Αφηρημένο

Ιστορικό

κερατινοκυττάρων αυξητικού παράγοντα των υποδοχέων (ΚΟΡΚ) είναι μια παραλλαγή ματίσματος του γονίδιο FGFR2 που εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα. Η ενεργοποίηση του KGFR είναι ένας βασικός παράγοντας για την ρύθμιση των φυσιολογικών διεργασιών στα επιθηλιακά κύτταρα όπως πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση και επούλωση των πληγών. Μεταβολές του KGFR σηματοδότηση έχουν συνδεθεί με την παθογένεση διαφόρων επιθηλιακών όγκων. Έχει επίσης υποτεθεί ότι η ειδικό συνδετήρα του, KGF, θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη της αντίστασης σε 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) σε επιθηλιακούς καρκίνους και ταμοξιφένη σε οιστρογόνο καρκίνους του μαστού θετικό.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA μορφομετατράπηκε εντός κερατινοκυττάρων ανθρώπινη κυτταρική σειρά (HaCaT), καρκίνος μαστού κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται (MCF-7) και μία κύρια καλλιέργεια κερατινοκυττάρων (KCS) για να προκληθεί επιλεκτική ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης KGFR. Μια ισχυρή και εξαιρετικά ειδική μείωση της έκφρασης KGFR παρατηρήθηκε τόσο σε RNA (μείωση = 75,7%,

P

= 0.009) και στο επίπεδο της πρωτεΐνης. KGFR σιγήσει κύτταρα έδειξαν μειωμένη ανταπόκριση στη θεραπεία KGF όπως αξιολογείται με μέτρηση ρυθμό πολλαπλασιασμού (14,2% έναντι 39,0% των κυττάρων ελέγχου,

P

& lt? 0.001) και την κυτταρική μετανάστευση (24,6% έναντι 96,4% του ελέγχου κύτταρα,

P

= 0,009). Σε κύτταρα ψευδο-επιμολυσμένα MCF-7, KGF εξουδετερώνει την ικανότητα της 5-FU να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ σε KGFR σιγήσει κύτταρα KGF παρεμβαίνει ασθενώς με 5-FU αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα (11,2% έναντι 28,4% των κυττάρων ελέγχου,

P

= 0,002). Η ικανότητα της 5-FU να επάγει κυτταρικό θάνατο, καταργείται με την ταυτόχρονη αγωγή με KGF, ενώ σε KGFR σιγήσει κύτταρα 5-FU επάγει αποτελεσματικά κυτταρικό θάνατο ακόμα συνδυαστούν για KGF, όπως προσδιορίζεται με την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Ομοίως, η ικανότητα του να αναστέλλει ταμοξιφένης MCF-7 και ο πολλαπλασιασμός KCs θα μειωθεί κατά πολύ με κατεργασία με KGF και είναι πλήρως αποκατασταθεί KGFR σιγήσει κύτταρα (12,3% έναντι 45,5% των κυττάρων ελέγχου,

P

& lt? 0.001) .

Συμπεράσματα /Σημασία

τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η εκλεκτική αναστολή του μονοπατιού ΚΟΡ /ΚΟΡΚ μπορεί να παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας των θεραπευτικών στρατηγικών για ορισμένες επιθηλιακών όγκων.

Παράθεση: Rotolo S, Ceccarelli S, Romano F, Frati L, Marchese C, Angeloni A (2008) κατασιγάσει του αυξητικό παράγοντα κερατινοκυττάρων Υποδοχέων Επαναφέρει 5-φθοριοουρακίλη και Tamoxifen αποτελεσματικότητα σε Responsive καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 3 (6): e2528. doi: 10.1371 /journal.pone.0002528

Συντάκτης: Stefan Maas, Πανεπιστήμιο Lehigh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 14, 2008? Αποδεκτές: 27 του Μαΐου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιουνίου 2008

Copyright: © 2008 Rotolo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει χρηματοδοτήθηκε από το MIUR, Cofin 2005, και από την επιχορήγηση Regione Lazio εκδοθεί για Progetto di Ricerca Finalizzata 2005. οι χρηματοδότες δεν ήταν άμεσα ούτε έμμεσα εμπλέκονται στο σχεδιασμό ή τη διεξαγωγή της μελέτης σε οποιοδήποτε μέρος.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα : Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κερατινοκυττάρων ανάπτυξη υποδοχέα του παράγοντα (ΚΟΡΚ /FGFR2-IIIb) είναι μια πρωτεϊνική κινάση της τυροσίνης που ανήκει στην οικογένεια του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών. υποδοχείς (FGFRs). KGFR αντιπροσωπεύει μία παραλλαγή μεταγραφής ματίσματος του γονιδίου FGFR2 και εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα διαφόρων οργάνων. Η εναλλακτικά ματισμένες ισομορφή, που είναι γνωστή ως FGFR2-IIIc, βρίσκεται σε κύτταρα μεσεγχυματικής γραμμώσεων [1], [2]. KGFR παίζει ένα ρόλο κλειδί στον έλεγχο της επιθηλιακής ανάπτυξης και διαφοροποίησης, διεξαγωγή βιολογικές επιδράσεις του σε ένα παρακρινή τρόπο [3] μέσω της υψηλής συγγένειας σύνδεσης προς ειδικούς συνδετήρες, δηλαδή αυξητικός παράγοντας κερατινοκυττάρων (KGF /FGF7), FGF 10 και FGF22 [4 ]. Μεταξύ αυτών, ο KGF δρα όχι μόνο ως ένα ισχυρό μιτογόνο για πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα, αλλά και προωθώντας πρόγραμμα διαφοροποίησή τους [5] και την προστασία τους από επαγωγή απόπτωσης [6], [7]. Επιπλέον, ο KGF εμπλέκεται τόσο πειραματικά [8], [9] και

in vivo

[10] μοντέλα επούλωσης τραυμάτων, την τόνωση μετανάστευση των κερατινοκυττάρων [11], [12] και την επαγωγή αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, ως εκ τούτου αύξηση των επιθηλιακών κυττάρων κινητικότητα [13].

Πρόσφατα, υπήρξε αυξανόμενο ενδιαφέρον για τον πιθανό ρόλο των μεταβολών των ΚΟΡ /ΚΟΡΚ σηματοδότησης σε επιθηλιακά ογκογένεση. Αυξημένη έκφραση KGFR mRNA έχει ανιχνευθεί σε ένα ευρύ φάσμα όγκων επιθηλιακής προέλευσης, όπως του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του παγκρέατος και του προστάτη. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως αυξημένη έκφραση φαίνεται να συνδέεται με το μετασχηματισμό των κυττάρων και, ίσως, κακοήθη εξέλιξη [14]. Επιπλέον, η χορήγηση KGF έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν την κυτταρική κινητικότητα σε υποδοχέα οιστρογόνου (ER) -θετικό καρκινικά κύτταρα του μαστού [15], [16], να δυνητικά εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του μαστού και τη μετάσταση [17] και για την ενίσχυση της επεμβατική δυναμικό της γαστρικό καρκίνωμα προέρχεται κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν KGFR [18].

Άλλες μελέτες οδήγησαν στην υπόθεση ότι ο KGF μπορεί να ασκήσει αντιαποπτωτικών δραστικότητα επί ορισμένων καρκινικών κυττάρων όπως επίσης και αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από το χημειοθεραπευτικό φάρμακο 5-φθοροουρακίλη (5-FU ) [19] – [22]. Η ανάπτυξη από τα καρκινικά κύτταρα της αντοχής σε παραδοσιακούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως 5-FU, συχνά παρατηρείται και παραμένει ένα μεγάλο εμπόδιο στην επιτυχή θεραπεία του καρκίνου και μια εξέχουσα αιτία της υποτροπής του όγκου μετά από χημειοθεραπεία [23].

Επιπλέον, έχει προταθεί ότι οι μεταβολές των οδών που περιλαμβάνουν FGFs και των ομώνυμων υποδοχέων μπορεί να αντιπροσωπεύουν έναν από τους μηχανισμούς αντίστασης στην ταμοξιφένη που αναπτύσσεται τελικά σε πολλές ER-θετικά καρκίνους του μαστού [24] – [27]. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση δεν έχει εξακριβωθεί πλήρως και το συγκεκριμένο ρόλο που διαδραμάτισε η μεγάλη οικογένεια των FGFs είναι μακριά από το να γίνει κατανοητό.

Η προσέγγιση που βασίζεται στην επιλεκτική ρύθμιση προς τα κάτω των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε κυτταρικές διεργασίες συσχετίζονται με την εξέλιξη του όγκου αντιπροσωπεύει ένα υποσχόμενη σύνορα για τη θεραπεία του καρκίνου. Η επιμόλυνση των συγκεκριμένων μικρών RNAs παρεμβολής (siRNAs) είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την επίτευξη ενός γονιδίου-ειδικό knockdown και αντιπροσωπεύει μια ισχυρή θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία πολλών ασθενειών, όπως ιογενείς λοιμώξεις, νευρολογικές διαταραχές και καρκίνους [28].

Η αποκλειστική εξειδίκευση στόχος του siRNA κατά mRNAs ασθένειες σχετικές αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιοποίηση αυτής της τεχνολογίας. Σε αυτή τη μελέτη, επιλεκτικά μειωτικά KGFR mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε τρεις επιθηλιακές κυτταρικές γραμμές, HaCaT κερατινοκύτταρα, MCF-7 κυττάρων καρκίνου του μαστού και πρωτογενών καλλιεργημένων κερατινοκυττάρων (KCS), από μία νέα προσέγγιση του siRNA σχεδιασμού, με βάση την χρησιμοποίηση του Dicer ενδονουκλεάσης υπόστρωμα dsRNAs 27-mer για να προκαλέσει παρεμβολή RNA (RNAi). Αυτή η τεχνική παρέχει αυξημένη αποτελεσματικότητα και μεγαλύτερη διάρκεια της RNAi σε σύγκριση με τις παραδοσιακές 21-μερές siRNAs, που επιτρέπει τη χρήση χαμηλότερων συγκεντρώσεων RNAi σε κύτταρα-στόχους, το οποίο μειώνει σημαντικά τις παρενέργειες. Επιπλέον, επιτρέπει τη στόχευση των sites που είναι ανθεκτικοί σε καταστολή με 21-μερές siRNAs [29].

Εμείς ανέλυσε τα αποτελέσματα της ΚΟΡΚ siRNA σχετικά με τα χαρακτηριστικά βιο-παραμέτρους, όπως η βιωσιμότητα των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και τη μετανάστευση των δοκιμαζόμενων κυτταρικών σειρών. Τέλος, αξιολογήσαμε κατά πόσο η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης KGFR είναι ικανή να αναστείλει 5-FU και tamoxifen αντίσταση που προκαλείται από KGF σε καλλιέργειες κυττάρων.

Αποτελέσματα

Αναστολή της έκφρασης KGFR mRNA με siRNAs

Δεν υπάρχουν σαφείς κανόνες που διέπουν siRNA επιλογή του τόπου-στόχου για συγκεκριμένες ακολουθίες mRNA. Ωστόσο, μέσα σε μια απλή αλληλουχία mRNA διαφορετικά μόρια siRNA δείχνουν μια δραματική μεταβλητότητα όσον αφορά την αποτελεσματικότητα και την ειδικότητα του γονιδιακή σίγηση. Εδώ χρησιμοποιήσαμε εργαστηριακά και web-based προγράμματα, σύμφωνα με τις περιγράφηκε προηγουμένως κριτήρια (https://www.rockefeller.edu/labheads/tuschl/sirna.html), για να επιλέξετε τρεις siRNAs αλληλουχίες που στρέφονται κατά του γονιδίου FGFR2. Είναι γνωστό ότι οι ίδιες γονίδιο κωδικοποιεί για δύο εναλλακτικές μεταγραφές, που ορίζεται ως KGFR /FGFR2-IIIb και FGFR2-IIIc, που διαφέρουν για αποκλίνουσα επιμήκυνση 49 αμινοξέων στο εξωκυτταρικό τομέα τους και εμφανίζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά σύνδεσης-συνδετήρα. Έτσι, για να πραγματοποιήσει μια συγκεκριμένη knockdown της μεταγραφής KGFR, επιλέξαμε siRNAs αλληλουχίες στοχευμένων εντός του εξονίου 8 του FGFR2 γονίδιο, το οποίο ματίζεται μόνο στην ισομορφή KGFR (Εικ. 1Α). Όλες οι αλληλουχίες siRNAs εισήχθησαν σε μια αναζήτηση BLAST για να εξασφαλιστεί ότι δεν υπήρχε σημαντική ομολογία με άλλα γονίδια. Ως σχετικά με την σχετική έκφραση των δύο ισομορφών FGFR2 σε πειραματικά μοντέλα μας, κύτταρα HaCaT έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι εκφράζουν την παραλλαγή FGFR2-IIIc του FGFR2 σε δύο τάξεις μεγέθους μικρότερο ποσό από το παραλλαγή FGFR2-IIIb ματίσματος [30]? σε κύτταρα MCF-7, που έχει προηγουμένως δειχθεί ότι εκφράζουν και τις δύο ισομορφές [31], αποδείξαμε ότι η έκφραση FGFR2-IIIb είναι κατά πολύ υψηλότερη από εκείνη των FGFR2-IIIc (11 φορές αύξηση) (Σχ. 1Β). Η ικανότητα του κάθε σχεδιαστεί siRNA και του ομαδοποιημένου συνόλου των τριών διπόλων να μειωθεί ειδικά τα επίπεδα KGFR mRNA, χωρίς να επηρεάζεται η έκφραση της ισομορφής FGFR2-IIIc, αναλύθηκε σε MCF-7 και κύτταρα HaCaT. Παροδικές επιμολύνσεις χρησιμοποιείται για να παραδώσει κάθε siRNA και τα κύτταρα επωάζονται μόνο με το λιποσωμικό φορέα (ψευδο επιμόλυνση) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Η βέλτιστη συγκέντρωση για siRNA επιμόλυνσης ήταν προσδιοριστεί πειραματικά να είναι 5 ηΜ (τα δεδομένα δεν φαίνονται), σύμφωνα με τις πρόσφατες παρατηρήσεις που υποδεικνύεται τοξικά μηχανισμούς, εκτός στόχου επιδράσεις και τη διέγερση της ανοσολογικής απόκρισης που επάγεται από υψηλές δόσεις συνθετικής RNAi

in vitro

και

in vivo

[32]. Η ικανότητα των διαφόρων siRNAs να μειώσει το ποσό του KGFR mRNA εκτιμήθηκε με Q-RT-PCR. Σε MCF-7 κύτταρα αξιολογήσαμε επίσης την ειδικότητα των siRNAs σχεδιάζονται. επίπεδα KGFR και FGFR2-IIIc mRNA ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα του mRNA β-ακτίνης. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, MCF-7 κύτταρα επιμολυσμένα με συγκεντρωτική δέσμη siRNA-1, -2 και -3 εξέφρασαν μία στατιστικά σημαντική μειωμένη ποσότητα KGFR mRNA σε σύγκριση με τα ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα (0.243 φορές, μείωση = 75,7%,

P

= 0,009) (Σχ. 2Α). Μια λιγότερο εμφανής επίδραση λήφθηκε με επιμόλυνση με τα επιμέρους διπόλων: siRNA-1 (0.613 φορές, μείωση = 38,7%,

P

= 0,168), siRNA-2 (0.405 φορές, μείωση = 59,5%,

P

= 0,068) και siRNA-3 (0.406 φορές, μείωση = 59,4%,

P

= 0,061) (Σχ. 2Α). Αντιστρόφως, ούτε μεμονωμένα ούτε siRNAs το siRNA-pool έδειξε καμία ανασταλτική επίδραση στα επίπεδα FGFR2-IIIc mRNA (siRNA-1: 0.902 φορές, μείωση = 9,8%,

P

= 0,71? SiRNA-3: 0.914 φορές, μείωση = 8,6%,

P

= 0,36? si-RNA-3: 0,943 φορές, μείωση = 5,7%,

P

= 0,52? siRNA-πισίνα: 1.028 φορές, διαφορά = 2.8% ,

P

= 0,85) (Εικ. 2Β).

(Α) Σχηματικό διάγραμμα που αντιπροσωπεύει το εναλλακτικό μάτισμα του FGFR2-IIIc και ΚΟΡΚ /FGFR2-IIIb. Το ένθετο (*) αναφέρει την αλληλουχία cDNA (νουκλεοτίδια από 1590 έως 1698) που αντιστοιχεί σε ολόκληρο το εξώνιο 8, με τις αλληλουχίες στόχο των τριών siRNAs (γκρι πλαίσια). (Β) Τα επίπεδα του KGFR και έκφραση FGFR2-IIIc mRNA προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR, και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνη επίπεδα mRNA. KGFR mRNA σε κύτταρα MCF-7 προσδιορίστηκε ως φορές σε σχέση με το FGFR2-IIIc mRNA. Το γράφημα δείχνει το διατεταρτημοριακό εύρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (κουτιά), μέση (οριζόντια διακεκομμένη μπάρες) και 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) (μουστάκια).

t

δοκιμή δύο όψεων του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε ΚΟΡΚ έναντι FGFR2-IIIc έκφραση: *

P

& lt? 0.001. Οι συνοδευτικές εκθέσεις πίνακα σημαίνει επίπεδο έκφρασης, τυπικό σφάλμα (SE), και το 95% CI για κάθε προσδιορίστηκαν δείγμα.

Η

(Α, Β) κύτταρα MCF-7 επιμολύνονται πλαστή ή επιμολυνθεί με 5 nM siRNA -1, -2, -3, ή με μία συγκεντρωτική δέσμη από αυτά, και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα επίπεδα του KGFR (Α) και η έκφραση του mRNA FGFR2-ΙΙΙο (Β) προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR, και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνης mRNA. KGFR (Α) ή FGFR2-IIIc (Β) mRNA σε κύτταρα siRNA επιμολυσμένα προσδιορίστηκαν ως φορές σε σχέση με εκείνη που εκφράζεται σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Για κάθε θεραπεία, τα γραφήματα δείχνουν το διατεταρτημοριακό εύρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (κουτιά), μέση (οριζόντια διακεκομμένη μπάρες) και 95% Διάστημα Εμπιστοσύνης (CI) (μουστάκια).

t

δοκιμή δύο όψεων του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε siKGFR-επιμολυσμένα έναντι ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα: *

P

= 0,009. Οι συνημμένες πίνακες αναφέρουν σημαίνει επίπεδο έκφρασης, τυπικό σφάλμα (SE), και το 95% CI για κάθε προσδιορίστηκαν δείγμα.

Η

Ως εκ τούτου, όλα τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν με την επιμόλυνση του siRNA-πισίνα, η οποία ταιριάζει τα κοινά εγκρίθηκαν τα κριτήρια της αποτελεσματικότητας siRNA (& gt? 70% μείωση στο mRNA-στόχο). Επιπλέον, δεδομένου ότι η πισίνα δείχνει μια υψηλή ειδικότητα για ΚΟΡΚ ισομορφή, αυτό θα αναφέρεται ως siKGFR στο υπόλοιπο του χειρογράφου.

Ώρα πορεία των siRNA μεσολάβηση ΚΟΡΚ φίμωση

Για την αξιολόγηση της διάρκειας και η αποτελεσματικότητα του KGFR σίγησης, εκτελέσαμε πειράματα χρονικής πορείας επί κυττάρων HaCaT επιμολυσμένα με siKGFR, καθορισμό του ποσού του KGFR mRNA με Q-RT-PCR σε 6, 24, 48, 72 και 96 h μετά την επιμόλυνση (Εικ. 3Α). Μία μείωση της έκφρασης mRNA KGFR παρατηρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα (1,127 έναντι 2,730 φορές, διαφορά = 58,7%,

P

& lt? 0.001), ενώ η πλήρης αποτελεσματικότητα επιτεύχθηκε στις 48 και 72 ώρες (1.127 έναντι 4.779 φορές, διαφορά = 76,4%,

P

& lt? 0.001 και 1.079 έναντι 4.463 φορές, διαφορά = 75,8%,

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα) από επιμόλυνση . 96 h μετά την επιμόλυνση, μία μεγάλη μείωση στην έκφραση KGFR παρατηρήθηκε επίσης στον έλεγχο. Ωστόσο, σε επιμολυσμένα κύτταρα, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΚΟΡΚ ήταν ακόμα σημαντική (1.215 έναντι 1.963 φορές, διαφορά = 38,1%,

P

= 0,017). Για τις βάσεις των αποτελεσμάτων πορεία του χρόνου και σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι η κορύφωση της έκφρασης της πρωτεΐνης ΚΟΡΚ επιτυγχάνεται σε 72 ώρες μετά από την πείνα [30] αποφασίσαμε να εκτελεί όλα τα επόμενα πειράματα σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siKGFR.

(Α) κύτταρα HaCaT επιμολύνθηκαν ψευδο ή επιμολυσμένα με 5 ηΜ siKGFR, και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα 6, 24, 48, 72 και 96 ώρες αργότερα. Τα επίπεδα της έκφρασης mRNA KGFR προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR, και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνης mRNA. Η ποσότητα του mRNA KGFR σε κάθε χρονικό σημείο εκφράσθηκε ως φορές του επιπέδου KGFR mRNA σε σχέση με το χρονικό σημείο 6 ώρες. Για κάθε χρονικό σημείο, το γράφημα δείχνει το διατεταρτημοριακό εύρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (κουτιά), μέση (οριζόντια διακεκομμένη μπάρες) και 95% CI (μουστάκια). Οι συνοδευτικές εκθέσεις πίνακα σημαίνει επίπεδο έκφρασης, τυπικό σφάλμα (Τ.Σ.), και το 95% CI για κάθε προσδιορίστηκαν δείγμα. Δύο όψεων του Student

t

δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση siKGFR-επιμολυσμένα έναντι ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα: *

P

& lt? 0.001 (24 ώρες)? **

P

& lt? 0.001 (48 ώρες)? †

P

& lt? 0.001 (72 ώρες)? ‡

P

= 0,017 (96 ώρες). κύτταρα (Β) HaCaT ήταν ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με 5 ηΜ siKGFR. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ng /ml KGF επί 48 ώρες. Τα επίπεδα της έκφρασης mRNA KGFR προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR, και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνης mRNA. Η ποσότητα του KGFR mRNA εκφράστηκε ως πλάσια των επιπέδων mRNA KGFR σε σχέση με μη επεξεργασμένα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. Γραφική παράσταση και έκθεση τραπέζι τα ίδια σύνολα δεδομένων όπως στο (Α) για κάθε προσδιορίστηκαν δείγμα.

P

τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή δύο όψεων του Student: *

P

= 0.003 έναντι μη επεξεργασμένα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? **

P

= 0,018 έναντι ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. κύτταρα (C) HaCaT επιμολύνθηκαν και κατεργάστηκε όπως στο (Β), και τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης KGFR προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας πολυκλωνικό αντι-bek αντίσωμα. Το ίδιο στύπωμα ανιχνεύτηκε για τουμπουλίνης ως έλεγχος για ίση φόρτωση. Η ποσότητα της πρωτεΐνης KGFR αξιολογήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση? οι τιμές από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα τυποποιήθηκαν σε επίπεδα τουμπουλίνης, που εκφράζεται ως πολλαπλάσια του KGFR πρωτεΐνης σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα και αναφέρεται ως ένα γράφημα.

Η

Η ελαττωμένη KGFR mRNA και πρωτεΐνης έκφραση με siRNA σε KGF-επεξεργασμένα κύτταρα HaCaT

είναι γνωστό ότι η θεραπεία των επιθηλιακών κυττάρων με KGF προκαλεί διάφορες εκδηλώσεις, όπως πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων μέσω δέσμευσης σε KGFR και εσωτερικοποίηση του υποδοχέα συζευγμένο με μείωση του επιπέδου της έκφρασης mRNA KGFR . Έτσι, εξετάσαμε την επίδραση της siKGFR επιμόλυνση σε κυτταρικές καλλιέργειες σε παρουσία 20 ng /ml KGF. τα επίπεδα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης ελέγχθηκαν με Q-RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Μια απότομη μείωση του KGFR mRNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με siKGFR σε σύγκριση με ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα (0.232 φορές, μείωση = 76,8%,

P

= 0,003) (Σχ. 3Β). Σε παρουσία του KGF, παρατηρήσαμε μια προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του KGFR επίσης σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. Ωστόσο, KGFR mRNA αναστολή από siRNA ήταν ακόμη εμφανής (0,265 έναντι 0,598 φορές, μείωση = 55,7%,

P

= 0,018) (Σχ. 3Β). Στο ίδιο σύνολο πειραμάτων, τα επίπεδα της πρωτεϊνικής έκφρασης KGFR προσδιορίστηκαν επίσης με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. έκφραση 3C, KGFR μειώθηκε σημαντικά σε siKGFR επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. Η πυκνομετρική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι siKGFR μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης, και στις δύο μη επεξεργασμένα και KGF-επεξεργασμένα κύτταρα, κατά περισσότερο από 50% σε σχέση με το ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (0,47 φορές έναντι 1 φορές, μείωση = 53% και 0,20 έναντι 0,73 φορές, μείωση = 72,6 %, αντίστοιχα) (Διάγραμμα Σχ. 3C).

siRNA μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση του KGFR αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και στη μετανάστευση των κυττάρων που προκαλείται από KGF

Για να αξιολογηθούν τα βιολογικά αποτελέσματα του KGFR σίγησης, εξετάσαμε την siKGFR ικανότητα να επηρεάσουν την KGF-επαγόμενο πολλαπλασιασμό με την πραγματοποίηση ενός προσδιορισμού πολλαπλασιασμού στην κυτταρική γραμμή HaCaT. Plated κύτταρα επιμολύνθηκαν με siKGFR και αναπτύχθηκαν για 48 ώρες σε πρότυπο μέσο συμπληρώθηκε ή όχι με 20 ng /ml KGF. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση κυττάρων θετικών για το αντιγόνο Κί67, το οποίο προσδιορίζει τα κύτταρα ποδηλασία, και αναφέρθηκαν σε γραφική παράσταση ως ποσοστό των θετικών κυττάρων (Σχ. 4Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα παρατηρήσαμε μια αύξηση στην HaCaT κύτταρα πολλαπλασιασμού μετά αγωγή με KGF σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (39% έναντι 13,6%, 2,9 φορές αύξηση,

P

& lt? 0.001). Η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΚΟΡΚ μέσω ειδικών siRNA κατήργησε σχεδόν εντελώς ΚΟΡ επίδραση στα HaCaT κύτταρα πολλαπλασιασμού, με ένα ρυθμό πολλαπλασιασμού σε βασικό επίπεδο (14,2% έναντι 39%, 2,7 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

& lt? 0.001) (Γράφημα Εικ . 4Α).

δοκιμασία Διάδοση

(Α). κύτταρα HaCaT, αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων, οι ψευδο-διαμολυσμένα ή επιμολυσμένα με 5 ηΜ siKGFR. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ng /ml KGF επί 48 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι Ki67 (κόκκινο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. μπαρ κλίμακα, 10 μm. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με τη χρησιμοποίηση 4 ‘, 6-διαμιδο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ). Το ποσοστό των Κί67-θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των Κί67-θετικών πυρήνων έναντι του συνολικού αριθμού των πυρήνων σε δέκα διαφορετικές περιοχές λαμβάνονται τυχαία από τρία διαφορετικά πειράματα, που εκφράζεται ως μέση τιμή ± 95% CI και αναφέρεται ως ένα γράφημα.

P

τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student: *

P

& lt? 0,001 έναντι του μη επεξεργασμένου ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? **

P

& lt? 0.001 έναντι ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (B, C) επούλωση πληγών δοκιμασίας. HaCaT (Β) και MCF-7 (C) κύτταρα επιμολύνθηκαν όπως στο (Α). 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, χώρο ελεύθερο κυττάρων (πληγή) εισήχθη σε συρρέουσες καλλιέργειες, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ή όχι με 50 ng /ml KGF και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες πριν από την φωτογράφηση υπό μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Ράβδοι κλίμακας, 10 μm. Η μετανάστευση των κυττάρων αξιολογήθηκε με ανασύσταση του αρχικού τραύματος με κύτταρα: το ποσοστό των ανακτηθέντων περιοχή μετρήθηκε με ανάλυση εικόνας και οι τιμές στα γραφήματα είναι ο μέσος όρος τριών πλακών για κάθε συνθήκη ± 95% CI.

P

τιμές προσδιορίστηκαν με χρήση του Student

t

δοκιμής: (Β) *

P

& lt? 0,001 έναντι του μη επεξεργασμένου ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? **

P

& lt? 0.001 έναντι ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (C) *

P

= 0.035 έναντι μη επεξεργασμένου ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? **

P

= 0,009 έναντι ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα.

Η

Στη συνέχεια, ανέλυσε τις επιπτώσεις της ΚΟΡΚ φίμωση για τη μετανάστευση των κυττάρων, ένα άλλο συγκρότημα και αυστηρά ρυθμιζόμενη κυτταρική διαδικασία έντονα που προκαλείται με κατεργασία KGF. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία επούλωση της πληγής. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με siKGFR ένα ελεύθερο κυττάρων περιοχής εισήχθη σε μονοστιβάδες κυττάρων HaCaT, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Κύτταρα κατεργασμένα ή όχι με 50 ng /ml KGF, η συγκέντρωση φέρεται να είναι πιο αποτελεσματική σε αυτή τη δοκιμασία [34], αφέθηκαν να μεταναστεύσουν από την άκρη του τραύματος για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, η πληγή κλείσιμο είχε σχεδόν ολοκληρωθεί 24 ώρες μετά τον αρχικό τραυματισμό στο ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα, ενώ χωρίς θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα εμφάνισαν περιορισμένη μετανάστευση σε σχέση με Τ0 (96,4% έναντι 23,1%, 4,2 φορές αύξηση,

P

= 0.035) (Γράφημα Εικ. 4Β). Η επιμόλυνση με siKGFR ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων που προκαλείται από KGF (Σχ. 4Β) και εν συνεχεία μείωσε τη ανακτάται περιοχή από 96,4% των κυττάρων ελέγχου σε 24,6%, 3,9 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

= 0.009) (Γράφημα Εικ . 4Β).

Η ίδια δοκιμασία επούλωση της πληγής εκτελέστηκε επίσης για τον καρκίνο MCF-7 κυττάρων του μαστού, που είναι γνωστή για να ανταποκρίνεται στις KGF από την άποψη της κινητικότητας [15], με παρόμοια αποτελέσματα (Σχ. 4C). αγωγή KGF προώθησε μια ισχυρή επανεισαγωγής, σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (83% έναντι 29,6%, 2,8 φορές αύξηση,

P

& lt? 0.001). Σε KGFR σιγήσει κύτταρα, ΚΟΡ-επαγόμενη μετανάστευση ήταν σχεδόν καταργήθηκε, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (25,4% έναντι 83%, 3,3 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

& lt? 0.001). (. Γράφημα σχήμα 4C)

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι KGFR σίγηση είναι αποτελεσματική στην αναστολή KGF βιολογικά αποτελέσματα, όπως η διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και της μετανάστευσης, είτε σε κερατινοκύτταρα HaCaT ή επιθηλιακά κύτταρα του καρκίνου του μαστού.

KGFR σίγηση αναστέλλει την αποκατάσταση των κυτταρικών πολλαπλασιασμός που διεγείρεται από KGF κατόπιν 5-FU διέγερση

Συχνά, τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν αντίσταση στα κοινά χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η 5-FU, έτσι προκλητική αποτελεσματικότητα χημειοθεραπείας [23]. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του KGFR στη δημιουργία της αντοχής σε 5-FU, εμείς παροδικά γκρέμισε έκφραση KGFR από siRNA στην καρκινική κυτταρική σειρά MCF-7 μαστού.

Η επιμόλυνση με siKGFR διεξήχθη με τον παρουσία ή όχι του 20 ng /ml KGF, 25 μg /ml 5-FU ή ένας συνδυασμός αυτών. Πρώτον, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα της KGFR σίγηση αναλύοντας τόσο mRNA και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, θεραπευτική αγωγή με KGF από ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα μείωσε την έκφραση του mRNA KGFR σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, ανεξάρτητα από την παρουσία του 5-FU σε κυτταρικές καλλιέργειες (0.555 φορές, μείωση = 44,5%,

P

= 0.170, και 0.545 φορές, μείωση = 45,5%,

P

= 0.183, αντίστοιχα). έκφραση Επιπλέον, η 5-FU μόνη της επηρεάζεται ελάχιστα KGFR mRNA (0.911 φορές, μείωση = 8,9%,

P

= 0,711). Σε siKGFR-επιμολυσμένα καλλιέργειες, παρατηρήσαμε μια ισχυρή επίδραση στην έκφραση του mRNA (0.133 φορές, μείωση = 86,7%,

P

= 0,039), με μέτριες διακυμάνσεις σε απόκριση προς την παρουσία ή απουσία του KGF ή /και 5 -FU. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι τα κύτταρα MCF-7 αντιδρούν παρομοίως σε κύτταρα HaCaT σε απόκριση KGFR σίγηση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε επίπεδο RNA επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης, όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β. Το ειδικό siRNA μειώθηκαν σημαντικά KGFR πρωτεΐνης σε μη επεξεργασμένα κύτταρα, καθώς και σε KGF ή /και 5-FU-επεξεργασμένα κύτταρα, κατά 60% -70% σε σχέση με την ίδια θεραπευτική αγωγή σε ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα (Graph Σχ. 5Β).

(Α) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν ψευδο ή επιμολυσμένα με 5 ηΜ siKGFR. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ng /ml KGF, 25 μg /ml 5-FU ή KGF συν 5-FU για 24 ώρες. Τα επίπεδα της έκφρασης mRNA KGFR προσδιορίστηκαν με την Q-RT-PCR, και κανονικοποιημένα επίπεδα σε β-ακτίνης mRNA. Η ποσότητα του mRNA σε KGFR siKGFR-επιμολυσμένα κύτταρα εκφράστηκε ως φορές του επιπέδου KGFR mRNA σε σχέση με το μη επεξεργασμένο ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. Για κάθε θεραπεία, το γράφημα δείχνει το διατεταρτημοριακό εύρος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (κουτιά), μέση (οριζόντια διακεκομμένη μπάρες) τους, και το 95% CI (μουστάκια). Οι συνοδευτικές εκθέσεις πίνακα σημαίνει επίπεδο έκφρασης, τυπικό σφάλμα (Τ.Σ.), και το 95% CI για κάθε προσδιορίστηκαν δείγμα.

P

τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student: *

P

= 0,039 έναντι του μη επεξεργασμένου ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (Β) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν και κατεργάστηκε όπως στο (Α), και η ποσότητα της πρωτεΐνης KGFR εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western με αντι-bek πολυκλωνικό αντίσωμα. Τουμπουλίνης χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. Η ποσότητα της πρωτεΐνης KGFR αξιολογήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση: οι τιμές από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα τυποποιήθηκαν σε επίπεδα τουμπουλίνης, που εκφράζεται ως πολλαπλάσια του επιπέδου KGFR σε σχέση με μη επεξεργασμένα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα και αναφέρεται ως ένα γράφημα

Η

επόμενο εκτελείται μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε κύτταρα MCF-7, επιμολύνθηκαν με siKGFR ή ψευδο-επιμολυσμένα και αναπτύχθηκαν για 48 ώρες σε πρότυπο μέσο συμπληρώθηκε ή όχι με KGF, 5-FU ή ένας συνδυασμός αυτών, όπως παραπάνω. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση των κυττάρων θετικά για το αντιγόνο Κί67, και αναφέρθηκαν σε γραφική παράσταση ως ποσοστό των θετικών κυττάρων (Σχ. 6Α). Επίσης, σε MCF-7 βρήκαμε μια αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά την αγωγή με KGF σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (34,8% έναντι 19,5%, 1,8 φορές αύξηση,

P

= 0,004). Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με 5-FU αποκάλυψε ένα αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα (6,0% έναντι 19,5%, 3,3 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

& lt? 0.001), η οποία ήταν σχεδόν πλήρως καταργήθηκε με την ταυτόχρονη αγωγή με KGF (28,4% έναντι 6,0%, 4,7 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

& lt? 0.001). ΚΟΡΚ ρύθμιση προς τα κάτω από siRNA σχεδόν καταργηθεί ΚΟΡ αποτέλεσμα πολλαπλασιασμού, τόσο μεμονωμένα και σε συνδυασμό με 5-FU (15,7% έναντι 34,8%, 2,2 φορές μεγαλύτερη διαφορά,

P

& lt? 0.001 και 11,2% έναντι 28,4%, 2,5 φορές διαφορά ,

P

= 0.002, αντίστοιχα) (Σχ. 6Α).

() κύτταρα A MCF-7, αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες, επιμολύνθηκαν ή επιμολυσμένο με 5 ηΜ siKGFR και 48 ώρες αργότερα mock αυτοί υπέστησαν αγωγή ή όχι με 20 ng /ml KGF, 25 μg /ml 5-FU ή KGF συν 5-FU. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-Κί67. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με τη χρησιμοποίηση 4 ‘, 6-διαμιδο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε ως ποσοστό του Κί67-θετικών πυρήνων έναντι του συνολικού αριθμού των πυρήνων σε δέκα διαφορετικές περιοχές λαμβάνονται τυχαία από τρία διαφορετικά πειράματα, που εκφράζεται ως μέση τιμή ± 95% CI και αναφέρεται ως ένα γράφημα.

P

τιμές προσδιορίστηκαν με τη χρήση του μαθητή

t

δοκιμής: *

P

= 0.004 και **

P

& lt? 0,001 έναντι του μη επεξεργασμένου ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? ***

P

& lt? 0,001 έναντι του 5-FU θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? †

P

& lt? 0.001 έναντι ΚΟΡ-θεραπεία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα? ‡

P

= 0,002 έναντι ΚΟΡ συν 5-FU κατεργασία ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα. (Β) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν και κατεργάστηκε όπως στο (Α), και ανάλυση στυπώματος Western της κατάστασης φωσφορυλίωσης της ERK διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ΕΚΚ μονοκλωνικό αντίσωμα φωσφο-ειδικό (ρ-ERK). Τα επίπεδα της ολικής ERK αξιολογήθηκαν από κηλίδωση με ένα ERK2-ειδικό αντίσωμα. Η ποσότητα του ενεργοποιημένου ERK αξιολογήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση: οι τιμές από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα τυποποιήθηκαν για τα συνολικά επίπεδα ERK, που εκφράζεται ως πολλαπλάσια έκφρασης ρ-ERK σε σχέση με μη επεξεργασμένα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα και αναφέρεται ως ένα γράφημα

είναι γνωστό ότι ERK /ΜΑΡΚ μονοπάτι παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε ανάλυση Western Blot για την αξιολόγηση της ενεργοποίησης ERK, χρησιμοποιώντας αντισώματα είτε ειδικά για την φωσφορυλιωμένη μορφή του μορίου ή κατευθύνεται εναντίον ολική ΕΚΚ. Όπως ήταν αναμενόμενο, σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα ενεργοποίηση ERK ήταν σημαντικά επάγεται από την αγωγή με KGF (7,5 φορές). Αντιστρόφως, 5-FU ήταν σε θέση να μειώσει τα επίπεδα του φωσφορυλιωθεί ERK (2,5 φορές), οι οποίες σχεδόν πλήρως αποκατασταθεί με την χορήγηση του KGF σε συνδυασμό με 5-FU (6,5 φορές). Σε siKGFR-επιμολυσμένα κύτταρα, σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα, η διεγερτική επίδραση του KGF επί της φωσφορυλίωσης ERK ήταν σε μεγάλο βαθμό ανασταλεί (2 φορές) (Εικ. 6Β).

Επιπλέον, αξιολογήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με χρώση κρύσταλλο ιώδες, και την επακόλουθη απορρόφηση του στα 570 nm, η οποία αντανακλά μεταβολές στον αριθμό των κυττάρων. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KGF, 5-FU ή ένας συνδυασμός τους για 24 ώρες, όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια, τα υπόλοιπα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 1% κρυσταλλικό ιώδες (Σχ. 7Α). Συγκρίναμε το αποτέλεσμα KGF και 5-FU επί του αριθμού των κυττάρων, κοιτάζοντας την επιρροή του KGFR φίμωση στη διαδικασία αυτή. Σε ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα αγωγή KGF ήταν σε θέση να αυξήσει τον αριθμό των κυττάρων (1,55 φορές), 5-FU προκάλεσε μείωση των βιώσιμων κυττάρων (0,45 φορές), ενώ σε παρουσία του KGF, 5-FU δεν ήταν αποτελεσματικό (1,49 φορές). Από την άλλη πλευρά, σε siKGFR-επιμολυσμένα κύτταρα, 5-FU κυτταρικό θάνατο που επάγεται όπως αναμενόταν (0,56 φορές), ενώ η αγωγή με ΚΟΡ δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει μια αύξηση του αριθμού των κυττάρων (0,91 φορές). Σε αυτή την περίπτωση 5-FU διατηρεί την ικανότητά της να καθορίζει κυτταρικό θάνατο ακόμα και σε παρουσία του KGF (0,49 φορές) (Διάγραμμα Σχ. 7Α).

(Α) κύτταρα MCF-7 διαμολύνθηκαν ψευδο ή επιμολυσμένα με 5 ηΜ siKGFR και 48 ώρες αργότερα υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με 20 ng /ml KGF, 25 μg /ml 5-FU ή KGF συν 5-FU. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με 1% crystal violet και αναλύθηκαν σε απορρόφηση 570 nm. Οι τιμές από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα εκφράστηκαν ως σχετική οπτική πυκνότητα και αναφέρεται ως ένα γράφημα. (Β) κύτταρα MCF-7, αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες, και επιμολύνθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α). Μετά από 24 ώρες, αυτά σταθεροποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοφθορισμού με ένα αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον του διασπασμένου μορφή της κασπάσης-3. Οι πυρήνες οπτικοποιήθηκαν με τη χρησιμοποίηση 4 ‘, 6-διαμιδο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (ϋΑΡΙ).