Αφηρημένο

Ιστορικό

Anti-EGFR θεραπείας που βασίζονται σε αντισώματα είναι ένα σημαντικό θεραπευτική στρατηγική για προχωρημένους καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC)? παρά το γεγονός αυτό, διάφορες μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων των

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

μεταλλάξεις, και

HER2

ενίσχυση-σχετίζονται με τους μηχανισμούς που διέπουν το ανάπτυξη αντοχής σε αντι-EGFR θεραπεία. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνήσει τις συχνότητες και κλινικές επιπτώσεις αυτών των γενετικών αλλοιώσεων σε προχωρημένη CRC.

Μέθοδοι

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

μεταλλάξεις προσδιορίσθηκαν με Cobas πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) σε 191 ασθενείς με προχωρημένο CRC με μακρινή μετάσταση. Αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) κατάσταση προσδιορίσθηκε με μία δοκιμασία κατακερματισμό και

HER2

ενίσχυση αξιολογήθηκε με άργυρο in situ υβριδισμού. Επιπλέον,

KRAS

μεταλλάξεις ερευνήθηκαν με τη μέθοδο αλληλούχισης Sanger σε 97 από 191 CRC περιπτώσεις.

Αποτελέσματα

Οι μεταλλάξεις στο

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

βρέθηκαν σε 104 (54,5%), 6 (3,1%), και 25 (13,1%) περιπτώσεις προηγμένων CRC, αντίστοιχα. MSI-υψηλή θέση και

HER2

ενίσχυση παρατηρήθηκαν σε 3 (1,6%) και 16 (8,4%) περιπτώσεις, αντιστοίχως.

PIK3CA

μεταλλάξεις πιο συχνά βρέθηκαν σε

KRAS

μεταλλαγμένο τύπο (18,3%) από ό, τι

KRAS

άγριου τύπου (6,9%) (

P

= 0.020 ). Σε αντίθεση,

HER2

ενισχύσεις και

BRAF

μεταλλάξεις που σχετίζονται με το

KRAS

άγριου τύπου με οριακή σημασία (

P

= 0,052 και 0,094, αντίστοιχα) . Σε συνδυασμό αναλύσεων με

KRAS

,

BRAF

και

HER2

κατάσταση,

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις συνδέθηκαν με το χειρότερη πρόγνωση του άγριου τύπου

KRAS

ομάδα (

P

= 0,004). Κατά τη σύγκριση της αποτελεσματικότητας των μεθόδων ανίχνευσης, τα αποτελέσματα της πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση αποκάλυψε 56 από 97 (57,7%) περιπτώσεις CRC με

KRAS

μεταλλάξεις, ενώ αλληλουχίας Sanger αποκάλυψε 49 περιπτώσεις (50,5%).

Συμπεράσματα

KRAS

μεταλλάξεις βρέθηκαν στο 54.5% των προηγμένων CRC ασθενών. αποτελέσματα υποστήριξή μας που υποομάδα χρησιμοποιώντας το

PIK3CA

και

BRAF

μετάλλαξη ή

HER2

καθεστώς ενίσχυσης, εκτός από

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης, είναι χρήσιμο για τη διαχείριση ασθενείς με προχωρημένο CRC

Παράθεση:. Nam SK, Yun S, Koh J, Kwak Υ, Seo AN, Πάρκο KU, et al. (2016)

BRAF

,

PIK3CA

, και

HER2

Ογκογόνες Τροποποιήσεις Σύμφωνα με

KRAS

Μετάλλαξη Κατάσταση στον τομέα των προηγμένων παχέος εντέρου με μακρινές μεταστάσεις. PLoS ONE 11 (3): e0151865. doi: 10.1371 /journal.pone.0151865

Επιμέλεια: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Κέντρο Καρκίνου, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 3 Δεκεμβρίου 2015? Αποδεκτές: 4 Μαρτίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 18 Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Nam et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στα αρχεία υποστήριξης Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η έρευνα υποστηρίχθηκε από την επιχορήγηση της Κορέας Υγεία Τεχνολογία R Ως εκ τούτου, πολλοί ασθενείς με αυτές τις μεταλλάξεις αντιμετωπίσετε αντίσταση ενάντια αντι-EGFR φάρμακα και εμφανίζουν φτωχή πρόγνωση [2,3,5,6]. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διερευνηθεί η μοριακή μηχανισμός που υπογραμμίζει την απόκριση και την αντίσταση σε αντι-EGFR θεραπεία σε προχωρημένο CRC.

KRAS

μεταλλάξεις, οι οποίες συνήθως ανιχνεύονται σε περίπου 40% των περιπτώσεων CRC , πιστεύεται ότι σχετίζεται με αντίσταση σε αντι-EGFR μεταχείριση στην CRC. Η αξιολόγηση των

KRAS

μεταλλάξεις είναι επομένως απαραίτητη πριν από την χρήση των αντι-EGFR φάρμακα για να επιλέξετε ασθενείς οι οποίοι μπορούν να επωφεληθούν από αντι-EGFR θεραπείες [7,8]. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι πρόσθετες μεταλλάξεις γονιδίων όπως

BRAF

μεταλλάξεις,

PIK3CA

μεταλλάξεις, και

HER2

ενίσχυση εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε φάρμακα που στοχεύουν EGFR για τους ασθενείς CRC με άγριου τύπου

KRAS

[5,9].

BRAF

, η οποία είναι μέλος της οικογένειας της RAF, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην /μονοπατιού ERK σηματοδότησης ΜΑΡ κινάσης [10]. Πολλές προηγούμενες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι οι μεταλλάξεις στο

BRAF

είναι ένας βιολογικός δείκτης για την κακή πρόγνωση σε προχωρημένο CRC. Επιπλέον,

BRAF

όγκους μεταλλαγμένου παρουσιάζουν φτωχή απάντηση στην αντι-EGFR θεραπείας, ειδικά σε ασθενείς CRC με άγριου τύπου

KRAS

[5,11].

PIK3CA

μεταλλάσσεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους? σε CRC, θα είναι μεταλλαγμένο σε περίπου 20% των περιπτώσεων. Επί του παρόντος, οι ασθενείς που φέρουν

PIK3CA

μεταλλάξεις στο εξόνιο 20 και δεν μεταλλάξεις στο

KRAS

μπορεί να δείξει αντοχή σε αντι-EGFR θεραπείας. Επιπλέον,

PIK3CA

μεταλλάξεις στο εξώνιο 9 και μεταλλάξεις KRAS τείνουν να βρεθούν μαζί [3,12]. Τέλος,

HER2

ενισχύσεις είναι παρόντα σε έναν μικρό αριθμό CRCs, και μερικές μελέτες έχουν αναφέρει τη συσχέτιση μεταξύ

HER2

ενίσχυση και η κακή απόκριση σε αντι-EGFR φάρμακα [13].

Παρά τα προηγούμενα ευρήματα, γνώση των συχνοτήτων και κλινικές επιπτώσεις αυτών των γενετικών αλλοιώσεων σε ασθενείς Κορέας είναι ακόμη περιορισμένη. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την επικράτηση αυτών των γενετικών αλλοιώσεων σε ασθενείς με προχωρημένο CRC, και αξιολόγησε τη σχέση αυτών των γενετικών αλλαγών με τις κλινικοπαθολογοανατομικών παράγοντες και την έκβαση των ασθενών. Επιπλέον, συγκρίναμε την αποτελεσματικότητα της χρήσης Cobas πραγματικό χρόνο αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης δοκιμές (PCR) με εκείνη του χρήση δοκιμών προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger ως μέθοδοι ανίχνευσης για

KRAS

μεταλλάξεις.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα ιστών

Ένα σύνολο από 191 ασθενείς με προχωρημένο CRC με σύγχρονη ή metachronous απομακρυσμένες μεταστάσεις οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική θεραπεία στο Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Bundang Νοσοκομείο μεταξύ του 2003 και του 2009 είχαν εγγραφεί στη μελέτη αυτή. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χειρουργική εκτομή των πρωτογενών CRCs κατά την αρχική διάγνωση και μακρινή μετάσταση εκτομή όταν ανιχνευθεί. Κανένας από τους ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Κλινικοπαθολογικοί πληροφοριών και παρακολούθηση στοιχεία ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία των ασθενών και τις εκθέσεις παθολογίας. Η συνολική επιβίωση (OS) υπολογίστηκε ως το χρονικό διάστημα μεταξύ της ημερομηνίας της χειρουργικής επέμβασης και την ημερομηνία του θανάτου.

Η ιστοπαθολογική εξέταση και ταξινόμηση των όγκων προσδιορίστηκαν σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ. Η χρήση των δεδομένων ιατρικού φακέλου και δείγματα ιστών για τη μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σεούλ Bundang Νοσοκομείο (αναφορά: Β-1210/174 – 301). Όλα τα δείγματα και τα ιατρικά δεδομένα ρεκόρ ήταν ανώνυμα πριν από τη χρήση σε αυτή τη μελέτη και οι συμμετέχοντες δεν παρέχουν γραπτή συγκατάθεση. Το Διοικητικό κριτική Θεσμικών παραιτηθεί από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση υπό την προϋπόθεση της ανωνυμίας και χωρίς πρόσθετη παρέμβαση στους συμμετέχοντες.

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

μετάλλαξη αναλύει τη χρήση του πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία

δείγματα όγκων συλλέχθηκαν από χειρουργικά δείγματα εκτομή του πρωτογενούς CRC. Αιματοξυλίνη-ηωσίνη (ΗΕ) χρωματισμένο διαφάνειες εξετάστηκαν από έναν παθολόγο (H.S.L). περιοχές όγκων ταυτοποιήθηκαν και μικροσκοπικά τεμαχίστηκαν περισσότερο από μια περιοχή cm 1 χ 1, η οποία αποτελείτο από περισσότερο από 60 κύτταρα% του όγκου. Ένα ή δύο 8-μm πάχους (FFPE) τμήματα ιστού όγκου εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), αφυδατωμένη σε απόλυτη αλκοόλη για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και αφήνεται να στεγνώσει στον αέρα εντελώς για 10 λεπτά. DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Cobas DNA Kit Παρασκευή Δείγματος (Roche, Branchburg, NJ, USA) και το ίδιο πρωτόκολλο προετοιμασίας για όλα τα κιτ μετάλλαξης Cobas χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Η συγκέντρωση του απομονωμένου DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop υν φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) και το DNA αραιώθηκε με DNA Αραιωτικό Δείγματος από το Cobas 4800 Mutation Test Kit (Roche) στη βέλτιστη συγκέντρωση για κάθε γονίδιο (

KRAS

4 ng /μL,

BRAF

5 ng /μL, και

PIK3CA

2 ng /μL). Ενίσχυση και ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν με ένα όργανο αναλυτή Cobas αυτοματοποιημένο X480. Η δοκιμή PCR πραγματικού χρόνου θα μπορούσε να ανιχνεύσει κωδικόνιο 12, 13, και 61 του

KRAS

μετάλλαξη, V600E

BRAF

μετάλλαξη, και το εξόνιο 1, 4, 7, 9 και 20 του

PIK3CA

μετάλλαξη.

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας την Sanger μέθοδο αλληλούχισης

δείγματα όγκων συλλέχθηκαν από τα ίδια πρωτογενή δείγματα CRC που είχε χρησιμοποιηθεί για το πραγματικό δοκιμές PCR χρόνο. Όλα τα δείγματα μικροτομή χέρι και & gt? 60% της έκτασης του δείγματος έδειξε να περιέχουν κύτταρα όγκου όπως εκτιμάται από την Η &? Ε-χρώση διαφάνειες. ανάλυση αλληλούχισης Sanger του

KRAS

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12, 13, και 61 διεξήχθη σε 97 από τα δείγματα ιστού 191 FFPE από ασθενείς CRC, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

HER2

ανάλυση με dual-χρώμα ασημί υβριδοποίηση in-situ (SISH)

HER

ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε τετράγωνα συστοιχία ιστού από την ίδια ομάδα. Κατασκευή των μπλοκ ιστικού πίνακα διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [5,15]. Εν συντομία, ένας εκπρόσωπος περιοχή των 191 δειγμάτων περίπτωση CRC εκχυλίζεται και δύο πυρήνες από την κεντρική και την περιφερειακή περιοχή μέτρησης διαμέτρου 2 mm για κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του ιστού σειρά μπλοκ. Φωτεινού πεδίου dual-χρώμα ανάλυση SISH πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή αυτόματης χρώσης SISH (BenchMark XT, Ventana Medical Systems) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή για το χρωμόσωμα INFORM HER2 DNA και INFORM 17 (CEP17) ανιχνευτές (Ventana Medical Systems). Εμείς ερμηνεύεται σήματα SISH HER2 /CEP17 σύμφωνα με την ερμηνευτική οδηγό που συνοδεύει το INFORM ανιχνευτής HER2 DNA για χρώση γαστρικά καρκινικά κύτταρα (Ventana Medical συστήματα). Όγκου ιστού αξιολογήθηκε για hot spots της θετικής σήματα HER2 /CEP17 χρησιμοποιώντας 20Χ ή 40Χ στόχους. Σήματα που απαριθμούνται σε 20 μη-επικαλυπτόμενα καρκινικών κυττάρων πυρήνες ανά πυρήνα με 60X ή 100X στόχους. Μικρές συστάδες ορίστηκαν ως 6 σήματα, και τα μεγαλύτερα συμπλέγματα ως 12 σήματα.

HER2

ενίσχυση γονιδίου ορίστηκε ως η αναλογία του HER2 /CEP17 των ≥ 2,0 σε κεντρικό ή περιφερειακό περιοχή. Αυτές οι αμφίβολες περιπτώσεις με αναλογία HER2 /CEP17 μεταξύ 1,8 και 2,2 είχαν εξιστορείται σε 20 επιπλέον των καρκινικών κυττάρων πυρήνες μη-επικαλυπτόμενα? ο δείκτης υπολογίσθηκε εκ νέου με βάση αυτά τα αποτελέσματα.

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) ανάλυση

Οι τομές που παρασκευάζονται από δείγματα ιστών FFPE και αιματοξυλίνη και διαφάνειες ηωσίνη-βάφονται αξιολογήθηκαν για την αναγνώριση του εκπροσώπου περιοχή του όγκου και κανονική περιοχή σε κάθε τμήμα. Αυτές οι επιλεγμένες περιοχές μικροτομή. ανάλυση MSI διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [16,17]. Εν συντομία, το καθεστώς MSI προσδιορίστηκε με ανάλυση πέντε μικροδορυφόρων τόπους (BAT-26, BAT-25, D5S346, D17S250, και S2S123) χρησιμοποιώντας DNA auto-sequencer (ΑΒΙ 3731 γενετικό αναλυτή? Applied Biosystems, Foster City, CA). Σύμφωνα με την κατευθυντήρια γραμμή Bethesda για MSI, οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί ως MSI-H, όταν τουλάχιστον δύο από τα πέντε δείκτες εμφανίζονται νέες ζώνες, MSI-L όταν επιπλέον αλληλόμορφα παρατηρήθηκαν με ένα από τα πέντε δεικτών, και MSS όταν εξετάζεται εμφανίζονται όλες μικροδορυφορικών δεικτών ταυτόσημα πρότυπα και στα δύο όγκων και φυσιολογικών ιστών.

Στατιστική ανάλυση

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το πακέτο λογισμικού SPSS Statistics 18 (Chicago, IL, USA). Η σύνδεση μεταξύ των κλινικοπαθολογική παραμέτρων και γενετικών αλλοιώσεων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Chi-square test ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Η δοκιμή chi-square διεξήχθη μόνο εάν τουλάχιστον το 80% των κυττάρων έχουν αναμενόμενη συχνότητα του 5 ή μεγαλύτερο, και κανένα κύτταρο έχει αναμενόμενη συχνότητα μικρότερη από 1,0. Αν όχι, χρησιμοποιήθηκε το ακριβές τεστ του Fisher. Ηλικία αντιμετωπίζεται ως συνεχής μεταβλητή και σε σύγκριση με τη χρήση ανεξάρτητων δοκιμών Τ λόγω της p & gt? 0.05 με τεστ κανονικότητας Shapiro-Wilk. καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier απεικονίσθηκαν, και στατιστικώς σημαντικές διαφορές στις καμπύλες επιβίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ log-rank. Ανάλυση Η πολυπαραγοντική επιβίωση χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο Cox αναλογικού κινδύνου διεξήχθη με μεταλλακτική κατάσταση, την ηλικία, και το στάδιο κατά την αρχική διάγνωση. Η αναλογία κινδύνου (HR) και το διάστημα εμπιστοσύνης 95% της (CI) αξιολογήθηκαν. Σε όλες τις περιπτώσεις,

P

τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών

Οι κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον S1 πίνακα. Οι ασθενείς που αποτελούνταν από 103 άνδρες (53,9%) και 88 γυναίκες (46,1%), με μέση ηλικία 60 ετών (εύρος: 28-93 έτη). Από τις 191 περιπτώσεις, 49 (25,7%) όγκοι βρίσκονται στο δεξιό κόλον, 71 (37,2%) των όγκων στο αριστερό κόλον, και 71 (37,2%) των όγκων στο ορθό. Όσον αφορά την ιστολογική βαθμό διαφοροποίησης, 165 (86,4%) όγκοι ήταν χαμηλής ποιότητας, και 26 (13,6%) όγκοι ήταν υψηλής ποιότητας. Όσον αφορά τις θεραπείες, 176 (92,1%) ασθενείς έλαβαν 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) -με βάση επικουρική χημειοθεραπεία με ή χωρίς αντι-EGFR θεραπεία (cetuximab) μετά από χειρουργική εκτομή? 150 (85,2%) ασθενείς έλαβαν μόνο 5-FU με βάση χημειοθεραπεία? και 26 (14,8%) ασθενείς έλαβαν 5-FU με αντι-EGFR φάρμακα.

Οι γενετικές μεταβολές που συνδέονται με την οδό σηματοδότησης EGFR σε προχωρημένο CRCs

Όλα τα βασικά δεδομένα που παρουσιάζονται στον Πίνακα S2. Από τις περιπτώσεις όγκων που εξετάστηκαν, 87 (45,5%) είχαν άγριου τύπου

KRAS

και 104 (54,5%) είχαν

KRAS

μεταλλάξεις. Μεταξύ των όγκων με

KRAS

μεταλλάξεις, μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 ή 13 παρατηρήθηκαν σε 97 (93,3%), ενώ οι μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 61 παρατηρήθηκαν σε 7 (6.7%) ασθενείς.

BRAF

(V600E) μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν σε 6 (3,1%) των όγκων.

PIK3CA

μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 25 (13,1%) των όγκων. Οι δύο πιο κοινές

PIK3CA

μεταλλάξεις που βρίσκεται στο εξόνιο 9 (17 περιπτώσεις, 68,0%) και το εξόνιο 20 (5 περιπτώσεις, 20,0%). Άλλες σπάνιες μεταλλάξεις που βρίσκονται στα εξώνια 1 και 4 (2 περιπτώσεις, 8,0%). Μία υπόθεση έτρεφε μια

PIK3CA

εξόνιο 4 μετάλλαξη, καθώς και

PIK3CA

εξόνιο 9 μετάλλαξη. SISH ανάλυση έδειξε

HER2

ενίσχυσης γονιδίου σε 16 (8,4%) των όγκων. Τρεις υποθέσεις από αυτή ομάδα ήταν MSI-H (1,6%), και οι υπόλοιπες 188 (98,4%) περιπτώσεις χαρακτηρίστηκαν ως MSS /MSI-L.

Από 104

KRAS

μεταλλαγμένο τύπο CRC περιπτώσεις, 23 (22,1%) είχαν

PIK3CA

μεταλλάξεις,

HER2

ενισχύσεις, ή

BRAF

μεταλλάξεις (Πίνακας 1). Δεκαοκτώ περιπτώσεις έδειξε

PIK3CA

μετάλλαξη, 4 περιπτώσεις έδειξε

HER2

ενίσχυση, μία υπόθεση είχε τόσο

BRAF

και

PIK3CA

μεταλλάξεις, και μία περίπτωση είχε τόσο

PIK3CA

μετάλλαξη και

HER2

ενίσχυση. Από 87

KRAS

CRCs άγριου τύπου,

BRAF

μεταλλάξεις,

PIK3CA

μεταλλάξεις, και

HER2

ενισχύσεις βρέθηκαν σε 5 (5,7%), 6 (6,9%), και 11 (12,6%) περιπτώσεις, αντιστοίχως? Συνολικά, 21 από 87

KRAS

άγρια ​​περιπτώσεις τύπου (24,1%) είχαν

BRAF

μεταλλάξεις,

PIK3CA

μεταλλάξεις, ή

HER2

ενισχύσεις.

Είναι ενδιαφέρον ότι, η παρουσία του

PIK3CA

μεταλλάξεων συσχετίστηκε σημαντικά με την παρουσία του

KRAS

μεταλλάξεις (

P

= 0,020? Πίνακας 2). Μεταλλάξεις στο

KRAS

και

BRAF

ήταν σχεδόν αλληλοαποκλείονται? Ωστόσο, μία περίπτωση έτρεφε ταυτόχρονη

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις.

HER2

ενισχύσεις και

BRAF

μεταλλάξεις έτειναν να παρατηρούνται συχνότερα σε

KRAS

όγκους άγριου τύπου σε σχέση με το

KRAS

όγκους μεταλλαγμένου τύπου με οριακή στατιστική σημαντικότητα (

P

= 0.052 και

P

= 0,094, αντίστοιχα). κατάσταση MSI δεν έδειξαν καμία σχέση με αυτές τις γενετικές αλλαγές σε αυτή την ομάδα.

Η

Σύλλογος γενετικές αλλαγές με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά

Ο Πίνακας 3 δείχνει τη σχέση μεταξύ των γενετικών τροποποιήσεων και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά.

KRAS

μεταλλαγμένο όγκοι ήταν πιο πιθανό να βρίσκονται στο δεξιό κόλον (

P

= 0,021). Οι όγκοι αυτοί συνδέονται επίσης με χαμηλού βαθμού ιστολογία (

P

= 0,029).

BRAF

όγκους μεταλλαγμένου συσχετίστηκε σημαντικά με το βάθος Τ4 εισβολής (

P

= 0,033). Αν και δεν έφθασε τη στατιστική σημασία,

BRAF

όγκους μεταλλαγμένου έτειναν να βρίσκονται στο δεξιό κόλον (

P

= 0,127) και να έχει λεμφική εισβολή (

P

= 0,097) σε σύγκριση με τα ίδια χαρακτηριστικά στο

BRAF

όγκους άγριου τύπου. Όγκους με

HER2

ενισχύσεις συσχετίζονταν σημαντικά με ένα απομακρυσμένο τοποθεσία (

P

= 0,006).

HER2

ενισχύσεις έδειξε επίσης μια συσχέτιση με τους νεότερους, αλλά η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,081). Δεν υπήρχαν άλλες σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της

PIK3CA

μεταλλάξεις ή την κατάσταση MSI με κλινικοπαθολογική παράγοντες.

Η

προγνωστική σημασία των γενετικών αλλοιώσεων

Για να προσδιοριστεί η προγνωστική σημασία αυτών των γενετικών μετατροπές, επιβίωση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου Kaplan-Meier για OS (Σχήμα 1). Παρακολούθηση δεδομένα από όλες τις 191 ασθενείς CRC συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση επιβίωσης. Υπήρχαν 84 CRC που σχετίζονται με θανάτους, και το διάμεσο χρόνο παρακολούθησης ήταν 37,9 μήνες (εύρος, 0,8 έως 104,6 μήνες). Οι ασθενείς με

BRAF

μεταλλάξεις έδειξαν μια τάση για αρνητική έκβαση για το OS, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0,081).

KRAS

μεταλλάξεις,

PIK3CA

μεταλλάξεις,

HER2

ενισχύσεις, και την κατάσταση MSI δεν δείχνουν καμία συσχέτιση με λειτουργικό σύστημα των ασθενών (

P

= 0,993 ,

P

= 0,538,

P

= 0.368 και

P

= 0,538, αντίστοιχα). Μετάλλαξη του

KRAS

κωδικόνιο 61 έτειναν να σχετίζεται με μικρότερη συνολική επιβίωση, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

= 0.554).

Εκτίμηση επιβίωσης

Kaplan-Meier γραφήματα συνολική επιβίωση (OS) σε 191 ασθενείς με προχωρημένο CRC σύμφωνα με

KRAS

κατάσταση μεταλλάξεις (α), οι θέσεις του

KRAS

μεταλλάξεις σε προχωρημένο CRC ασθενείς (β),

BRAF

μεταλλάξεις (γ),

PIK3CA

μεταλλάξεις (δ),

HER2

ενισχύσεις (ε), και την κατάσταση MSI (στ).

η

Είναι ενδιαφέρον ότι η

άγριου τύπου KRAS

υποομάδα με

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις έδειξε τη χειρότερη πρόγνωση σε συνδυασμό αναλύσεις (

P

= 0,004? σχήμα 2Α). Με τη χρήση του μοντέλου Cox proportional κινδύνων, αυτή η υποομάδα ήταν κακό προγνωστικό παράγοντα (HR, 2.055? CI, 1,093 έως 3,861?

P

= 0,025), ανεξάρτητα από την ηλικία και το στάδιο κατά την αρχική διάγνωση (S3 Πίνακας). Μεταξύ των 191 προηγμένες ΚΕΣ 165 ασθενείς που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ασθενείς αντι-EGFR φάρμακα, στους οποίους η

άγριου τύπου KRAS

υποομάδα με

BRAF

ή

HER2

μεταβολές έδειξαν, επίσης, η χειρότερη πρόγνωση (

P

= 0,012? Σχήμα 2Β). Με τη χρήση του μοντέλου Cox proportional κινδύνων, αυτή η υποομάδα ήταν φτωχός προγνωστικός παράγοντας με οριακή στατιστική σημαντικότητα (HR, 1.984? CI, 0,963 έως 4,085?

P

= 0,063? Δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, σε 26 ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με 5-FU με αντι-EGFR φάρμακα, η

άγριου τύπου KRAS

υποομάδα με

BRAF

ή

HER2

μεταβολές δεν ήταν σχετίζεται με κακή πρόγνωση (

P

= 0.305, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), η οποία μπορεί να είναι λόγω του μικρού αριθμού των περιπτώσεων. Στο

KRAS

άγριου τύπου υποομάδα,

BRAF

ή

HER2

αλλοιώσεις συσχετίστηκε με υψηλό βαθμό διαφοροποίησης ιστολογική, προχωρημένο στάδιο, λεμφική εισβολή και περινευρικές εισβολή, αλλά με οριακή στατιστική σημασίας (S4 Πίνακας).

τα αποτελέσματα των συνδυασμένη ανάλυση σε ασθενείς με προχωρημένο CRC με το

KRAS

άγρια ​​υποομάδα τύπου σύμφωνα με το

BRAF

μετάλλαξη και

HER2

ενίσχυση ανεξάρτητα από την κατάσταση της θεραπείας αντι-EGFR (n = 191) (α), στους οποίους δεν ήταν σε αγωγή με αντι-EGFR φάρμακα (n = 165) (β).

η

σύγκριση Cobas πραγματικό time PCR και Sanger μεθόδους αλληλούχισης για

KRAS

μεταλλάξεις

191 δείγματα CRC, οι ιστοί των 97 ασθενείς ήταν διαθέσιμοι για ανάλυση για να συγκρίνουν την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεις με το δοκιμή αλληλουχίας Sanger και σε πραγματικό χρόνο δοκιμή PCR Cobas. Από περιλαμβάνονται οι 97 όγκοι,

KRAS

μεταλλάξεις ανιχνεύτηκαν σε 49 περιπτώσεις (50,5%) με τη δοκιμασία προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger. Μεταλλάξεις στο

KRAS

κωδικόνιο 12 ή 13 και

KRAS

κωδικόνιο 61 ανιχνεύθηκαν σε 47 (48,5%) και 2 (2,1%) περιπτώσεις, αντιστοίχως. Από την άλλη πλευρά, 56 περιπτώσεις (57,7%) του

KRAS

μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν με την σε πραγματικό χρόνο δοκιμή PCR? η δοκιμή βρίσκεται 52 (53,6%) μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 ή 13 και 4 (4,1%) μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 61. Η πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία έδειξε υψηλότερη ευαισθησία από αυτή του τεστ προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger.

Συζήτηση

KRAS

είναι ένα πολύ γνωστό ογκογονίδιο οδηγό CRCs και η παρουσία του

KRAS

μετάλλαξη προβλέπει μικρή ανταπόκριση στην αντι-EGFR στοχευμένη θεραπεία σε ασθενείς με μεταστατικό CRC. Αξιολογήσαμε τις συχνότητες και clincopathologic σημασία των μεταλλάξεων στο

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

, και

HER2

ενίσχυσης, καθώς και τη σχέση αυτών των γενετικών αλλοιώσεων σε προχωρημένη CRC ασθενείς οι οποίοι ήταν υποψήφιοι για αντι-EGFR θεραπείας στην καθημερινή πρακτική. Μεταλλάξεις σε περιπτώσεις

KRAS

,

BRAF

, και

PIK3CA

βρέθηκαν σε 104 (54,5%), 6 (3,1%), και 25 (13,1%) των προηγμένων CRC, αντίστοιχα. Επιπλέον, MSI-H φαινότυπο και

HER2

ενίσχυση παρατηρήθηκαν σε 3 (1,6%) και 16 (8,4%) περιπτώσεις, αντιστοίχως.

Η ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών κατά συγκεκριμένων μοριακών μεταβολών έχει συνέβαλε στην διαχείριση των ασθενών με προχωρημένο CRC, και αντι-ΕΟΡΚ φάρμακα που χρησιμοποιούνται σε αυτούς τους ασθενείς. Παρά το γεγονός ότι η παρουσία του

KRAS

μετάλλαξη είναι χρήσιμο να αποκλειστούν ασθενείς οι οποίοι δεν θα ωφεληθούν από αντι-EGFR θεραπεία, πολλοί ασθενείς με άγριου τύπου

KRAS

CRC δείχνουν αρνητικές απαντήσεις σε αυτή τη θεραπεία. Μέχρι σήμερα, θεωρείται ότι

BRAF

μεταλλάξεις,

PIK3CA

μεταλλάξεις, και

Οι HER2

ενισχύσεις που συνδέονται με τις υποκείμενων μηχανισμών αυτών των φτωχών απαντήσεις [4,5]. Στην ομάδα μας, 16 από 87

KRAS

άγρια ​​περιπτώσεις τύπου (18,4%) είχαν

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις? Επιπλέον, συνδυασμένη ανάλυση έδειξε ότι

KRAS

ασθενείς άγριου τύπου με

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις είχαν τη χειρότερη πρόγνωση. Επειδή οι στοχευμένες θεραπείες για

BRAF

μεταλλάξεις και

HER2

ενισχύσεις έχουν σημαντικό όφελος επιβίωσης σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [10,18,19], η θεραπεία με αντι-BRAF και αντι-HER2 παράγοντες μπορεί να είναι μια καλή θεραπευτική στρατηγική για τη βελτίωση της επιβίωσης σε ασθενείς CRC με άγριου τύπου

KRAS

υπόθαλψη

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις και οι οποίοι επίσης έχουν κύρια ή δευτερεύουσα αντοχή σε αντι-EGFR θεραπείας.

Παρά το μικρό αριθμό των όγκων με

PIK3CA

μεταλλάξεις στην ομάδα μας, διαπιστώσαμε ότι

PIK3CA

μεταλλάξεις επικαλύπτονται σε μεγάλο βαθμό με το

KRAS

μεταλλάξεις, η οποία ήταν σύμφωνη με τις προηγούμενες μελέτες στις ευρωπαϊκές [20] και [21] οι ασθενείς Ιαπωνικά CRC με μετάσταση. Επί του παρόντος, πολλές αναστολείς που στοχεύουν το

PIK3CA

μονοπάτι σηματοδότησης έχουν αναπτυχθεί, και αυτοί οι παράγοντες δοκιμάζονται σε προκλινικές και κλινικές δοκιμές ασθενών με CRC [22-24]. Θεωρώντας αποτέλεσμα μας και τις προηγούμενες μελέτες [20,21] που

KRAS

μεταλλάξεις συχνά συνυπήρχαν με

PIK3CA

μεταλλάξεις, αναστέλλοντας το

PIK3CA

μονοπατιού σηματοδότησης μπορεί να είναι μια χρήσιμη θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία ασθενών CRC με

KRAS

μεταλλάξεις.

Συνολικά, 24 από 191 περιπτώσεις (12,6%) είχαν δύο ή περισσότερα ογκογόνο αλλαγές σε αυτή τη μελέτη. Μπορεί να ερμηνευθεί ότι αυτές οι γενετικές μεταβολές συμβαίνουν ταυτόχρονα στο ίδιο όγκο, αλλά αυτό μπορεί να οφείλεται στην ετερογένεια του όγκου. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, ογκογόνο μεταβολές αναπτυχθεί σε έναν υποκλώνο, τα οποία συμβάλλουν στην μετάσταση του καρκίνου και της αντίστασης στα φάρμακα. Χρησιμοποιήσαμε περισσότερο ευαίσθητες μέθοδοι ανίχνευσης, έτσι θα μπορούσε να ανιχνευθεί μεταλλάξεις σε ελάσσονα πληθυσμό καρκινικών κυττάρων. Στο πλαίσιο της διαχείρισης των ασθενών CRC, ευαίσθητη μοριακή διάγνωση είναι χρήσιμη για τον εντοπισμό ανηλίκου ογκογόνο αλλαγές, οι οποίες μπορεί να είναι ο επόμενος στόχος σε ασθενείς με προχωρημένο CRC με πρωτογενή ή δευτερογενή αντίσταση στην πρώτη γραμμή στοχευμένη θεραπεία. Στην ομάδα μας, μία περίπτωση έτρεφε ταυτόχρονη

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις. Είναι γνωστό ότι

BRAF

μεταλλάξεις ανιχνεύονται συνήθως στο

KRAS

όγκους άγριου τύπου, και ότι είναι σχεδόν αμοιβαία αποκλειόμενα με το

KRAS

μεταλλάξεις στο CRC. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι σπάνιες περιπτώσεις λιμάνι συνδυασμό

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις, η οποία εμφανίζεται σε λιγότερο από 0,02% [25,26]. Ακόμη και αν η βιολογία του όγκου και την πρόγνωση των ασθενών με ταυτόχρονη

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις ήταν ακόμη αβέβαιη, προηγούμενες έρευνες δείχνουν ότι αυτά τα ταυτόχρονη μεταλλάξεις που σχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου, όπως λεμφαδένα μετάσταση και ανώτερο στάδιο Τ [25,27]. Περαιτέρω μελέτες μεγάλης κλίμακας που απαιτούνται για να αποσαφηνιστεί η λειτουργία επίπτωση και βιολογική της ταυτόχρονης

KRAS

και

BRAF

μεταλλάξεις.

Προηγούμενες μελέτες με ασθενείς με προχωρημένο CRC με μετάσταση ανέφερε ότι περίπου 34 ~ 45% των ασθενών είχαν

KRAS

μεταλλάξεις [20,21,28]. Η μελέτη αυτή με CRC ασθενείς Κορέας έδειξε ότι η συχνότητα του

KRAS

μεταλλάξεις ήταν 54,5%, και ότι αυτές οι μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν κυρίως στα κωδικόνια 12 ή 13 (93,3%). Η συχνότητα των

KRAS

μεταλλάξεις σε αυτή την ομάδα ήταν ελαφρώς υψηλότερο από ότι σε προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές της CRC ασθενείς με μεταστατικό [20,21,28]. Υπάρχουν αρκετές πιθανές εξηγήσεις για αυτό. Πρώτον, συμμετείχαν μόνο ασθενείς με προχωρημένο CRC σε αυτή την ομάδα, η οποία μπορεί να ευθύνεται για την αύξηση της συχνότητας των

KRAS

μεταλλάξεις. Δεύτερον, υπήρχαν ορισμένες διαφορές στις μεθόδους ανίχνευσης μετάλλαξης. Αναλύσαμε κατάσταση μετάλλαξης χρησιμοποιώντας Cobas πραγματικού χρόνου PCR, η οποία θεωρείται ότι παρουσιάζουν υψηλότερη ευαισθησία από εκείνη των άλλων μεθόδων ανίχνευσης.

Έχει αναφερθεί ότι οι περισσότερες συμβαίνουν

KRAS

μεταλλάξεις σε ασθενείς CRC στο κωδικόνιο 12 και 13. Αυτή η μελέτη απέδειξε επίσης ότι

KRAS

μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν κυρίως στα κωδικόνια 12 ή 13 (93,3%). Σε μας

KRAS

ανάλυση μετάλλαξης υποομάδας, η μετάλλαξη του

KRAS

κωδικόνιο 61 έτειναν να σχετίζεται με μικρότερη συνολική επιβίωση, αλλά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Η προγνωστική επίπτωση των

KRAS

κωδικόνιο 61 μεταλλάξεις έχει αναφερθεί σε αρκετές προηγούμενες μελέτες, αν και με αμφιλεγόμενα αποτελέσματα [29]. Επειδή η συχνότητα εμφάνισης των

KRAS

κωδικόνιο 61 μεταλλάξεις είναι σπάνια, περαιτέρω μελέτες μεγάλης κλίμακας μπορεί να βοηθήσει στην αποσαφήνιση της σχέσης μεταξύ αυτών των μεταλλάξεων και της κλινικής έκβασης.

Οι μεταλλάξεις του

BRAF

και

PIK3CA

ανιχνεύθηκαν στο 3,1% και 13,1% των περιπτώσεων, αντίστοιχα. Αν και οι συχνότητες αυτών των μεταλλάξεων θεωρείται ότι είναι χαμηλή, ήταν παρόμοια με εκείνα των προηγούμενων μελετών σε προχωρημένο CRC [20,21,28]. Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη [30],

BRAF

μεταλλάξεις που συνδέονται με την επιθετική ιστολογία CRC, όπως ανώτερο στάδιο Τ και η παρουσία του λεμφικού εισβολής. Αν και τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντική, ασθενείς οι οποίοι φέρουν

BRAF

μεταλλάξεων έδειξε επίσης μικρότερα OS

Εμείς αξιολογήθηκαν δύο μεθόδους ανίχνευσης για

KRAS

μεταλλάξεις σε δείγματα CRC:. Cobas πραγματικό -Ώρα PCR και αλληλούχιση Sanger. Υπήρξε μια καλή συσχέτιση μεταξύ

KRAS

ανίχνευση μεταλλάξεων με PCR πραγματικού χρόνου και της αλληλουχίας Sanger, και σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε υψηλότερη ευαισθησία από εκείνη της αλληλουχίας Sanger. Στην ομάδα μας, 7 περιπτώσεις

KRAS

μεταλλάξεις ανιχνεύονται από τη δοκιμή σε πραγματικό χρόνο που δεν είχαν εντοπιστεί από τη δοκιμή αλληλουχίας Sanger, ειδικά 5 περιπτώσεις για κωδικόνιο 12 ή 13 και 2 περιπτώσεις για κωδικόνιο 61. Η Sanger μέθοδος προσδιορισμού της αλληλουχίας, που αναπτύχθηκε το 1975, θεωρήθηκε μια από τις βασικές μεθόδους ανίχνευσης μετάλλαξης? Ωστόσο, η μέθοδος αυτή φαίνεται να έχει περιορισμένη ευαισθησία-χαμηλό επίπεδο του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου μπορεί να είναι μη ανιχνεύσιμη με τη μέθοδο αυτή [31]. Αντίθετα, η δοκιμή PCR σε πραγματικό χρόνο, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων εμπορικών κιτ θεωρείται ότι είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που δείχνει τα πλεονεκτήματα όσον αφορά την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεων [32]. Μέχρι σήμερα, η σημαντική ενδοογκική ετερογένεια των μοριακών αλλοιώσεων και κλινικές επιπτώσεις τους στην στοχευμένη θεραπεία έχουν περιγραφεί σε διάφορους όγκους. Σε CRC, αρκετές μελέτες ανέφεραν την κλινική σημασία του

KRAS

ετερογένεια σε αντι-EGFR θεραπείας [5,33,34]. Normanno et al. πρότεινε ότι μια χαμηλή περιεκτικότητα

KRAS

μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ήταν αρκετή για να προκαλέσει ανθεκτικότητα στις EGFR μονοκλωνικά αντισώματα, και το όριο στη μελέτη τους ήταν 3 ~ 10% των μεταλλαγμένων

KRAS

συχνότητα αλληλόμορφο το οποίο ήταν απίθανο που πρόκειται να ανιχνευθεί με τη χρήση Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας [33]. Αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επικυρώσει τα αποτελέσματα αυτά και να αποσαφηνίσει το ρόλο των μοριακών αλλαγών σε αντίσταση σε αντι θεραπεία EGFR, η ακριβής ανίχνευση αυτών των μεταλλάξεων έχει μεγάλη κλινική σημασία.

Εν κατακλείδι, βρήκαμε ότι ο επιπολασμός της

KRAS

μεταλλάξεις ήταν 54,5% σε ασθενείς με προχωρημένο Κορέας CRC, η οποία ήταν πιο συχνή από ό, τι αυτή που παρουσιάζεται σε άλλους πληθυσμούς.

BRAF

μεταλλάξεις ή

HER2

ενισχύσεις βρέθηκαν στο 16,1% των

KRAS

ασθενείς άγριου τύπου, και, επιπλέον, συνδυασμένη ανάλυση έδειξε ότι

KRAS

άγριου τύπου ασθενείς με

BRAF

ή

HER2

ενισχύσεις είχαν τη χειρότερη πρόγνωση.

PIK3CA

μεταλλάξεις παρατηρήθηκαν πιο συχνά σε

KRAS

μεταλλαγμένο τύπο σε σχέση με το αγρίου τύπου

KRAS

ασθενείς CRC.