Abstract

ανώμαλη ενεργοποίηση της κινάσης που προκύπτει από μετάλλαξη, ενίσχυση, ή μετατόπιση μπορεί να κατευθύνουν την ανάπτυξη και την επιβίωση σε μια υποομάδα ανθρώπινου καρκίνου.

FGFR2

ενισχύεται σε καρκίνο του μαστού και του γαστρικού και αναφέρουμε εδώ την πρώτη χαρακτηρισμό

FGFR2

ενίσχυση του γονιδίου σε καρκίνο του παχέος εντέρου στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η716.

FGFR2

εκφράζεται έντονα και ενεργοποιείται σε κύτταρα NCI-Η716, και αναστολείς μικρού μορίου FGFR επιλεκτική ή FGFR2 shRNA έντονα ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων

in vitro

, αναφέροντας «εθισμός» των κυττάρων NCI-Η716 σε FGFR2. ανάπτυξη NCI-Η716 σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ανεστάλη επίσης με έναν αναστολέα μικρού μορίου FGFR. FGFR2 ήταν απαραίτητη για την ενεργοποίηση των πολλαπλών κατάντη πρωτεϊνών σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων των AKT, ERK, S6RP και NFKB. Αναστολή της κατάντη κινασών όπως ΑΚΤ ή ERK είχε μόνος μέτρια αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού, ενώ συνδυασμένη αναστολή της ΑΚΤ και σηματοδότησης ERK οδήγησε σε απώλεια βιωσιμότητας παρόμοια με την αναστολή FGFR2. Ταυτοποιήσαμε αυξημένα

FGFR2

έκφραση σε ένα μικρό υποσύνολο του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου, ωστόσο

δεν παρατηρήθηκε FGFR2

ενίσχυσης. Αν και

FGFR2

ενίσχυση δεν είναι κοινή σε πρωτοπαθή καρκίνο του παχέος εντέρου ή των λεμφαδένων και ηπατικές μεταστάσεις, άλλα υποσύνολα του ορθοκολικού καρκίνου όπως ασκίτης, από το οποίο προέρχεται η κυτταρική γραμμή NCI-Η716, πρέπει ακόμη να δοκιμαστεί. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αναδυόμενες θεραπευτική αναστολέας FGFR μπορεί να έχει αποτελεσματικότητα σε ένα υποσύνολο του καρκίνου του παχέος εντέρου οδηγείται από

FGFR2

ενίσχυση

Παράθεση:. Mathur Α, Υγιεινής C, Davis L, Gazdar Α, Παν BS , Lutterbach Β (2014)

FGFR2

ενισχύεται στην γραμμή κυττάρων NCI-Η716 καρκίνου του παχέος εντέρου και απαιτείται για την ανάπτυξη και την επιβίωση. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10.1371 /journal.pone.0098515

Επιμέλεια: Irina U. Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Φεβ 2014? Αποδεκτές: 2 Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη Merck Research Labs. Ο χρηματοδότης παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς (AM, CW, LD, BP, BL), αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Συγγραφείς εκτός AG είναι υπάλληλοι της Merck Research Labs. AM, CW, LD, η BP, και BL έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα ως υπάλληλοι της Merck, αλλά δηλώνουν ότι αυτή η υπαγωγή δεν μεταβάλλει την προσήλωσή τους στις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Δεν υπάρχουν περιορισμοί σχετικά με την κοινοχρησία των δεδομένων ή /και υλικών.

Εισαγωγή

Για προχωρημένους, τελευταίο στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου σχετίζεται με σημαντική θνησιμότητα και παραμένει μια ακάλυπτη ιατρική ανάγκη. Η έγκαιρη διάγνωση οδηγεί σε μια ιδιαίτερα ευνοϊκή πρόγνωση, όπως ότι η ασθένεια σταδίου 1 και σταδίου 2 έχουν ένα 80-90% επιβίωση πέντε ετών. Αντίθετα στάδιο 3 και το στάδιο 4 ασθένεια μεταστατικού συνδέονται με πέντε ετής επιβίωση του 60% και 8%, αντίστοιχα. [1] Γενετικές ανωμαλίες που προκύπτουν στο αρχικό στάδιο της νόσου περιλαμβάνουν

APC

μεταλλάξεις, ενώ

KRAS, BRAF, p53

, και

Οι PIK3CA

μεταλλάξεις που βρίσκονται στα τελευταία στάδια της ανάπτυξης του όγκου [2] – [4]. Ωστόσο, αυτές οι μεταλλάξεις γονιδίων δεν έχουν επηρεαστεί θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, επειδή είναι είτε απώλεια μεταλλάξεων λειτουργίας (

APC, ρ53

) ή δεν αποκρίνονται σε αναστολείς ΜΕΚ ή ΡΙ3Κ (

BRAF, KRAS, PIK3CA

). Παρά το γεγονός ότι η ενίσχυση της τυροσινικής κινάσης, μετατόπιση, ή μεταλλάξεις δεν είναι κοινές σε καρκίνο του παχέος εντέρου,

EGFR

ενίσχυσης μπορεί να βρεθεί σε ένα υποσύνολο του παχέος εντέρου, [5], [6]. ανασταλτικά αντισώματα EGFR, όπως Το cetuximab μπορεί να οδηγήσει σε απαντήσεις και όφελος επιβίωσης σε

KRAS

καρκίνους άγριου τύπου, αλλά ο ρόλος του

EGFR

ενίσχυσης δεν είναι σαφές [7].

ErbB2

ενίσχυση έχει επίσης αναφερθεί [6], [8], και μπορεί να σχετίζεται με την απάντηση στην trastuzumab [9].

FGFR2

ενίσχυση έχει περιγραφεί 5% των γαστρικών καρκίνων [10] και 1-4% των καρκίνων του μαστού [11], [12], αλλά δεν έχει αναφερθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Μαστού και κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου που φιλοξενούν

FGFR2

ενίσχυσης είναι πολύ ευαίσθητα σε

FGFR2

αναστολείς σε προκλινικά μοντέλα [13] – [15], και ενίσχυση σε καρκίνο και του μαστού και καρκίνου του στομάχου συνδέεται στενά με κακώς διαφοροποιημένο, αργά όγκους στάδιο [11], [16]. Σε γαστρικό καρκίνο

FGFR2

ενίσχυση μπορεί να συμβεί σε ένα μεταστατικό όγκο, αλλά όχι στα συνδεδεμένα πρωτογενή όγκο, επίσης συνεπής με ένα ρόλο στο μεταστατικό καρκίνο και το προχωρημένο στάδιο [16], [17].

Εδώ ορίζουμε μια νέα

FGFR2

ενίσχυση στον καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή NCI-Η716 που προέρχεται από τον ασκίτη ενός ανεπαρκώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου.

FGFR2

αποτέλεσμα της ενίσχυσης του γονιδίου σε FGFR2 υπερέκφραση και συστατική ενεργοποίηση. Είναι σημαντικό, την ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η716 και την επιβίωση

in vitro

και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού ήταν εξαρτημένοι από FGFR2. Ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε

FGFR2

υπερέκφραση σε ένα υποσύνολο του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά δεν τήρησε την ενίσχυση. Ωστόσο, αυτοί οι πίνακες δεν περιέχουν ασκίτη που προέρχονται από αντιπροσωπευτικά δείγματα από την προέλευση των κυττάρων ΝΟΙ-Η716. Παρά το γεγονός ότι

FGFR2

ενίσχυση και υπερέκφραση είναι σπάνιες σε καρκίνο του παχέος εντέρου, μας

in vitro

και

in vivo

μοντέλα δείχνουν ότι οι αναδυόμενες αναστολείς FGFR θα μπορούσε να έχει αποτελεσματικότητα σε ένα υποσύνολο του καρκίνου του παχέος εντέρου φιλοξενούν αυτή ενισχύσεως.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

οι κυτταρικές σειρές ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε RPMI συν μοσχαριού εμβρύου 10% ορό και 100 μg /ml Pennicillin /στρεπταβιδίνη (Sigma). PD173074 ήταν από τη Sigma (St Louis, ΜΟ). MK2461 ήταν από την Merck [18].

FISH ανάλυση

DNA FISH πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 αντιμετωπίζονται με κολκεμίδης (0,02 μg /ml για 3 ώρες) και σε πυρήνες ιστού μικροσυστοιχιών όπως περιγράφεται στο παρελθόν [19], [20] χρησιμοποιώντας βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα κλώνους RP11-62L18 για

FGFR2

ανιχνευτές. Αυτός ο ανιχνευτής FISH περιέχει την αλληλουχία γονιδιώματος του Chr10: 123,224,100-123,398,498, η οποία περιλαμβάνει το σύνολο του γονιδίου FGFR2 σε Chr10: 123,237,844-123,353,481. Ανιχνευτές σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας απευθείας Spectrum Orange dUTP και Spectrum Πράσινη dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).

Η ανοσοϊστοχημεία

H80 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ήταν χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:50 σε ΝΟΙ-Η716 ξενομόσχευμα και Asterand τμήματα γαστρικού καρκίνου και σε αραίωση 1:20 σε πυρήνες συστοιχία από US Biomax Inc (Rockville, MD): CO802 (78 πρωτογενείς όγκους, 2 κανονικό), CO702 ( 69 δείγματα-30 πρωτογενείς όγκους, 25 λεμφαδένες, 8 ηπατικών μεταστάσεων, 9 κανονικό), CO992 (33 πρωτογενείς όγκους και 33 μεταστάσεις λεμφαδένων), BCO5115 (69 συνολικά 60 πρωτογενείς όγκους, 7 ηπατικών μεταστάσεων), Σε αυτούς τους πίνακες, 20 ασθενών ήταν κάτω των 35 ετών. Η χρώση διεξήχθη σε Ventana Discovery ΧΤ χρησιμοποιώντας Rabbit Ultra-HRP. Η ανίχνευση έγινε με το κιτ ChromoMap (Ventana Συστήματα Μοριακής Discovery, Tucson, AZ)

παραγωγή shRNA και τη μόλυνση

shRNA ακολουθίες ήταν:.

F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC,

F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC

F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC

F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC

λουσιφεράσης: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC

AAA. Κωδικοποιημένα: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG

GAGACAAAA ολιγονουκλεοτίδια αναδιατάχθηκαν και 5’BbsI και 3 ‘SpeI χρησιμοποιηθεί για να κλωνοποιηθεί σε ένα ιδιόκτητο πλασμίδιο ENTR ακολουθούμενη από μετατροπή σε pLenti6 /Αποκλεισμός-it-DEST (Invitrogen, Grand Island ΝΥ) χρησιμοποιώντας Πύλη ( Invitrogen, Grand Island NY). την παραγωγή του ιού και τον προσδιορισμό του τίτλου ήταν όπως κατευθύνεται από την Invitrogen. Για την ανάλυση της ανάπτυξης, τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 4000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, ενώ για το δυτικό κύτταρα ανάλυση σπάρθηκαν στα 40.000 κύτταρα σε 12 φρεατίων πλάκες. Viral υπερκείμενα προστέθηκαν για 20 ώρες παρουσία 8 μg /ml πολυβρενίου, κατά την οποία αφαιρείται και αντικαθίσταται με μέσο ανάπτυξης που περιέχει 10% ορό εμβρύου βόειας ιογενούς υπερκείμενα σημείο. Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν για ανάλυση Western 48 ώρες αργότερα.

δοκιμασίες ένωση θεραπείας και την ανάπτυξη

PD173074 (Sigma, St Louis ΜΟ) και MK2461 αραιώθηκαν σε DMSO για να δημιουργήσουν μια σειρά τιτλοδότησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],14]. Gleevec, λαπατινίμπη, PHS665753 και PD168393 ήταν από ChemieTek (Indianapolis ΙΝ) Αντι IGF1R αντισώματος AF305 ήταν από τα συστήματα R /D. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε φρεάτια εις τριπλούν, και μετά από 3 ημέρες αριθμούς κυττάρων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Vialight (κιτ δοκιμασίας Vialight, Cambrex, Rockland ΜΕ). Η φωταύγεια μετρήθηκε ποσοτικά με ένα Topcount ΝΧΤ HTS (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ) και προσδιορισμούς IC50 γίνει με τη χρήση λογιστικής καμπύλης 4 παραμέτρων προσαρμογή. Για ποσοτικοποίηση της φωσφοτυροσίνης σε FGFR2 και στυπώματα σαρώθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageQuant. Οι τιμές που αντιστοιχούν σε μπάντα ένταση παρίστανται γραφικώς έναντι συγκέντρωσης φαρμάκου για τη δημιουργία ενός IC50 της αναστολής του φαρμάκου. ScanMAX χαρακτηριστικών των 442 κινασών ήταν στο Πεδίο Biosciences (San Diego, CA).

κηλίδωση Western, ανοσοκαθίζηση, αντισώματα και αυξητικοί παράγοντες

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε 30 mmol /L Tris-HCL, ρΗ 7,5, 50 mmol /L NaCl, 5 mmol /L EDTA, 50 mmol /L NaF, 30 mmol /L NaPPi, 1% Triton, 0,5% IGEPAL, 10% γλυκερόλη, 1 mmol /L βαναδικό, 1 mmol /L bpPhen (Calbiochem), και αναστολέα πρωτεάσης (Roche) και κηλίδωση Western και ανοσοκαθίζηση έγιναν όπως περιγράφεται [21], [22]. Αντισώματα έναντι FGFR2 περιλαμβάνονται Ν-άκρο MAB6841 (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) και Η80 (Santa Cruz), C-άκρο C-20 (Santa Cruz) και Y653 /654 ειδικές 3471 ((Cell Signaling Technology, (CST) , Danvers ΜΑ.)). Πρόσθετες αντισώματα από CST ήταν: ρΑΚΤ S473 (4060), ΑΚΤ (9272), pERK (4370), ERK (9102), pS6RP S235 /236 (2217), S6RP (2211), διασπασμένη PARP (9542), βήτα ακτίνη (4967 ), ρ 105 NFKB S933, ρ 105 NFKB, Gab1 Y672, FRS2 Y436, SHC Y317 CRKII Y221, PRAS40 T246, ΡϋΚ1 S241, GSKIII S9, PKC S660, RSK S227 (ιστοσελίδα ΡϋΚ1), RSK S359 /363 (θέση ΕΚΚ), ΑΜΡΚ T172 (ιστοσελίδα ΕΚΒ) και GAPDH. 4G10 φωσφοτυροσίνης ήταν από την Upstate (Charlottesville VA). Ανασυνδυασμένη FGF2 ήταν από R &?. D Systems (Minneapolis ΜΝ)

Η κυτταρομετρία ροής

Ένα Becton Dickinson FACS Calibur χρησιμοποιήθηκε για κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα σε 1 ml παγωμένης αιθανόλης 70% μετά πλύθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με ΡΙ /RNAse (BD Pharmingen, San Diego) για 3 ώρες. λογισμικό ModFit χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί σχετική κατανομή στο G1, S, G2 /M, και χειροκίνητη περίφραξη για να καθορίσει το περιεχόμενο subG1.

Ξενομοσχεύματος

Οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με IACUC (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και Χρησιμοποιήστε Επιτροπή) τις κατευθυντήριες γραμμές και τα πειράματα έχουν εγκριθεί από τη Merck επιτροπή επανεξέτασης ερευνητικά εργαστήρια ηθική. Συστηματική παρακολούθηση και καταγραφή της ευημερίας των ποντικών σύμφωνα να φτάσει τις κατευθυντήριες γραμμές για την εμφάνιση, το μέγεθος, την κατάσταση παλτό, τη στάση του σώματος, το βάδισμα, τα επίπεδα δραστηριότητας, την αλληλεπίδραση με το περιβάλλον και τα κλινικά συμπτώματα. Ευθανασία ήταν coducted από εκθέτουν τα ζώα σε CO

2 μέχρι την πλήρη διακοπή της αναπνοής παρατηρήθηκε για τουλάχιστον 2 λεπτά (συνολικά περίπου 5 έως 10 λεπτά). Τα ζώα οπτικά για την απουσία της κυκλοφορίας και της αναπνοής. Ο θάνατος είχε εξασφαλίζεται επίσης με απομάκρυνση του ιστού του όγκου ή πολλαπλών οργάνων.

5 × 10

6 κύτταρα ΝΟΙ-Η716 εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε BALB /c γυμνά ποντίκια. Μετά την επίτευξη 200 mm

3, οι όγκοι υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, 300 mg /kg ή 800 mg /kg, μία φορά την ημέρα για 24 ημέρες. 10 ποντίκια ήταν σε κάθε ομάδα, και το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε με μέτρηση με παχύμετρο. Κανένα ζώο δεν εμφάνισε απώλεια βάρους μεγαλύτερη από 5% κατά τη διάρκεια της θεραπείας. FGFR2, ΑΚΤ, και ERK αναστολή

in vivo

μετρήθηκε με δοσολόγηση των ζώων και τη συλλογή όγκων στις 4 και 24 ώρες μετά την αγωγή. Οι όγκοι τοποθετήθηκαν σε υγρό άζωτο και υφίσταται επεξεργασία από διάσπαση σε 600 ul ρυθμιστικού λύσης σε Lyzer ιστού (Qiagen). Τα λύματα ποσοτικοποιούνται και επεξεργασία για SDS-PAGE και κηλίδωση Western όπως περιγράφεται για κυτταρολύματα.

Αποτελέσματα

FGFR2

ενισχύεται, και ενεργοποιείται σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716

Επειδή

FGFR2

ενίσχυση μπορεί να οδηγήσει στομάχου και του καρκίνου του μαστού ανάπτυξη των κυττάρων, ψάξαμε για περισσότερες κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν παρόμοιες

FGFR2

αντιγράψετε κέρδος. Οι μικροσυστοιχίες DNA επιβεβαίωσε γνωστό

FGFR2

ενίσχυση στην KATOIII και SNU 16 κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου [23], [24] και επεσήμανε μια νέα άκρως κομβικό ενίσχυση στο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η716 (Σχήμα S1 Α στο S1 αρχείου. η Oncomine βάση δεδομένων [25] αποκάλυψε επίσης υψηλό

FGFR2

έκφραση messager RNA στα κύτταρα NCI-Η716. φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH) αποκάλυψε εντυπωσιακή

FGFR2

αντιγράψετε το κέρδος και διπλασιασμό γονιδίου σε ομοιογενή χρώση περιοχές (Εικόνα 1Α). το πράσινο ανιχνευτής κεντρομερίδιο δεν αποκάλυψε το κέρδος αντίγραφο, σύμφωνα με το άκρως κομβικό αμπλικόνιο στο

FGFR2

θέση (Σχήμα S1 Α στο S1 αρχείου). Ένας ανιχνευτής FISH για

Met

αποκάλυψαν κανένα κέρδος αντίγραφο σε NCI-Η716 σε αυτό το χρωμόσωμα 7 τόπο, και το κέρδος

FGFR2

καθετήρας δεν παρουσίασε ενίσχυση σε DLD1 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που στερούνται

FGFR2

αντιγραφή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς τότε συγκρίνεται

FGFR2

έκφραση και ενεργοποίηση σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 σε σχέση με μία ομάδα εννέα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χωρίς

FGFR2

ενίσχυση, και βρήκαμε εντυπωσιακή FGFR2 υπερέκφραση και φωσφορυλίωση μόνο στην NCI-Η716 κύτταρα (Εικόνα 1Β). FGF2 δεν ενεργοποίησε περαιτέρω FGFR2 σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716, αποκαλύπτοντας ότι ο υποδοχέας είναι κατά ανώτατο φωσφορυλιωμένη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το επίπεδο ενεργοποίησης FGFR2 σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 ήταν παρόμοια με τα επίπεδα φαίνεται στο

FGFR2

ενισχυμένο SNU 16 γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (Σχήμα S2 σε S1 File). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι στο πάνελ μας κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου που

FGFR2

είναι ιδιαίτερα υπερεκφράζεται και ενεργοποιείται μόνο σε κύτταρα NCI-Η716.

Α. κύτταρα NCI-Η716 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κολσεμίδη (0,02 μg /ml για 3 ώρες), σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη /οξικό οξύ, και έπεσε πάνω σε μία πλάκα μικροσκοπίου σύμφωνα με τα υλικά και τις μεθόδους. Βακτηριακό τεχνητό χρωμόσωμα κλώνος RP11-62L18 σημάνθηκε με Spectrum Orange dUTP και ένας ανιχνευτής κεντρομεριδίου σημάνθηκε με Spectrum Πράσινο dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) και υβριδοποιήθηκε σε σταθερά κύτταρα. Κόκκινο δείχνει

FGFR2

και πράσινο υποδεικνύει Κεντρόμερο. B. FGFR2 υπερεκφράζεται και περιέχει υψηλά επίπεδα φωσφορυλίωσης τυροσίνης στην κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η716. Α, Προϊόντα λύσης κυττάρου (που παρασκευάζεται σύμφωνα με Υλικά και Μέθοδοι) από μη επεξεργασμένα ή FGF2 κατεργασία (30 ng /ml, 5 λεπτά) τα κύτταρα λύθηκαν και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κιτ BCA (Pierce Rockford Thermo Fisher Ill). ποσό ίσο λύμα (50 ug) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western με αντισώματα FGFR2 εναντίον Ν άκρο (H80. MAB6841), C άκρο (C20) και την ενεργοποίηση φωσφορυλίωσης βρόχος Y653 /654 (3471, σ-FGFR2) και ακτίνη.

η

FGFR2 απαιτείται για την ανάπτυξη των κυττάρων ΝΟΙ-Η716

μπορεί να απαιτηθεί FGFR2

ενίσχυση και ενεργοποίηση σε κύτταρα NCI-Η716 πρότεινε αυτό το κινάσης για την κυτταρική ανάπτυξη. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα NCI-Η716 με δύο αναστολείς μικρού μορίου FGFR να δοκιμάσει ένα ρόλο για FGFR2 στην ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η716. Σε ένα μεγάλο πάνελ kinses βρήκαμε PD173074 να είναι ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας του FGFR-1, -2, -3 [14], και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω την αξιοσημείωτη εκλεκτικότητα εδώ με ένα ξεχωριστό μεγάλο πάνελ κινασών (Σχήμα S3 κατά αρχείου S1). Μπορούμε επίσης κατεργασμένα κύτταρα με MK2461, έναν αναστολέα μικρού μορίου Met κινάσης που επίσης αναστέλλει φωσφορυλίωση FGFR2 και ανάπτυξη του

FGFR2

ενισχυμένο γαστρικού και του καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [13]. PD173074 και MK2461 ανέστειλε ισχυρά FGFR2 φωσφορυλίωση σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 (Σχήμα 2Α) με IC50 18 ηΜ (PD173074) και 165 ηΜ (MK2461, Σχήμα S4A σε File S1). Αμφότερες οι ενώσεις ανέστειλε ισχυρά την ανάπτυξη ΝΟΙ-Η716 με τιμές IC50 25 ηΜ για PD173074 και 130 ηΜ για MK2461 (Σχήμα 2Β). Είναι σημαντικό ότι, η IC50 για την αναστολή της ανάπτυξης και FGFR2 αναστολή φωσφορυλίωσης ήταν παρόμοια, και οι δύο τιμές ήταν επίσης παρόμοιες με τις τιμές που ελήφθησαν προηγουμένως για κυτταρικές γραμμές SNU 16 και KATOIII [13], [14]. Έχοντας παρατηρήθηκε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων NCI-Η716, έχουμε την επόμενη δοκιμάστηκαν αμφότερες τις ενώσεις για αναστολή σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του παχέος εντέρου. Αμφότερες οι ενώσεις αναστολέα FGFR εμφανίζεται μια εντυπωσιακή εκλεκτικότητα για την αναστολή των κυττάρων ΝΟΙ-Η716, με μεγαλύτερη από 80 φορές (MK2461) ή 400-φορές (PD173074) μικρότερη IC50 σε σχέση με μη

FGFR2

ενισχυμένες κυτταρικές γραμμές κόλου ( Σχήμα 2C). Ο αναστολέας FGFR AZD4547 επίσης επιλεκτικά ανέστειλε την ανάπτυξη σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, η ανάπτυξη ΝΟΙ-Η716 δεν ανεστάλη με αγωγή με αναστολέα κινάσης ενώσεις που έχουν έλλειψη αναστολής FGFR, συμπεριλαμβανομένων Tarceva, λαπατινίμπη, Gleevec, PHA665752 (ένα Met αναστολέα) PD168393 (μη αναστρέψιμο αναστολέα EGFR) και ένα ανασταλτικό αντίσωμα IGF1R (Σχήμα S4B σε File S1 ).

Α. PD173074 και MK2461 αναστέλλουν φωσφορυλίωση FGFR2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με μια τιτλοδότηση του PD173074 όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν και πρωτεΐνη 50 ug υποβλήθηκε σε SDS-PAGE και κηλίδωση Western με φωσφο Y653 /654 FGFR και MAB6841 συνολικό αντίσωμα FGFR2. Β PD173074 και MK2461 αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η716. Οι κυτταρικές γραμμές απλώθηκαν σε 4000 κύτταρα /φρεάτιο και επωάστηκαν όλη τη νύκτα. κύτταρα NCI-Η716 υπέστησαν αγωγή με μία τιτλοδότηση των PD173074 όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με αντιδραστήριο Vialight, και η ανάπτυξη παρουσιάστηκε σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. C. PD173074 και MK2461 επιλεκτικά αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων ΝΟΙ-Η716. Colon καρκινικές κυτταρικές γραμμές που αναφέρονται απλώθηκαν σε 4000 κύτταρα /φρεάτιο και 24 ώρες αργότερα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τιτλοδότηση των ενώσεων. 4 ημέρες αργότερα κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με vialight και τα IC50 υπολογίστηκαν από pad γράφημα πρίσματος. Δ

FGFR2

shRNA μειώνεται πρωτεΐνης FGFR2 στα κύτταρα NCI-Η716.

FGFR2

shRNA παρασκευάστηκε και τα κύτταρα ΝΟΙ-Η716 μολύνθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Αριστερά, η έκφραση FGFR2 αναλύθηκε με φωσφο Y653 /654 και η συνολική πρωτεΐνη με MAB6841. Ε Ανάπτυξης αναλύθηκε 5 ημέρες μετά τη μόλυνση με το αντιδραστήριο Vialight.

Η

Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω έναν κρίσιμο ρόλο για την FGFR2 στην ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η716 χρησιμοποιώντας το

FGFR2

shRNA. Εντοπίσαμε δύο πρώτα φουρκέτες (F2 και F4, Σχήμα 2D) με αποτελεσματικό

FGFR2

νοκ ντάουν. Αυτές οι φουρκέτες shRNA προκάλεσε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 (Σχήμα 2Ε). Αντιθέτως, ο έλεγχος shRNA και shRNA που δεν μειώνουν τα επίπεδα πρωτεΐνης FGFR2 (V και F1) δεν ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η716 (Σχήμα 2D, E).

Πολλαπλές πρωτεΐνες σηματοδότησης περιλαμβανομένων ΑΚΤ, ERK και NFKB ενεργοποιούνται από FGFR2

έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι το

FGFR2

ενεργοποιείται ΑΚΤ και ERK μονοπάτια σηματοδότησης σε FGFR2 ενισχυμένο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου [14]. Ως εκ τούτου, ορίζεται το δίκτυο σηματοδότησης FGFR2 στα κύτταρα NCI-Η716 αναλύοντας φωσφορυλίωση πολλαπλών πρωτεϊνών προσαρμογέα και οδών σηματοδότησης μετά την αναστολή FGFR2. Μετά από δύο ώρες επεξεργασίας με μία τιτλοδότηση MK2461 και PD173074 παρατηρήσαμε απώλεια της φωσφορυλίωσης σε πρωτεΐνες προσαρμογέα κινάσης Gab1 /2, FRS1 /2, και SHC. Επίσης παρατηρήσαμε απώλεια της ERK και φωσφορυλίωση ΑΚΤ (Σχήμα 3Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι στόχοι κατάντη της ΑΚΤ και ERK όπως PRAS40 και S235 /236 σε S6RP (και S9 σε GSKIII, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) παρέμεινε φωσφορυλιωμένη σε αυτό το χρονικό σημείο 2 ώρα. Εμείς επόμενη anlayzed αναστολή των στόχων ΑΚΤ και ERK σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία με 100 ηΜ PD173074. Εξετάσαμε, επίσης, διάφορα άλλα μονοπάτια για να καθορίσει εάν καθυστερήσει η κινητική της αναστολής επίσης συμβαίνουν. Σε αντίθεση με την 2 ώρα χρονικό σημείο, τόσο S6RP και φωσφορυλίωση PRAS40 ανεστάλησαν έντονα 12 ώρες μετά την ένωση προσθήκης (Σχήμα 3Β). Βρήκαμε επίσης μια παρόμοια καθυστερημένη αναστολή της φωσφορυλίωσης της σερίνης-933 σε ρ105 NFKB, υποδηλώνοντας ότι η σηματοδότηση NFKB είναι μέρος της ανάπτυξης ΝΟΙ-Η716 (Σχήμα 3Β). NFKB P50 και τα επίπεδα της πρωτεΐνης Ρ105 μειώθηκαν μόνο σε 72 ώρες. Ενώ η αναστολή 12 ώρες μετά την αγωγή μπορεί να προκύψει από μια παρατεταμένη ημιζωή των πρωτεϊνών σηματοδότησης, αναστολή σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία όπως 72 ωρών μπορεί να είναι δευτερεύουσα σε αναστολή της ανάπτυξης (και κυτταρικό θάνατο, όπως περιγράφεται παρακάτω στο Σχήμα 4). CRKII Y221, ΑΜΡΚ T172 και ΡϋΚ1 S241 ανεστάλησαν μόνο σε 48-72 ώρες μετά τη θεραπεία, και πάλι υποδεικνύοντας ότι η απώλεια αυτών των χώρων μπορεί να είναι δευτερεύουσα σε αναστολή της ανάπτυξης. CRKII, επίπεδα πρωτεΐνης ΑΜΡΚ, και PDK δεν μειώθηκε κατά τη διάρκεια της χρονικής πορείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, άλλες περιοχές όπως GSKIII S9 (μία θέση φωσφορυλίωσης ΑΚΤ), PKC S660, S227 RSK (ένα site φωσφορυλίωσης ΡϋΚ1) παρέμεινε φωσφορυλιωμένη ακόμα και μετά από 72 ώρες (Εικόνα 3Β). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι ΡϋΚ1 παραμένει ενεργή και ικανή να φωσφορυλιώσει θέσεις στόχους παρά την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Αν και η θέση φωσφορυλίωσης S227 ΡϋΚ1 επί RSK δεν ανεστάλη η ERK θέση φωσφορυλίωσης σερίνης-359 /363was ανέστειλε εντός 2 ωρών από τη θεραπεία PD173074 (Σχήμα S5 σε File S1). GSKSIII Σερίνη-9 παρέμειναν επίσης φωσφορυλιωμένο σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, και μπορεί να είναι δυνατό ότι άλλες κινάσες εκτός από ΑΚΤ διατηρούν φωσφορυλίωση σε αυτήν την θέση. Τέλος, επειδή η αναστολή της ΜΕΚ επηρέασε την ανάπτυξη ΝΟΙ-Η716, εμείς ορίζεται περαιτέρω το δίκτυο σηματοδότησης ΜΕΚ χρησιμοποιώντας 100 ηΜ του αλλοστερικής ΜΕΚ αναστολέα PD0325901 [26]. Σερίνη-933 στο ρ 105 NFKB και σερίνη-265 στο FRA1 περιγράφονται ως θέσεις φωσφορυλίωσης της ERK και επιβεβαιώσαμε την απώλεια αυτών των χώρων. Σερίνη-235/236 S6RP είναι επίσης ένας στόχος ΜΕΚ σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 (Σχήμα 3C). Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αναστολή FGFR2 οδήγησε σε ένα διφασικό πρότυπο της αναστολής της οδού, με ERK και ΑΚΤ αναστέλλεται σε πρώιμα χρονικά σημεία, ενώ PRAS40, S6RP, και παράγοντες μεταγραφής όπως NFKB ρ105 παρουσίασαν καθυστερημένη αναστολή. Άλλες πρωτεΐνες σηματοδότησης όπως ΡϋΚ1 και PKC ισομορφών παρέμεινε φωσφορυλιωμένο ακόμη και σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία. Ωστόσο, παραμένει πιθανό ότι παρά φωσφορυλίωση πρωτεϊνών όπως ισομορφές PKC μπορεί να είναι ανενεργό οφείλεται σε άλλους παράγοντες, όπως κινητά εσφαλμένος εντοπισμός. Συνολικά αυτά τα αποτελέσματα προειδοποιούν ότι η ανάλυση ενός δικτύου σηματοδοσίας μόνο στα αρχικά χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία αναστολέας δεν μπορεί να καθορίσει πλήρως το φάσμα των δραστών σηματοδότησης.

Α. Κυτταρολύματα χρησιμοποιούνται στο Σχ. 2Α αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για φωσφορυλιωμένη ή ολικών πρωτεϊνών μετά από μια θεραπεία 2 ώρα με υποδεικνυόμενη ένωση τιτλοδότησης. «P» δείχνει φωσφοπρωτεΐνη, και οι θέσεις φωσφορυλίωσης αναφέρονται στις Μεθόδους. B. Χρονική πορεία της αναστολής για πολλαπλές πρωτεΐνες σηματοδότησης. κύτταρα NCI-Η716 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ PD173074 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και μονοπάτια σηματοδότησης αναλύθηκαν με SDS PAGE και κηλίδωση Western. 100 ηΜ PD173074 επιλέχθηκε επειδή το ποσό αυτό προκάλεσε την πλήρη αναστολή της pERK στο χρονικό σημείο 2 ωρών. «P» δείχνει φωσφοπρωτεΐνη, και οι θέσεις φωσφορυλίωσης αναφέρονται στις Μεθόδους. Ορολογία στη δεξιά πλευρά του σχήματος ομάδων πρωτεϊνών σύμφωνα με το χρόνο κατά τον οποίο λαμβάνει χώρα η αναστολή ή πρωτεΐνη απώλεια. κύτταρα C. ΝΟΙ-Η716 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ PD0325901 για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Τα προϊόντα λύσης παρασκευάστηκαν για SDS PAGE και κηλίδωση Western με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. κύτταρα D. ΝΟΙ-Η716 τοποθετήθηκαν σε 4000 κύτταρα /φρεάτιο υπέστησαν κατεργασία 24 ώρες αργότερα με 1 υΜ L-547 (Ακτή), 100 ηΜ PD0325901 (MEKi), 5 ηΜ ραπαμυκίνη (ραπαμυκίνη), 100 ηΜ PD173074, ή 1,5 υΜ MK2461, ή η υποδεικνύεται συνδυασμούς. Μετά από 5 ημέρες ένωση και τα μέσα αφαιρέθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκο ​​ένωση και τα μέσα ενημέρωσης. Μετά επιπλέον 5 ημέρες (10 ημέρες δοκιμασία ολικής) ανάπτυξης σε σχέση κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Vialight.

Η

Α. Κυτταρολύματα από το Σχήμα 3Β δείχνουν αυξημένες διάσπαση PARP. Φωσφο S6RP περιλαμβάνεται ως αναφορά και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. B. προφίλ κυτταρικού κύκλου των κατεργασμένων κυττάρων. 1 × 10exp6 κύτταρα ΝΟΙ-Η716 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 100 ηΜ PD173074, αναστολέα ΜΕΚ (100 ηΜ) ή αναστολέα ΜΕΚ + ΑΚΤ (L-547, 1 μΜ) ή DMSO (μη επεξεργασμένα) απομονώθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία και σε επεξεργασία για ιωδιούχου προπιδίου χρώση και ανάλυση FACS όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Β δείχνει ένα πίνακα αναπαράσταση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου, όπως καθορίζεται από το εγχειρίδιο διόδου για G1, S, G2 /M και subG1 περιοχές. C είναι το προφίλ του κυτταρικού κύκλου.

Η

συνδυασμένη αναστολή της ΑΚΤ και ERK είναι υποχρεωμένη να αναστείλει πλήρως NCI-Η716 ανάπτυξη

Στα κύτταρα NCI-Η716 ERK, ΑΚΤ και S6RP φωσφορυλίωση απαιτεί FGFR2 , και είμαστε δίπλα χρησιμοποιούνται εκλεκτικοί αναστολείς αλλοστερική των ΜΕΚ, ΑΚΤ, και mTOR να καθορίσει το ρόλο αυτών των περιόδων ανάπτυξης NCI-Η716. Αν και ΜΕΚ αναστολέα PD0325901 μειωμένη ανάπτυξη ΝΟΙ-Η716 με IC50 60 +/- 14 ηΜ, μία πορεία χρόνου έδειξε ότι τα κύτταρα NCI-Η716 παρέμειναν στην προοδευτική ανάπτυξη (Σχήμα 3D, τυρκουάζ γραμμή). Βρήκαμε ότι το 1 υΜ αναστολέα ΑΚΤ L-547 ή 5 ηΜ ραπαμυκίνη μόνη της ή σε συνδυασμό είχε μόνο ελάσσονα αποτελέσματα επί της ανάπτυξης παρά την ισχυρή αναστολή της ΑΚΤ και S6RP φωσφορυλίωση (Σχήμα S6 σε File S1). Αντίθετα, ένας συνδυασμός αναστολέα ΑΚΤ και ΜΕΚ αναστολέα μπλοκάρει την ανάπτυξη και προκάλεσε μία μείωση στον αριθμό κυττάρων που είναι παρόμοια με FGFR αναστολής (Σχήμα 3D). Ως εκ τούτου, τόσο ΑΚΤ και ERK είναι κρίσιμα τελεστές της FGFR2 στα κύτταρα NCI-Η716. Αντίθετα, ένας συνδυασμός της αναστολής ΜΕΚ και η ραπαμυκίνη δεν ήταν ανώτερη ΜΕΚ αναστολή μόνο. Αυτό είναι σύμφωνο με τα βιοχημικά αποτελέσματα μας (Εικόνα 3C) ότι S6RP είναι κατάντη του ΜΕΚ σε αυτή την κυτταρική γραμμή, έτσι ώστε η αναστολή ERK οδηγεί ήδη σε αναστολή της S6RP. Επιπλέον, η έλλειψη ενός φαινοτύπου με ραπαμυκίνη υποδηλώνει ότι πολλαπλές τελεστές της ERK πρέπει να ανασταλεί σε συνδυασμό για να μιμηθεί την αναστολή της ανάπτυξης που παρατηρείται με αναστολέα ΜΕΚ.

Η απόπτωση είναι ο μηχανισμός για την αναστολή της ανάπτυξης

ο αρχικός αριθμός των κυττάρων μειώθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με PD173074 και με την ΑΚΤ και συνδυασμό αναστολέα ΜΕΚ, υποδηλώνοντας αυτοί οι αναστολείς προκάλεσε κυτταρικό θάνατο. Διασπασμένη PARP, ένας δείκτης της απόπτωσης, έντονα επάγεται μετά από αγωγή PD173074 (Σχήμα 4Α) και με MK2461 (δεν φαίνεται). Η κυτταρομετρία ροής και το περιεχόμενο του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν διακοπή της ανάπτυξης μετά από 24 ώρες της θεραπείας με αναστολείς FGFR ή συνδυασμούς αναστολέα ΜΕΚ /ΑΚΤ όπως φαίνεται στην απώλεια του πληθυσμού φάσης S (Σχήμα 4Β, C) Στις 48 ώρες και αργότερα χρονικά σημεία η σύλληψη ανάπτυξη ακολουθήθηκε από εξέχοντες επαγωγή ενός πληθυσμού subG1. Στην πραγματικότητα σε 4 ημέρες μετά την θεραπεία, το κλάσμα subG1 αντιπροσωπεύεται το ήμισυ του πληθυσμού κυττάρου. Αντιθέτως, η αναστολή της ΜΕΚ μειώθηκε κυττάρων σε φάση S στις 24 ώρες, αλλά ούτε εξαλείφονται κύτταρα φάσης S σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία ούτε προκάλεσε παρόμοια εξέχοντα κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 4Β, C). Τέλος, οι εικόνες των κυττάρων ΝΟΙ-Η716 αποκαλύπτει εκτεταμένη κατάτμηση των κυττάρων μετά από 72 ώρες επεξεργασίας με PD173074 ή 1 υΜ MK2461, συνεπής με το κυτταρικό θάνατο (Εικόνα S7 στο File S1). Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν ότι η επιβίωση ΝΟΙ-Η716 κυττάρων εξαρτάται από FGFR2, και επίσης να υποστηρίξει προηγούμενες ενδείξεις ότι τόσο ΑΚΤ και δραστηριότητα ERK είναι απαραίτητα για την επιβίωση.

FGFR2 απαιτείται για την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου ΝΟΙ-Η716

Ισχυροί ευαισθησία NCI-Η716 σε FGFR αναστολείς

in vitro

πρότεινε ότι η αύξηση του όγκου ξενομοσχεύματος μπορεί επίσης να ανασταλεί

in vivo

. ΝΟΙ-Η716 προήλθε από ένα ασκίτη, και σύμφωνα με την προσαρμογή στο περιβάλλον αυτό, η κυτταρική γραμμή πολλαπλασιάζεται ασύνδετος σε εναιώρημα. Ως εκ τούτου, επιχείρησαν να δημιουργήσουν ένα μοντέλο ασκίτη χρησιμοποιώντας κύτταρα που εκφράζουν λουσιφεράση ΝΟΙ-Η716 εγχέονται εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας. Ωστόσο απεικόνισης λουσιφεράσης αποκάλυψε έλλειψη επέκταση των καρκινικών κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, δοκιμάστηκαν για την αναστολή της ανάπτυξης όγκου σε ένα καθιερωμένο μοντέλο ξενομοσχεύματος υποδόρια. Επειδή PD173074 έχει κακή φαρμακοκινητικές ιδιότητες, έχουμε ποντίκια που έλαβαν αγωγή με MK2461. Όταν οι όγκοι έφθασαν 200 mm

3 σε μέγεθος, MK2461 δοσολογήθηκε μία φορά ημερησίως (QD) σε είτε 300 ή 800 mg /kg. Κατά τη διάρκεια της μελέτης 21 ημερών, το /kg αγωγή 800 mg προκάλεσαν πλήρη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, ενώ 300 mg /kg οδήγησε σε μερική αναστολή η οποία δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 5Α). Ούτε δόση είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια σωματικού βάρους που υπερβαίνει το 5% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τόσο υψηλές και χαμηλές δόσεις MK2461 προκάλεσε πλήρη αναστολή της FGFR2, ERK, και φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε όγκους 2 ώρες μετά τη δόση (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, στο 23 ώρες μετά τη χορήγηση, μόνο η δόση των 800 mg /kg είχε σημαντική αναστολή της φωσφορυλίωσης FGFR2 και ERK. Η αδυναμία της δόσης των 300 mg /kg για να προκαλέσει τη συνεχή αναστολή της FGFR2 και ERK σηματοδότησης μπορεί να εξηγήσει την έλλειψη σχετίζεται αποτελεσματικότητας. Αν και 800 mg /kg προκάλεσαν πλήρη αναστολή της ανάπτυξης, δεν παρατηρήθηκε καμία διασπασμένης ΡΑΚΡ

in vivo

, σε αντίθεση με

in vitro

θεραπεία με MK2461 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η έλλειψη διασπασμένης ΡΑΚΡ

in vivo

είναι επίσης συνεπής με την απουσία παλινδρόμησης στο μοντέλο ξενομοσχεύματος, και μπορεί να προκύψουν από την έλλειψη ισχυρή αναστολή της φωσφορυλίωσης ΑΚΤ. Για παράδειγμα, όταν μόνο ERK ήταν εύρωστα αναστέλλεται

in vitro

(με ΜΕΚ αναστολέα PD0325901), υπήρχε μειωμένη ανάπτυξη αλλά όχι κυτταρικό θάνατο. Συνεπώς, η έλλειψη ισχυρή αναστολή ΑΚΤ μπορεί να εξηγήσει γιατί παλινδρόμησης δεν παρατηρήθηκε στο μοντέλο ξενομοσχεύματος. Ο λόγος για την έλλειψη αναστολής της ΑΚΤ

in vivo

δεν είναι σαφής, αλλά θα μπορούσε ενδεχομένως να προκύψει από αντισταθμιστικά ενεργοποίηση της οδού από ενδογενείς παράγοντες ανάπτυξης ή κυτοκίνες που δεν υπάρχει στο μέσο καλλιέργειας ιστού ποντικού.

Α. 5 × 10exp6 κύτταρα ΝΟΙ-Η716 εμφυτεύθηκαν υποδορίως σε Balb /c γυμνούς ποντικούς και κατεργάζεται με MK2461 είτε 300 mg /kg ή 800 mg /kg σε ένα δοσολογικό σχήμα QD. Η σχετική ανάπτυξη του όγκου δεικνύεται στον άξονα Υ. B. όγκους ποντίκια που φέρουν υποβλήθηκαν σε αγωγή με μία μόνο δόση MK2461 είτε 300 mg /kg ή 800 mg /kg. Οι όγκοι απομονώθηκαν είτε 4 ή 24 ώρες μετά τη θεραπεία, και τοποθετήθηκε σε υγρό άζωτο. Οι όγκοι υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας το Lyzer ιστού (Qiagen) όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους και αναλύθηκαν με SDS-PAGE και κηλίδωση Western με την υποδεικνυόμενη φωσφο και συνολική αντισώματα.

Η

FGFR2 υπερέκφραση αλλά δεν ενίσχυσης βρίσκεται σε ένα υποσύνολο του πρωτογενούς καρκίνου του παχέος εντέρου και των μεταστάσεων λεμφαδένων

Εμείς ορίστηκε ότι ο επιπολασμός της FGFR2 υπερέκφραση και ενίσχυση στην πρωτογενή καρκίνο του παχέος εντέρου χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC) για την έκφραση FGFR2 και FISH για

FGFR2

ενίσχυσης. Επειδή δεν υπάρχει προηγούμενο για την επιλεκτική

FGFR2

ενίσχυση σε μία μετάσταση αλλά όχι στον πρωτογενή όγκο αναλύσαμε επίσης 15 του ήπατος και 58 λεμφαδένα μεταστάσεων μαζί με τα συνδεδεμένα τους πρωτογενείς όγκους. Επειδή περιγράφηκε προηγουμένως C-τελικό άκρο αντισώματα δεν ανιχνεύουν τις ισομορφές FGFR2 σε κύτταρα ΝΟΙ-Η716 με κηλίδωση Western ή IHC (τα δεδομένα δεν φαίνονται), έχουμε βελτιστοποιημένα χρώση IHC με το Ν-άκρο H80 αντίσωμα. Εμείς επιβεβαίωσε την έντονη αντίδραση IHC στο ξενομόσχευμα NCI-Η716 και με ένα

FGFR2

ενισχύεται όγκου του στομάχου του καρκίνου (Σχήμα 6).