Abstract

Βλεννίνη 1 (MUC 1) είναι μια ετεροδιμερής πρωτεΐνη που εκφράζεται με παρεκκλίνοντα σε ποικίλα ανθρώπινα καρκινώματα και ορισμένα αιματολογικές κακοήθειες. Το ογκογόνο C-τερματική υπομονάδα MUC1 διαμεμβράνης (MUC1-C) λειτουργεί εν μέρει από μεταγωγή ανάπτυξη και σήματα επιβίωσης από υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη δομή της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C ως πιθανός στόχος φαρμάκου. Χρησιμοποιώντας μεθόδους για δομικές προβλέψεις, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ένα άκρως συντηρημένη αλληλουχία CQCRRK, το οποίο βρίσκεται δίπλα στην κυτταρική μεμβράνη, σχηματίζει ένα μικρό θύλακα που εκθέτει τα δύο κατάλοιπα κυστεΐνης για το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών. Αντιθέτως, το υπόλοιπο της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C δεν έχει εμφανή δομή, σύμφωνα με ένα εγγενώς διαταραγμένο πρωτεΐνη. έτσι μελέτες μας επικεντρώθηκε στην στόχευση της περιοχής MUC1 CQCRRK. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι L- και D-αμινοξέων πεπτίδια CQCRRK περιέχουν δεσμεύονται άμεσα με το μοτίβο CQC. Δείχνουμε επίσης ότι το πεπτίδιο D-αμινοξέων, που ορίζεται GO-203, μπλοκ ομοδιμερισμό της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C in vitro και σε επιμολυσμένα κύτταρα. Επιπλέον, GO-203 συνδέεται άμεσα με ενδογενή MUC1-C σε κύτταρα του μαστού και καρκίνο του πνεύμονα. μελέτες colocalization αποδεικνύουν επίσης ότι GO-203 δεσμεύεται κυρίως στην MUC1-C στην κυτταρική μεμβράνη. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την περαιτέρω ανάπτυξη των παραγόντων που στοχεύουν στην MUC1-C κυτταροπλασματική CQC τομέα μοτίβο και με τον τρόπο λειτουργίας MUC1-C σε καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Raina D, Agarwal P, Lee J, Bharti Α, McKnight CJ , Sharma P, et al. (2015) Χαρακτηρισμός της MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή σαν τον καρκίνο Target. PLoS ONE 10 (8): e0135156. doi: 10.1371 /journal.pone.0135156

Επιμέλεια: Srinivasa Μ Srinivasula, IISER-TVM, ΙΝΔΙΑ

Ελήφθη: 8 Απρ του 2015? Αποδεκτές: 17, Ιουλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Raina et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα που αναφέρθηκαν σε αυτή τη δημοσίευση υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο των βραβείων CA097098 και CA166480, http: //www.cancer. gov (DK). Γένος Ογκολογίας παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς D.R. και S.K. LeadInvent παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς Ρ.Α. και Υ.Γ. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στην ενότητα «συγγραφείς συνεισφορές». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχω διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα : DK έχει μετοχές σε γένος Ογκολογίας και είναι σύμβουλος στην εταιρεία. Η υπαγωγή του Γένους Ογκολογίας και LeadInvent με αυτό το έργο δεν αλλάζει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Επιθήλια είναι στρώματα πλευρικά συνδέονται κυττάρων με ακραία-βασική πολικότητα που προστατεύονται από το εξωτερικό περιβάλλον από βλέννη [1]. Η βλεννίνη οικογένεια εκκρινόμενων και διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών εξελίχθηκε σε μετάζωα να δώσει προστασία των επιθηλίων που, για παράδειγμα, γραμμή (i) το αναπνευστικό και το γαστρεντερικό σύστημα, και (ii) οι αγωγοί σε εξειδικευμένα όργανα [1]. Η βλεννίνη 1 (MUC 1) είναι ένα μέλος διαμεμβρανική αυτής της οικογένειας, που αναγνωρίστηκε από την υπερέκφραση του σε ανθρώπινους καρκίνους του μαστού [2]. MUC1 αποτελείται από δύο υπομονάδες που προέρχονται από σχάση ενός απλού πολυπεπτιδίου και, με τη σειρά του, σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές σύμπλοκο στο ακραία μεμβράνη των φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [1]. Η MUC1 Ν-τερματικό υπομονάδα (MUC1-N) περιέχει συνδυασμό 20-αμινοξέων (αα) επαναλήψεις που τροποποιούνται από

O

-γλυκάνες. Η MUC1 Ο-τερματικό υπομονάδα (MUC1-C) είναι η διαμεμβρανική συστατικό του ετεροδιμερούς και άγκυρες MUC1-Ν στην επιφάνεια του κυττάρου. MUC1 υπερεκφράζεται σε διάφορες καρκινώματα, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι προς τα πάνω ρύθμιση του συμπλόκου MUC1-Ν /MUC1-C αντιπροσωπεύει μια ανατροπή της φυσιολογικής λειτουργίας της να προάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [1]. Στο πλαίσιο αυτό και πέραν των συμμετεχόντων στην βλέννη, γλυκοζυλιωμένη MUC1-N μπορεί να ενισχύσει τη λειτουργία του υποδοχέα στην κυτταρική επιφάνεια για να στηρίξει την ανάπτυξη και την επιβίωση [3]. Επιπλέον, και σε συνδυασμό με την απώλεια της πολικότητας, MUC1-C αλληλεπιδρά με μόρια κυτταρικής επιφάνειας, όπως κινάσες τυροσίνης υποδοχέα, και προωθεί την ενεργοποίηση τους και κατάντη σηματοδότησης [4]. Σημαντικά, η υπερέκφραση του MUC 1-C είναι επαρκής για να προσδώσει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη και ογκογονικότητα, υποστηρίζοντας την ογκογόνο λειτουργία αυτού υπομονάδας [5].

MUC1-C αποτελείται από ένα 58-aa εξωκυτταρική περιοχή, μία 28- aa διαμεμβρανική περιοχή και μια 72-αΑ κυτταροπλασματική περιοχή. Το εξωκυτταρικό πεδίο MUC1-C περιλαμβάνει ένα μοτίβο NPG με το υπόλειμμα ασπαραγίνης που υπόκεινται σε

N

-glycosylation [6]. Η σύνδεση του γαλεκτίνη-3 στην εν λόγω θέση γλυκοζυλιωμένη NPG προάγει τον σχηματισμό εξωκυττάριας γεφυρών μεταξύ MUC1-C και άλλων μορίων κυτταρικής επιφάνειας, όπως ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) [6]. Η MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή (MUC1-CD) περιέχει ένα CQC μοτίβο πλησίον της περιοχής διαμεμβράνης, η οποία είναι αναγκαία και επαρκής για το σχηματισμό της MUC1-C ομοδιμερή [7,8]. Σημαντικά, μετάλλαξη του CQC μοτίβο να AQA μπλοκ εισαγωγή του MUC1-C στον πυρήνα και των μιτοχονδρίων εξωτερικής μεμβράνης [7,9,10]. Επιπλέον, η μετάλλαξη CQC → AQA καταργεί την ογκογόνο λειτουργία MUC1-C, που υποστηρίζουν τη σημασία της MUC1-C ομοδιμερισμό στην οδήγηση ενδοκυτταρικά σήματα που παρέχουν την ανάπτυξη και την επιβίωση [7,11]. Κατά συνέπεια, το μοτίβο MUC1-C CQC έχει αναδειχθεί ως ένας ελκυστικός στόχος για την ανάπτυξη του πεπτιδίου και αναστολέων μικρών μορίων που μπλοκάρουν ομοδιμερισμό MUC1-C και η λειτουργία [12,13].

Οι παρούσες μελέτες έχουν διερευνήσει τη δομή της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C βασίζεται στην πιθανή σημασία του ως στόχο τον καρκίνο. Έχουμε αποδείξει ότι η MUC1-C κυτταροπλασματική CQC μοτίβο κατοικεί σε ένα druggable διαμόρφωση και ότι το υπόλοιπο της κυτταροπλασματικής περιοχής είναι αδόμητη, συνεπής με άλλες ογκογόνο μόρια που κατευθύνουν την ενεργοποίηση πολλαπλών οδών σηματοδότησης [14]. Δείχνουμε επίσης ότι η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C μπορεί να στοχεύεται εκλεκτικά με πεπτίδια που δεσμεύονται απευθείας στο CQC μοτίβο και να μπλοκάρουν MUC1-C ομοδιμερισμό in vitro και σε κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

μοριακής Δυναμικής

MUC1-CD (αμινοξέα 1-15) δομή χτίστηκε

ab-inito

με τις προτιμώμενες γωνίες φ /psi των αντίστοιχων αμινοξέων. Η προκύπτουσα ατομική δομή με σαφείς μορίων του νερού και ιόντων μελετήθηκε χωρίς μεμβράνη διπλής στρώσης χρησιμοποιώντας Υποβοηθούμενη Μοντέλο Κτίριο με Ενέργειας Βελτίωση (ΠΟΡΤΟΚΑΛΙ) [15]. Μετά τα βήματα σταθεροποίηση της ελαχιστοποίησης, θέρμανση και εξισορρόπησης, σύντομη 15 ns προσομοιώσεις διεξήχθησαν για να δημιουργήσουν 1.500 διαμορφώσεις που χωρίζονται από 10 picoseconds, τα οποία αναλύθηκαν περαιτέρω για Root πλατεία μέση απόκλιση (RMSD). Σε πρόσθετες μελέτες, η περιοχή της μεμβράνης MUC1-C, η οποία έχει ένα κυρίαρχο διαμόρφωση έλικας όπως προβλέπεται από THMHMM και TMPred, εισήχθη σε ένα προ-equalibrated 1-παλμιτοϋλ-2-ολεοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (POPC) bi -layer και διαλυμένες με ρητή νερό και ιόντα. Τα υπόλοιπα αμινοξέα κυτταροπλασματική περιοχή κτίστηκαν με γωνίες /psi προτιμώμενη φ τους. Νανοκλίμακας μοριακής δυναμικής (NAMD) [16] χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση της μελέτης μοριακής δυναμικής.

NMR ανάλυση των MUC1-CD

Του-MUC1-CD εκφράστηκε από pet-MUC1- πλασμιδίου CD (Novagen, Billerica, ΜΑ) και η

15Ν-επισημασμένη πρωτεΐνη παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [17]. Το δείγμα NMR αποτελούνταν από 1,7 mg /ml του His-MUC1-CD, 1% D

2O, ένωση αναφοράς TMSP (250 μΜ) και 10 mM δ

10-DTT. Το ρΗ ρυθμίστηκε στο 5.0 με την προσθήκη 1 Μ HCI. Ένα και δύο διαστάσεων

15N ετεροπυρηνικών μονού κβάντου (HSQC) συλλογές δεδομένων διεξήχθησαν στους 20 ° C και 10 ° C σε MHz Bruker σύστημα 500 Advance III NMR στις εγκαταστάσεις του Πανεπιστημίου της Βοστώνης πυρήνα των διαρθρωτικών NMR. Η ανάλυση των δεδομένων δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό topspin Bruker του.

Μέτρηση συγγενειών δέσμευσης

συγγένειες δέσμευσης ΡΙΤΟ-GO-202 και FITC-GO-203 προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο σύνδεσης κορεσμού [18]. Εν ολίγοις, 96 φρεατίων γλουταθειόνη- ή νικέλιο-επικαλυμμένες πλάκες (Thermo Fisher, Waltham, ΜΑ) επωάστηκαν με 150 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος PBS που περιείχε 21,45 μg /ml του GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) ή His-MUC1-CD όλη τη νύκτα στους 4 ° C που ακολουθείται από έκπλυση με 50 mM Tris και 150 mM NaCl που περιέχει 0.1% Tween-20 (TBST) και παρεμπόδιση με 0.5% BSA σε TBS. Οι πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με TBST. FITC-GO-202 ή FITC-GO-203 προστέθηκε στα φρεάτια σε 0,19 μΜ έως 25 μΜ. Η μη ειδική σύνδεση προσδιορίζεται παρουσία της GST μόνο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C σε έναν αναδευτήρα που ακολουθείται από έκπλυση 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης. ένταση φθορισμού προσδιορίστηκε σε μια άπειρη M1000 PRO Tecan Microplate Reader (Tecan, NC) με διέγερση στα 490 nm και εκπομπή στα 525 nm. GraphPad Prism 4.0 Software (San Diego, CA) χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σταθερά διάστασης ισορροπίας (Kd) με μία μέθοδο μη-γραμμική παλινδρόμηση.

Complex Χαρακτηρισμός με MALDI-TOF-MS

Binding πειράματα με MUC1-CD και GO-203 διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [19]. Συγκροτήματα εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια γλουταθειόνης, υποβλήθηκαν σε διαπίδυση και συμπυκνώθηκε χρησιμοποιώντας Amicon ultra φυγόκεντρες φίλτρα (Millipore, Billerica, ΜΑ). Τα σύμπλοκα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μη αναγωγική ηλεκτροφόρηση και βάφτηκαν με Coomassie Blue. Οι ζώνες πρωτεΐνης αποκόπηκαν και αναλύθηκαν με MALDI-TOF-MS όπως περιγράφεται [20]. Εν συντομία, πήγματα κόπηκαν σε μικρά, ομοιόμορφα κομμάτια? τα τεμάχια γέλης αφυδατώθηκαν με ακετονιτρίλιο και στη συνέχεια επανυδατώθηκαν σε 100 mM διττανθρακικού αμμωνίου που ακολουθείται από 2 πλύση και ξήρανση κύκλους με διττανθρακικό αμμώνιο και ακετονιτρίλιο, αντίστοιχα. Μετά την πλήρη αφυδάτωση, τεμάχια γέλης αιωρήθηκαν σε 12,5 ng /μl θρυψίνη σε 50 mM διττανθρακικού αμμωνίου (50 μΐ). In-γέλη πέψη διεξήχθη στους 37 ° C για 10-12 ώρες και τα δείγματα οξυνίζεται με 50 μΙ 0,5% TFA. Τριάντα μικρολίτρα αυτού του μίγματος αφαλατώθηκαν με C-18 που περιέχει Zip-Tip (Millipore, Billerica, ΜΑ). Χωνευθέν με θρυψίνη πεπτίδια αναλύθηκαν με MALDI-TOF-MS (ΑΒΙ-4800). αναλύσεις MALDI-TOF-MS πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ανακλαστήρας που βελτιστοποιήθηκε για απόκτηση για το φάσμα μάζας 700-3500 amu. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Explorer δεδομένων (ΑΒ-Sciex, Framingham, ΜΑ) και MASCOT (ver.2.0.04, Matrix Science, Boston, MA). Η ανάλυση MS-γέφυρα έγινε χρησιμοποιώντας Protein Prospector (ver.4.27.2 βασική και ver.5.0, UCSF). Οι παράμετροι αναζήτησης της βάσης δεδομένων ήταν: (i) θρυπτικού χωνέψει, (ii) οξειδώνεται Met, (iii) 2 αναπάντητες διασπάσεις, και (iv) δισουλφιδική γέφυρα με μέγιστη μόρια σύνδεσμο ρυθμιστεί σε 2 και μία μάζα ανοχή 50 ppm. Η αναζήτηση διεξήχθη κατά GST-MUC1-CD και GO-203.

Κατασκευή πλασμιδίου

Οι φορείς που εκφράζουν GST-MUC1-CD, GST-MUC1-CD (AQA) και His-MUC1-CD , GFP-MUC1-CD και FLAG-MUC1-CD έχουν περιγραφεί [7]. His-tagged MUC1-CD (αρουραίους και σκύλους) κλωνοποιήθηκαν στον φορέα ρΕΤ28α (Clontech, Mountain View, CA) και εκφράζεται σε

E

.

coli

BL21 (DE3).

In Vitro

διμερισμός

Καθαρίστηκε His-MUC1-CD επωάστηκε σε PBS ή αυξανόμενες ποσότητες GO-203 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, όπως περιγράφεται [19]. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε μη αναγωγικά πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση.

Cell Culture

Ανθρώπινο ZR-75-1 καρκίνου του μαστού (ΑΤΤΟ) και ο καρκίνος του πνεύμονα H1975 (ΑΤΤΟ) κυτταρικές γραμμές ήταν αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (HI-FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Κύτταρα 293Τ αναπτύχθηκαν σε DMEM με 10% FBS HI-, αντιβιοτικά, και 2 mmol /L Ε-γλουταμίνη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FITC συζευγμένο-GO-202 (FITC-GO-202), FITC-GO-203 ή μη συζευγμένο GO-203 συντέθηκαν με τη MIT Biopolymer Laboratory (Cambridge, ΜΑ) και AnaSpec, Inc (San Jose, CA). Η p3XFLAG-CMV-10 (Sigma, St. Louis, ΜΟ), pEGFP-C1 και pDsRed-μονομερούς-Ν1 (Clontech, Mountain View, CA) φορείς χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση των αρουραίους και σκύλους MUC1-CD και πλήρους μήκους ανθρώπινο MUC1 σε κύτταρα 293Τ παρουσία Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ).

Ανοσοκαταβύθιση και Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [19]. Οι διαλυτές πρωτεΐνες ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-FLAG (Sigma, St. Louis, ΜΟ), αντι-MUC1-C (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ) ή ένα IgG ελέγχου. Τα ιζήματα και υλικά λύσεως δεν υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση ανοσοστυπώθηκαν με αντι-MUC1-C, αντι-GFP (Abcam, Cambridge, ΜΑ), αντι-FLAG και αντι-FITC (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Η αντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε με συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο και χημειοφωταύγεια.

Ανάλυση του GO-203 Localization

293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν με MUC1-pDsRed-μονομερούς-N1 παρουσία Lipofectamine 2000 για 48 h. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με FITC-GO-203 για 3 ώρες και εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα επιφθορισμού ευρύ πεδίου της Nikon αποσυνέλιξης με ένα 100χ αντικειμενικό φακό λαδιού. Οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση του λογισμικού NIS-στοιχείου (Nikon) και αναλύονται από το λογισμικό ImageJ.

Αποτελέσματα

Ανάλυση της Δομής MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή

Για να ορίσετε τη δομή του 72-αμινοξέων MUC 1 κυτταροπλασματική περιοχή (MUC1-CD), χρησιμοποιήσαμε πρώτα πολλαπλές συνθήκες για την δημιουργία κρυστάλλων με καθαρισμένη πρωτεΐνη MUC1-CD. Αυτές οι προσπάθειες κρυστάλλωσης απέβησαν άκαρπες, μας ζητά να διερευνήσει μελέτες μοριακής προσομοίωσης. Πρέπει πρώτα στράφηκε προς μοντελοποίηση ομολογίας ως μια προσέγγιση για να χαρτογραφήσει τις διαρθρωτικές πτυχές της MUC1-CD. Αξιοσημείωτα, όμως, MUC1-CD επέδειξε ελάχιστη ή και καμία ομολογία αλληλουχίας με γνωστές πρωτεΐνες. Συνεπώς, μελετήσαμε προβλέψεις δευτεροταγούς δομής για MUC1-CD χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους, που περιλαμβάνουν ROBETTA [21] και IGB-SSPro [22]. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών έδειξαν ότι συλλογικά MUC1-CD δεν είναι σύμφωνες με ένα τυπικό δευτερεύον δομή.

Εμείς έτσι επικέντρωσε τις προσπάθειές μας για τα πρώτα 15 αμινοξέα της MUC1-CD (CQCRRKNYGQLDFIP) μελετώντας ατομιστικής μοριακή δυναμική της . Η MUC1-CD (1-15) μοντέλο κατασκευάστηκε

ab-inito

με τις προτιμώμενες φ γωνίες /psi αμινοξέων. Η δομή που προκύπτει στη συνέχεια σπούδασε με ρητή νερό και ιόντα. Χρησιμοποιώντας σύντομο 15 προσομοιώσεις νανοδευτερόλεπτο (1500 διαμορφώσεις που διαχωρίζονται από 10 picoseconds) με κεχριμπάρι και όπως καταδεικνύεται από RMSD, βρήκαμε ότι η MUC1-CD (1-15) αλληλουχία επίσης εγγενώς δομημένη χωρίς προτιμώμενη διαμορφώσεις (Σχ 1Α). Επιπλέον, η ανάλυση NMR του MUC1-CD επιβεβαίωσε την απουσία μιας ανιχνεύσιμης δευτεροταγούς δομής (Σχήμα 1Β-1ϋ), όπως φαίνεται από την παρουσία των κορυφών μεταξύ 7,5 και 8,5 ppm, συνεπής με MUC1-CD είναι ένας μη δομημένη πρωτεΐνη.

(Α) RMSD των στιγμιότυπα που λαμβάνονται για την αρχική

ab-initio

δομή της MUC1-CD (1-15). Υ-άξονας είναι η RMSD και Χ-άξονας είναι η ακολουθία στιγμιότυπο (picoseconds). (Β) Τα φάσματα NMR πρωτονίου (1D) και

15Ν-HSQC φάσματα MUC1-CD (1-15) αποκτήθηκαν στα 500 MHz σε (C) 20 ° C και (δ) 10 ° C σε ρΗ 5.0.

MUC1-CD (1-15) περιέχει ένα CQC μοτίβο που ακολουθείται από τρία θετικά φορτισμένα υπολείμματα (RRK). Η κυτταροπλασματική περιοχή CQCRRK βρίσκεται δίπλα στην κυτταρική μεμβράνη (που προβλέπεται από TMPred & amp? Phobius) και ως εκ τούτου θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στη δομή MUC1-CD, λόγω των αλληλεπιδράσεων για να φορτίσετε χρέωση με τα αρνητικά φορτισμένα στρώματα λιπιδίων. Ως εκ τούτου, μελέτησε τη δυνητική επίδραση του στρώματος λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης στα υπολείμματα CQCRRK. Μια ακολουθία MUC1 οξέος 45 αμινοξέων (SAQSGAG-VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV-CQCRRKNYGQ) χτίστηκε

ab-initio

με το μέρος της MUC1-C /εξωκυτταρική περιοχή (MUC1-C /ECD? SAQSGAG), η MUC1 28-αμινοξέων -C /διαμεμβρανική περιοχή (MUC1-C /TMD? VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV) και τα πρώτα 10 υπολείμματα της MUC1-CD (CQCRRKNYGQ). Όπως καθορίζεται από τις μελέτες μοριακής δυναμικής, η TMD έχει μια κυρίαρχη έλικας (Σχήμα 2Α). Τα υπόλοιπα αμινοξέα χτίστηκαν με γωνίες /psi προτιμώμενη φ τους. Η προκύπτουσα δομή εισήχθη σε ένα αντιπροσωπευτικό επίθεμα μεμβράνης (POPC δύο στρώσεων) και ατομιστικής μελέτες μοριακής δυναμικής διεξήχθησαν για 55 ns χρησιμοποιώντας το λογισμικό NAMD. Παρατηρήσαμε μια εξισορροπημένη δομή με σταθερό RMSD και μια προτιμώμενη διαμόρφωση (με τη σειρά) στο CQC περιοχή (Σχήμα 2Α). Βρήκαμε επίσης ότι τα δύο κατάλοιπα Arg προσανατολιστούν κατά προτίμηση προς την κατεύθυνση της μεμβράνης επειδή αλληλεπιδράσεων φορτίου-φορτίου με τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές της λιπιδικής διπλοστοιβάδας, δημιουργώντας έτσι ένα μικρό τσέπη για το CQC μοτίβο (Σχήμα 2Β). Αυτή η προτιμώμενη μικρό προσανατολισμό τσέπη, σε συνδυασμό με την εγγύτητα της στην λιπιδική διπλοστοιβάδα, υποστήριξε την άποψη ότι οι CQC μοτίβο κατάλοιπα Cys μείωσαν διαμορφωτική ελευθερία, προδιαθέτουν τους για να σχηματίσουν δεσμούς δισουλφιδίου πιο αποτελεσματικά με περιορισμένη εντροπικών ποινή.

(Α ) δευτερογενούς διανομής δομή των στιγμιότυπων λήφθηκαν σε σχέση με το προσομοιωμένο χρόνο και αξιολογούνται με τον αλγόριθμο dSsp. Υ-άξονας είναι η αλληλουχία υπολειμμάτων: (1 έως 7-SAQSGAG), (8 έως 35 -VPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAV), (36 μέχρι 45 -CQCRRKNYGQ). Χ-άξονας είναι ο χρόνος σε picoseconds (ps). (Β) Το σχήμα απεικονίζει μια περιοχή της λιπιδικής διπλοστοιβάδας επισημανθεί ως ροζ, κόκκινο και πορτοκαλί μπαστούνια εκπροσωπούν φωσφολιπιδίων μονομερών με την ελικοειδή MUC1-C TMD. Τα κυτταροπλασματικά κατάλοιπα της MUC1-C που αποτελείται από CQCRRK επισημανθεί ως πρότυπο μπάλα και ραβδί. Τα θετικά φορτισμένα αργινίνες τράβηξε μέχρι και κλειδωμένα προς τα αρνητικά φορτισμένων φωσφορικών ομάδων.

Η

Μελέτες δέσμευσης με την MUC1 CQC Motif

Το μοτίβο MUC1-C CQC παρέχει το σχηματισμό της MUC1- ομοδιμερή C είναι απαραίτητες για τη λειτουργία MUC1-C [7,8]. Ως εκ τούτου, δημιουργείται πεπτίδια που περιέχουν την αλληλουχία CQCRRKN ​​ως πιθανοί παράγοντες που θα μπορούσαν να συνδέονται προς το θύλακα CQC και μπλοκάρουν MUC1-C ομοδιμερισμό. Ένα τέτοιο πεπτίδιο, που ορίζεται GO-202, περιέχει μία αλληλουχία πολυ-Arg για κυτταρική διείσδυση που συνδέονται με CQCRRKN ​​(L-αμινοξέα? Σχήμα 3Α). GO-202 συντέθηκε με ένα Ν-τερματικό σήμα FITC για να αξιολογηθεί άμεσης δέσμευσης αυτού του πεπτιδίου σε GST-MUC1-CD δεσμεύεται σε πλάκες ELISA γλουταθειόνη με λεπτό υμένιο. Όπως καθορίζεται από τη μέθοδο σύνδεσης κορεσμού, η σταθερά διαστάσεως (Kd) ήταν 0,88 μΜ (Εικόνα 3Α). Μπορούμε επίσης αξιολογήθηκε πρόσδεσης ενός πεπτιδίου, που ορίζεται GO-203, στην οποία ο τομέας κύτταρο-διεισδυτική πολυ-Arg συνδέεται με CQCRRKN ​​(D-αμινοξέα? Σχήμα 3Β). Η επώαση των ΡΙΤΟ-επισημασμένο GO-203 σε GST-MUC1-CD επέδειξε μια Kd των 0.63 μΜ (Σχήμα 3Β). Για να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση της δέσμευσης, FITC-GO-203 επωάστηκε με His-MUC1-CD δεσμεύεται σε πλάκες ELISA νικελίου-επικάλυψη (Σχήμα 3C). Σε αυτές τις μελέτες, η Kd ήταν 0,86 μΜ, υποδεικνύοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ GO-203 και MUC1-CD δεν προσδίδεται από την ΟδΤ ή His-tag. Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης, FITC-GO-203 επωάστηκε επίσης με GST-MUC1-CD στο οποίο ο CQC μοτίβο μεταλλάχθηκε σε AQA. Εδώ, δεν υπάρχει αλληλεπίδραση ήταν εμφανής μεταξύ FITC-GO-203 και GST-MUC1-CD (AQA) όπως υποστηρίζεται από την ανίχνευση μόνο υποβάθρου φθορισμού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο τα L- και D-μορφές του πεπτιδίου CQCRRKN ​​δεσμεύονται άμεσα με MUC1-CD και ότι η σύνδεση είναι ειδική στο CQC μοτίβο.

(Α) Δεικνύεται η αλληλουχία L-αα του GO -202 και (Β) ακολουθία D-αα της GO-203. Η φαινόμενη Kd για την σύνδεση του (Α) FITC-GO-202 σε GST-MUC1-CD, (Β) FITC-GO-203 σε GST-MUC1-CD και (C) FITC-GO-203 έως His-MUC1-CD πρωτεΐνες προσδιορίζεται με πειράματα δέσμευσης κορεσμού.

η

GO-203 Έντυπα δισουλφιδικούς δεσμούς με MUC1-CD στο CQC Motif

Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η σύνδεση των GO-203 με MUC1-CD , GO-203 επωάστηκε με καθαρισμένο GST-MUC1-CD. Τα σύμπλοκα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και πέψης θρυπτικού αναλύθηκαν με MALDI-TOF-MS (Εικόνα 4Α). πεπτίδιο αναγνώρισης που βασίστηκε στην ανάλυση MS-γέφυρα των θρυπτικών δεδομένα πέψης MALDI-TOF ενάντια στις αλληλουχίες των 2 γνωστά συστατικά της αντίδρασης, δηλαδή GST-MUC1-CD (S1 Σχήμα) και GO-203. Το διμερές πεπτίδιο με ένα μόνο δισουλφιδική γέφυρα στην CQC μοτίβο εκπροσωπήθηκε από την κορυφή του m /z 1483.6084 Da (Σχήμα 4Β) και οι ιδιότητες παρατίθενται στον πίνακα 1. Αυτή η κορυφή δεν παρατηρήθηκε στα πέψης θρυπτικού με GST + GO-203 και τα δείγματα GST-MUC1-CD, υποδεικνύοντας ότι GO-203 μορφές δισουλφιδίου γέφυρες ειδικά με MUC1-CD, και όχι με την GST.

(Α) θρυψίνη πέψης της 35 kDa GST-MUC1-CD και GO- 203 συγκρότημα αναλύθηκε με MALDI-TOF μάζα δακτυλικών αποτυπωμάτων. (Β) Η επισημασμένη περιοχή (Α) επεκτάθηκε για να δείξει μια ειδική κορυφή πεπτιδίου σε m /z 1483 Da οφείλεται στο σχηματισμό μιας δισουλφιδικής γέφυρας μεταξύ GO-203 και MUC1-CD.

Η

GO-203 μπλοκ MUC1-CD ομοδιμερισμό

In Vitro

Η

Η ακολουθία MUC1-CD περιορίζεται σε είδη θηλαστικών που εμφανίστηκε στα τέλη του εξέλιξη [6]. Η αλληλουχία CQCRRK διατηρείται στον αρουραίο, σκύλο και ανθρώπινες πρωτεΐνες (Σχήμα 5Α). Μια ανάλυση των πρωτεϊνών ομολογία αλληλουχίας χρησιμοποιώντας Clustal Omega κατέδειξε επίσης ότι (AAA60019.1) μετοχές ανθρώπου-CD MUC1 σημαντική ομολογία αλληλουχίας 83% με τις πρωτεΐνες MUC1-CD του αρουραίου (AAI66505) και σκύλου (NP_001181906.1) (Σχήμα 5Α). Για να εκτιμηθεί η λειτουργική σημασία της CQCRRK, δημιουργήσαμε καθαρίστηκε His-tagged πρωτείνης MUC1-CD αρουραίου (~ 10 kDa) (Σχήμα 5Β). Η επώαση του αρουραίου His-MUC1-CD σε ρΗ 7,4 συνδέθηκε με τον σχηματισμό ~ 20 kDa ομοδιμερών (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, η προσθήκη της GO-203 σε αυξανόμενες ποσότητες σε σχέση με την His-MUC1-CD μειώνεται ομοδιμερισμό (Σχήμα 5Β). Σκύλος και ανθρώπινο His-tagged πρωτεΐνες MUC1-CD σχηματίζονται επίσης ομοδιμερή που ανέστειλε αποτελεσματικά με GO-203 (Σχ 5C και 5D). Αντιθέτως, το πεπτίδιο ΟΡ-2, η οποία περιλαμβάνει AQARRKN, δεν είχε καμία επίδραση στην ανθρώπινη MUC1-CD ομοδιμερισμό (Σχήμα 5D).

(Α) του Ανθρώπου, πρωτεΐνες αρουραίου και σκύλου MUC1-CD μοιράζονται ομολογία αλληλουχίας όπως υψηλή ευθυγραμμίζονται χρησιμοποιώντας Clustal Omega. Οι συντηρημένες περιοχές φαίνεται στα κουτιά, με το κόκκινο πλαίσιο δηλώνει την περιοχή CQCRRK. (Β) αρουραίου και (C) σκύλος καθαρίστηκε-MUC1-CD His πρωτεΐνες επωάστηκαν με PBS (έλεγχος) ή αυξανόμενες ποσότητες GO-203 (50, 150 και 450 μΜ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε ένα μη-αναγωγικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-MUC1-C. (Δ) Η καθαρή ανθρώπινη His-MUC1-CD πρωτεΐνη επωάστηκε με PBS (έλεγχος), CP-2 (150 μΜ) ή GO-203 (150 μΜ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε μη αναγωγικό πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση με αντι-MUC1-C.

Η

GO-203 Μπλοκ MUC1-CD ομοδιμερισμό σε κύτταρα

Για την περαιτέρω αξιολόγηση τα αποτελέσματα της στόχευσης του μοτίβου MUC1-CD CQCRRK σε κύτταρα, μπορούμε κύτταρα 293Τ να εκφράσουν αρουραίου GFP επισύναψη ή FLAG-tagged MUC1-CD (Σχήμα 6Α, αριστερά). μελέτες Συνανοσοκατακρήμνιση έδειξαν ότι FLAG-MUC1-CD σχηματίζει διμερή με GFP-MUC1-CD (Σχήμα 6Α, δεξιά). Αξίζει να σημειωθεί ότι, κατεργασία των επιμολυσμένων κυττάρων 293Τ με GO-203 συνδέθηκε με την αναστολή των συμπλοκών FLAG-MUC1-CD /GFP-MUC1-CD (Σχήμα 6Α, δεξιά). Αντίθετα, η θεραπεία με CP-2 δεν είχε εμφανή επίδραση (Σχήμα 6Α, δεξιά). Η επιμόλυνση των κυττάρων 293Τ να εκφράσουν με ετικέτα σκύλος MUC1-CD (Σχήμα 6Β, αριστερά και δεξιά) ή ανθρώπινο MUC 1-CD (Σχήμα 6C, αριστερά και δεξιά) επιβεβαίωσε το σχηματισμό ομοδιμερών MUC1-CD. Επιπλέον, GO-203 αγωγή είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της MUC1-CD ομοδιμερισμό (Σχήμα 6Β, δεξιά και 6C, δεξιά). Επιπλέον, η επίδειξη ότι η θεραπεία CP-2 δεν έχει καμία επίδραση στο σχηματισμό MUC1-CD ομοδιμερές υποστήριξε την ειδικότητα της στόχευσης του CQC μοτίβο (Σχήμα 6Β, δεξιά και 6C, δεξιά).

293Τ κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά σε εκφράζουν ένα κενό φορέα και (Α) αρουραίος GFP-MUC1-CD και FLAG-MUC1-CD, (Β) σκύλος GFP-MUC1-CD και FLAG-MUC1-CD ή (C) ανθρώπινο GFP-MUC1-CD και FLAG-MUC1 -CD. Στις 48 ώρες, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ GO-203 ή CP-2 κάθε ημέρα για 3 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ανοσοκηλίδωση με αντι-ΟΡΡ και αντι-FLAG (αριστερά πάνελ). Λύματα ολόκληρων κυττάρων επίσης καταβυθίστηκε με αντι-FLAG και τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα (δεξιά πάνελ).

Η

Η σύνδεση του GO-203 στην ενδογενή MUC1-C σε κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν GO-203 συνεργάτες με ενδογενή MUC1-C, που αντιμετωπίζονται ZR-75-1 κύτταρα καρκίνου του μαστού με FITC-GO-203. Ανάλυση της αντι-MUC1-C καθιζάνει με ανοσοστύπωμα με αντι-FITC έδειξαν ότι GO-203 σχηματίζει σύμπλοκα με MUC1-C (Σχήμα 7Α). Παρόμοιες μελέτες πραγματοποιήθηκαν σε FITC-GO-203-θεραπεία H1975 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα παρείχαν περαιτέρω υποστήριξη για την ιδέα ότι GO-203 συνεργάτες με ενδογενή MUC1-C (Σχήμα 7Β). MUC1-C εκφράζεται ως ~ 25-20 kDa Ν-γλυκοζυλιωμένη μορφή και ως 17/15 kDa μη γλυκοζυλιωμένη είδη [6,8]. Επιπλέον, MUC1-C είναι ανιχνεύσιμη ως ομοδιμερή και ανώτερα ολιγομερή τάξης υπό μη αναγωγικές συνθήκες όπως χρησιμοποιούνται σε αυτά τα πειράματα [8]. Στο πλαίσιο αυτό και όπως φαίνεται σε ολόκληρο ανοσοστυπώματα που λαμβάνονται από τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν παραπάνω (Σχήμα 7Α και 7Β), FITC-GO-203 αλληλεπιδρά με τις διάφορες MUC1-C μονομερών και ολιγομερών μορφών (S2A και S2B Εικ). Για τον καθορισμό του εντοπισμού των GO-203 σύμπλοκα /MUC1-C, ανοσοφθορισμός micoroscopy διεξήχθη σε κύτταρα 293Τ επιμολυσμένα για να εκφράσουν DsRedMN1 επισημασμένου MUC1 ή /και υποβάλλεται σε επεξεργασία με FITC-GO-203. 293Τ κύτταρα ελέγχου επωάζονται με Hoechst χρωστική για τη χρώση των πυρήνων δεν είχε ανιχνεύσιμη DsRed ή FITC σήματα (Εικ 7C). Αντιθέτως, σε κύτταρα επιμολυσμένα για να εκφράζουν DSRedMN1-MUC1, τα DsRed σήματα εντοπίζεται κυρίως κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης με λίγες κουκκίδες ανιχνεύσιμη στον πυρήνα (Σχήμα 7D). Σε κύτταρα 293Τ που έλαβαν μόνο FITC-GO-203, τα σήματα FITC ήταν εντοπισμένες κατά μήκος της μεμβράνης και στο κυτταροδιάλυμα (Εικ 7Ε). Επιπλέον, σε κύτταρα 293Τ που εκφράζουν DSRedMN1-MUC1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με FITC-GO-203, συν-εντοπισμό των σημάτων DsRed και FITC (Κόκκινο + Πράσινο → Κίτρινο) παρατηρήθηκε κατά μήκος της μεμβράνης (Σχήμα 7F). Η φωτεινή χρώση με FITC-GO-203 σε κύτταρα 293Τ που εκφράζουν MUC 1 σε σύγκριση με εκείνη στην MUC 1-null ρύθμιση θα μπορούσε να εξηγηθεί από την κατακράτηση του FITC-GO-203 σε σύμπλοκα με MUC1-C στην κυτταρική μεμβράνη.

(Α) ZR-75-1 και (Β) H1975 κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (έλεγχος), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ FITC-GO-203 όλη τη νύκτα. Η λύση πραγματοποιήθηκε σε ένα ρυθμιστικό μη αναγωγικές. Τα υλικά λύσεως καταβυθίστηκαν με αντι-MUC1-C ή ένα IgG ελέγχου που ακολουθείται από προσθήκη του μη-αναγωγικό ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Τα ιζήματα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-FITC και αντι-MUC1-C. κύτταρα 293Τ αφέθηκαν χωρίς θεραπεία (C? έλεγχος), (Δ) παροδικά επιμολυσμένα με DsRedMN1-MUC1, (Ε) υποβάλλεται σε επεξεργασία με 5 μΜ FITC-GO-203, ή (F) επιμολυσμένα με DsRedMN1-MUC1 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μΜ FITC- GO-203. Κατανομή του MUC 1 (κόκκινο) ή FITC-GO-203 (πράσινο) και colocalization (κίτρινο) εκτιμήθηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με βαφή Hoechst (μπλε).

Η

Συζήτηση

Η MUC1-C διαμεμβρανική υπομονάδα αλληλεπιδρά με RTKs, όπως EGFR, στην κυτταρική επιφάνεια και συμβάλλει στην ενεργοποίηση τους και κατάντη ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης [6,19,23]. Κατά συνέπεια, υπήρξε αναδυόμενες ενδιαφέρον για την λειτουργία της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C ως ογκοπρωτεΐνη. Στο πλαίσιο αυτό, η υπερέκφραση της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC 1-C είναι επαρκής για να προσδώσει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη και ογκογονικότητα [5]. Πώς η κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C προκαλεί μετασχηματισμού υπήρξε το επίκεντρο της σημαντικής μελέτης? Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη δομή αυτού του ογκογόνου πρωτεΐνης. Έτσι, οι παρούσες μελέτες διερευνήθηκαν τα φυσικά χαρακτηριστικά του cytoplastic τομέα 72-αμινοξέων και αποδεικνύουν ότι, εκτός από την αλληλουχία CQCRRK κατοικούν πλησίον της κυτταρικής μεμβράνης, ενώ το υπόλοιπο αυτής της πρωτεΐνης δεν έχει εμφανή δομή.

Η απουσία αναγνωρίσιμων έλικες άλφα ή βήτα-φύλλα ήταν ενδιαφέρον το ότι οι αλληλουχίες κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C προς τα κάτω του CQC μοτίβο υπόκεινται σε φωσφορυλίωση από πολλαπλές κινάσες οι οποίες περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, EGFR, ΜΕΤ, SRC, ABL, GSK3 και PKC [ ,,,0],1,4]. Με τη σειρά τους, αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ρυθμίζουν αλληλεπιδράσεις της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C με τελεστές μονοπατιών ποικίλες σηματοδότησης που συνδέονται με τον μετασχηματισμό [1,4]. Ως ένα παράδειγμα, η φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C παρέχει σύνδεση προς την οδό τελεστή WNT, β-κατενίνης, και ως εκ τούτου η ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων WNT [5,24]. Άλλες εργασίες που συνδέονται με την κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C στην ενεργοποίηση της p65 NF-κΒ [25,26] και STAT1 /3 [27,28] οδούς. Με τον τρόπο αυτό, ο εγγενώς διαταραγμένη δομή της κυτταροπλασματικής περιοχής MUC1-C έχει προφανώς την ικανότητα να υποβληθούν σε ποικίλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και να αλληλεπιδρά με πολλαπλούς τελεστές.

Οι πρωτεΐνες με εγγενώς διαταραγμένο δομές που βρέθηκαν σε όλο το γονιδίωμα και περιλαμβάνουν ογκοπρωτεΐνες, όπως p53 [29], ΡΤΕΝ [30], ο υποδοχέας ανδρογόνων [31] και άλλοι [14]. Αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να παρουσιάσουν τις προκλήσεις για την ανάπτυξη φαρμάκων με δεδομένη την απουσία του τσέπες ή καλά καθορισμένες τρισδιάστατες πτυχώσεις [14]. Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στο σχεδιασμό των παραγόντων που στοχεύουν το μοτίβο CQC, με βάση τις παρατηρήσεις ότι ενδογενείς μορφές MUC1-C ομοδιμερή και οι CQC κυστεΐνες είναι αναγκαίες και επαρκείς για την αλληλεπίδραση αυτή [7,8]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι μεταλλάσσοντας το μοτίβο CQC να AQA κατήργησε την ικανότητα του MUC1-C για την προώθηση της μετατροπής [7]. Τα παρόντα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι ένα L-αμινοξύ [Κ]

9-CQCRRKN ​​περιέχει πεπτίδιο (GO-202) συνδέεται άμεσα με την κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με ένα D-αμινοξύ [Κ]

9-CQCRRKN ​​πεπτίδιο (GO-203), σύμφωνα με μια οπισθοανάστροφο επίδραση στην οποία η CQC μοτίβο πλαισιώνεται από τις δύο πλευρές με βασικά αμινοξέα. Εξειδίκευση αυτών κυστεΐνη μεσολάβηση αλληλεπιδράσεων επιβεβαιώθηκε σε μελέτες που αποδεικνύουν ότι μετάλλαξή CQC να AQA στην κυτταροπλασματική περιοχή MUC1-C ή στο πεπτίδιο ελέγχου CP-2 καταργηθεί δεσμευτική.

Σε συνεννόηση με άμεση σύνδεση με το MUC1- C κυτταροπλασματική περιοχή CQC μοτίβο, GO-203 ήταν αποτελεσματική στη διακοπή ομοδιμερή MUC1-CD in vitro. Επιπλέον, GO-203 θεραπεία ανέστειλε το σχηματισμό του GFP-MUC1-CD /ομοδιμερή FLAG-MUC1-CD σε κύτταρα, σε συμφωνία με πρόσδεση του GO-203 σε μονομερή ετικέτα-MUC1-CD ενδοκυτταρικά και μπλοκάροντας έτσι τη διαθεσιμότητα της MUC1-C κυτταροπλασματική CQC μοτίβο τομέα για σχηματισμό ομοδιμερούς. Από αυτή την άποψη και το σημαντικότερο, οι μελέτες Συνανοσοκατακρήμνιση Αποδείχθηκε περαιτέρω ότι FITC-GO-203 συνδέεται με ενδογενή MUC1-C σε κύτταρα του μαστού και καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, ομοεστιακό μελέτες έδειξαν ότι GO-203 δεσμεύεται κυρίως στην MUC1-C στην κυτταρική μεμβράνη. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν συλλογικά την έννοια που GO-203 συνδέεται με το MUC1-C κυτταροπλασματική περιοχή CQC μοτίβο στα κύτταρα και έτσι να εμποδίζει MUC1-C ομοδιμερισμό και τη λειτουργία.