Αφηρημένο

GIPC1 είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη ικρίωμα που αλληλεπιδρά με τα πολυάριθμα συμπλέγματα υποδοχέων σηματοδότησης, και τις αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι παίζει ρόλο στην καρκινογένεση. GIPC1 εκφράζεται έντονα σε έναν αριθμό ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, των ωοθηκών, του γαστρικού, του παγκρέατος και καρκίνοι. Καταστολή της GIPC1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος αναστέλλει

in vivo

ανάπτυξη του όγκου σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Για την καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας GIPC1, εμείς καταστέλλεται η έκφραση του στο μητρικό και ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMECs) και προσδιορίστηκαν οι δύο γονιδιακή έκφραση και την κυτταρική φαινότυπο. Καταστολή της GIPC1 προάγει την απόπτωση σε MCF-7, MDA-MD231, SKBR-3, SW480, και τα κύτταρα SW620 και εξασθενίζει σχηματισμό αποικίας ανεξάρτητη από προσκόλληση του HMECs. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν GIPC1 παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό, και είναι αναγκαία η έκφραση του για την επιβίωση του ανθρώπινου μαστού και του παχέος εντέρου κύτταρα. Επιπλέον, ένας knock-down γονίδιο υπογραφή GIPC1 χρησιμοποιήθηκε για να ανακρίνουν δημόσια διαθέσιμες μαστού και σύνολα δεδομένων καρκίνο των ωοθηκών μικροσυστοιχιών. Αυτή η υπογραφή GIPC1 συσχετίζεται στατιστικώς με έναν αριθμό μαστού και των ωοθηκών φαινοτύπων και τα κλινικά αποτελέσματα, συμπεριλαμβανομένης της επιβίωσης των ασθενών. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η αναστολή GIPC1 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο στόχο για θεραπευτική ανάπτυξη για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων

Παράθεση:. Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng Η, Holton Κ, Prendergast Ν, et al. (2010) Θεραπευτικές Συνέπειες της GIPC1 κατασιγάσει στον Καρκίνο. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10.1371 /journal.pone.0015581

Επιμέλεια: Pawel Michalak, Virginia Tech, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 του Οκτώβρη, 2010? Αποδεκτές: 12 Νοεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 30 Δεκέμβρη του 2010

Copyright: © 2010 Τσίτεντεν et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, ΜΑ, και RS υποστηρίχθηκαν από τα ταμεία της από την Πρωτοβουλία της Dana-Farber Στρατηγικό Ταμείο και το Ίδρυμα Claudia Adams Barr. J.Q. και J.C.M υποστηρίχθηκαν εν μέρει από μια επιχορήγηση από την Εθνική Βιβλιοθήκη Ιατρικής (R01LM010129) των Ηνωμένων Πολιτειών Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

GIPC1, GIPC2 και GIPC3 περιλαμβάνουν την ανθρώπινη οικογένεια γονιδίων GIPC, η οποία χαρακτηρίζεται από ένα ενιαίο, συντηρημένη περιοχή PDZ και GIPC ομολογία (GH1 και GH2) τομείς [1]. GIPC1 είναι μια πρωτεΐνη ικρίωμα που εμπλέκονται στην έκφραση του υποδοχέα της κυτταρικής επιφάνειας, η ενδοκυτταρική διακίνηση, και την μεταγωγή σήματος. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν GIPC1 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη φυσιολογική σηματοδότηση παράγοντα ανάπτυξης, ρύθμιση ενδοθηλιακών κυττάρων, και αρτηριακή διακλάδωση μορφογένεσης τόσο στα ποντίκια όσο και zebrafish [2], [3]. Επιπλέον, GIPC1 αλληλεπιδρά με και σταθεροποιεί σημαντικά συμπλέγματα υποδοχέων σηματοδότησης, περιλαμβανομένων κινασών τυροσίνης υποδοχέα TrkA και TrkB [4], [5], VEGF συν-υποδοχέα νευροπιλίνη-1 [6], FGF συν-λήπτη syndecan-4 [7], [ ,,,0],8], Frizzled-3 υποδοχέα [9], IGF-1 υποδοχέα [10], ο υποδοχέας τύπου ΤΟΡ-βήτα III [11], και ενδογλίνη [12]. Αυτές οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις υποδοχέα αντικατοπτρίζει το ρόλο GIPC1 παίζει ως πρωτεΐνη προσαρμογέα, η οποία συνδέει τις διαδικασίες αναγνώρισης παράγοντας που υποστηρίζεται από πολλούς ανάπτυξης σε μονοπάτια ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, με αποκορύφωμα στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, μεταξύ άλλων λειτουργιών.

Στον καρκίνο, GIPC1 ταυτοποιήθηκε ως ένα ανοσογονικό αντιγόνο υπερ-εκφράζεται σε αμφότερα μαστού και των ωοθηκών [13], [14]. GIPC1 και GIPC2 mRNAs εκφράζονται σε Okajima, TMK1, ΜΚΝ45 και ΚΑΤΟ-ΙΙΙ ανθρώπινο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, καθώς και σε διάφορες πρωτογενείς γαστρικών όγκων [15], [16]. GIPC1 εκφράζεται έντονα στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος του ανθρώπου και παίζει κεντρικό ρόλο της σταθερότητας του IGF-1R στο αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές [17], [18]. Πιο πρόσφατα, η καταστολή GIPC1 σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα αποδείχθηκε ότι αναστέλλει

in vivo

παγκρεατικού ανάπτυξης όγκου σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [19]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο GIPC1 προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου δεν είναι καλά εδραιωμένη.

Για να ερευνηθεί ο ρόλος που παίζει GIPC1 στον καρκίνο, χρησιμοποιήσαμε RNAi για την καταστολή της έκφρασης GIPC1 στα δύο του μαστού και του παχέος εντέρου κύτταρα και ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMECs). Ξεκινήσαμε τη μελέτη μας με την εξέταση μεταβολές στα πρότυπα έκφρασης παγκόσμια γονιδίου μετά την καταστολή GIPC1. Η ανάλυσή μας δείχνει ότι GIPC1 απαιτείται για στήθους και του παχέος επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό.

Αποτελέσματα

GIPC1 σίγηση και γονιδιακή έκφραση σε σχηματοποίηση MDA-ΜΒ231 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου μαστού

γονιδιακής έκφρασης GIPC1 χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα MDA-MB231 από τη μεταγωγή του μικρού RNAs φουρκέτα (GIPC1 KD), μαζί με την άδεια φορέα και μη μεταγωγή ελέγχους. Μετά την επιλογή πουρομυκίνης, επτά ανεξάρτητες βιολογικές επαναλήψεις της κάθε μεταγωγής αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια, το RNA εκχυλίζεται και GIPC1 knock-down αναλύθηκε με χρήση qPCR. qPCR βρέθηκε 85% knock-down στα κύτταρα GIPC1 KD σχέση με τα μη-μεταχθέντα και κενός-φορέα ελέγχου. RNAs από τις ανεξάρτητες πισίνες υβριδοποιήθηκαν Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChips ™, τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Στιβαρή Multi-Array ανάλυση [20] εφαρμόζεται στην Bioconductor

Affy

πακέτο, και διερευνητική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με την ιεραρχική ομαδοποίηση χρησιμοποιώντας το πακέτο Bioconductor,

made4

[21]. Μια ισχυρή βιολογική επίδραση της αποσιώπησης GIPC1 παρατηρήθηκε (Σχήμα S1). Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM? Q-value = 0%). [22] χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό 3081 probesets (~2271 γονίδια) με τροποποιημένη έκφραση στα κύτταρα GIPC1 KD σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα

Αυτή κατάλογος γονίδιο GIPC1 KD συγκρίθηκε με εκείνες που παρουσιάζονται από Bild et al. [23], ο οποίος ανέλυσε υπερέκφραση πέντε ογκογονίδια (H-ενεργοποιημένου Ras, ανθρώπινη E2F3, ενεργοποιημένα β-κατενίνης, ανθρώπινου c-myc, και την ανθρώπινη c-Src) σε πρωτογενείς HMECs, χρησιμοποιώντας το

OrderedList

[ ,,,0],24]. Βρήκαμε μια στατιστικά σημαντική επικάλυψη των ασυνήθιστα εκφρασμένων γονιδίων στο GIPC1 KD και τα ενεργοποιημένα H-Ras υπερέκφραση λίστες γονιδίου (P«0.05, Εικόνα S2).

Χρησιμοποιήθηκαν οι 3081 GIPC1 KD probesets αντιπροσωπεύουν 2271 γονίδια σε μια ανάλυση λειτουργικό εμπλουτισμό χρησιμοποιώντας ανάλυση έκφρασης Συστηματική Explorer (ΕΑΣΕ) [25] και τα ένθετα ευκολία, το οποίο ισχύει η ευκολία αναπαράστασης ανάλυση επαναληπτικό για τον εντοπισμό GO όρους κόρη που οδηγούν τη σημασία των όρων υψηλότερου επιπέδου (Chittenden

et al

., που υποβλήθηκε). ΕΑΣΕ χρησιμοποιεί ακριβής δοκιμασία Fisher για τον εντοπισμό λειτουργικές κατηγορίες του σετ γονιδίων που υπερεκπροσωπούνται σε σχέση με την κατανομή υπόβαθρο των γονιδίων προσδιορίστηκαν. Οκτώ από 67 υπερεκπροσωπούνται οντολογία γονίδιο (GO) όροι που βρέθηκαν από την ευκολία φαίνονται στον Πίνακα 1, μεταξύ των οποίων είναι όροι που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, μετανάστευση κυττάρων, και διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη αποικοδόμησης πρωτεΐνης.

Οι ένθετες ΕΑΣΕ (Nease) είναι μια επέκταση της ΕΑΣΕ που χρησιμοποιεί ένα δεύτερο, υπο-επίπεδο, Ακριβής Τεστ επαναληπτική Fisher για να βρείτε GO υποκατηγορίες που οδηγούν επιλογή ΕΑΣΕ όρο. Τα αποτελέσματα, που φαίνονται στον Πίνακα 2, περιλαμβάνουν 17 στατιστικώς εμπλουτισμένο λειτουργική υποκατηγορίες των κυτταρικών διεργασιών που βρέθηκαν από την ευκολία. Nease διαπίστωσε ότι η ευκολία σημαντική GO τάξεις βιολογική διαδικασία,

πολλαπλασιασμό των κυττάρων

,

τροποποίηση πρωτεϊνών

,

μίτωση

,

την ανάπτυξη των κυττάρων και /ή

συντήρησης ,

οργάνωση του κυτταροσκελετού και βιογένεση

, και

φυσιολογική διαδικασία

συλλογικά καθοδηγείται από τις βιολογικές διεργασίες

κυτταρική προσκόλληση και ιντεγκρίνης με τη μεσολάβηση σηματοδότησης

. Ομοίως, ευκολία σημαντική όρο

οργάνωση κυτταρόπλασμα και βιογένεση

βρέθηκε από Nease να οδηγείται εν μέρει από

κυτοκίνηση μετά την μίτωση

. Nease βρέθηκε

απόπτωση

σημαντική λόγω GO όρων που συνδέονται με

ρύθμιση των

ακτίνης και το

JAK-STAT καταρράκτη σηματοδότησης

. Αλλοιωμένη έκφραση βρέθηκε σε γονίδια που εμπλέκονται τόσο στην

μετανάστευση των κυττάρων

και

μεταβολισμό

? τροποποιήσεις στο

δραστηριότητα λιγάσης ουβικιτίνη-πρωτεΐνη

οφείλονται σε μεταβολές στην πρωτεΐνη δέσμευσης. Nease δείχνει επίσης ότι GIPC1 KD μεταβάλλει έκφραση των γονιδίων στον EGF, ΤΟΡβ, και τα μονοπάτια σηματοδότησης του υποδοχέα WNT.

Η

Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι GIPC1 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την κυτταρική κινητικότητα και την προσκόλληση , και διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη αποικοδόμησης πρωτεΐνης. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι GIPC1 παίζει ένα ευρύ ρόλο πέρα ​​από νωρίς τη σύνδεσή της με αγγειακή ρύθμιση και ότι μπορεί, στον καρκίνο, να συμμετέχουν στις διαδικασίες που σχετίζονται με τον έλεγχο σε κύτταρα κύκλο.

GIPC1 αποσιώπηση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των MDA-MB231 και επάγει την απόπτωση

Επειδή GIPC1 KD επηρεάζει τις διαδικασίες που συνδέονται με την ανάπτυξη των κυττάρων, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της εξάντλησης GIPC1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MDA-ΜΒ231. Έχουμε καθορίζεται η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την εξάντληση GIPC1 και από τις δύο δοκιμασίες resazurin και τη μείωση τετραζολίου MTS στην πειραματική και ελέγχου των κυττάρων. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, GIPC1 σίγηση προκαλεί σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων στις 48 ώρες μετά τη σπορά (Σχήμα 1Α και 1 D). Από GIPC1 αλληλεπιδρά με νευροπιλίνη-1 [6], τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με VEGFA (10 ng /ml) για να καθοριστεί αν η απώλεια της βιωσιμότητας των κυττάρων που προκαλείται από την καταστολή GIPC1 θα μπορούσαν να ξεπεραστούν με σχετική μιτογόνο. θεραπεία VEGFA δεν είναι επαρκής για να αποτρέψει μια κατά προσέγγιση 40% και 60% μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε κύτταρα GIPC1 KD στις 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα (Σχήμα 1 D).

A. Αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων (μπλε) και 3/7 δραστικότητα κασπάσης (ροζ) σε 0, 24, 48, και 72 ώρες. Συμπαγείς γραμμές με μπλε κουτιά (μη μεταγωγή) και μπλε διαμάντια (μη-στόχος) και η διακεκομμένη γραμμή με μπλε τρίγωνα (GIPC1 KD) δείχνουν τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Ροζ δηλώνει κασπάσης 3/7 δραστηριότητα. Β Κανονικοποιημένη κασπάσης 3/7 δραστηριότητα. Η συνολική δραστικότητα της κασπάσης 3/7 κανονικοποιήθηκε σε βιωσιμότητα των κυττάρων και να αξιολογούνται σε 0, 24, 48, και 72 ώρες. Η κανονικοποίηση δείχνει μια αύξηση 2,1 φορές σε δραστικότητα της κασπάσης 3/7 σε κύτταρα GIPC1 KD σύγκριση με τα κύτταρα μη στόχους στις 72 ώρες. δοκιμασία σήραγγας Γ. κατάτμηση του DNA εκτιμήθηκε ως% θετικός έλεγχος. GIPC1 KD συσχετίζεται με 11,24 φορές αύξηση στην απόπτωση (GIPC1 /Μη-στόχο? P & lt? 0,05). D. Αξιολόγηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά από VEGF (10 ng /ml) επαγωγή. Ο πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε στις 0, 24, 48, και 72 ώρες. Ημέρες 1, 2 και 3 κανονικοποιήθηκαν σε ημέρα 0. Οι συνεχείς γραμμές με μπλε κουτί (μη μεταδιηγερμένα) και μπλε διαμάντια (που δεν αποτελούν στόχο) και διακεκομμένη γραμμή με τρίγωνα μπλε (GIPC1 KD) δείχνουν πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μέσο λιμοκτονίας. Ροζ δηλώνει επαγωγή VEGF. Δ Αξιολόγηση του διασπασμένου PARP1. PARP1, που διασπάται PARP1, GIPC1, και η έκφραση GAPDH αξιολογήθηκε με στύπωμα Western σε ΜΟΑ-ΜΒ231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) μεταξύ των μη-στόχους και τους όρους GIPC1 KD.

Η

GIPC1 KD επηρεάζει επίσης την απόπτωση. Για τον προσδιορισμό των επιδράσεων GIPC1 φίμωση στη δραστηριότητα κασπάσης 3/7, η δοκιμασία μείωση ρεζαζουρίνης φθορομετρική φαίνεται στο Σχήμα 1Α ήταν πολυπλέκονται με Αρο-ΕΝΑ ομοιογενούς δοκιμασίας κασπάσης-3/7. Όταν κασπάση 3/7 δραστηριότητες κανονικοποιούνται σε τιμές κυτταρική βιωσιμότητα, εντοπίσαμε μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα της κασπάσης 3/7 σε κύτταρα GIPC1 KD σε σύγκριση με τον έλεγχο γραμμές κυττάρων σε 72 ώρες (Εικόνα 1Β). Βρήκαμε παρόμοιες απώλειες της βιωσιμότητας των κυττάρων και την αύξηση της κασπάσης 3/7 δραστηριότητες μετά GIPC1 φίμωση στην MCF-7 και SKBR-3 ανθρώπινος καρκίνος του μαστού και του ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές SW480 και SW620 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να καθοριστεί αν η αύξηση της δραστηριότητας κασπάσης 3/7 βρέθηκαν σε κύτταρα MDA-MB231 συνδέεται με τον κατακερματισμό του DNA, πραγματοποιήσαμε ένα αδιέξοδο δοκιμασία χρωματομετρική ΤΟΥΝΕΛ (Σχήμα 1C). GIPC1 στόχευση προκαλεί κατακερματισμό του DNA? αξιολογηθεί ως μια αναλογία σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, η σχετική αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων (GIPC1 KD /μη-στόχος) είναι 11,24 (Ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, η αύξηση τόσο της κασπάσης 3/7 δραστηριότητα και DNA κατακερματισμού GIPC1-σιγήσει κύτταρα συνδέονται με μια αυξημένη έκφραση του διασπάται PARP1 (Εικόνα 1D). Τα δεδομένα αυτά συμφωνούν με τα ευρήματα των μικροσυστοιχιών (Πίνακες 1 και 2), τα οποία δείχνουν GIPC1 αποσιώπηση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προάγει την απόπτωση.

GIPC1 αποσιώπηση προκαλεί MDA-MB231 G2 του κυτταρικού κύκλου σύλληψη

μικροσυστοιχιών αποτελέσματα ενοχοποιηθεί επιδράσεις κυτταρικού κύκλου του GIPC1 KD. Πραγματοποιήσαμε μονού καναλιού ανάλυση FACS κυττάρων GIPC1 KD και οι σχετικοί έλεγχοι για τη διερεύνηση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα ελέγχου και GIPC1 KD. καταστολή GIPC1 προωθεί λεπτές G1 και G2 βαθιά σύλληψης κατά την ημέρα 14 μετά την πουρομυκίνη επιλογή των επιμολύνσεων GIPC1 shRNA (Σχήμα 2Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν συσσώρευση κυττάρων τόσο G1 (43,70% ± 1,86% των κυττάρων έναντι 38,58% ± 0,21%) και G2 (46,33% ± 1,29% έναντι 27,70% ± 0,67%) φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε GIPC1 KD σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου που δεν αποτελούν στόχο. κύτταρα GIPC1 KD συνεχίσει να διασχίσει φάση S κατά της εξέχοντα σύλληψη G2 (9,98% ± 0,57% έναντι 33,73% ± 0,53%). GIPC1 knockdown έχει επίσης ως αποτέλεσμα σημαντική συσσώρευση κυττάρων σε ένα κορυφή 8Ν DNA (9,74% ± 0,67% έναντι 0%), και τα κυτταρικά υπολείμματα (υπο-G1? 5,52% ± 0,54% έναντι 1,57% ± 0,17%). Μαζί με τα ευρήματα μικροσυστοιχίας παρουσιάζονται στους Πίνακες 1 και 2, και σε σύγκριση με κατάλληλους ελέγχους, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν καταστολή GIPC1 προάγει τη σύλληψη κυτταρική διαίρεση και την απόπτωση.

A. Ενιαία κανάλι FACS ανάλυση των μη-μετατραπέντων, που δεν αποτελούν στόχο, και τα κύτταρα GIPC1 KD 14 ημέρες μετά την μεταγωγή. Grey είναι% των κυττάρων στο G1. Κίτρινο υποδεικνύει% των κυττάρων στη φάση S. Πορτοκαλί ισούται% κυττάρων σε G2. Το μπλε είναι% των κυττάρων σε 8N. D υποδηλώνει% συντρίμμια. Η ανάλυση στυπώματος Western Β του Cdc25b, GIPC1, και GADD 45 α /γ έκφραση σε μη-μεταχθέντα, που δεν αποτελούν στόχο, και τα κύτταρα GIPC1 KD. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) μεταξύ των όρων που δεν αποτελούν στόχο και GIPC1 KD.

Η

Για να διαπιστωθούν οι αιτίες της βρίσκονται με την καταστολή GIPC1 την ανώμαλη κυτταρικού κύκλου, χρησιμοποιήσαμε κηλίδωση Western για να αξιολογήσει πρωτεΐνη έκφραση των γνωστών ρυθμιστές σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που βρέθηκαν εκφράζονται διαφορικά στην ανάλυση μικροσυστοιχίας. GIPC1 σίγηση επάγει μία απώλεια Cdc25b και μια αύξηση στην έκφραση GADD45α /πρωτεΐνης γ (Σχήμα 2Β). CDC25b απαιτείται για την ενεργοποίηση CDK1 και την έναρξη της μίτωσης? λαμβάνοντας υπόψη ότι η έκφραση των μελών της οικογένειας πρωτεϊνών GADD45 αυξάνονται μετά τη σύλληψη της ανάπτυξης και βλάβες στο DNA. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τόσο την μικροσυστοιχιών (Πίνακες 1 και 2) και FACS (Εικόνα 2Α) τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η καταστολή GIPC1 προωθεί κυρίως G2 σύλληψη.

καταστολή GIPC1 μεταβάλλει την κυτταρική προσκόλληση και την κινητικότητα

ευρήματα υποδηλώνουν μικροσυστοιχιών GIPC1 εμπλέκεται στην προσκόλληση και την κινητικότητα (πίνακες 1 και 2). Αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της GIPC1 φίμωση στην κυτταρική κινητικότητα και την προσκόλληση σε MDA-MB231 πειραματική και ελέγχου των κυττάρων. GIPC1 σίγασης που ενισχύεται σημαντικά προσκόλλησης κυττάρου MDA-ΜΒ231 και στα δύο 30 και 60 λεπτά μετά την επίστρωση (Σχήμα S3A). Χρησιμοποιήσαμε μια γρατσουνιά (πληγή) δοκιμασία για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της GIPC1 KD στην κυτταρική κινητικότητα. καταστολή GIPC1 μειώθηκαν σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση MDA-ΜΒ231, είτε με είτε χωρίς οκτώ ώρες επαγωγής αυξητικού παράγοντα (Σχήμα S3b). ευρήματα υποδεικνύουν Microarray καταστολή GIPC1 σχετίζεται με εμπλουτισμό των ασυνήθιστα εκφρασμένων γονιδίων εντός του διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη, πρωτεΐνη RHO, JAK-STAT, EGF, Ras, ΤΟΡβ και WNT οδούς (Πίνακας 2 και Σχήμα S2). Αυτά τα μονοπάτια, που βρέθηκαν για πρώτη φορά στην ανάλυση βιοπληροφορικής μας, ρυθμίζουν τόσο την κυτταρική προσκόλληση και τη μετανάστευση και είναι υποψήφιοι για περαιτέρω έρευνα. Πειραματικά, GIPC1 αποτελέσματα εξάντληση σε ενισχυμένη πρόσφυση των κυττάρων και μειωμένη κυτταρική κινητικότητα. αποτελέσματα εξάντληση GIPC1 στην απώλεια της ΕΤΠ, FGF2, PDGF-BB, TGFβ1 και VEGFA που προκαλείται κυτταρική κινητικότητα (Εικόνα S3b). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι GIPC1 παίζει ένα ρόλο σε μια σειρά σημαντικών οδών μεταγωγής σήματος που προσκρούουν τόσο κυτταρική προσκόλληση και κινητικότητα.

GIPC1 απαιτείται για σχηματισμό αποικιών αγκύρωση-ανεξάρτητη της κυτταρικής σειράς tHMEC-ΙΤ-st

για να εκτιμηθεί κατά πόσον GIPC1 απαιτείται για ογκογόνο μετασχηματισμό, θα κατασταλεί η έκφραση της στην hTERT-απαθανάτισε HMECs μετασχηματιστεί με SV40 μεγάλου Τ (LT) και Μικρών T (ST) αντιγόνα (tHMEC-LT-ος) [26]. tHMEC-LT-st κύτταρα είναι ικανά ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη? Ωστόσο, η εξάντληση GIPC1 μείωσε σημαντικά την αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας αγκίστρωση ανεξάρτητη της κυτταρικής σειράς tHMEC-LT-st σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ως επιπρόσθετος έλεγχος, ένα δεύτερο κατασκεύασμα που GIPC1 shRNA χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το σύνολο πειραμάτων (Εικόνα 3Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι GIPC1 απαιτείται για σχηματισμό αποικιών ανεξάρτητη από προσκόλληση, ένα μέτρο της ογκογόνο μετασχηματισμό των κυττάρων HMEC.

A. Μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικιών σε μη διαμολυσμένων, που δεν αποτελούν στόχο, και GIPC1 KD tHMEC-LT-st κύτταρα κύτταρα. Β κηλίδωση Western δείχνει την effectivness της GIPC1 φίμωση με δύο ανεξάρτητες κατασκευάσματα GIPC1 shRNA: NM_005716.2-1083s1c1 και NM_005716.2-499s1c1. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SEM. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) μεταξύ των μη-στόχους και τους όρους GIPC1 KD.

Η

Η κλινική σημασία των γονιδίων που ρυθμίζονται από GIPC1 knock-down

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η υπόθεση ότι GIPC1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων, 411 probesets με πολλαπλή μεταβολή ≥2 σε SAM ανάλυση GIPC1 απεμπλουτισμένου κύτταρα MDA-ΜΒ231 σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (GIPC1 υπογραφή? πίνακα S1) χρησιμοποιήθηκαν για να ανακρίνει δυο διαθέσιμες στο κοινό και κλινικά σχολιασμένο μαστού και σύνολα δεδομένων καρκίνου των ωοθηκών με το πακέτο Bioconductor,

globaltest

[27]. Ένα μεγάλο συγχωνευθείσα καρκίνου του μαστού μικροσυστοιχιών DNA σύνολο δεδομένων με 689 προεπεξεργασίας δειγμάτων [28], [29], [30] και ένα σύνολο δεδομένων των ωοθηκών καρκίνο με τους ασθενείς που έλαβαν 274 [31] χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση. Στο Global Test πολυμεταβλητή ανάλυση των ασθενών 689 με καρκίνο του μαστού, η υπογραφή GIPC1 KD συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου (Ρ & lt? 0,01), την κατάσταση λεμφαδένα (Ρ & lt? 0.0001), και την κατάσταση ER (Ρ & lt? 0,05). Η υπογραφή GIPC1 συνδέεται επίσης σε μεγάλο βαθμό την επιβίωση των ασθενών εντός της ΕΚΒΒ2 + /ER + (n = 42, P & lt? 0.001), του αυλού Β (n = 146, Ρ & lt? 0,05) και τα βασικά (n = 92, Ρ & lt? 0,01) μοριακού μαστού υποτύπων καρκίνου (Πίνακας 3). Ανάλυση του συνόλου δεδομένων καρκίνου των ωοθηκών δείχνει ότι η υπογραφή GIPC1 συνδέεται σημαντικά με όλες τις κλινικές μεταβλητές αξιολογούνται? συμπεριλαμβανομένης της επιβίωσης των ασθενών και το στάδιο του όγκου, το βαθμό και τον τύπο (Πίνακας 3). Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν πρόσφατες εκθέσεις που υποδηλώνει ότι GIPC1 παίζει ρόλο στο ανθρώπινο μητρικό και αιτιολογία του καρκίνου των ωοθηκών και της εξέλιξης [13], [14].

Η

Συζήτηση

Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο της GIPC1 στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Τα στοιχεία δείχνουν ότι εκφράζεται υψηλά σε έναν αριθμό ανθρώπινων κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, των ωοθηκών, του γαστρικού, του παγκρέατος και [13], [14]. Επιπλέον, μια πρόσφατη έκθεση δείχνει GIPC1 απαιτείται για

in vivo

παγκρέατος ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια [19]. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τα δύο υπολογιστικές και πειραματικές προσεγγίσεις για την εξέταση GIPC1 στο ανθρώπινο μητρικό και ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα και σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι GIPC1 απαιτείται για στήθους και του παχέος επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, και αυτό παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό των ανθρώπινων μαστικών επιθηλιακών κυττάρων.

Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης GIPC1 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. ανάλυση Ευκολία GIPC1 knockdown σε κύτταρα MDA-ΜΒ231 δείχνει εμπλουτισμό των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με σχολιασμένα λειτουργίες σε G1 /S και G2 /M μεταπτώσεις, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και την απόπτωση. Nease επιδιώκει βιολογικές εξηγήσεις για αυτές τις κύριες επιδράσεις και εμπλέκει πιθανές ανωμαλίες στην κυτταρική προσκόλληση, διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη σηματοδότηση και τη ρύθμιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επιπλέον, Nease βρήκε έναν εμπλουτισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτοκίνηση. Αυτό το εύρημα είναι σε συμφωνία με μια πρόσφατη έκθεση δείχνει ότι η ενεργοποίηση του syndecan-4 (sdc4), μια διαμεμβρανική πρωτεογλυκάνης θειικής ηπαράνης που αλληλεπιδρά με GIPC1 και τον υποδοχέα FGFR1 να ρυθμίζει σηματοδότηση FGF2, απαιτείται για την κυτοκίνηση των MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [32]. Keller-Πίντερ

et al

. έδειξε ότι serine179-φωσφορυλίωση και εξωτερικός τομέας αποβολή του sdc4 είναι μέγιστη σε G2 /M. Έκφραση της μηχανικής μεταλλάξεις μιμούνται σερίνη 179-φωσφορυλίωση (Ser179Glu) ή φωσφορυλίωση ανθεκτικά sdc4 προκάλεσε ελλιπής πτώση του καρπού και γιγαντιαία, πολυπύρηνα κύτταρα [32]. Επιπλέον, sdc4 ρυθμίζει τον πολυμερισμό της ακτίνης, ο σχηματισμός εστίασης πρόσφυση, και την κυτταρική κινητικότητα μέσω σηματοδότησης ΡΙ3Κ

ανάλυση Nease δείχνει επίσης ότι GIPC1 εμπλέκεται σε έξι μεγάλα δίκτυα μεταγωγής σήματος στον καρκίνο του μαστού:. Ιντεγκρίνη μεσολάβηση, RHO πρωτεϊνών, JAK-STAT, EGF, TGFβ και WNT. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι GIPC1 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα Frizzled-3 [9], ο υποδοχέας τύπου ΤΟΡ-βήτα III [11], και ενδογλίνη [12]. Παρά το γεγονός ότι η ανάλυσή μας δεν υποδηλώνουν μια εμπλουτισμός των γονιδίων εντός του δικτύου μεταγωγής σήματος PI3K, διαπιστώνουμε ότι η καταστολή GIPC1 μειώνει την έκφραση ενός αριθμού βασικών γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό, συμπεριλαμβανομένων των

SDC2, PIK3CB, PIK3D, ΡϋΚ1, ΑΚΤ3, CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1,

και

RAC1

. Αντίθετα, GIPC1 αποσιώπηση προωθεί σημαντικές αυξήσεις στην έκφραση του γονιδίου για

PTEN, p27

Kip1, RHOBTB1, RhoB,

και

ΡΑΚ2

. Ενώ παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΡΙ3Κ εμπλέκεται στην επαγωγή του ογκογόνο μετασχηματισμό, αυτά τα γονίδια λειτουργούν από κοινού για να ενσωματώσει μηχανισμούς που ελέγχουν έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης κυτταροσκελετού, κινητικότητα κυττάρου και προσκόλληση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και την απόπτωση [26], [ ,,,0],33].

πειραματική επιβεβαίωση της γονιδιακής έκφρασης προφίλ αποτελεσμάτων δείχνει ότι GIPC1 σίγηση προάγει G2 διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, και εναλλαγές στην κυτταρική πρόσφυση και κινητικότητα σε ΜΟΑ-ΜΒ231 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού. εξάντληση GIPC1 συσχετίζεται με αυξημένη δραστηριότητα κασπάσης 3/7, κατάτμηση του DNA, προς τα πάνω ρύθμιση των μελών της οικογένειας GADD45, και η απώλεια της έκφρασης Cdc25b. Επιπλέον, GIPC1 σίγηση συσχετίζεται με την ένδειξη μειώσεις βιωσιμότητα των κυττάρων και των αξιολογήσεων που κασπάσης 3/7 δραστηριότητες σε MCF-7 και SKBR-3 ανθρώπινου καρκίνου του μαστού και SW480 και SW620 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικά κύτταρα.

Με τη χρήση RNAi να καταστρέφουν GIPC1 mRNA σε MDA-MB-231 κύτταρα ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει ένα ευρύ φάσμα των γονιδίων των οποίων η έκφραση μεταβλήθηκε. Συγκρίναμε αυτή την υπογραφή GIPC1 σε διαθέσιμες στο κοινό του μαστού και σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου των ωοθηκών για τον οποίο καλά σχολιασμένο δεδομένα φαινότυπο και τα αποτελέσματα ήταν διαθέσιμα. Βρήκαμε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της υπογραφής GIPC1 και μια σειρά σημαντικών ασθενή κλινικές μεταβλητές.

Σε καρκίνο του μαστού, χρησιμοποιήσαμε Παγκόσμια Μεθοδολογία δοκιμής και βρήκε ελεύθερη υποτροπής επιβίωση ήταν σημαντικά σχετίζεται με την υπογραφή GIPC1 μόνο εντός συγκεκριμένων μοριακών υποτύπους της νόσου: οι ασθενείς με αυλού Β ER + όγκους (υψηλού βαθμού ER +? Ρ = 0,015), erbB2 + /ER + νόσο (P = 4.3 × 10

-4), και ίσως βασική-όπως ή τριπλό-αρνητικό καρκίνους (Ρ = 0,0074). Εντός του αυλού Ένα ER + (χαμηλού βαθμού ER +) περιπτώσεις και σε ασθενείς με ΕΚΒΒ2 + /καρκίνων ΕΚ-, η υπογραφή GIPC1 δεν ήταν προβλεπτική της επιβίωσης χωρίς υποτροπή. Ως εκ τούτου, η υπογραφή GIPC1 μπορεί να είναι ικανό να διακρίνει τα αποτελέσματα των ασθενών μέσα σε ομάδες των καρκίνων του μαστού υψηλής ποιότητας, ιδιαίτερα εκείνα που είναι ER +, και όχι απλώς να διακρίνει βαθμού του όγκου (υψηλή έναντι χαμηλή) ή κατάσταση ER (θετικός έναντι αρνητικό). Στο σύνολο δεδομένων καρκίνο των ωοθηκών, η υπογραφή GIPC1 στατιστικά συσχετίζονται με όλες τις κλινικές μεταβλητές αξιολογούνται: συνολική επιβίωση και το βαθμό του όγκου, τον τύπο και το στάδιο. Ένα κοινό χαρακτηριστικό των συσχετισμών που βρήκαμε μεταξύ της υπογραφής GIPC1 και κλινικές παραμέτρους σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών ήταν ένωση με όγκους υψηλού βαθμού που χαρακτηρίζονται από υπερβολική βλάβη του DNA και φτωχή πρόγνωση ασθενούς.

Τα διαθέσιμα δεδομένα έκφραση υποδεικνύουν ότι GIPC1 εκφράζεται έντονα σε κάθε ανθρώπινο καρκίνο και τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν GIPC1 είναι ένα απαραίτητο συστατικό για την ανάπτυξη ανθρώπινων καρκινικών προωθείται από ανάντη αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους. Επειδή GIPC1 μεταγωγής σήματος ενεργοποιείται από ένα ευρύ φάσμα των υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας και επειδή είναι επίσης γνωστό ότι είναι απαραίτητη για διακλάδωση μορφογένεση των αρτηριών, η στόχευση μεσολάβηση GIPC1 οδούς είναι μια λογική θεραπευτική στρατηγική για την αγωγή ανθρώπινων καρκίνων. Ειδικότερα, τα στοιχεία μας δείχνουν στόχευση GIPC1 μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τους καρκίνους του μαστού υψηλής ποιότητας με θετικούς υποδοχείς οιστρογόνων.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Η MCF-7 , MDA-ΜΒ231 και SKBR-3 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και η SW480 και SW620 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικές κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC. Ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMECs) αγοράστηκαν από την Invitrogen (# Α-10565). Πρωτοβάθμια πειράματα HMEC έγιναν πέρασμα ≤ 10.

hTERT

-immortalized HMECs εκφράζουν SV40 LT και st καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε 100 πιάτα καλλιέργειας ιστού × 20 mm (Becton Dickinson # 353803). Τα κύτταρα MCF-7 καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε ΕΜΕΜ (GIBCO # 11095-080) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (ATCC # 30-2020) και 1% αντιβιοτικό-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). κύτταρα MDA-ΜΒ231 καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 0% CO

2 σε L-15 Leibovitz media (Gibco # 11415-064) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό-Antimyotic. SKBR-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε μέσο McCoy 5Α (Gibco # 12330-031) συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό-Antimyotic. SW480 και SW620 κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 0% CO

2 σε L-15 Leibovitz media συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικό-Antimyotic. Πρωτογενή HMECs καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε Μέσο 171PRF (κόκκινο φαινόλης-ελεύθερο) (GIBCO # Μ-171PRF-500) συμπληρωμένο με μαστικά επιθηλιακά συμπλήρωμα ανάπτυξης (Megs) (GIBCO # S-015- 5) και 1% αντιβιοτικά Antimyotic. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε 60-70% συρροή.

shRNA βραδέος παραγωγή φορέα και την μεταγωγή

GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 και NM_005716.2-499s1c1) και κενών πλασμιδίων φορέα shRNA ως καθώς και οι Delta 8.9 και VSVG πλασμίδια ελήφθησαν από τις εγκαταστάσεις της RNAi στο Αντικαρκινικό Ινστιτούτο Dana-Farber. Μια ομελέτα, των μη στοχευόμενων shRNA πλασμίδιο ήταν η αγορά από Sigma (# SHC002). εκδόσεις cDNA του SV40 LT + st (LTG) κλωνοποιήθηκαν εντός pWZL-blast όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Όλα τα πλασμίδια αναπτύχθηκαν σε LB ζωμό 100 μg /μl αμπικιλλίνη (Teknova # L8105). Τα πλασμίδια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το Qiagen Πλασμίδιο ταχύπλοο Maxi Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen # 12663), και οι αποδόσεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Scientific # SID-10135606). ΗΕΚ 293Τ /17 κύτταρα (ATCC # CRL-11268) επεκτάθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

6/100 mm κυτταρικής καλλιέργειας πιάτο (BD Primaria # 353803) σε Τροποποιημένο Μέσο Dulbecco Eagle (ATCC # 30-2002) + 10% θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό (ATCC # 30-2020) και επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 24 ώρες. Κάθε πλάκα στην συνέχεια επιμολύνονται με αντιδραστήριο Fugene 6 Transfection (Roche # 11814443001), VSVG καθαρισμένο πλασμίδιο, δέλτα 8.9 καθαρίστηκε πλασμίδιο, και είτε 6 μg του shRNA καθαρισμένου πλασμιδίου ή 4 μg καθαρισμένου LTG

WB πλασμίδιο σε Optimem μέσο (Invitrogen # 11058-021). Media αλλάχθηκε μία ημέρα μετά την επιμόλυνση με DMEM + FBS μέσο 10% που περιέχει 1% αντιβιοτικό-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). Τα μέσα που περιέχουν το συσκευασμένο ιός συλλέχθηκε την ημέρα 2 μετά την επιμόλυνση, προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο, ​​και το ιικό συγκομιδή συλλέχτηκε και πάλι την ημέρα 3 μετά την επιμόλυνση. Το συσκευασμένο lentivirus διηθήθηκε με 0.45 μm φίλτρων (Corning # 431220) και συμπυκνώθηκε για 90 λεπτά σε 16,600 g χρησιμοποιώντας έναν υπερφυγόκεντρο (Beckman # L8-70M). Μετά την επαναιώρηση, το φακοϊό τιτλοδοτήθηκε χρησιμοποιώντας το QuickTiter Lentivirus ποσοτικοποίηση Kit (Cell Biolabs # VPK-108-HIV) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για λεντοϊού μεταγωγή φορέα shRNA, μέσα ανάπτυξης που περιέχουν πολυβρένιο και όγκο λεντοϊού που εξισώνεται σε ΜΟΙ 50 προστέθηκαν στα κύτταρα και επωάστηκαν για μία νύχτα σε κυτταρική γραμμή ειδικές συνθήκες καλλιέργειας. Την επόμενη ημέρα, τα μέσα ενημέρωσης ιός αντικαταστάθηκε με κυτταρική σειρά ειδικών μέσο ανάπτυξης. Στις 72 ώρες, το μέσο αναπτύξεως συμπληρώθηκε με είτε 10 μg /mL πουρομυκίνης και /ή 2,5 μg /ml βλαστισιδίνη. Τα πειράματα διεξήχθησαν 14 ημέρες μετά την επιλογή.

απομόνωση RNA, μικροσυστοιχιών υβριδισμό και την επεξεργασία, και ποσοτική PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen # 74106) σύμφωνα με προδιαγραφές του κατασκευαστή με στήλες QIAshredder (Qiagen # 79656) για την ομογενοποίηση κυτταρικού ιζήματος. Ολικό RNA ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Scientific # SID-10135606). Είκοσι μία Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Συστοιχίες χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Επτά συστοιχίες ανά ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για τις ακόλουθες κυτταρικές γραμμές MDA-MB231: μη μεταχθέντα, κενό φορέα, και GIPC1 KD. υβριδισμού και επεξεργασία μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τυποποιημένα πρωτόκολλα στην εγκατάσταση μικροσυστοιχιών πυρήνα στο Αντικαρκινικό Ινστιτούτο Dana-Farber. Η επεξεργασία των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με έναν Affymetrix GeneChip ρευστονικής Station FS450 και συστοιχίες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή συστοιχίας GCS300 σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Δύο-βήμα ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη με ένα σύστημα Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems # 4329001). TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems # Hs00991802_m1) και 18S ενδογενής Ελέγχου (Applied Biosystems # 4304437) δοκιμασίες διεξήχθησαν σε 8 επαναλήψεις ανά δείγμα, χρησιμοποιώντας τη σχετική ποσοτικοποίηση (Δέλτα Ct), FAM δεν ρυθμίσεις απόσβεσης. Delta Cts υπολογίστηκαν αφαιρώντας την μέση Ct των ενδογενών ελέγχων από το μέσο όρο Ct του στόχου ενίσχυσης. Η δέλτα-δέλτα Ct υπολογίστηκε αφαιρώντας τη μέση δέλτα Ct των κενών δειγμάτων φορέα από τον μέσο όρο της δέλτα Ct των δειγμάτων διανύσματος στόχου. Διπλώστε αλλαγή αυτή υπολογίζεται ως 2 στη δύναμη του δέλτα-δέλτα Ct.

κανονικοποίηση των δεδομένων μικροσυστοιχιών και ανάλυση

Πρώτες δεδομένων (.cel αρχεία) εισήχθησαν R και τα δεδομένα κανονικοποιούνται με RMA [ ,,,0],20] χρησιμοποιώντας το πακέτο Bioconductor,

Affy

. Αρχική διερευνητική ανάλυση των δεδομένων έγινε με ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης (μέσος-σύνδεση και τη μονάδα μέτρησης 1 – Pearson συσχέτιση απόσταση συντελεστή) χρησιμοποιώντας το πακέτο Bioconductor,

made4

[21]. Δύο τάξη Ανάλυση αταίριαστο Σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM?. [22] με ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη 0% (Q-value) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η διαφορική έκφραση των γονιδίων μεταξύ άδειο φορέα ελέγχου και τα κύτταρα GIPC1 KD MDA-MB231