Αφηρημένο

Το σύστημα επιδιόρθωσης αναντιστοιχία DNA (MMR) διατηρεί τη σταθερότητα του γονιδιώματος μέσω της αναγνώρισης και επισκευή αναντιστοιχίες μονής βάσης και μικρές θηλιές εισαγωγή-διαγραφή. Η αδρανοποίηση της οδού MMR προκαλεί αστάθεια μικροδορυφόρου και τη συσσώρευση γενετικών μεταλλάξεων που μπορεί να προκαλέσει ή να συμβάλει στον καρκίνο. Στην πραγματικότητα, το 10-20% ορισμένων συμπαγείς και αιματολογικές καρκίνοι είναι MMR-ανεπαρκή. MMR ανεπάρκεια καρκίνοι δεν ανταποκρίνονται σε κάποιο πρότυπο των χημειοθεραπευτικών προσοχή λόγω των υποτιθέμενων αυξημένη ανοχή της βλάβης του DNA, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για νέα θεραπευτικά φάρμακα. Προς αυτό το στόχο, δημιουργήσαμε ισογονιδιακές καρκινικές κυτταρικές σειρές για άμεση σύγκριση της MMR-καλά και MMR-ανεπαρκή κύτταρα. Εμείς μηχανικής ΝΟΙ-Η23 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα για να περιέχουν ένα δοξυκυκλίνη επαγόμενο shRNA σχεδιαστεί για να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων MLH1, και σε σύγκριση μονό υποκλώνοι κυττάρων που δεν είχαν επαχθεί (MLH1-καλά) έναντι επάγεται για την MLH1 shRNA (MLH1 ανεπάρκεια ). Εδώ παρουσιάζουμε τον χαρακτηρισμό αυτών των MMR επαγόμενο κυτταρικές σειρές και να επικυρώσει μια νέα κατηγορία ενώσεων ροδίου metalloinsertor που αναστέλλουν διαφορικά τον πολλαπλασιασμό του MMR ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Bailis JM, Gordon ML, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IR (2013) ενός επαγόμενου, Καρκίνος Ισογενή σύστημα κυτταρικής γραμμής για τη στόχευση του κράτους Ασυμφωνία Ανεπάρκεια επισκευής. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10.1371 /journal.pone.0078726

Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 24 Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 17, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Bailis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς ευχαριστώ τον ΝΙΗ (GM33309 να JKB) και NSF (υποτροφία για να ACK) για οικονομική υποστήριξη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel και Ilan Kirsch είναι ή ήταν υπάλληλοι της Amgen, Inc. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Genome αστάθεια είναι το σήμα κατατεθέν των καρκινικών κυττάρων και μπορεί να οδηγήσει σε αριθμητική ή δομικές αλλαγές στα χρωμοσώματα (χρωμόσωμα αστάθεια, ή CIN), ή την επισκευή νουκλεοτιδίων αναντιστοιχία (MMR) ανεπάρκεια (MIN) [1]. Ενώ CIN μπορεί να προκύψει από απώλεια της λειτουργίας ενός αριθμού κυτταρικών οδών, MIN προκύπτει ειδικά από ελαττώματα στο σύστημα MMR και είναι αναγνωρίσιμα από το κέρδος ή η απώλεια του μονο-, δι- ή τρι-νουκλεοτιδίου επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, που αναφέρονται ως αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) (αναθεωρηθούν 2). σφάλματα αντιγραφής όπως ολίσθηση της πολυμεράσης παράγουν μικρές θηλιές εισαγωγή-διαγραφή (IDLS) ή μόνο αναντιστοιχίες βάσεων στο DNA. βλάβες στο DNA μπορεί επίσης να τροποποιήσετε τις βάσεις για να προκαλέσει αναντιστοιχίες. Σε ανθρώπινα κύτταρα που είναι MMR-καλά, ετεροδιμερή που περιέχουν τις βακτηριακές MutS ομόλογο MSH2 δεσμεύουν μια αναντιστοιχία, και στη συνέχεια, ετεροδιμερή που περιέχουν το βακτηριακό MutL ομόλογο MLH1 συνεργάτης με την πρωτεΐνη: συγκρότημα DNA για να μεσολαβήσει στην πρόσληψη των παραγόντων επισκευής που αποκοπεί η αναντιστοιχία και αποκαταστήσει την σωστή αλληλουχία DNA. MMR-ανεπαρκή κύτταρα είναι σε θέση να διορθώσει αναντιστοιχίες, με αποτέλεσμα την ενσωμάτωση των σφαλμάτων στο πρότυπο DNA και ένα φαινότυπο μεταλλάκτη.

ανεπάρκεια MMR συνδέεται στενά με τον καρκίνο. γραμμή Germ μετάλλαξη των γονιδίων MMR, ιδιαίτερα MLH1 ή MSH2, είναι η βάση της κληρονομικής μη πολυποδίαση ορθοκολικό καρκίνο (HNPCC), ή σύνδρομο Lynch, η οποία προσδίδει ευαισθησία σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά επίσης και σε άλλους ειδικούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ενδομητρίου και του καρκίνου των ωοθηκών (επισκόπηση σε 3,4). Μετάλλαξη ή υπερμεθυλίωση των γονιδίων MMR σε σωματικά κύτταρα συνδέεται με περίπου το 15% των σποραδικών καρκίνων του παχέος, καθώς και 10-15% των ωοθηκών, του ενδομητρίου και γαστρικών καρκίνων (ανασκόπηση στο 5). ανεπάρκεια MMR και MSI έχουν επίσης εντοπιστεί σε έως και 20% των λευχαιμιών σε ασθενείς που υποτροπιάζουν, ή ότι αναπτύσσουν την ασθένεια ως συνέπεια της προηγούμενης χημειοθεραπείας [6].

ανεπάρκεια MMR και MSI εμφανίζονται επίσης σε πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα σχετίζεται με το κάπνισμα ή την έκθεση σε χρώμιο [7-9]. Οι Καρκίνοι με MSI έχουν αναφερθεί ότι είναι ανθεκτικά σε διάφορα πρότυπο-of-care χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως η αντιμεταβολίτη 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), η πλατίνα ενώσεις σισπλατίνη και η καρβοπλατίνη, η τεμοζολομίδη αλκυλιωτικό φάρμακο, και το ετοποσίδη παρεμποδιστή τοποϊσομεράσης [ ,,,0],10]. Η αδρανοποίηση της οδού MMR μπορεί να επιτρέψει στα κύτταρα να ανέχεται ορισμένους τύπους βλάβης του DNA χωρίς να κινήσει ένα μονοπάτι του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου [11].

Μια πρόκληση για τον εντοπισμό θεραπείες για MMR ανεπάρκεια των καρκίνων είναι ότι τα μοριακούς στόχους και κλινικές φαινότυποι που προκύπτουν από απενεργοποίηση γονιδίων MMR είναι μεταβλητή. ανεπάρκεια MMR μπορεί να οδηγήσει σε μετατόπιση πλαισίου μεταλλάξεις σε γονίδια που περιέχουν επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στο DNA, και έχουν τουλάχιστον 30 γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί στόχοι της MSI, συμπεριλαμβανομένης της ογκογόνων BRAF και KRAS, και τα γονίδια απόκριση βλάβης DNA MRE11, BRCA1 και ATR [ ,,,0],12,13]. Οι προσπάθειες για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων που εμφανίζουν συνθετικό θνησιμότητα με MMR ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα έχουν αποκαλύψει μεταβλητότητα σε γενετική στόχους με απώλεια της λειτουργίας του MLH1 ή MSH2 [14]. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι οι καρκίνοι με MSI αντιπροσωπεύουν μια πολύπλευρη, ετερογενές σύνολο των ασθενειών. Λαμβάνοντας υπόψη την πολυπλοκότητα των όγκων MSI, έχουμε προτείνει στο παρελθόν με στόχο το τέλος φαινότυπο ή «κράτος» της ίδιας της αναντιστοιχίας ανεπάρκεια επισκευής [15,16].

Κατά την τρέχουσα προσπάθεια που περιγράφεται εδώ, ο στόχος μας ήταν να αναπτύξουμε εργαλεία για τη χρηματοδότηση μελετών του που προκαλείται από ανεπάρκεια επισκευή ασυμφωνία. Περιγράφουμε ένα εντελώς ισογονιδιακές σύστημα κυτταρική γραμμή στην οποία η έκφραση του γονιδίου MLH1 MMR μπορεί να ενεργοποιηθεί ή να απενεργοποιηθεί με τη χρήση shRNA. Όπως σύστημα μοντέλου μας χρησιμοποιήσαμε το αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα ΝΟΙ-Η23, μία κυτταρική γραμμή που επιλέγεται με βάση τα σχετικά υψηλά επίπεδα του MLH1 που θα μπορούσε να αδρανοποιηθεί αντιστρεπτά με shRNA. Σε αυτή τη μελέτη, επάγει ανεπάρκεια MMR στο σύστημα κυτταρικής σειράς ΝΟΙ-Η23 και αποδεικνύουν ότι αυτό έχει ως αποτέλεσμα MSI και αυξημένη αντίσταση σε παράγοντες βλάβης του DNA. Ως πιθανό βήμα προς την ανάπτυξη ενός θεραπευτικού που στοχεύει το τέλος «κατάσταση» της ανεπάρκειας MMR, μπορούμε επίσης να χρησιμοποιήσετε αυτό το σύστημα κυτταρικής σειράς για την επικύρωση περαιτέρω μια νέα κατηγορία των συμπλόκων μετάλλων που στοχεύουν αναντιστοιχίες DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύντομη φουρκέτα RNA (shRNA)

Ακολουθίες προβλέπεται να γκρεμίσουμε την έκφραση των γονιδίων MLH1 ή MSH2 σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Τέσσερις ανεξάρτητες ακολουθίες για κάθε γονίδιο επιλέχθηκαν ως υποψήφια shRNA προκαλεί, όπως αναφέρεται κατωτέρω (αρίθμηση υποδεικνύει τη θέση στο cDNA).

MLH1.

362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC

740 GCAGGTATTCAGTACACAATG

928 GGTTACATATCCAATGCAAAC

2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC

MSH2.

399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG

1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG

1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT

2359 GGGCTATATCAGAATACATTG

Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την κατασκευή των κασετών shRNA έχει περιγραφεί λεπτομερώς αλλού [17]. Εν συντομία, shRNA αίσθηση-loop-αντινοηματικά κατασκευάσματα αυτών των αλληλουχιών δημιουργήθηκαν με PCR, χρησιμοποιώντας TTCATGAGA ως ακολουθία βρόχο. Το τελικό προϊόν της PCR, το οποίο περιείχε την αίσθηση-loop-αντίθετης φοράς shRNA ακολουθίες πλαισιώνεται από το

attB1 Ιστοσελίδα και Th1 υποκινητή στο 5 ‘άκρο, και ένα σήμα τερματισμού και το

attB2 Ιστοσελίδα για το 3 ‘άκρο, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα πύλη pDONR (Life Technologies). τεχνικές ανασυνδυασμού πύλη στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να μεταφέρει τις κασέτες shRNA σε πύλη συμβατή φορείς λεντοϊού προορισμό pLV736G ή pLV739G.

λεντοϊών αποθέματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [17]. 293-METR κύτταρα [18] επιμολύνθηκαν με ένα pLV736G ή pLV739G φορέα που περιείχε ένα άτομο κασέτα shRNA, μαζί με πλασμίδια που περιέχουν τα γονίδια Gag /Pol, Rev, και Εην. Μετά από ολονύκτια επώαση, το υπερκείμενο συλλέχθηκε, διηθήθηκε, συμπυκνώθηκε με υπερφυγοκέντρηση και αποθηκεύονται στους -80 ° C.

γενιάς γραμμή κυττάρων

κύτταρα ΝΟΙ-Η23 λαμβάνεται από την American Type Culture Collection (ATCC ) αναπτύχθηκαν εντός μέσου RPMI με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Για φακοϊικών μεταγωγή, κύτταρα NCI-Η23 σπάρθηκαν σε 2 Χ 10

4 κύτταρα ανά ml σε πλάκες 12 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Το μέσο αναρροφήθηκε από τα κύτταρα και αντικαταστάθηκε με Opti-ΜΕΜ (Life Technologies) που περιείχε 10 μg /ml Διαιθυλαμινοαιθυλ-Δεξτράνη (GE Healthcare Life Sciences) και 1-5 χ 10

6 μονάδες μεταγωγής ανά χιλιοστόλιτρο (TU /ml ) του λεντοϊού. Τα κύτταρα σε μεταγωγή με φακοϊό περιέχουν MLH1 shRNA ή MSH2 shRNA. Οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια, μέσα που περιέχουν φακοϊό αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο RPMI. Μετά από 1-3 ημέρες (d), τα κύτταρα επεκτάθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αναπτύχθηκαν παρουσία του παράγοντα επιλογής (250 μg /ml G418 για MLH1 και 2,5 μg /ml πουρομυκίνη για MSH2). 500ng /ml δοξυκυκλίνης (Sigma-Aldrich) προστέθηκε στα κύτταρα για να προκαλέσει την έκφραση του shRNA.

κύτταρα αναπτύσσονται υπό επιλογή και με shRNA επαγωγή για τουλάχιστον 2 μήνες απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 0.3 κύτταρα ανά φρεάτιο για να επιλεγούν ενιαία υποκλώνων κυττάρων. Ενιαία υποκλώνοι κυττάρων επεκτάθηκαν και διατηρείται υπό συνθήκες επιλογής. Οι μη επαγόμενες κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση με τις επάγεται υποκλώνους ελήφθησαν με καλλιέργεια των υποκλώνων απουσία δοξυκυκλίνης για τουλάχιστον μία εβδομάδα.

Αντισώματα και κηλίδες Western

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ( 50mM HEPES, 1% Triton Χ-100, 150 NaCl, 1 mM EGTA, 10% γλυκερόλη, 1 mM διθειοθρεϊτόλη) στο οποίο φωσφατάση και αναστολείς πρωτεάσης (20mM β-γλυκεροφωσφορικό, 100 mM φθοριούχο νάτριο, 0.5 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 0.1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 10 μg /ml λευπεπτίνη) προστέθηκαν. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και στη συνέχεια αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε 4-12% Bis-Tris πηκτώματα (Life Technologies) που ακολουθείται από ανοσοστύπωση. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κατά MLH1 (Becton Dickinson # 551091), MSH2 (Becton Dickinson # 556349), GAPDH (Abcam # ab9484), φωσφορυλιωμένη H2AX ιστόνης (Millipore # 05-636) ή τουμπουλίνης (Cell Signaling # 2148). Πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύτηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα σε IRDye700 ή IRDye800 (licor) και οπτικοποιείται με τη licor Οδύσσεια. Κάθε πείραμα στυπώματος Western εκτελέστηκε τουλάχιστον δύο φορές, σε ανεξάρτητες ημέρα. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα μόνο πείραμα παρουσιάζονται.

θραύσμα DNA ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA από τους υποκλώνους ΝΟΙ-Η23 παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας κιτ DNeasy (Qiagen). Multiplex PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν σύμφωνα με το Σύστημα Ανάλυσης MSI, έκδοση 2.1 (Promega). Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε έναν ΑΒΙ 3130 sequencer, και στη συνέχεια αναλύθηκαν τα δεδομένα χρησιμοποιώντας λογισμικό GeneMapper (Life Technologies). Οι υποκλώνοι που εκτίθενται MSI για τουλάχιστον ένα δείκτη στο πρώτο πείραμα επανεξετάστηκαν σε ένα ανεξάρτητο πείραμα για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα.

προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας

Κύτταρα που αναπτύσσονται σε απουσία ή παρουσία δοξυκυκλίνης απλώθηκαν σε 2000-5000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και αφέθηκαν να επωαστούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενώσεις σε απόκριση δόσης για 4δ. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυττάρων Titer-Glo (Promega) για το μεταβολισμό ΑΤΡ. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων διεξήχθησαν εις διπλούν σε τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από ένα τέτοιο πείραμα παρουσιάζονται.

απεικόνιση αντίθεσης φάσης των κυττάρων κατά τη διάρκεια των πειραμάτων πολλαπλασιασμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα IncuCyte με στόχο 20Χ (Essen BioScience).

δοκιμασίες σχηματισμού αποικιών χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να ελεγχθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από θεραπεία με την ένωση. Κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία δοξυκυκλίνης απλώθηκαν σε 500-2000 κύτταρα ανά φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων και αφέθηκαν να επωαστούν για μία νύχτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ενώσεις σε απόκριση δόσης για 24 ώρες (h), και στη συνέχεια μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που δεν περιείχε ένωση. Οι αποικίες έγιναν ορατές με χρωστική κρυσταλλικού ιώδους σε 10-12d

σχετίζονται Γήρανση βήτα-γαλακτοσιδάση (SA – gal). Παραγωγή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια ιστοχημική χρώση για δραστικότητα βήτα-γαλακτοσιδάσης σε ρΗ 6,0 (Sigma-Aldrich) . Τα κύτταρα χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με ενώσεις όπως υποδεικνύεται για 3d, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν κύτταρα, χρωματίζονται για SA -. Gal και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axio ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με έγχρωμη κάμερα

Η στατιστική ανάλυση

για τους προσδιορισμούς κυτταρικής βιωσιμότητας, χρησιμοποιήθηκαν ζεύγη t τεστ για να συγκρίνουν το ήμισυ της μέγιστης ανασταλτική (IC

50) ή μέση θανατηφόρος δόση (LD

50) τιμές από πολλαπλά πειράματα και να καθορίσει σ τιμές. Οι τιμές Ρ ίση ή μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το λογισμικό Graph Pad Prism.

Microarray ανάλυση

Ολικό RNA παρασκευάσθηκε από δείγματα εις διπλούν κυττάρων σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης, χρησιμοποιώντας ένα RNeasy μίνι κιτ (Qiagen). ακεραιότητα του δείγματος εκτιμήθηκε σε BioAnalyzer. Cy3- και Cy5-σημασμένο RNA παρασκευάστηκε από 200 ng ολικού RNA ανά δείγμα, και στη συνέχεια υβριδοποιείται προς Human Genome Σύνολο Arrays (Agilent Technologies) σύμφωνα με την Agilent Δύο Color βάσει μικροδιάταξης Gene Expression Πρωτόκολλο Ανάλυσης. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στο Rosetta Αναλυτής.

Χημικές ενώσεις

Σύνθεση του [Rh (ΑΠΔΠΧ)

2chrysi]

3+ και [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ έχουν περιγραφεί [19,20]. Η σύνθεση του [Rh (ΚΣΕ) (phen) (Χρυσή)]

3+ αναφέρθηκε πρόσφατα [21]. Η σισπλατίνη, δοξορουβικίνη, ετοποσίδη, 6-θειογουανίνη και τεμοζολομίδη ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich και διαλύθηκε σε DMSO ή νερό. Το /6 αναστολέας CDK4 PD-0332991 [22], χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για δοκιμασίες γήρανση, συντέθηκε σύμφωνα με δημοσιευμένες μεθόδους.

Αποτελέσματα

Αναστολή της MLH1 με shRNA μειώνει τα επίπεδα πρωτεΐνης MLH1

Το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα γραμμή NCI-H23 είναι καλά για την αναντιστοιχία επισκευή και περιέχει σχετικά υψηλά επίπεδα των πρωτεϊνών MMR MLH1 και MSH2 [23]. Με στόχο τη δημιουργία ενός συμφωνημένα σύστημα που προκαλεί MMR ανεπάρκεια και επιτρέπει την άμεση σύγκριση με το MMR-καλά κύτταρα, ελέγξαμε εάν η έκφραση αυτών των πρωτεϊνών MMR μπορεί να ρυθμίζεται προς τα κάτω από shRNA. κύτταρα ΝΟΙ-Η23 μετήχθησαν με επιλέχθηκαν και επεκτάθηκαν φακοϊό περιέχει διεγέρσιμο shRNA να MLH1 ή MSH2, και κύτταρα που σταθερά ενσωματωμένο το κατασκεύασμα εντός του γονιδιώματος. Υπό κανονικές συνθήκες ανάπτυξης, το ολοκληρωμένο shRNA δεν ήταν ενεργός και οι πρωτεΐνες MMR συνέχισαν να εκφράζονται. Η έκφραση του shRNA ρυθμιζόταν με κατεργασία των κυττάρων με δοξυκυκλίνη. Όταν το shRNA προκλήθηκε, πρωτεΐνη προϊόντα λύσης από κύτταρα που περιείχαν οποιοδήποτε από τα τέσσερα κατασκευάσματα shRNA έναντι MLH1 κατέδειξε σχεδόν πλήρη (& gt? 90%) αναστολή της πρωτεΐνης MLH1 (Σχήμα S1). Σε αντίθεση, η πρωτεΐνη MSH2 μόνο μερικώς μειωμένη μετά από επαγωγή από οποιοδήποτε από τα τέσσερα MSH2 shRNA κατασκευασμάτων σε κύτταρα ΝΟΙ-Η23 (Σχήμα S1) και τα κύτταρα αυτά δεν χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω.

Λόγω της πιθανότητας για μεταβλητότητα της έκφρασης shRNA εντός ενός πληθυσμού κυττάρων, απομονώσαμε και χαρακτηρίζεται από ενιαία υποκλώνων κυττάρων από κύτταρα ΝΟΙ-Η23 μεταγωγή με ένα από τα shRNA κατασκευάσματα, MLH1 928. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό την παρουσία δοξυκυκλίνη να επάγει την MLH1 shRNA για τουλάχιστον ένα μήνα, και στη συνέχεια απλώνονται για μονά κύτταρα τα οποία επεκτάθηκαν σε αποικίες που διατηρήθηκαν σε επαγωγικές συνθήκες. τα επίπεδα της πρωτεΐνης MMR στη συνέχεια επανεκτιμηθεί από ανοσοαποτύπωση. Οι υποκλώνοι ΝΟΙ-Η23 που εκφράζεται MLH1 shRNA μειώνεται σταθερά τα επίπεδα της πρωτεΐνης MLH1 & gt? 90%, χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα της πρωτεΐνης MSH2 (Σχήμα 1).

επίπεδα πρωτεΐνης MLH1 σε ΝΟΙ-Η23 υποκλώνοι που επάγεται για την MLH1 928 shRNA συγκρίθηκαν με τα επίπεδα πρωτεΐνης MLH1 στα γονικά κύτταρα ΝΟΙ-Η23 (H23). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση για τα επίπεδα πρωτεϊνών MLH1 και MSH2. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την πρωτεΐνη φόρτωσης.

Η

Ελάττωση του MLH1 προκαλεί αστάθεια μικροδορυφόρου

Έχουμε επιλέξει τουλάχιστον 20 υποκλώνων από τα κύτταρα NCI-H23 που εκφράζεται MLH1 shRNA για τη δοκιμή για MSI. Γονιδιακό DNA παρασκευάστηκε από γονικά κύτταρα ΝΟΙ-Η23 και από κάθε υποκλώνο, και στη συνέχεια πολλαπλή PCR διεξήχθη για να ενισχύσει ένα πρότυπο πάνελ μικροδορυφορικών δεικτών (ΒΑΤ-26, ΒΑΤ-25, μονο-27, NR-21 και NR-24 ). Θραύσμα μεγέθη των προϊόντων PCR κατόπιν αναλύθηκαν επί αλληλουχητή DNA. Όλα τα υποκλώνων ΝΟΙ-Η23 έδειξε MSI στην επανάληψη μονονουκλεοτίδιο ΒΑΤ-26 [24], που υποδεικνύεται από μία μετατόπιση από 1-3 νουκλεοτίδια στο τόπο (Σχήμα S2). Ως εκ τούτου, η ανεπάρκεια MLH1 είναι επαρκής για να επάγει MSI. Ένας αριθμός υποκλώνων που εμφανίζονται επίσης δυνατόν MSI σε άλλο δείκτη, με ανεξάρτητη υποκλώνους αποδεικνύουν αλλοίωση των διαφορετικών δεικτών (Εικόνα S2). Υποκλώνοι 4-10 και 4-13, τα οποία ελήφθησαν από τη μεταγωγή των κυττάρων NCI-H23 με το shRNA κατασκεύασμα MLH1 928, επιλέχθηκαν για επιπλέον φαινοτυπική ανάλυση.

Ελάττωση των γονιδίων MMR από shRNA είναι αναστρέψιμη

Οι υποκλώνοι μόνο κύτταρο NCI-H23 διατηρήθηκαν κάτω από συνθήκες ανάπτυξης που προκαλείται από συνεχή έκφραση shRNA. Για να ελεγχθεί κατά πόσο η shRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του MLH1 ήταν αναστρέψιμη, κύτταρα από κάθε υποκλώνο χωρίστηκαν σε δύο ξεχωριστές καλλιέργειες, με μία καλλιέργεια διατηρείται υπό την παρουσία δοξυκυκλίνης να διατηρήσει ανεπάρκεια MLH1, και η άλλη καλλιέργεια αναπτύχθηκε σε απουσία δοξυκυκλίνη για να επιτρέψει έκφραση MLH1. Μετά από μία εβδομάδα, προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα, και το επίπεδο πρωτεΐνης MLH1 εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση. Εν απουσία δοξυκυκλίνης, τα κύτταρα από τα 4-10 και 4-13 υποκλώνους ήταν σε θέση να αποκαταστήσει εκφράζουν άγριου τύπου επίπεδα του MLH1 πρωτεΐνης (Σχήμα 2). Δεν είναι όλα τα υποκλώνων που ελέγχθηκαν ήταν σε θέση να αποκαταστήσει ρητή MLH1 πρωτεΐνη μετά από ανάπτυξη σε απουσία δοξυκυκλίνης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι ο shRNA σε αυτές υποκλώνους μπορούν να εκφράζονται συστατικώς.

ΝΟΙ-Η23 υποκλώνοι 4 -10 και 4-13 που επάγονται για MLH1 shRNA χωρίστηκαν σε δύο πολιτισμούς, ένας διατηρούνται σε συνθήκες επαγωγής (+ δοξυκυκλίνη) και το άλλο αναπτύχθηκαν απουσία δοξυκυκλίνης (-) για να επιτρέψει την εκ νέου έκφραση του MLH1. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση για την έκφραση της πρωτεΐνης MLH1. Τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την ίση πρωτεΐνη φόρτωση απέναντι δείγματα.

Η

MLH1 ανεπάρκεια NCI-H23 υποκλώνοι δεν εμφανίζονται παγκόσμιες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση

ανάλυση μικροσυστοιχιών διεξήχθη στις NCI-H23 ενιαία υποκλώνοι κυττάρων για να ελέγξετε αν αρνητική ρύθμιση της MLH1 από shRNA επηρεάζει την έκφραση άλλων γονιδίων. Κύτταρα από υποκλώνους 4-10 και 4-13 είτε διατηρήθηκαν υπό την παρουσία δοξυκυκλίνης να επάγει MLH1 shRNA, ή αναπτύχθηκαν απουσία της δοξυκυκλίνης για τουλάχιστον μία εβδομάδα για να επιτρέψει την εκ νέου έκφραση του MLH1. Η γονική κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η23, είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με δοξυκυκλίνη, συμπεριλήφθηκε ως μάρτυρας. Ολικό RNA απομονώθηκε από δείγματα εις διπλούν των κυττάρων, σημασμένο με φθορισμό, και υβριδοποιήθηκε σε Agilent συστοιχίες ολόκληρο το γονιδίωμα. μοτίβα γονιδιακής έκφρασης στα μη επαγόμενα υποκλώνους ήταν παρόμοια με εκείνα των γονικών κυττάρων ΝΟΙ-Η23, είτε μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με δοξυκυκλίνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επίπεδα του γονιδίου μεταγραφής MLH1 μειώθηκαν περίπου τριπλάσια στις 4-10 και 4-13 υποκλώνοι όπου MLH1 shRNA είχε προκληθεί (Σχήμα S3). Μια πιο διαδεδομένη υπογραφή γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με την επαγωγή MLH1 shRNA δεν προκύπτουν από τα στοιχεία (Εικόνα S3).

MLH1 ανεπάρκεια NCI-H23 υποκλώνοι εμφανίζουν αυξημένη αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν προκαλείται από ανεπάρκεια MMR θα μπορούσε να προκαλέσει αντίσταση σε παράγοντες βλάβης του DNA. Συγκρίναμε άμεσα τα MMR-ανεπαρκή υποκλώνοι NCI-H23 για MMR-ικανός κύτταρα από τον ίδιο τον υποκλώνο που ελήφθησαν με τα κύτταρα επιτρέποντας την εκ νέου express MLH1. Οι MMR ανεπάρκεια και MMR-ικανοί υποκλώνοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ετοποσίδη παρεμποδιστή τοποϊσομεράσης ή η τεμοζολομίδη αλκυλιωτικό παράγοντα και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά από 4d (Σχήμα 3Α, D). Οι MMR-καλά υποκλώνους, στο οποίο δεν είχαν επαχθεί η shRNA, δεν έδειξε σημαντική διαφορά στην ευαισθησία προς τις ενώσεις σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ΝΟΙ-Η23 που ήταν είτε χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με δοξυκυκλίνη (ρ = 0,34) (Σχήμα S4). Για κάθε ζεύγος των κυττάρων (για παράδειγμα, υποκλώνος 4-10 χωρίς επαγωγή σε σύγκριση με 4-10 επαγόμενη), οι MLH1 με ανεπάρκεια κύτταρα ήταν σταθερά τουλάχιστον δύο φορές πιο ανθεκτικά σε αυτές τις ενώσεις από τα ισογονιδιακά MLH1-καλά κύτταρα, ένα εύρημα ότι είναι στατιστικά σημαντική (ρ = 0,04 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη, και ρ = 0.01 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τεμοζολομίδη) (Σχήμα 3Α, D). Οι MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνους ήταν επίσης πιο ανθεκτικά στην σισπλατίνη παράγοντα διασταύρωσης (p = 0.02), το ανάλογο πουρίνης 6-θειογουανίνη (p = 0.05), και ενός άλλου αναστολέα τοποϊσομεράσης, δοξορουβικίνη (ρ = 0,04) (Σχήμα S5). Το περίπου διπλάσια διαφορά σε βιωσιμότητα του MMR ελλειμματικών κυττάρων έναντι MMR-καλά κυττάρων in vitro σε απόκριση σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες έχει αναφερθεί προηγουμένως και φαίνονται να μεταφράσει σε αντοχή φαρμάκου in vivo (ανασκόπηση στο 4,10). Για να επιβεβαιωθεί ότι η διαφορική επίδραση επί της βιωσιμότητας οφείλεται στην παρουσία ή την απουσία MLH1, χρησιμοποιήσαμε διαφορετικές αλληλουχίες shRNA, 362 και 2239, για την αναστολή της έκφρασης MLH1 και, στη συνέχεια, που χαρακτηρίζεται από ευαισθησία των κυττάρων σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Παρατηρήσαμε ότι η MLH1 ανεπάρκεια που προκύπτει από την επαγωγή αυτών των ανεξάρτητων shRNA ενεργοποιεί οδήγησε σε μια παρόμοια αύξηση στην αντίσταση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα σε σχέση με τα κύτταρα NCI-H23 που εκφράζεται MLH1 (p = 0,01) (Σχήμα S6).

ΝΟΙ-Η23 υποκλώνοι που δεν είχαν επαχθεί ή επαγωγή για MLH1 shRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με ετοποσίδη (Α-Ο) ή temozolomide (D-F). (Α, D) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με την ένωση στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται, και η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε σε 4d χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυττάρων Titer-Glo. Τα γραφήματα δείχνουν την σχετική επιβίωσης για δείγματα εις διπλούν από ένα μοναδικό πείραμα. δοκιμασίες Τ για σύγκριση IC

50 τιμών σε πολλαπλά πειράματα προσδιορίστηκε τιμές ρ ρ = 0,04 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη, και ρ = 0.01 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τεμοζολομίδη. (Β, Ε) οι εικόνες αντίθεσης φάσης των κυττάρων στα σημεία 0h και χρόνο 96h κατά τη διάρκεια του πειράματος κυτταρικής βιωσιμότητας απεικονίζεται. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 390 μΜ ετοποσίδη (Β) ή 500 μΜ temozolomide (Ε). (C, F) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ένωση επί 24 ώρες στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις και αξιολογήθηκε η ικανότητα σχηματισμού μετά ένωσης έκπλυση αποικία. Οι γραφικές παραστάσεις εμφανίζουν ποσοστό επιβίωσης κατά 10d για διπλά δείγματα των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη (C) ή τεμοζολομίδη (F). Σύγκριση της LD

50 τιμών σε πολλαπλά πειράματα με t-test ρ προσδιορίζονται τιμές των ρ = 0,03 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη, και ρ = 0.04 για τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τεμοζολομίδη.

Η

Για να διερευνηθεί η διαφορική ευαισθησία στις ενώσεις με περισσότερες λεπτομέρειες, θα απεικονίζεται κύτταρα κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας 4δ της δοκιμασίας κυτταρικής βιωσιμότητας και εξετάστηκαν αριθμός των κυττάρων και η μορφολογία. Στο 0h χρονικό σημείο, τα κύτταρα είναι σε φάση ανάπτυξης και φαίνονται υγιή με απεικόνιση αντίθεσης φάσης. Ωστόσο από 96h, οι διαφορές μεταξύ των μη διεγερμένων και διεγερμένων υποκλώνους ήταν εμφανείς: τα περισσότερα από τα MLH1-καλά κύτταρα είχαν υποβληθεί σε κυτταρικό θάνατο μετά από θεραπεία με τις ϋΝΑ βλαπτικούς παράγοντες, ενώ οι MLH1 ανεπάρκεια κύτταρα συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται (Σχήμα 3Β, E). Η θεραπεία με τις ϋΝΑ βλαπτικούς παράγοντες δεν επηρέασε την έκφραση MLH1 στα μη επαγόμενα υποκλώνους αλλά είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του φωσφορυλιωμένου Η2ΑΧ ιστόνης, έναν δείκτη για τον κατακερματισμό του DNA [25], υποδηλώνοντας ότι οι MLH1 εκφράζουν κύτταρα είχαν υποστεί απόπτωση (Σχήμα S7).

Ερευνήσαμε περαιτέρω την επιβίωση των κυττάρων μετά από θεραπεία με την ένωση χρησιμοποιώντας κλωνογενείς δοκιμασίες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ετοποσίδη ή temozolomide για 24 ώρες, και ανάκτηση από την ένωση θεραπείας εκτιμήθηκε με σχηματισμό αποικιών μετά 10d. Οι MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνοι ΝΟΙ-Η23 ήταν πιο ανθεκτικά στην ένωση θεραπείας από τα ισογονικών κυττάρων ικανό για MLH1 (Σχήμα 3C, F), που δείχνει μια σημαντική διαφορά στο LD

50 τιμές (ρ = 0,03 για ετοποσίδη, και ρ = 0.04 για την τεμοζολομίδη). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν μια διαφορική απόκριση σε βλάβη του DNA, που βασίζεται αποκλειστικά στην παρουσία ή την απουσία του MLH1.

MLH1 ανεπάρκεια NCI-H23 υποκλώνοι οθόνη αυξημένη ευαισθησία σε ενώσεις metalloinsertor ρόδιο

περιγράφηκε προηγουμένως μεταλλικά σύμπλοκα που δεσμεύονται μη ομοιοπολικά αναντιστοιχίες DNA με μέτρια συγγένεια και υψηλή εξειδίκευση, λόγω της θερμοδυναμικής αποσταθεροποίηση των εσφαλμένης σύμπτωσης ζευγών βάσης (που επισκοπείται στο 26). Αρχικά απέδειξαν ότι αυτή η κατηγορία ενώσεων αναστέλλει κατά προτίμηση τον πολλαπλασιασμό των MMR ελλειμματικών κυττάρων, χρησιμοποιώντας ένα συμφωνημένα ΗΟΤ-116 σύστημα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή και ένα σύστημα γενετική νοκ-άουτ [16,19,21]. Αυτή η προηγούμενη εργασία ήταν το θεμέλιο και το κίνητρο για τη δημιουργία των ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη και μας οδήγησε να ελέγξετε αν ενώσεις του ροδίου metalloinsertor ήταν επίσης αναστέλλουν κατά προτίμηση τη βιωσιμότητα αυτών των κυττάρων, όταν η ανεπάρκεια MMR προκλήθηκε.

σε επαγώγιμων μας σύστημα κυτταρική γραμμή, η ένωση ροδίου metalloinsertor [Rh (Χρυσή) (phen) (ΚΣΕ)]

3+ ανέστειλε επιλεκτικά τη βιωσιμότητα των επαγόμενων MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνοι NCI-H23, με τουλάχιστον τρεις φορές αλλαγή στην κυτταρική IC

50 σε ένα 4δ κυττάρων Titer-Glo δοκιμασία σε σχέση με τις MLH1-καλά υποκλώνους (ρ = 0,01) (Σχήμα 4Α, Β). Μια άλλη ένωση ροδίου metalloinsertor, [Rh (ΑΠΔΠΧ)

2chrysi]

3+ επίσης κατά προτίμηση ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των MLH1 ανεπάρκεια κυττάρων (Σχήμα S8), με δύο έως τρεις φορές την αλλαγή στην κυτταρική IC

50 τιμές (p = 0.02). Για να επιβεβαιωθεί ότι η διαφορά προέκυψε από ανεπάρκεια MLH1 παρά ένα αποτέλεσμα εκτός στόχου του shRNA, χρησιμοποιήσαμε επιπλέον, ανεξάρτητος MLH1 shRNA κατασκευασμάτων μειορυθμίζει MLH1 σε κύτταρα ΝΟΙ-Η23 και επαλήθευσε ότι οι MLH1 ανεπάρκεια κύτταρα ήταν κατά προτίμηση ευαίσθητα σε ρόδιο metalloinsertor ενώσεις (ρ = 0,01) (Σχήμα S9). Σε αντίθεση, μία σχετική ένωση που εμφανίζει ασθενές μόνο σύνδεση προς αταίριαστων DNA, [Rh (DIP)

2chrysi]

3+ [21] δεν εμφανίζει μια διαφορετική επίδραση επί της κυτταρικής βιωσιμότητας του μη διεγερμένων και διεγερμένων ΝΟΙ-Η23 κλώνοι (ρ = 0,90) (Σχήμα S9). Μαζί, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι μειορύθμιση του MLH1 αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων με τις ενώσεις ροδίου metalloinsertor.

ΝΟΙ-Η23 υποκλώνοι που δεν είχαν επαχθεί ή επαγωγή για MLH1 shRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με την ένωση ροδίου metalloinsertor [Rh (Χρυσή) (phen) (ΚΣΕ)]

3+. (Α) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε συγκεντρώσεις υποδεικνύεται, και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά 4δ χρησιμοποιώντας δοκιμασία κυττάρων Titer-Glo. Ποσοστό βιωσιμότητα των διπλών δειγμάτων από ένα και μόνο πείραμα παρουσιάζεται. Η τιμή ρ προσδιορίστηκε ως ρ = 0,01 με δοκιμή t. εικόνων (Β) αντίθεση φάσης των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 5 μΜ [Rh (Χρυσή) (phen) (ΚΣΕ)]

3+ σε 0h και 96h κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας βιωσιμότητας των κυττάρων εμφανίζονται. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με [Rh (Χρυσή) (phen) (DPE)]

3+ για 24 ώρες, και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν για το σχηματισμό αποικιών μετά 10d. Τα γραφήματα δείχνουν το ποσοστό επιβίωσης των διπλών δειγμάτων των κυττάρων ένωσης θεραπεία. Η τιμή ρ προσδιορίστηκε ως ρ = 0,01 με δοκιμή t.

Η

Εξετάσαμε την κυτταρική μορφολογία των υποκλώνων NCI-H23 αγωγή με [Rh (Χρυσή) (phen) (ΚΣΕ)]

3+ κατά τη χρονική πορεία των δοκιμασιών πολλαπλασιασμού, χρησιμοποιώντας φάσης αντίθεση απεικόνισης. Κύτταρα από τα MLH1-καλά και MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνοι εμφανίστηκε υγιή και σε φάση ανάπτυξης κατά το χρονικό σημείο 0 ώρες. Από 96h, τα χωρίς επαγωγή MLH1-καλά κύτταρα συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται, αλλά λιγότερα κύτταρα φαίνεται να υφίσταται μίτωση, γεγονός που υποδηλώνει μια καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου ή σύλληψης (Σχήμα 4C). Τα κύτταρα δεν φαίνεται να είναι γηρασμένα, όπως αποδεικνύεται από την έλλειψη παραγωγής SA – gal [26] (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση, τα περισσότερα από τα MLH1 ελλειμματικών κυττάρων είτε απέτυχαν να πολλαπλασιαστούν, ή είχαν υποβληθεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω 96h (Σχήμα 4C). Έχουμε διαπιστώσει ότι αυτή η διαφορική επίδραση οφειλόταν στην απουσία ή παρουσία MMR στα κύτταρα αξιολογώντας τα επίπεδα πρωτεΐνης MLH1 σε κύτταρα κατεργασμένα με ενώσεις ροδίου metalloinsertor (Σχήμα S10). Η προηγουμένως αποδειχθεί επίδραση της επαγωγής shRNA επί έκφρασης πρωτεΐνης MLH1 δεν μετεβλήθη μετά από θεραπεία με τις ενώσεις ροδίου (Σχήμα S10).

Επιβεβαιώσαμε επίσης την αυξημένη ευαισθησία των MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνοι ΝΟΙ-Η23 στο metalloinsertor ρόδιο ενώσεις χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασίες. Μετά τη θεραπεία 24 ώρες με [Rh (Χρυσή) (phen) (ΚΣΕ)]

3+, οι υποκλώνοι MLH1 ανεπάρκεια NCI-H23 σχηματίζονται λιγότερες αποικίες από τις ισογονιδιακές MLH1-καλά υποκλώνους, παρουσιάζουν μια σημαντική διαφορά στο LD

50 τιμές (ρ = 0,01) (Σχήμα 4D). Η διαφορική ευαισθησία των MLH1 ανεπάρκεια υποκλώνους στις ενώσεις ροδίου metalloinsertor είναι συνεπές με την υπόθεση ότι αυτές οι ενώσεις ασκούν τις επιδράσεις τους μέσω δέσμευσης σε αναντιστοιχίες DNA που είναι παρόντες σε MMR-ελλειμματικών κυττάρων.

Συζήτηση

το μονοπάτι MMR διατηρεί τη σταθερότητα του γονιδιώματος με την προώθηση της αναγνώρισης και επισκευή μόνο αναντιστοιχίες βάση και τις μικρές θηλιές εισαγωγή-διαγραφή στο DNA που προκύπτουν από σφάλματα αντιγραφής ή βλάβη του DNA. Η απώλεια της λειτουργίας της οδού MMR αυξάνει την επικράτηση των κυτταρικών μεταλλάξεων και μπορεί να προκαλέσει ή να συμβάλει στον καρκίνο. Ο μηχανισμός της καρκινογένεσης που προκύπτει από κληρονομική ανεπάρκεια MMR έχει καλά μελετηθεί, ιδιαίτερα σε καρκίνο του παχέος εντέρου [4,27], και έχει ως πρότυπο σε συστήματα κυτταρικής γραμμής όπως HCT 116-Ο κύτταρα, τα οποία είναι ελλειμματικά MLH1 αλλά περιέχουν ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 2 και HCT 116-Ν κύτταρα, στα οποία η ανεπάρκεια MLH1 συμπληρώνεται από ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 3 που περιέχει άγριου τύπου MLH1 [28]. Σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως του καρκίνου του πνεύμονα, ανεπάρκεια MMR μπορεί να προωθηθεί με καρκινογόνο έκθεση [7-9]. χημειοθεραπεία μπορεί επίσης να προωθήσει ανεπάρκεια MMR που οδηγεί σε δευτερογενείς λευχαιμία [6]. Το σύστημα κυτταρική γραμμή περιγράφουμε παρέχει το πρώτο παράδειγμα ενός ισογονικών μοντέλο για προκαλούμενη ανεπάρκεια MMR που μπορεί να είναι αναστρέψιμα ενεργοποιηθεί ή να απενεργοποιηθεί στο επίπεδο του ελέγχου της έκφρασης πρωτεΐνης. Παρέχει ένα μοντέλο για τη μελέτη θεμάτων σχετικά προκαλείται από ανεπάρκεια MMR και να επιτρέπουν την ταυτοποίηση των μορίων που θα μπορούσαν να προσφέρουν θεραπευτικό όφελος σε MMR ανεπάρκεια καρκίνους.

Η NCI-H23 συμφωνημένα σύστημα κυτταρική γραμμή που περιγράφεται εδώ επιτρέπει την λεπτομερή χαρακτηρισμό του χρόνου και την ακολουθία των γεγονότων που προκύπτουν όταν η ανεπάρκεια MMR προκαλείται. Παρατηρήσαμε παρόμοιες επιδράσεις με τρεις διαφορετικές αλληλουχίες shRNA απευθύνονται σε MLH1, και σε δύο διαφορετικές μονά υποκλώνων κυττάρων που απομονώνονται από κύτταρα που έχουν υποστεί μεταγωγή με ένα από τα κατασκευάσματα MLH1 shRNA.