Αφηρημένο

γονιδίωμα-ευρεία microRNA (miRNA) ανάλυση Τρέχουσα υπογραφή της έκφρασης με τη χρήση τεχνολογιών βαθιά αλληλουχίας μπορεί να οδηγήσει την ανακάλυψη νέων οδών καρκίνου ρυθμίζεται από ογκογόνο ή /και όγκου miRNAs κατασταλτική. Έχουμε καθορίζεται το γονιδίωμα-ευρεία υπογραφή έκφραση miRNA στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης (BC) με τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας. Ένα σύνολο από δέκα μικρών βιβλιοθηκών RNA αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία (πέντε ΣΔ και πέντε δείγματα επιθηλίων ιστολογικά φυσιολογικό κύστη (NBE)), και 13190619 18559060 για καθαρό μικρό RNA διαβάζει ελήφθησαν. Ένα σύνολο από 933 γνωστά miRNAs και 17 νέοι υποψήφιοι miRNA ανιχνεύθηκαν σε αυτή την ανάλυση. Μεταξύ των γνωστών miRNAs, συνολικά 60 miRNAs ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε σχέση με το π.Χ. NBE. Βρήκαμε επίσης ότι αρκετές miRNAs, όπως

miR-1 /133α

,

miR-206 /133b

,

ας-7c /miR-99a

,

miR-143/145

και

miR-195/497

, βρίσκονται κοντά μεταξύ τους σε πέντε διαφορετικές θέσεις και αποτελούσε συμπλέγματος miRNAs. Μεταξύ αυτών συγκεντρωμένα miRNAs, εστιάσαμε στο

miR-195/497

συμπλέγματος, επειδή αυτό το σύμπλεγμα miRNA δεν είχε αναλυθεί σε π.Χ.. Επιμόλυνση των ώριμων

miR-195

ή

miR-497

σε δύο π.Χ. κυτταρικές σειρές (αγόρι και Τ24) πολλαπλασιασμό ανέστειλε σημαντικά καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η

ΜΙΚ 195/497

συμπλέγματος λειτουργούσαν ως καταστολείς των όγκων π.Χ.. Όσον αφορά τα γονίδια που στοχεύονται από το

miR-195/497

συμπλέγματος, η TargetScan αλγόριθμος έδειξε ότι 6.730 γονίδια ήταν υποτιθέμενο

miR-195/497

στόχους, και 113 εμπλουτίζεται σημαντικά μονοπάτια σηματοδότησης εντοπίστηκαν στην η ανάλυση αυτή. Η κατηγορία «Μονοπάτια του καρκίνου» ήταν η πιο εμπλουτισμένη, με τη συμμετοχή 104 υποψήφια γονίδια-στόχους. δεδομένων γονιδιακής έκφρασης αποκάλυψε ότι 27 από 104 υποψήφια γονίδια στόχοι πράγματι υπερεκφράζεται σε κλινικά δείγματα. π.Χ. δοκιμασίες αναφοράς της λουσιφεράσης και κηλίδωση Western έδειξε ότι

BIRC5

και

WNT7A

άμεσα στόχαστρο

miR-195/497

. Εν κατακλείδι, παρεκκλίνουσα έκφραση του συμπλέγματος miRNAs ταυτίστηκε με βαθιά αλληλουχίας, και προς τα κάτω ρύθμιση

miR-195/497

συνέβαλαν π.Χ. εξέλιξη και μετάσταση. Όγκου κατασταλτικά miRNA με τη μεσολάβηση μονοπατιών του καρκίνου παρέχουν νέες γνώσεις σχετικά με τους πιθανούς μηχανισμούς π.Χ. ογκογένεση

Παράθεση:. Itesako Τ, Seki Ν, Yoshino Η Chiyomaru Τ, Yamasaki Τ, Hidaka H, ​​et al. (2014) Η microRNA Έκφραση Υπογραφή καρκίνου της ουροδόχου κύστης από Deep αλληλουχίας: Η λειτουργική σημασία του

miR-195/497

συμπλέγματος. PLoS ONE 9 (2): e84311. doi: 10.1371 /journal.pone.0084311

Επιμέλεια: Bernard W. Futscher, Το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 του Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 13 Νοεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Itesako et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού και Πολιτισμού επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (C), 23501298 και 23592340, 2011. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στις ανεπτυγμένες χώρες, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης (π.Χ.) είναι η πέμπτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται όγκου και η δεύτερη πιο συχνή αιτία θανάτου σε ασθενείς με κακοήθειες του ουροποιογεννητικού συστήματος. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, υπάρχουν περισσότεροι από 73.000 νέες περιπτώσεις και 14.000 θανάτους ετησίως [1]. Στην Ιαπωνία, ο αριθμός των νέων ασθενών π.Χ. εκτιμήθηκε σε 17.461 το 2007 και ο αριθμός των θανάτων εκτιμάται σε 7.008 το 2011 [2].

ΣΔ μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες, μη-διηθητικό όγκων και διηθητικό όγκων. Παρά το γεγονός ότι το 70% -80% των ασθενών που διαγιγνώσκονται με μη διηθητικό όγκων, οι υψηλοί ρυθμοί υποτροπής (50% -70%) που παρατηρήθηκε σε αυτούς τους ασθενείς. Επιπλέον, μεταξύ υποτροπιάζουσες περιπτώσεις, το 15% του BCS εξελιχθεί σε διηθητικό ασθένειας [3]. Το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τους ασθενείς με μη διηθητικό π.Χ. είναι κοντά στο 90%, ενώ εκείνη των ασθενών με διηθητικό π.Χ. είναι περίπου 60% [4]. Επιπλέον, σχεδόν 80% των ασθενών με μεταστάσεις στους λεμφαδένες πεθαίνουν εντός των πρώτων πέντε ετών [5]. Δεδομένου ότι οι περισσότερες κλινικές δοκιμές των χημειοθεραπευτικών για προχωρημένους π.Χ. έχουν δείξει περιορισμένα οφέλη, νέα προγνωστικούς δείκτες και αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας με βάση τις τρέχουσες αναλύσεις καρκίνο του γονιδιώματος είναι απαραίτητες.

Η ανακάλυψη των μη-κωδικοποίησης του RNA στο ανθρώπινο γονιδίωμα ήταν σημαντική εννοιολογική επανάσταση στην εποχή μετα-γονιδιωματικής αλληλουχίας [6]. Βελτιωμένη κατανόηση των μη-κωδικοποίησης RNA είναι απαραίτητη για τη συνέχιση της προόδου στην έρευνα για τον καρκίνο. miRNAs αποτελούν μια κατηγορία από μικρά, μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA, 19-22 νουκλεοτίδια σε μήκος, που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου. Κανονισμός επιτυγχάνεται μέσω ατελής σύζευξη με αγγελιαφόρο RNA στόχο (mRNAs) των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και μεταγραφική ή μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης τους [7]. Επί του παρόντος, 2.042 ανθρώπινη ώριμη miRNAs είναι εγγεγραμμένοι σε miRBase απελευθερώσει 20.0 [https://microrna.sanger.ac.uk/]. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs συμβάλλουν επίσης στην έναρξη, την ανάπτυξη και μετάσταση διαφόρων τύπων καρκίνου. Πολλοί ανθρώπινοι καρκίνοι παρουσιάζουν ανώμαλη έκφραση των miRNAs που μπορεί να λειτουργήσει είτε ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [8]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των έκτροπα εξέφρασε miRNAs είναι το πρώτο βήμα προς την αποσαφήνιση miRNA με τη μεσολάβηση ογκογόνο μονοπάτια σε ανθρώπινους καρκίνους.

Η ανάπτυξη της υψηλής απόδοσης, τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας έχει γρήγορα ακάλυπτο μυθιστόρημα πληροφορίες σχετικά με miRNAs. Ανάλυση βαθιά αλληλουχίας φαίνεται να είναι ανώτερη από microarray- ή PCR-based μεθόδων που περιορίζονται σε γνωστά miRNAs και συνήθως δεν περιέχουν την πλήρη λίστα των γνωστών αλληλουχιών miRNAs. Ανάλυση βαθιά αλληλουχίας θα γίνει το χρυσό πρότυπο μέθοδο για την εμπεριστατωμένη ανάλυση miRNA στον τομέα της γονιδιωματικής καρκίνο. miRNA υπογραφές έκφραση π.Χ. λαμβάνεται με την τεχνολογία βαθιά αλληλουχίας έχουν οδηγήσει σε τέσσερις πρόσφατες δημοσιεύσεις [9] – [12] και η μελέτη αυτή αποτελεί την πέμπτη έκθεση. Συνολικά δέκα μικρών βιβλιοθηκών RNA υποβλήθηκαν σε αλληλούχιση (πέντε καρκινώματα της ουροδόχου κύστης και πέντε συμφωνημένα, ιστολογικά δείγματα φυσιολογικού της urothelia), οδηγώντας σε 13.190.619 σε 18.559.060 καθαρό μικρά RNA διαβάζει σε αυτή την ανάλυση. Διαπιστώσαμε 933 γνωστά miRNAs και 17 νέοι υποψήφιοι miRNA στη σειρά των δειγμάτων.

Μερικά miRNAs βρίσκονται πολύ κοντά το ένα στο άλλο για το ανθρώπινο γονιδίωμα, και ως εκ τούτου ονομάζεται σύμπλεγμα miRNAs. Στο ανθρώπινο γονιδίωμα, έχουν 247 ανθρώπινα miRNAs έχουν βρεθεί να συγκεντρώνονται σε 64 περιοχές σε ενδο-miRNA αποστάσεις μικρότερες των 5000 bp [13]. Η

miR-15a /16

συμπλέγματος, για παράδειγμα, είναι καλά γνωστό ότι δρα ως καταστολέας των όγκων με τη στόχευση πολλαπλών ογκογονίδια, συμπεριλαμβανομένου του

BCL2

,

MCL1

, em

CCND1

και

Wnt3A

[14] – [16], ενώ η

miR-17/92

σύμπλεγμα αναγνωρίζεται ως ογκογονίδιο [17]. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι

miR-1-1 /133α-2

και

miR-1-2 /133α-1

σχηματίζονται συστάδες σε διάφορες χρωμοσωμικές θέσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα, 20q13.33 και 18q11.2, αντίστοιχα, και αυτά τα συμπλέγματα λειτουργούν ως καταστολείς όγκων, στοχεύοντας αρκετά ογκογονίδια σε ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των BC [18] – [24]. Η

miR-143/145

συμπλέγματος βρίσκεται στο 5q32 τόπο και αναφέρθηκε επίσης ως κατασταλτικό όγκου σύμπλεγμα miRNA π.Χ. [25] – [28]. Έχουμε επιλέξει 60 μειωτικά miRNAs στην υπογραφή π.Χ. και διερευνήθηκαν χρωμοσωμικές τους τόπους. Είναι ενδιαφέρον ότι, μεταξύ των 60 miRNAs, διαπιστώσαμε ότι πολλές σχηματίζονται συμπλέγματα, όπως

miR-1 /133α

,

miR-206 /133b

,

ας-7c /miR-99α

,

miR-143/145

και

miR-195/497

.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι το

miR-195/497

σύμπλεγμα λειτουργούσε ως καταστολέας των όγκων μέσω της στόχευσης των πολλών ογκογόνων γονιδίων που εμπλέκονται σε συγκεκριμένες σχετίζονται με τον καρκίνο περιόδων. π.Χ. Με βάση αυτή την υπόθεση, πραγματοποιήσαμε μελέτες κέρδος-of-λειτουργία στο microRNAs επιμολύνσεις και προσπάθησε να εντοπίσει νέες

miR-195/497

συμπλέγματος μεσολάβηση μοριακούς στόχους και πορείες από

in silico ανάλυση

. Η κατανόηση του ρόλου των miRNAs θα παρέχουν μια αποτελεσματική και πολλά υποσχόμενη στρατηγική για miRNA που σχετίζεται με θεραπευτικά βάσει αποδείξεων για τη θεραπεία της. Π.Χ.

Αποτελέσματα

αλληλουχίας και σχολιασμό των μικρών RNAs

Δέκα μικρές βιβλιοθήκες RNA (από πέντε ΣΔ και πέντε NBEs) σε ακολουθία με τη χρήση της τεχνολογίας βαθιά αλληλουχίας. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Αρχικά, 13905124 18938856 για την ακατέργαστη αλληλουχία διαβάζει παρήχθησαν για τις βιβλιοθήκες. Μετά το φιλτράρισμα και την περικοπή των διαβάζει για χαμηλή ποιότητα και προσαρμογείς, από 13.190.619 σε 18.559.060 καθαρό μικρά RNA διαβάζει ελήφθησαν (Πίνακας 2). Η κατανομή των μηκών νουκλεοτιδίου καθαρών μικρών RNA διαβάζει κυμαινόταν από 16 να 38 νουκλεοτίδια σε κάθε βιβλιοθήκη. Το πλέον άφθονο μήκος ήταν 22 νουκλεοτίδια (Σχήμα S1). Όλα τα υψηλής ποιότητας καθαρό διαβάζει μεγαλύτερα από 18 νουκλεοτίδια χαρτογραφήθηκαν στο ανθρώπινο γονιδίωμα και αυτά γονιδίωμα ταιριαστό διαβάζει χωρίστηκαν σε διαφορετικές κατηγορίες των μικρών RNAs σύμφωνα με βιογένεση και σχολιασμό (Πίνακας 3) τους. Αμφότερες ΣΔ και NBEs περιείχε πολλαπλά και ετερογενή μικρά RNAs είδη που περιλαμβάνονται miRNA, θραύσματα αποικοδόμηση της μη-κωδικοποίησης RNAs (tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, κλπ), γονιδιακό επαναλήψεις, mRNAs, ή χωρίς διαβάθμιση RNAs. Η πιο άφθονη κατηγορία RNA από κάθε βιβλιοθήκη ήταν miRNA. Τα δεδομένα ακολουθίας από αυτή τη μελέτη είχαν κατατεθεί σε ϋϋΒΙ Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο (αριθμός πρόσβασης? DRA001043)

Η

Η

Αναγνώριση μειωτικά miRNAs με βάση miRNA υπογραφές έκφραση π.Χ.

Έχουμε διαχωρίσει τα υψηλής ποιότητας καθαρό ακολουθίες ανάγνωσης σε κάθε βιβλιοθήκη σε δύο κατηγορίες, miRNAs ή μη-κωδικοποίησης RNAs χρήση δεδομένων NCBI GenBank, δεδομένων Rfam και miRBase. Σε αυτή τη μελέτη, συνολικά 933 γνωστά miRNAs και 17 υποψήφια νέα miRNAs ανιχνεύθηκαν από υψηλής ποιότητας σειρές καθαρά Διαβάστε (Πίνακες S1 και S2). Τα επίπεδα έκφρασης των νέων υποψηφίων miRNA ήταν χαμηλές και οι λειτουργικές τους ρόλους δεν αξιολογήθηκαν αρκετά (Πίνακας S2). Για τους λόγους αυτούς, θα τους εξαιρέθηκαν από την ανάλυση. Ωστόσο, η λειτουργική σημασία αυτών των νέων υποψηφίων miRNA είναι σημαντική και θα πρέπει να μελετηθεί στο μέλλον. Εδώ, έχουμε επικεντρωθεί στις 933 γνωστές miRNAs και καθιέρωσε την υπογραφή έκφραση των miRNAs του BC με βαθιά αλληλουχίας. Διαφορικά εκφραζόμενο miRNAs ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση του προγράμματος Edger με ένα γενικό γραμμικό μοντέλο. Επελέγησαν συνολικά 60 μειωτικά miRNAs για την ανάλυση αυτή (Πίνακας 4).

Η

Στη συνέχεια, θα χαρτογραφηθούν τα μειωτικά miRNAs στο ανθρώπινο γονιδίωμα και βρέθηκαν αρκετές miRNAs που ήταν κοντά και είχαν ονομαστεί συγκεντρωμένα miRNAs, όπως

miR-1 /133α, miR-206 /133b, αφήστε-7c /miR-99a, miR-143/145

και

miR-195/497

(Πίνακας 5). Επειδή ο ρόλος του

miR-195/497

συμπλέγματος δεν είχε αναφερθεί στην π.Χ., επικεντρωθήκαμε σε αυτό για περαιτέρω μελέτες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1,

miR-195

και

Οι miR-497

βρίσκεται μέσα στην ίδια χρωμοσωμική περιοχή (17ρ13.1), 209 bp πέρα.

miR-195

και

miR-497

βρίσκονται σε ένα ιντρόνιο του

MIR497HG

γονίδιο στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 17q13.1, όπου χωρίζονται από 209 bp.

τα επίπεδα έκφρασης του

miR-195

και

miR-497

σε κλινικά δείγματα

Για να επικυρώσετε τα επίπεδα έκφρασης του

ΜΙΚ 195

και

miR-497

σε κλινικά δείγματα, θα υποβληθούν 29 ΣΔ και 20 NBEs να ανακόψει βρόχου RT-PCR. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του

miR-195

και

miR-497

στο ΣΔ ήταν σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες NBEs (

miR-195

: 0,083 ± 0,078 και 1.367 ± 1.178, P & lt? 0,0001?

miR-497

: 0,056 ± 0,058 και 1,928 ± 2,425, P & lt? 0.0001) (Σχήμα 2Α, Β). Είναι ενδιαφέρον ότι ο συντελεστής συσχέτισης Spearman που ελήφθησαν με τη δοκιμασία rank αποκάλυψε μια σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του

miR-195

και

miR-497

στα κλινικά δείγματα (r = 0,984, P & lt? 0.0001) (Σχήμα 2C).

Α, Β) Η έκφραση του

miR-195

και

miR-497

ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε 20 κλινικά δείγματα π.Χ. από ό, τι σε 29 δίπλα noncancerous δείγματα.

RNU48

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. *, P & lt? 0,0001. Γ) Σημαντικές θετική συσχέτιση μεταξύ των προτύπων έκφρασης των miRNAs του

miR-195

και

miR-497

(rank δοκιμασία Spearman του συντελεστή συσχέτισης r = 0,984, P & lt?. 0.0001)

Η

Επίδραση του

miR-195

και

miR-497

επιμολύνσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή, και τις δραστηριότητες μετανάστευσης των κυτταρικών σειρών π.Χ.

για να διερευνήσουν τις λειτουργικές τους ρόλους της αυτά τα miRNAs, πραγματοποιήσαμε μελέτες κέρδος-of-λειτουργία με miRNA επιμολύνσεων. Η δοκιμασία ΧΤΤ έδειξε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε

miR-195

και

miR-497

επιμολύνσεων (αγόρι και Τ24) σε σύγκριση με τις επιμολύνσεις miR-ελέγχου (ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων για BOY : 61.7 ± 1.4, 59.1 ± 0.9, και 100.0 ± 2.2, αντίστοιχα, Ρ & lt? 0,0001? και, για Τ24: 66.0 ± 0.9, 67.7 ± 1.2, και 100.0 ± 2.8, αντίστοιχα, Ρ & lt? 0.0001) (Σχήμα 3Α). Η δοκιμασία Matrigel εισβολής απέδειξε ότι εισβάλλοντας αριθμούς κυττάρων μειώθηκε σημαντικά και στις δύο

miR-195-

και

miR-497

επιμολυσμένα αγόρι και Τ24 κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τους ελέγχους (ποσοστό των κυττάρων εισβολή για το αγόρι: 8.7 ± 3.1, 13.4 ± 1.7, και 100 ± 12.3, αντίστοιχα, κάθε Ρ & lt? 0,0001? και, για Τ24: 64,7 ± 16,2, 36,5 ± 7,5, και 100 ± 18.7, αντίστοιχα, Ρ = 0,009 για το

miR-195

επιμόλυνσης έναντι του ελέγχου, η P & lt? 0,0001 για το em> miR-497

επιμόλυνσης έναντι του ελέγχου

miR-195-

και

miR-497

επιμολυσμένα αγόρι και Τ24 κύτταρα σε σύγκριση με τους ελέγχους (ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος για BOY : 51,2 ± 15,5, 43,9 ± 8,3, και 100 ± 28,7, αντίστοιχα, κάθε P & lt? 0,0001? και για Τ24: 70,1 ± 11,4, 72,3 ± 18,8, και 100 ± 12.6, αντίστοιχα, κάθε P & lt? 0.0001) (Σχήμα 3C).

Αποκτήστε-του-λειτουργία μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρησιμοποίηση

miR-195

και

miR-497

επιμολυσμένα αγόρι και Τ24 σε σύγκριση με τις επιμολύνσεις miR-ελέγχου. Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΧΤΤ. Β) δραστηριότητα κυττάρων εισβολή αποδεικνύεται από την δοκιμασία εισβολή Matrigel. C) δραστηριότητα κυτταρικής μετανάστευσης προσδιορίστηκε με την δοκιμασία επούλωσης πληγών. *, P & lt? 0,0001? **, Ρ = 0,009.

Η

Προβλεπόμενη γονιδίων στόχων και μονοπατιών του καρκίνου του

miR-195/497

σύμπλεγμα

Για να διερευνήσουν τις βιολογικές λειτουργίες του

miR-195/497

συμπλέγματος, πραγματοποιήσαμε

in silico αναλύσεις

χρήση δύο ανεξάρτητων αλγορίθμων, TargetScan και GeneCodis3, και τα δεδομένα έκφρασης δημόσια μικροσυστοιχιών εγκριθεί από GEO. Η ροή εργασίας για

in silico

ανάλυση φαίνεται στο Σχήμα 4. Κατά την πρώτη, η βάση δεδομένων TargetScan ανέφερε ότι 6.730 γονίδια είχαν προβλεφθεί οι στόχοι του

miR-195/497

συμπλέγματος, το οποίο μοιράζεται το ίδιο ακολουθία σπόροι »GCUGCU» στο 3′-αμετάφραστες περιοχές τους (3’UTR).

Ένα σύνολο από 6730 γονίδια που εντοπίστηκαν από τον αλγόριθμο TargetScan. Στη συνέχεια, 113 εμπλουτίζεται σημαντικά μονοπάτια σηματοδότησης ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση των προγραμμάτων KEGG και GeneCodis3. Μεταξύ αυτών, οι εμπλουτισμένες οδοί κορυφή 21 φαίνονται στον Πίνακα S3. Τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων 104 στην κορυφή εμπλουτισμένο οδού (Pathways σε καρκίνο) τελικά αξιολογήθηκαν. Μεταξύ αυτών, 27 υποθετικών γονιδίων στόχων ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε π.Χ. κλινικά δείγματα με βάση τα δεδομένα της έκφρασης της βάσης δεδομένων GEO (αριθμοί πρόσβασης? GSE11783 και GSE31684). (Πίνακας S4)

Η

Με βάση την κατάταξη της οδού KEGG, αυτά γονίδια που εμπλέκονται σε 113 διαβάσεις, και «μονοπάτια του καρκίνου» ήταν η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη (Πίνακας S3). Ένα σύνολο από 104 γονίδια που εμπλέκονται σε αυτή την οδό. Ψάξαμε τα ογκογονίδια που καλύπτεται από τις

miR-195/497

συμπλέγματος βασίζεται στην υπόθεση ότι η υποτιθέμενη ογκογονίδια θα ρυθμίζεται προς τα πάνω σε κλινικά δείγματα που οφείλεται σε ελάττωση της κατασταλτικής του όγκου

miR-195/497

miRNAs . Με τη χρήση της ανάλυσης δεδομένων GEO, 27 γονίδια που επιλέχθηκαν ως

miR-195/497

-regulated ογκογόνων γονιδίων π.Χ. (Σχήμα 5 και Πίνακας S4). Για να επιβεβαιωθεί αυτή η ανάλυση, έχουμε επιλέξει τα κορυφαία δύο απορυθμίζεται γονίδια (

BIRC5

και

WNT7A

), και επικυρώνονται αν αυτές miRNAs ρυθμίζονταν από

miR-195/497

( παρακάτω).

διάγραμμα χάρτη θερμότητας δείχνει την έκφραση της 27 υποψήφια γονίδια που εμπλέκονται στην «Μονοπάτια του καρκίνου» σε 90 δείγματα π.Χ. και έξι γειτονικά δείγματα noncancerous της ουροδόχου κύστης.

η

BIRC5

και

WNT7A

άμεσα ρυθμίζονται από το

miR-195/497

συμπλέγματος στα κύτταρα π.Χ.

Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης του

BIRC5

και

WNT7A

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω στο

miR-195-

και

miR-497-

επιμολυσμένα αγόρι και Τ24 κύτταρα σε σύγκριση με επιμολύνσεις ελέγχου (Σχήμα 6Α, Β).

Α)

BIRC5

και

WNT7A

έκφραση του mRNA 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με

miR-195

,

miR-497

, και το miR-ελέγχου.

GUSB

έκφραση χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Β)

BIRC5

και

έκφραση WNT7A

πρωτεΐνη 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με

miR-195

,

miR-497

, και το miR-ελέγχου.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης. Η αναλογία των

BIRC5

ή

WNT7A

να

GAPDH

έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (ver 1,43?. https://rsbweb.nih.gov/ij/index .html). * P & lt?. 0.01

Η

επόμενο εκτελούνται λουσιφεράσης ρεπόρτερ για να διαπιστωθεί αν

BIRC5

και

WNT7A

mRNA που είχε λειτουργικές θέσεις στόχους για το

miR-195

και

miR-497

π.Χ.. Χρησιμοποιήσαμε ένα φορέα που κωδικοποιεί το 3-‘UTRs του

BIRC5

και

WNT7A

mRNA, συμπεριλαμβανομένων υποθετικές θέσεις στόχους για το

miR-195

και

miR-497

(θέσεις 198-204 και 197-203, αντίστοιχα? Πίνακας S5). Βρήκαμε ότι η ένταση της φωταύγειας μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του στην περιοχή-στόχο του

BRIC5 από

miR-195-

και

miR-497-

επιμολύνσεις (Σχήμα 7Α ). Έχουμε επιτύχει το ίδιο αποτέλεσμα με μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης για την

WNT7A

γονίδιο (Σχήμα 7Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι

miR-195

και

miR-497

δεσμεύεται άμεσα με συγκεκριμένες θέσεις στο 3′-UTR και των δύο

BRIC5

και

WNT7A

mRNA.

ένταση φωταύγεια μετρήθηκε σε

miR-195-

και

miR-497-

επιμολύνσεις σε σύγκριση με το επιμόλυνσης miR-ελέγχου. Α)

miR-195/497

θέσεις δέσμευσης του συμπλέγματος στην 3′-UTR του

BIRC5

mRNA. φορέα δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιείται η κωδικοποίηση 3′-UTR περιοχή του

BIRC5

συμπεριλαμβανομένων των θεωρούμενων

miR-195/497

θέσεις στόχους.

Renilla

λουσιφεράσης τιμές ομαλοποιήθηκαν σε λουσιφεράσης πυγολαμπίδας τιμές. * P & lt? 0,01. Β)

miR-195/497

θέσεις δέσμευσης του συμπλέγματος στην 3′-UTR του

WNT7A

mRNA. Λουσιφεράσης φορέα δοκιμασία ρεπόρτερ είναι η κωδικοποίηση 3′-UTR περιοχή του

WNT7A

συμπεριλαμβανομένων των θεωρούμενων

miR-195/497 Ιστοσελίδα στόχο. * P & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Πιστεύεται ότι miRNAs ρυθμίζουν την έκφραση των περίπου 30% όλων των γονιδίων στο ανθρώπινο γονιδίωμα [29]. Σε φυσιολογικά κύτταρα, η αλληλεπίδραση των miRNAs και αγγελιαφόρο RNA στόχου (mRNAs) ρυθμίζεται αυστηρά, ενώ ο κανονισμός αυτός είναι συχνά λείπει σε καρκινικά κύτταρα. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι οι miRNAs παρεκκλίνοντα εκφράζονται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους και ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους στην έναρξη, την ανάπτυξη, και μετάσταση των καρκίνων αυτών [30]. Ως εκ τούτου, ο εντοπισμός των παρεκκλίνοντα εκφράζονται miRNAs είναι ένα σημαντικό βήμα στην ανάλυση της ανθρώπινης ογκογένεσης. Η τελευταία μέθοδος ανάλυσης σε γονιδιωματική, τεχνολογία βαθύ αλληλουχίας, έχει τη δυνατότητα για την ταυτοποίηση νέων miRNAs ιστο-ειδικούς συμπεριλαμβανομένων και εκείνων σε ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς [31]. τεχνολογία Deep αλληλουχίας είναι σήμερα ο χρυσός κανόνας για την εμπεριστατωμένη ανάλυση της ανθρώπινης miRNAs. Σε αυτή τη μελέτη, βαθιά αλληλουχίας εντόπισε μεγάλο σύνολο των miRNAs που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ π.Χ. και φυσιολογικό επιθήλιο.

Ο καθορισμός των υπογραφών έκφραση miRNAs μπορούν γρήγορα και αξιόπιστα αποκαλύπτουν miRNAs που εκφράζονται ανώμαλα σε καρκίνους. Ως εκ τούτου, έχουμε ήδη αναλύσει υπογραφές έκφραση miRNA με τη χρήση των συστοιχιών που βασίζεται στην PCR και έψαξε για miRNAs καταστολής όγκου σε BC. Με τον τρόπο αυτό, εντοπίσαμε με επιτυχία όγκου κατασταλτικά miRNAs όπως

miR-1

,

miR-133a

,

miR-145

και

miR-218

[18] – [20], [25], [32] – [36]. Συγκρίναμε τα προηγούμενα αποτελέσματα μας με τις υπογραφές βαθιά αλληλουχίας που περιγράφεται εδώ, που μας επιτρέπει να περιλαμβάνουν τα αρχικά δεδομένα που με το νέο της υπογραφής. Μέχρι σήμερα, υπήρξαν τέσσερις μελέτες των υπογραφών έκφρασης π.Χ. miRNA από αναλύσεις βαθιά αλληλουχίας [9] – [12]. Σε δημοσιευμένα στοιχεία,

miR-1

,

miR-145

,

miR-143

,

miR-125b

, και

ΜΙΚ οι 100

έχει καταχωρηθεί ως τα πιο συχνά μειωτικά miRNAs [9] – [12], τα δεδομένα που επιβεβαιώνεται από τη δική μας υπογραφή. Το γεγονός αυτό ενισχύει την αποτελεσματικότητα της βαθιάς υπογραφή αλληλουχίας, και αυτό δείχνει ότι υπάρχουν νέα miRNAs κατασταλτική του όγκου σε αυτά τα νέα δεδομένα. Το πλεονέκτημα αυτής της στρατηγικής είναι να είναι σε θέση να προσδιορίσει νέους υποψηφίους miRNA π.Χ. που δεν έχουν αναφερθεί στο παρελθόν. Βρήκαμε 17 τέτοιες ακολουθίες που θα μπορούσαν να αποτελέσουν νέους υποψηφίους miRNA. Ωστόσο, ανιχνεύθηκαν σε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με γνωστές miRNAs τόσο καρκίνου και καλοήθεις ιστούς. Η λειτουργική σημασία αυτών των νέων υποψηφίων miRNA είναι άγνωστη, και θα είναι σημαντικό στο μέλλον να εξετάσει τη σχέση μεταξύ αυτών των υποψηφίων miRNAs και BC ογκογένεση. Στην παρούσα μελέτη, δεν χρησιμοποιήσαμε ιστού μικρο-ανατομή, επομένως, η ακριβής αναλογία των επιθηλιακών κυττάρων στα φυσιολογικά δείγματα και η ακριβής αναλογία των κυττάρων όγκου στα δείγματα όγκου είναι άγνωστες. Ωστόσο, η λεπτή-πτερύγιο του φυσιολογικού βλεννογόνου της κύστης αποτελούνταν κυρίως από κύτταρα NBE, ενώ τα δείγματα όγκων αποτελούνταν κυρίως των καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων. Ως εκ τούτου, πιστεύουμε ότι η ρύπανση ήσσονος σημασίας των άλλων κυττάρων δεν ήταν σημαντική και δεν επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης των microRNAs.

Τα microRNAs μπορεί να ταξινομηθούν σε οικογένειες με βάση τις αλληλουχίες τους ή σε ομάδες με βάση την γενωμική τόπους τους. είναι συγκεντρωμένα miRNAs μεταγράφονται συντονισμένα και να έχουν παρόμοιες λειτουργίες που ρυθμίζουν τους ίδιους στόχους [37]. Για παράδειγμα, η έκφραση του

miR-1 /133α

διασποράς μειώνεται συχνά διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων π.Χ.. Αυτή η ομάδα λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων στοχεύουν τα ίδια ογκογόνων γονιδίων όπως

TAGLN2

και

PNP

[18] – [23]. Παρόμοια παραδείγματα έχουν αναφερθεί με άλλα συγκεντρωμένα miRNAs όπως

miR-15a /16

και

miR-143/145

[14] – [16], [25] – [28]. Έτσι, αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι συμπλέγματος miRNAs θα μπορούσε να λειτουργήσει σε συνδυασμό για να επιτευχθεί η λειτουργία τους σε όλες τις ίδιες βιολογικές διεργασίες και τα ίδια στοχευμένες γονίδια. Όσον αφορά το

miR-195/497

συμπλέγματος, έχει δειχθεί ότι

miR-195

ήταν προς τα κάτω σε αρκετούς καρκίνους [38] – [40] και ανέστειλε την πρόσληψη γλυκόζης, πολλαπλασιασμό, και του κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση

GLUT3

και

CDK4

π.Χ. [41], [42]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το m

ΙΚ-497

ήταν μειωτικά και λειτούργησε ως καταστολέας όγκου μέσω στόχευσης

BCL2

σε αρκετούς καρκίνους [43], [44]. Η

miR-195/497

σύμπλεγμα λειτούργησε επίσης ως καταστολέας των όγκων με τη στόχευση

RAF1 /CCND1

στον καρκίνο του μαστού [45]. Να επικυρώσει αυτές τις τελευταίες εκθέσεις, αξιολογήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του

miR-195

και

miR-497

σε κλινικά δείγματα π.Χ. και επιβεβαίωσε ότι

miR-195

και

miR-497

ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς όγκων. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λειτουργική σημασία του

miR-195

και

miR-497

π.Χ. χρησιμοποιώντας δύο κυτταρικές σειρές, αγόρι και Τ24. Αποκατάσταση των ώριμων

miR-195

ή

miR-497

σε καρκινικά κύτταρα αποκάλυψε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και τη μετανάστευση. σημερινά δεδομένα μας και οι προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι το

miR-195/497

σύμπλεγμα όντως λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό π.Χ..

miRNAs είναι μοναδικό στην ικανότητά τους να ρυθμίζουν πολλές κωδικοποίησης πρωτεϊνών γονιδίων. Bioinformatic προβλέψεις δείχνουν ότι miRNAs ρυθμίζουν περισσότερο από το 30% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες [29]. Στα καρκινικά κύτταρα, φυσιολογικά miRNA – Τα δίκτυα mRNA διαταράσσεται από έκτροπα που εκφράζονται miRNAs. Έχουμε λάβει τη θέση ότι η ταυτοποίηση νέων μονοπατιών του καρκίνου και υπεύθυνη γονιδίων-στόχων που ρυθμίζονται από την κατασταλτική του όγκου

miR-195/497

συμπλέγματος είναι ένα σημαντικό πρώτο βήμα για την κατανόηση π.Χ. ογκογένεση. Με βάση αυτή την άποψη, εντοπίσαμε μοριακών οδών και ογκογονίδια στόχο που ρυθμίζονται από το

miR-195/497

συμπλέγματος χρησιμοποιώντας δεδομένα γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία και

in silico

ανάλυση. Η

miR-195/497

σύμπλεγμα ανήκει η

miR-15/16/195/424/497

οικογένεια που μοιράζεται το ίδιο 3′-UTR αλληλουχία δέσμευσης σπόρων (AGCAGCA). Η βάση δεδομένων TargetScan εντοπίστηκαν 6.730 γονίδια που ήταν υποψήφιος στόχους του

miR-195/497

συμπλέγματος. Ανάλυση μονοπατιού KEGG έδειξε ότι τα γονίδια που εμπλέκονται σε 113 διαβάσεις, συμπεριλαμβανομένων των «Pathways στον καρκίνο», «σηματοδότηση ΜΑΡΚ», «Ενδοκυττάρωση», «σηματοδότηση της ινσουλίνης» και «σηματοδότηση Wnt».

Ανάμεσα σε αυτά τα μονοπάτια, έχουμε επικεντρώθηκε στην «Pathways στον Καρκίνο», λόγω της άμεσης συνάφειάς τους. Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, γονίδια στόχους του

miR-195/497

θα πρέπει να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκινικά κύτταρα. Όταν εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων 104 στην ομάδα «Pathways στον καρκίνο», 27 γονίδια ρυθμίζεται αυξητικά σε κλινικά δείγματα π.Χ., υποδηλώνοντας ότι αυτά τα γονίδια ήταν υποψήφιος

miR-195/497

στόχους και λειτούργησε ως ογκογονίδια σε Π.Χ. Για να επιβεβαιωθεί η αξιοπιστία του μας

in silico

ανάλυση των πιθανών γονιδίων στόχων, ελέγξαμε εάν

BIRC5

και

WNT7A

γονίδια, στην πραγματικότητα διέπεται από το

ΜΙΚ 195/497

σύμπλεγμα π.Χ.. απέδειξαν τα δεδομένα μας ότι

BIRC5

και

WNT7A

άμεσα ρυθμίζονται από το

miR-195/497

σύμπλεγμα π.Χ..

BIRC5

είναι μέλος του αναστολέα της απόπτωσης (ΙΑΡ) της οικογένειας κατά προτίμηση εκφράζεται με πολλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων π.Χ. [46]. Μπορεί να μετρηθεί στα ούρα σε επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης, και τα ούρα

BIRC5

αναφέρθηκε ως διαγνωστικό βιοδείκτη για BC [47]. Πρόσφατες μελέτες από άλλες ομάδες έχουν δείξει ότι πολλές microRNAs όπως

miR-542-3p

,

miR-218

,

miR-708

και

miR-203

αναστέλλεται άμεσα

BIRC5

έκφραση σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου [48]. Η μελέτη μας είναι η πρώτη που δείχνουν ότι

BIRC5

μπορεί να ρυθμίζεται από το

miR-195/497

συμπλέγματος στα κύτταρα. π.Χ. Ως εκ τούτου, η στρατηγική μας για τον εντοπισμό νέων όγκου-κατασταλτικό, miRNA-ρυθμίζονται μοριακούς στόχους /οδούς π.Χ. είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για την έρευνα miRNA-καρκίνου.

Συμπεράσματα

Εν ολίγοις, κατασκευάσαμε την έκφραση των miRNAs υπογραφές των κλινικά δείγματα π.Χ. χρησιμοποιώντας βαθιά αλληλουχίας ως χρυσός κανόνας μέθοδο. Ένα σύνολο από 60 miRNAs ήταν σημαντικά μειωμένη σε δείγματα π.Χ.. Εντοπίσαμε πολλά μειωτικά miRNAs που βρίσκονταν μέσα στην ίδια γονιδιωματική περιοχή αποτελεί ένα σύμπλεγμα miRNA, συμπεριλαμβανομένων των

miR-1 /133α

,

miR-143/145

,

miR-99α /ας-7c

,

miR-195/497 και miR-144 /451Α

. Προς τα κάτω ρύθμιση του

miR-195/497

cluster ήταν ένα συχνό συμβάν σε κλινικά δείγματα. Π.Χ. Αποκατάσταση αυτών των miRNAs ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, γεγονός που υποδηλώνει ότι

miR-195/497

λειτουργούν ως καταστολείς των όγκων π.Χ.. Η ανάλυσή μας από το

miR-195/497

σύμπλεγμα πρότεινε ότι ρυθμιζόμενη μονοπάτια υποθετικό καρκίνο και ογκογόνο γονίδια. Αυτά τα ευρήματα θα συμβάλει στην ανάλυση του BC ογκογένεσης. Προσδιορισμός του όγκου-κατασταλτικό

miR-195/497

συμπλέγματος σε ανθρώπινο π.Χ. μπορούσε να παρέχει νέες πληροφορίες σχετικά με πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για τη θεραπεία της. Π.Χ.

Υλικά και Μέθοδοι

κλινικά δείγματα και κυτταρικής καλλιέργειας

δείγματα ιστών για miRNA διαλογή χρησιμοποιώντας βαθιά αλληλουχίας ελήφθησαν από πέντε ασθενείς π.Χ. και πέντε NBEs. ασθενείς π.Χ. είχαν υποβληθεί σε κυστεκτομή ή διουρηθρική εκτομή των όγκων της ουροδόχου κύστεως (TUR-BT) στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Καγκοσίμα μεταξύ του 2003 και του 2010. Πέντε NBEs προήλθαν από ασθενείς με ασθένειες μη-BC. Αριθ μόλυνση των καρκινικών κυττάρων ανιχνεύθηκε με παθολόγους. Μια άλλη σειρά από 29 ΣΔ και 20 NBEs ελήφθησαν από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Καγκοσίμα μεταξύ του 2003 και του 2010. Αυτή η ομάδα υποβλήθηκε σε πραγματικό χρόνο RT-PCR για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs. Τα δείγματα οργανώθηκαν σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης των όγκων-κόμβο-μετάσταση της μεικτής επιτροπής Αμερικής για τον Καρκίνο /Ένωσης Internationale Contre le Καρκίνου (UICC) και ιστολογικά βαθμολογούνται [49]. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη μας εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής του Πανεπιστημίου Καγκοσίμα. Τα υπόβαθρα των ασθενών και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά συνοψίζονται στους Πίνακες 1 και 6.

Η

Χρησιμοποιήσαμε δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές π.Χ: BOY, η οποία ιδρύθηκε το εργαστήριο μας από μια ασιατική άνδρα ασθενή, 66 ετών , ο οποίος είχε διαγνωστεί με σταδίου ΙΙΙ π.Χ. με μετάσταση στους πνεύμονες? και, Τ24, η οποία ήταν επεμβατική και ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα στους 37 ° C.

συλλογή ιστού και RNA εκχύλιση

δείγματα ιστού βυθίστηκαν σε RNAlater (QIAGEN, Valencia, CA, USA) και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι διεξήχθη εκχύλιση RNA. Ολικό RNA, συμπεριλαμβανομένων των miRNA, εξήχθη από το κατεψυγμένο φρέσκο ​​ιστούς χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ακεραιότητα του RNA ελέγχθηκε με το RNA 6000 Nano Assay Kit και 2100 Bioanalyzer ™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

Μικρές προετοιμασία της βιβλιοθήκης RNA και προφίλ από βαθιά αλληλουχίας

Σύνολο RNAs από πέντε ΣΔ και πέντε NBEs υποβλήθηκαν σε βαθιά αλληλουχίας. Η πειραματική διαδικασία περιελάμβανε τα ακόλουθα στάδια: μικρό απομόνωση RNA, παρασκευή βιβλιοθήκης cDNA, και αλληλούχιση. Ολικό RNA από κάθε δείγμα κλασματώθηκε κατά μέγεθος επί 15% πήκτωμα PAGE, και ένα κλάσμα 18-30 νουκλεοτιδίων συλλέχθηκε. Ο προσαρμογέας 5′-RNA συνδέθηκε με το RNA με Τ4 RNA. Το συνδεδεμένο RNA κλασματώθηκε βάσει μεγέθους, και το κλάσμα 36-50 νουκλεοτιδίων αποκόπηκε. Ο προσαρμογέας 3′-RNA στη συνέχεια συνδέθηκε προς καταβυθισθέν RNA χρησιμοποιώντας Τ4 RNA. Το συνδεδεμένο RNA κλασματώθηκε βάσει μεγέθους, και το 62-75 νουκλεοτιδίων κλάσμα (μικρά RNA + προσαρμογείς) αποκόπηκε. Πίνακας S1. Πίνακας S2. Πίνακας S3. Πίνακας S4. Πίνακας S5.