Abstract

ZBRK1, μία πρωτεΐνη δακτύλου ψευδαργύρου που αλληλεπιδρά με τον καρκίνο του μαστού 1 (BRCA1) και KRAB-ZFP πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1 (KAP1), έχει προταθεί να χρησιμεύσει ως καταστολέας όγκου μέσω καταστολής του όγκου μετάσταση /εισβολή. Μέχρι σήμερα, οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί για τον τρόπο συμμετοχής BRCA1 και KAP1 σε ZBRK1 μεσολάβηση μεταγραφική καταστολή, μετάσταση και εισβολή, καθώς και των συνδεδεμένων κλινική σημασία παραμένουν ασαφείς. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι τόσο η Ν- και Ο-τερματικά πεδία του ZBRK1 είναι σημαντικά για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Συγκεκριμένα, το Ν-τερματικό πεδίο του KRAB ZBRK1 εμφανίζεται πιο κρίσιμο ρόλο στην αναστολή της μετάστασης και εισβολής μέσω διαμόρφωσης της λειτουργίας KAP1 σε μεταγραφικά εξαρτώμενο τρόπο. Η απώλεια ZBRK1 οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης KAP1, η οποία ενισχύεται μετανάστευση και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων τόσο η

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μια αντίστροφη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης μεταξύ ZBRK1 και KAP1 εξής εξέλιξης του όγκου από καρκίνωμα in situ σε επεμβατικές /μεταστατικό δείγματα καρκίνου του τραχήλου. Στο σύνολό τους, τα σημερινά αποτελέσματα δείχνουν ότι η απώλεια των ZBRK1 συμβάλλει στην αυξημένη έκφραση των KAP1, ενισχυτικά της ρόλο για την ενίσχυση της μετάστασης και εισβολής

Παράθεση:. Lin LF, Li CF, Wang WJ, Yang WM, Γουάνγκ DD-Η, Chang WC, et al. (2013) Απώλεια ZBRK1 συμβάλλουν στην αύξηση της KAP1 και προωθεί KAP1 Μεσολαβεί μετάσταση και εισβολή στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας. PLoS ONE 8 (8): e73033. doi: 10.1371 /journal.pone.0073033

Επιμέλεια: Yves St-Pierre, INRS, Καναδάς

Ελήφθη: 3 Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 16 του Ιούλη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από NSC επιχορήγηση 101-2320-B-006-020-my3 και Εθνική Cheng Kung University επιχορήγηση ορόσημο C007 (Ταϊβάν). Ταμείο για τη δημοσίευση της Ανοικτής Πρόσβασης που παρέχονται από τον NSC επιχορήγηση 101-2320-B-006-020-my3. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κακοήθεια του καρκίνου προέρχεται από την ικανότητά της να εισβάλει και να μεταστάσεις γειτονικές και άπω ιστών, με αποτέλεσμα την τοπική και συστηματική αποτυχίες οργάνων. Η μετάσταση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που απαιτεί συχνά τα καρκινικά κύτταρα να ξεφύγουν από το καρκινικό όγκο, εισβάλλουν μέσω της εξωκυττάριας μήτρας, και υφίστανται ενδαγγείωση στην κυκλοφορία του αίματος ή το λεμφικό κυκλοφοριακό σύστημα, που ακολουθείται από εξαγγείωση και είσοδος σε απομακρυσμένα όργανα, επιτρέποντας την ανάπτυξη μικρομεταστάσεων [1]. Πολλές πτυχές αυτής της περίπλοκης διαδικασίας είναι προς το παρόν άγνωστη, όπως το γονίδιο εκφράσεις των καλά χαρακτηρισμένων μεταστατικό καταστολείς.

Περισσότερα από 700 πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου έχουν ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο. πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου προσδένονται σε ειδικές αλληλουχίες DNA και ενεργοποιήστε τα γονίδια ή να απενεργοποιήσετε. Σχεδόν το ένα τρίτο των πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου θηλαστικών έχουν εξαιρετικά συντηρημένη Kruppel σχετιζόμενη κουτί (KRAB) μοτίβο. Οι λειτουργίες των πρωτεϊνών δακτύλου ΚΚΑΒ-ψευδαργύρου διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των ειδών στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ειδικά για εκείνους που εμπλέκονται στη μεταγραφική δραστηριότητες καταστολής. Ανθρώπινη ZBRK1 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας που περιέχει ένα Ν-τερματικό τομέα KRAB, οκτώ διαδοχικές δακτύλους ψευδαργύρου C2H2, και ένα BRCA1 εξαρτώμενη C-τελική περιοχή μεταγραφικής καταστολής (CTRD) [2]. ZBKR1 έχει τη δυνατότητα να ρυθμίζει διαφορετικά κατάντη γονίδια από την αλληλεπίδραση με μια διαφορετική ομάδα των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, αναφέρθηκε ότι ZBRK1 μπορούν να αναστείλουν την έκφραση του γονιδίου 1 αγγειοποιητίνη μέσω αλληλεπίδρασης με μεταγραφική συγκαταστολείς, CtIP και BRCA1 [3]. Επιπλέον, KAP1 αλληλεπιδρά με ZBRK1 μέσω της Ν-τερματικό πεδίο του KRAB ZBRK1. ZBRK1 και KAP1 συμβάλλουν επίσης στην αποτελεσματικότητα αντιγραφής oriLyt μέσω BBLF2 /3 αλληλεπίδραση [4]. Μέχρι σήμερα, οι λεπτομερείς μηχανισμοί και οι σχετικές κυτταρικές λειτουργίες των αλληλεπιδράσεων του ZBRK1 με αυτές τις πρωτεΐνες παραμένουν ανεξερεύνητες

Η κύρια αλληλουχία αμινοξέων της KAP1 περιέχει αρκετά συντηρημένα μοτίβα:. Ένα δάχτυλο RING, Β-κουτιά, ένα διπλής ελίκωσης περιοχής, ένα δάχτυλο PHD και μια περιοχή βρωμο. Το δάκτυλο RING, Β-κουτιά, και σπειραμάτων ονομάζονται συλλογικά τον τομέα RBCC, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι επαρκής για τη μονάδα ομο-ολιγομερισμό και KRAB καταστολή δεσμευτικός [5,6]. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι KAP1 συνδέεται με τις πρωτεΐνες που περιέχουν KRAB και διευκολύνει KRAB-πρωτεΐνη που περιέχει τη μεσολάβηση μεταγραφική καταστολή. Επιπλέον, KAP1 λειτουργεί επίσης ως ένα μοριακό ικρίωμα για τη ρύθμιση δομή χρωματίνης, μέσω της αλληλεπίδρασης με Mi-2α, ένα συστατικό της δεακετυλάσης NuRD ιστόνης συγκρότημα [7], μεθυλτρανσφεράση SETDB1 [8] ή πρωτεΐνη ετεροχρωματίνη 1 (ΗΡ1) μέλη της οικογένειας [9 , 10]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε KAP1 να συμβάλλει στην αναστολή της E2F1 απόπτωσης που διαμεσολαβείται [11] και συσχετίζεται στενά με κακή πρόγνωση σε γαστρικό καρκίνο [12]. Επιπλέον, KAP1 περιγράφηκε ως παίζουν ένα ρόλο στην ινοβλαστών-ειδική πρωτεΐνη 1 μεσολάβηση επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [13]. Παρά αυτές τις πρόσφατες προσπάθειες για τη διευκρίνιση κυτταρικές λειτουργίες της και τις συναφείς μοριακοί μηχανισμοί, οι ρόλοι των KAP1 στην ογκογένεση παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες.

προηγούμενη μελέτη μας δείχνει ότι ZBRK1 δρα ως καταστολέας μεταστατικό και ότι η απώλεια της ZBRK1 ενισχύει τη μεταγραφή MMP9 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [14]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώνουμε ότι η έκτοπη έκφραση της KAP1 σε κύτταρα HeLa αυξάνει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων /εισβολή. Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη άμεση απόδειξη για να αποδείξει ότι KAP1 έχει τη δυνατότητα να προωθήσει τη μετάσταση των όγκων και

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, ZBRK1 καταστέλλει αυτή τη διαδικασία με την πρόσληψη BRCA1 μέσω αλληλεπίδρασης C-τερματικό και αναστέλλοντας KAP1 μεταγραφική δραστηριότητα. Επιπλέον, στις κολπικών δειγμάτων καρκίνου που εμείς επικυρωθεί, τα επίπεδα έκφρασης του ZBRK1 αντιστρόφως ανάλογη με την απώλεια της KAP1. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ZBRK1 χρησιμεύει για την αναστολή της μετάστασης όγκου και εισβολή του καρκίνου του τραχήλου μέσω διαμόρφωσης του KAP1.

Αποτελέσματα

KAP1 και BRCA1 αλληλεπίδρασε με τα Ν- και C-τελικές περιοχές, αντίστοιχα , του ZBRK1

Προηγουμένως, βρήκαμε ότι ZBRK1 δρα ως καταστολέας όγκου, την αναστολή του πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης, εισβολή και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [14]. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, KAP1 και BRCA1 αλληλεπιδρούν με τα Ν- και Ο-τερματικά πεδία, αντίστοιχα [15,16], του ZBRK1. Ήμασταν ενδιαφέρονται ειδικά για την κατανόηση των λειτουργικών συνεισφορές αυτών των αλληλεπιδράσεων για την καταστολή των όγκων. Εκτιμήσαμε πρώτα την εξειδίκευση δέσμευσης KAP1 και BRCA1 προς άγριου-τύπου ή κολοβωμένη ZBRK1 χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι KAP1 και BRCA1 πράγματι ειδικά αλληλεπίδρασε με τα Ν- και C-τελικές περιοχές, αντίστοιχα, των ZBRK1 σε κύτταρα HeLa (Εικόνα S1 και Εικόνα 1Α).

Α, Η in vivo αλληλεπίδραση μεταξύ ZBRK1 και KAP1. Τα προϊόντα λύσης κυττάρων HeLa που εκφράζουν σταθερά EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) ή EGFP-συντηγμένο κολοβωμένη ZBRK1s (GZBDK και GZBDZ) ανοσοκατακρημνίστηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ΟΡΡ Ab (Roche). Ανοσοκαταβυθισμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν από την πρώτη βρασμού εντός ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS και στη συνέχεια διαχωρισμό σε ένα πήκτωμα 10% SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανάλυση ανοσοστυπώματος με ένα αντίσωμα αντι-KAP1 (Bethyl Laboratories) για την ανίχνευση KAP1 ή με ένα αντι-ΟΡΡ Ab για την ανίχνευση GFP . Β, ακρωτηριασμένες Ν- ή C-άκρο της ZBRK1 χάνει την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη.

Αριστερά

, ίσοι αριθμοί σταθερών κύτταρα HeLa που εκφράζουν EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) ή EGFP-συντηγμένο κολοβωμένη ZBRK1s (GZBDK και GZBDZ) σπάρθηκαν να αξιολογήσει την ανάπτυξη με βαφή κρυσταλλικού ιώδους. Ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε στους χρόνους που υποδεικνύονται.

Δεξί

, η έκφραση του ZBRK1 και των μεταλλάξεών της σε κύτταρα HeLa αναλύθηκε με στύπωμα Western. C, ακρωτηριασμένες Ν- ή C-άκρο της ZBRK1 χάνει την ικανότητα να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό. Μια δοκιμασία σχηματισμού εστίαση διεξήχθη χρησιμοποιώντας διάφορες σταθερές κυτταρικές σειρές HeLa.

Στήλες

, να επικεντρωθούν οι αριθμοί?

μπαρ

, μέση τιμή ± SD. **

σ

Το εργαστήριο αυτή τη στιγμή ενεργά τις απαντήσεις σε αυτές τις ερωτήσεις.

Έχουν υπάρξει κάποιες προκαταρκτικές μελέτες που διερευνούν πώς επιγενετικές καθοριστικούς παράγοντες μπορεί να επαναπρογραμματίσει την έκφραση των γονιδίων σε σχέση με την μετάσταση του καρκίνου. Για παράδειγμα, η Polycomb πρωτεΐνη ομάδα ΕΖΗ2 καταλύει τροποποιήσεις των ιστονών, προωθεί την μεθυλίωση του DNA, και αποτελεί προγνωστικό δείκτη της διεισδυτικής ανάπτυξης στον μεταστατικό του προστάτη και του μαστού [23,24]. Επίσης, η ενεργοποίηση του συμπλέγματος β-κατενίνης reptin χρωματίνη αναδιαμόρφωση οδηγεί σε αποσιώπηση του γονιδίου καταστολέα μετάστασης

KAI1

[25]. KAP1 προηγουμένως ταυτοποιήθηκε ως ένα μοριακό ικρίωμα να ρυθμίσει τη δομή της χρωματίνης μέσω της αλληλεπίδρασής της με Mi-2α, ένα συστατικό της αποακετυλάσης ιστόνης NuRD συγκρότημα [7]? μεθυλοτρανσφεράση SETDB1 [8]? και ετεροχρωματίνη protein1 (Θ1) της οικογένειας [9,10], καθιστώντας KAP1 το πρώτο δυναμικό επιγενετική τακτική που προωθεί μετάσταση των κυττάρων. Αυτή η ανακάλυψη δικαιολογεί την ταυτοποίηση των συστατικών στο KAP1 μεσολάβηση συγκρότημα που συμμετέχει στην προαγωγή της μετάστασης.

Σε αυτή την εργασία, αποδείξαμε ότι KAP1 έχει την ικανότητα να προάγει τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, KAP1 μπορεί να προωθήσει την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Έχουμε αποκάλυψε επίσης μια νέα λειτουργία του ZBRK1 σαν ένας μεταγραφικός καταστολέας του γονιδίου KAP1. Κλινικής σημασίας, παρατηρήσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης των ZBRK1 μειώθηκαν σημαντικά, ενώ τα επίπεδα της KAP1 αυξήθηκαν σημαντικά στην επιθετική δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ZBRK1 χρησιμεύει ως καταστολέας της μετάστασης του καρκίνου με γονίδια διαμόρφωσης μετάσταση συνδέονται μέσω της μεταγραφικής καταστολής του KAP1.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα όγκων

Η επιτροπή δεοντολογίας του Chi Mei Ιατρικό Κέντρο (Ταϊνάν, Ταϊβάν) είχε εγκρίνει τη μελέτη με τη χρήση φορμόλης-σταθερό ιστό του καρκίνου του τραχήλου της μελέτης αυτής (IRB100-11-009). Διαθέσιμο μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη ανακτήθηκαν από 10 in-situ καρκινώματα (CIS) [26], 15 διηθητικά καρκινώματα, και κομβικών μεταστάσεις άλλα 10 διηθητικά καρκινώματα, καθώς και 10 μη-όγκου του τραχήλου της μήτρας επιθηλιακά δείγματα. Η επιτροπή δεοντολογίας μας έχει εγκριθεί για τη λήψη δειγμάτων από μας (Chi-Mei Medical Center) Βιοτράπεζας. Κατά κανόνα, όλα τα δείγματα πρέπει να είναι εγγεγραμμένοι μόνο με συμφωνίες των ασθενών και με ολοκληρωμένες ενημερωμένη συγκατάθεση. Από τα δείγματα στη συνέχεια αποσυνδέεται με αναγνωρίσιμες προσωπικές πληροφορίες τους, περαιτέρω ενημερωμένη συγκατάθεση δεν μπορεί να είναι διαθέσιμη και να μην είναι απαραίτητη.

Cell Culture και σταθερές κυτταρικές σειρές Ίδρυση

Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε πλήρη μέσο που περιέχει ϋΜΕΜ, 5% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 g /mL στρεπτομυκίνης και 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλίνης.