρνητικό μάρτυρα.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

Οι αναλύσεις ChIP πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός κιτ δοκιμασίας ChIP ( Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, ΝΥ) όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή. Brifely, κύτταρα (15 cm τρυβλίου καλλιέργειας, περίπου 1,0 × 10

7 κύτταρα) καθηλώθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από έκπλυση δύο φορές με 20 ml ψυχρού 1 × PBS και συλλέχθηκαν με απόξεση. Μετά από φυγοκέντρηση, τα κυτταρικά ιζήματα λύθηκαν σε 1 mL SDS ρυθμιστικό λύσης που περιέχει Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης II. Κυτταρόλυμα υποβλήθηκε σε υπερήχους σε υγρό πάγο τέσσερις φορές για 15 δευτερόλεπτα κάθε φορά σε διαστήματα των 15 δευτερολέπτων για να ληφθούν κλάσματα χρωματίνη των περίπου 200-1000 νουκλεοτίδια bp. Φυγοκεντρούμε εις 12000 χ g στους 4 ° C για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί το αδιάλυτο υλικό, και στη συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο σε φρέσκους σωλήνες μικροφυγοκέντρου σε δείγματα 100 μL. Κάθε 100 υπερκείμενα μι αραιώθηκαν με 900 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης chip και προεπωάστηκαν με Πρωτεΐνη G αγαρόζης σε 4 ° C για 1 ώρα, και στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν αγαρόζη με σύντομη φυγοκέντρηση και απομακρύνθηκε 10 μL (1%) του υπερκειμένου ως είσοδο. Υπερκείμενα επωάστηκαν στους 4 ° C για μία νύχτα με 5 μg Six1 (SC-9709, Santa Cruz), το αντίσωμα RNA πολυμεράση ΙΙ (Pol II, SC-56767, Santa Cruz) και κανονική IgG, (SC-2028, Santa Cruz) επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με περιστροφή, και στη συνέχεια προστέθηκαν 60 μL πρωτεΐνης G αγαρόζης σε κάθε σωληνάριο και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 4 ° C με περιστροφή. Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείμενο και πλένεται η Πρωτεΐνη G σύμπλεγμα Αγαρόζης-αντισώματος /χρωματίνης με επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 1 mL από το καθένα από Low Salt /υψηλό αλάτι /LiCl ανοσοποιητικού Complex ρυθμιστικό Bufferwash Wash για μία φορά, ακολουθούμενη από έκπλυση δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ. Μετά την τελική πλύση, τα ανοσοϊζήματα εκλούστηκαν και αντίστροφη διασυνδεδεμένη με επώαση όλη τη νύκτα στους 65 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. DNA στη συνέχεια καθαρίστηκε με κιτ καθαρισμού PCR (Qiagen, Hilden, Germany). Ανοσοκαταβυθισμένες DNAs αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: κυκλίνη D1 υποκινητή (-1.189 να -985), 5′-AGGAACCTT CGGTGGTCTTG-3 ‘και 5′-CCTTGACCAGTCGGTCCTTG-3′? υποκινητή κυκλίνης D1 (-348 να -190), 5’-CTCAGGGATGGCTTTTGGGC-3 ‘και 5′-ACTCCCCTGTAGT CCGTGTG-3′? ο θετικός έλεγχος GAPDH γονιδίου εγγύς υποκινητή, 5’-TACTAGC GGTTTTACGGGCG-3 ‘και 5′-TCGAACAGGAGGAGCAG AGAGCGA-3’.

Ποντίκια ξενομοσχεύματος Μοντέλο

Θηλυκά BALB /c (6-8 εβδομάδων παλιά) αθυμικά γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Πειραματικό Κέντρο ζώων της επαρχίας Henan (Zhengzhou, Κίνα). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε πέντε /κλουβί σε μονάδες μικροαπομονωτικά υπό υγρασία και η ελεγχόμενη θερμοκρασία συνθήκες με κύκλους φωτός-σκότους 12 ωρών. Εκεί είχαν τραφεί με μια τυπική αποστειρωμένο εργαστήριο διατροφής (Zhengzhou Πανεπιστήμιο, Zhengzhou, Κίνα) τουλάχιστον τρεις ημέρες πριν από τη χρήση. την υγεία των ζώων εξετάστηκε πριν από την εμφύτευση του όγκου και τυχαιοποίηση για να εξασφαλιστεί ότι επιλέχθηκαν μόνο τα ζώα χωρίς συμπτώματα της νόσου για να εισάγετε τις διαδικασίες δοκιμών. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, τα ζώα παρακολουθήθηκαν δύο φορές την ημέρα για το φορτίο του όγκου, η γενική κατάσταση, τροφίμων και νερού. Τα ποντίκια κατανεμήθηκαν τυχαία σε δύο ομάδες και υποδορίως στις περιοχές πλευρό με 5,0 × 10

6 κύτταρα σε 0.1 mL PBS. Ομάδα 1 (έλεγχος φορέα) εγχύθηκε με κύτταρα PANC-1 η οποία stablely επιμολυσμένα με pcDNA4 /TO? ομάδα 2 (Six1) εγχύθηκε με PANC-1 κύτταρα, τα οποία ήταν επιμολυσμένα με stablely pcDNA4 /TO-Six1. Όταν η βελόνα εγχύθηκε κάτω από το δέρμα, που πραγματοποιήθηκε τη βελόνα παράλληλα με το σώμα του ζώου για να αποφευχθεί η διάτρηση υποκείμενες δομές και αναρροφήθηκε τη σύριγγα για να εξασφαλιστεί ότι η βελόνα δεν έχει εισέλθει σε ένα αιμοφόρο αγγείο. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 5 ημέρες με παχύμετρο. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον τύπο: (μήκος Χ πλάτος

2) /2. Πέντε εβδομάδες μετά την εμφύτευση, ένας όγκος άρχισε να εμφανίζεται στο σημείο της εμφύτευσης με 400 έως 800 mm

3 κατ ‘όγκο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με ασφυξία με CO

2 θάλαμος και οι όγκοι αποκόπηκαν με τη χρήση τυποποιημένων λαβίδες, ψαλίδια, και χειρουργικές λεπίδες. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων και την Επιτροπή Χρήση του Πανεπιστημίου Zhengzhou.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± s.e.m. Μεταξύ ομάδων και μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις διεξήχθησαν με Student t test και ANOVA, αντίστοιχα. Mann-Whitney U test χρησιμοποιείται για μη παραμετρικές μεταβλητές. Η συσχέτιση της έκφρασης του mRNA Six1 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, την τοποθεσία, το στάδιο, διαφοροποίηση, περινευρικό εισβολή και την κατάσταση των λεμφαδένων αναλύθηκε είτε από το Chi-τετράγωνο ή δίπλευρη ακριβής δοκιμή Fisher. Το τεστ συσχέτισης τάξης Spearman αξιολογήθηκε για να επαληθεύσετε τη σύνδεση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των Six1 και κυκλίνης D1 σε τιμές log-μετασχηματιστεί. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 4.0 (PRISM4) (GraphPad Software Inc, La Jolla, Καλιφόρνια), και

P

*

P

& lt?. 0.05

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση άμεση κυττάρων, ΜΤΤ

ανάπτυξη δοκιμασία

, την ενσωμάτωση BrdU και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Τόσο ΜΙΑ PaCa-2 και τα κύτταρα Panc-1 χρησιμοποιήθηκαν. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα καταμέτρηση των κυττάρων, ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων με υπερεκφράζεται Six1 ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου? περισσότερο Six1-επιμολυσμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 4, 5, και 6 ημέρες μετά την επίστρωση (*

P & lt? 0,05

, Σχήμα 2Α).

δοκιμασίες ανάπτυξης ΜΤΤ

έδειξαν ότι ο ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά μετά την υπερέκφραση της Six1 (*

P & lt? 0,05

, Εικόνα S1B). Στον προσδιορισμό ενσωμάτωσης BrdU, ομάδα οι αριθμοί των BrdU θετικών κυττάρων στον έλεγχο και pcDNA4 /TO-Six1 ήταν 29,3% ± 1,7% και 44,0% ± 1,1%, αντίστοιχα (*

P

& lt? 0.05, Σχήμα 2Β ). Στην δοκιμασία σχηματισμού αποικίας για PANC-1 οι αριθμοί των αποικιών που σχηματίστηκαν για τον έλεγχο φορέων και pcDNA4 /TO-Six1 ομάδα ήταν 84 ± 16 και 184 ± 28, αντίστοιχα (*

P

& lt? 0,05, Σχήμα 2C). Έχουμε λάβει παρόμοια αποτελέσματα

για

ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα σε δοκιμασία σχηματισμού αποικιών (*

P

& lt? 0.05, Σχήμα S1c)

Για να ελέγξετε αν Six1 απαιτείται για. πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος, εμείς σιγήσει Six1 στα δύο κύτταρα PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο siRNA. Η δοκιμασία αριθμός των κυττάρων έδειξαν ότι ο αριθμός των Six1-knockdown κυττάρων ήταν σημαντικά χαμηλότερος από τον αριθμό των κυττάρων τόσο ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και επιμολυσμένα με περιπλεγμένο ελέγχου (Εικόνα 2D και σχήμα S1D). Η αναστολή της ενδογενούς Six1 σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 οδήγησε σε περίπου 1,8-φορές μείωση των ποσοστών θετικών κυττάρων BrdU, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου κωδικοποιημένα. (Κωδικοποιημένα siRNA εναντίον Six1 siRNA-1, 43% έναντι 26%? Κωδικοποιημένα siRNA εναντίον Six1 siRNA-2, 43% έναντι 23%? *

P

& lt? 0.05, Σχήμα S1E). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στα κύτταρα PANC-1 (Σχήμα S1F). Η αποσιώπηση της έκφρασης Six1 επιβεβαιώθηκε μετά από θεραπείες Six1 siRNA (20 ηΜ για 72 ώρες) τόσο από ποσοτική PCR και ανάλυση κηλίδας Western (Εικόνα S2). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι Six1 προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Για να επιβεβαιώσουν τα παραπάνω ευρήματα, ένα

χρησιμοποιείται in vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου. PANC-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά Six1 ή κύτταρα ελέγχου ενέθηκαν υποδορίως σε δύο ομάδες γυμνών ποντικών (η = 5). Όπως αναμένεται, η καμπύλη ανάπτυξης όγκου έδειξε ότι οι όγκοι που προέρχονται από ομάδα Six1 αυξήθηκαν ταχύτερα από εκείνα της ομάδας ελέγχου. Πέντε εβδομάδες μετά την ένεση, ο όγκος του όγκου της ομάδας Six1 ήταν 0,47 ± 0,26 cm

3, ενώ ο όγκος του όγκου της ομάδας ελέγχου ήταν 0.08 ± 0,06 cm

3 (*

P & lt? 0,05

, Εικόνα 2Ε). Επιπλέον, το μέσο βάρος του όγκου στο τέλος του πειράματος ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα που υπερεκφράζουν Six1 (1.69 ± 0.44 g) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (0,39 ± 0,25 g? *

P & lt? 0,05

, Σχήμα 2F ). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι Six1 αυξάνει την ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος

in vivo

.

Six1 μεταγραφικά Ενεργοποιεί το γονίδιο που κωδικοποιεί Κυκλίνη D1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Έχει αναφερθεί ότι Six1 είναι ένας ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου και επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου τόσο στην κανονική ανάπτυξη και στον καρκίνο [3], [5], [20], [35]. Για τη μελέτη υποκείμενη μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους Six1 προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων, αναλύσαμε ρυθμιστές αρκετές κυτταρικού κύκλου και διαπίστωσε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 σε μεταγωγή με Six1, ενώ τα κύτταρα με Six1 knockdown έδειξαν μειωμένη έκφραση κυκλίνης D1 (Σχήμα 3Α και Σχήμα S1 Α). Six1 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που δρα ως ένα από τα κύρια ρυθμιστές της ανάπτυξης. Για να καθοριστεί εάν Six1 επαγόμενη έκφραση κυκλίνης D1 στο επίπεδο της μεταγραφής, αναλύσαμε την έκφραση D1 κυκλίνης με ποσοτική ανάλυση PCR. Βρήκαμε ότι η κυκλίνη D1 επίπεδο mRNA αυξήθηκαν τουλάχιστον 4 φορές σε Six1 μεταδιηγερμένα κύτταρα PANC-1 (*

P & lt? 0,05

, Σχήμα 3Β). Είμαστε δίπλα ρώτησε αν Six1 θα μπορούσε να ρυθμίσει άμεσα τη δραστηριότητα του υποκινητή κυκλίνης D1. κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν με τον ανταποκριτή προαγωγέα ανθρώπινης κυκλίνης D1 με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του πλασμιδίου Six1-έκφραση άνθρωπο. Τα δεδομένα έδειξαν ότι Six1 ενίσχυσε σημαντικά την δραστικότητα λουσιφεράσης του υποκινητή κυκλίνης D1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (*

P & lt? 0,05

, Εικόνα 3C). Στη συνέχεια, εκτελέσαμε ανάλυση τσιπ για να καθοριστεί εάν Six1 δεσμεύεται στον προαγωγό κυκλίνης D1 σε χρωματίνη. Κανονική IgG συνδεδεμένο με προαγωγό κυκλίνη D1 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. RNA πολυμεράση II αντίσωμα-ανοσοκαταβυθίστηκαν DNA ενισχύθηκε με εκκινητές του υποκινητή GAPDH για να χρησιμεύσει ως θετικός έλεγχος. Η Εικόνα 3D δείχνει ότι Six1 μπορεί να συνδεθεί με τον προαγωγό κυκλίνη D1 μεταξύ -1189 και -985, μια περιοχή που περιέχει τα δύο MEF3-σαν μοτίβα (TCAGCTTTC και TAATATTTC) [36]. Σε αντίθεση, μία άσχετη αλληλουχία πλησίον της θέσης έναρξης της μεταγραφής (-348 να -190) δεν δεσμεύουν Six1. Για να συνοψίσουμε, Six1 θετικώς ρυθμισμένη έκφραση D1 κυκλίνης τόσο σε mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης, υποδεικνύοντας ότι η κυκλίνη D1 είναι ένα

in vivo

στόχο Six1 σε παγκρεατικά κύτταρα.

Α και Β, η επίδραση της