Abstract

GAIP πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης C άκρο (GIPC) είναι γνωστό ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε μία ποικιλία φυσιολογικών και ασθένειας. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε εντοπίσει ένα νέο ρόλο για GIPC ως κύριος ρυθμιστής της αυτοφαγία και τις εξωκυτταρικό μονοπάτια στον καρκίνο. Δείχνουμε ότι η εξάντληση των GIPC επαγόμενης αυτοφαγία σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, όπως είναι εμφανές από την προς τα πάνω ρύθμιση του δείκτη LC3II αυτοφαγία. Αναφέρουμε επίσης ότι GIPC ρυθμίζει κυτταρικές οδούς διακίνησης, ρυθμίζοντας την έκκριση, βιογένεση και μοριακή σύνθεση εξωσωμάτων. Εντοπίσαμε επίσης τη συμμετοχή της GIPC στις μεταβολικές οδούς του στρες που ρυθμίζουν την αυτοφαγία και microvesicular απόπτωση, και παρατήρησε ότι το καθεστώς GIPC καθορίζει τη φόρτωση των κυτταρικών φορτίου στο εξωσωμάτων. Επιπλέον, έχουμε δείξει την υπερέκφραση του γονιδίου ABCG2 αντίστασης φαρμάκου σε εξωσώματα από GIPC εξαντλημένο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Δείξαμε επίσης ότι η εξάντληση των GIPC από τα καρκινικά κύτταρα να ευαισθητοποιούνται σε θεραπεία γεμσιταμπίνη, μια λεωφόρο που μπορεί να διερευνηθεί ως δυνητική θεραπευτική στρατηγική για να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου για τον καρκίνο

Παράθεση:. Bhattacharya S, Pal K, Sharma AK , Dutta SK, Lau JS, Yan IK, et al. (2014) GAIP πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με C-Terminus Ρυθμίζει Autophagy και εξωσωμάτων Βιογένεση του καρκίνου του παγκρέατος μέσω μεταβολικών οδών. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10.1371 /journal.pone.0114409

Επιμέλεια: Ramani Ramchandran, Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25, Απρ 2014? Δεκτές: 7 Νοέμ του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3, Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Bhattacharya et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA78383 και CA150190 (DM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μακροαυτοφαγία, κοινώς αποκαλείται ως αυτοφαγία, είναι ένα ουσιαστικό καταβολική διαδικασία που κυττάρων εφαρμογή σε διάφορες βιολογικές και φυσιολογικές δραστηριότητες [1], [2]. Υπό κανονικές κυτταρικές συνθήκες, η διαδικασία αυτή διατηρεί την κυτταρική ομοιοστασία και ιστών σε ένα προστατευτικό τρόπο από την ανακύκλωση και εξευτελιστική κυτταρικά συστατικά κατά τη διάρκεια του κυτταρικού θανάτου [2] – [5]. Προηγουμένως, θεωρήθηκε ότι η autophagosome, ένα διπλό-membraned κυστίδιο, καταπίνει οργανίδια τυχαία [1], [2], [5]? Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η επιλογή των οργανιδίων κατευθύνεται από το φορτίο ειδικούς παράγοντες [6]. Επιπλέον, autophagy παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές διαδικασίες ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [7]. Σε διάφορους τύπους καρκίνου, αυτοφαγία μπορεί να επηρεάσει την έναρξη και την πρόοδο της νόσου του [8], [9] και την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου κάτω από το μεταβολικό στρες της υποξίας. Επειδή οι μεταλλάξεις των γονιδίων που σχετίζονται με αυτοφαγία έχουν αναφερθεί σε ανθρώπινους καρκίνους [10], [11], οι μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην γενετική και χημική αναστολή autophagy ως θεραπευτική στρατηγική [12].

GAIP αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη C- άκρο (GIPC) αρχικά αναγνωρίστηκε ως αλληλεπιδρά εταίρος της ΟΤΡάσης-πρωτεΐνης ενεργοποίησης RGS-GAIP για G-πρωτεΐνη υποδοχέα GI υπομονάδα άλφα [13]. Η περιοχή PDZ του GIPC σταθεροποιεί πολλές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, περιλαμβανομένου του μεταφορέα GLUT1, Σημαφορίνης-F, νευροπιλίνη-1, ιική πρωτεΐνη ΦΟΡΟΣ, της ντοπαμίνης D2 και D3, και IGF1R [14] – [19]. Ενώ η πλειοψηφία των συνδετήρων τομέα δέσμευσης PDZ για GIPC είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, πολλές από αυτές είναι κυτοσολικές πρωτεΐνες, όπως APPL1 και RGS19 [13], [20]. Λειτουργικά, η Ν-τερματική περιοχή του GIPC εμπλέκεται στην διμερισμό και η C-τελική περιοχή του GIPC αλληλεπιδρά με μυοσίνη VI (MYO6) [21], [22], τονίζοντας το ρόλο της ως μόριο προσαρμογέας για τα φορτία domain-στοχευμένες φόρτωση ΡΟΖ πάνω στην πρωτεΐνη κινητήρα MYO6 για τις μεταφορές. GIPC επίσης εμπλέκονται στη διακίνηση των διαφόρων διαμεμβρανικών πρωτεϊνών σε ενδοκυτταρικά κυστίδια και απαραίτητη για την διακίνηση των εσωτερικεύονται ιντεγκρινών κατά τη μετανάστευση των κυττάρων, την αγγειογένεση και την κυτοκίνηση [23] – [25]. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης GIPC αναφερθεί σε αρκετές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του παγκρέατος και του καρκίνου του μαστού, την προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [19] τους, [26] – [30]. Αντίθετα, η εξάντληση των GIPC σε καρκινικά κύτταρα αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και προάγει την απόπτωση. Knockdown των αποτελεσμάτων GIPC σε G

2 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και μειώνει τη θνησιμότητα σε κύτταρα MDA-ΜΒ231, υποδηλώνοντας περαιτέρω το ρόλο της GIPC σε κυτταροκίνηση και μετανάστευση κυττάρων [23], [31].

Τα εξωσώματα είναι ενδοκυτταρικά κυστίδια (40-100 nm) που απαιτούνται για την ενδοκυτταρική επικοινωνία σε πολυκύτταρους οργανισμούς [23]. Η μοριακή μηχανήματα που εμπλέκονται στην εξωσωμάτων βιογένεση περιλαμβάνει τέσσερις multiprotein συγκροτήματα γνωστή ως ενδοσωματιακής διαλογής αρμόδιος για τις μεταφορές (ESCRT) -0, -Ι-ll, και -III, και βοηθητικές πρωτεΐνες, όπως Alix και VPS4. Η ESCRT-0, -Ι και -II συγκροτήματα αναγνωρίζουν και διαχωρίζουν ουβικιτινιωμένες πρωτεΐνες της μεμβράνης στο ενδοσωματιακή περιορισμό της μεμβράνης, ενώ το συγκρότημα ESCRT-III είναι υπόλογοι για τη μεμβράνη εκκολαπτόμενους και την πραγματική απομάκρυνση του ενδοαυλική κυστίδια (ILVs) [32]. Πρόσφατα, Alix (επίσης γνωστή ως PDCD6IP) ήταν λειτουργικά συνδεδεμένη με εξωσωμάτων βιογένεση μέσω της αλληλεπίδρασης της με τις πρωτεΐνες TSG101 και CHMP4 [33] – [35]. Μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι ο σχηματισμός και η απελευθέρωση των αρρεστίνη τομέα που περιέχουν 1 μεσολάβηση μικροκυστίδια (ARMMs) στη μεμβράνη του πλάσματος εξαρτάται από την πρόσληψη της πρωτεΐνης TSG101 [36].

Υπάρχουν συσσωρεύονται ενδείξεις ότι παίζει GIPC ένα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική διακίνηση. Ειδικότερα, GIPC δρα ως ικρίωμα για τον έλεγχο μεσολάβηση υποδοχέα διακίνηση [20], [22], [37] και μετά από εσωτερικοποίηση του υποδοχέα, GIPC συσχετίζει παροδικά με μια δεξαμενή ενδοκυτταρικά κυστίδια κοντά στη μεμβράνη του πλάσματος [15]. Εξωσωμάτων βιογένεση καθώς και το σχηματισμό του autophagosome περιλαμβάνει κυστιδίων ενδοκυτώσεως. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία σαφής ένδειξη ότι αυτές οι δύο μηχανισμοί στιχομυθία σχηματισμού κυστιδίων με το άλλο [38]. Στην παρούσα μελέτη, αποκαλύπτουν ένα μοναδικό ρυθμιστικό ρόλο του GIPC στην αυτοφαγία μέσω μεταβολικών μονοπατιών και η διαμόρφωση της έκκρισης εξωσωμάτων. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι η εξάντληση των GIPC από τα καρκινικά κύτταρα τους ευαισθητοποιεί σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως η γεμσιταμπίνη, μια λεωφόρος που μπορούν να διερευνηθούν περαιτέρω, ως μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική κατά της ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργεια κυττάρων & amp? knockdown κυτταρικές σειρές GIPC

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές AsPC-1 και PANC-1 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (για AsPC-1) ή υψηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ (για PANC-1) που έχει συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 5% Ε-γλουταμίνη και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 95% αέρα-5% CO

2 (ν /ν). Σταθερές κυτταρικές γραμμές knockdown GIPC παρήχθησαν χρησιμοποιώντας φακοϊό shRNA. Τα σωματίδια φακοϊού παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο έκφρασης gag-pol pCMVΔ8.91, το πλασμίδιο έκφρασης περιβλήματος VSVG PMD-G, και το πλασμίδιο που κωδικοποιεί pLKO.1 φορέα cDNAs για την έκφραση του ΟΙΡΟ /Synectin shRNA (5 «-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3 ‘). GIPC /Synectin shRNA στο pLKO.1 αγοράστηκε από την Open Biosystems. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και καταψύχθηκαν στους -80 ° C. PANC-1 ή AsPC-1 κύτταρα στη συνέχεια μολύνθηκαν επί μία νύκτα στους 37 ° C και σταθερή αποικίες απομονώθηκαν μετά από επιλογή πουρομυκίνης (1 μg /ml). Για να εξασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα της knockdown ΟΙΡΟ /Synectin, προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδα για ΟΙΡΟ /Synectin. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε μεταγωγή με ένα άδειο φορέα πρωτεΐνη. Ρετροϊική ρΒΑΒΕ-puro mCherry-EGFP-LC3B πλασμίδιο από Addgene (Addgene πλασμίδιο 22418) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή σωματιδίων ρετροϊού χρησιμοποιώντας κύτταρα 293Τ ακόλουθη πρότυπη διαδικασία. AsPC-1 ή PANC-1 κύτταρα μολύνθηκαν με σωματίδια ρετροϊού και σταθερή αποικίες απομονώθηκαν μετά από επιλογή πουρομυκίνης (1 μg /ml). Τα πειράματα διεξήχθησαν σε 70-80% συρροή κυττάρου και επιβεβαιώθηκε σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

παρεμβολή RNA, επιμόλυνση

Μετά από μια 24-ωρη επώαση με θρεπτικό μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντι-GIPC μικρό RNA παρεμβολής (siRNA) χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο DharmaFECT 2 Μορφομετατροπή (Dharmacon, Lafayette, CO). Εβδομήντα δύο έως 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, GIPC knockdown επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Μια παρόμοια προσέγγιση siRNA υιοθετήθηκε για αντι-ATG7 και αντι-Beclin1 νοκ ντάουν. Για πειράματα γλυκόζη πείνα, και οι δύο τον έλεγχο siRNA και GIPC siRNA επεξεργασμένα κύτταρα AsPC-1 κρατήθηκαν σε γλυκόζη ελεύθερο RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS για τελευταίες 16 ώρες του πειράματος 96 ώρες. Για αυτοφαγικά ροή πειράματα, τόσο ελέγχου siRNA και GIPC siRNA αντιμετωπίζονται AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις των πεπστατίνη-Α και Ε-64d για την τελική 24 ώρες του πειράματος 96 ώρες.

Αντισώματα και ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

ολόκληρου κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης συμπληρωμένο με ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και Ανάσχεση κοκτέιλ αναστολέα φωσφατάσης (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Anti-GIPC, αντι-ΡΙ_Ογ, και οι συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Αντισώματα έναντι ABCG2, mTOR, φωσφο-mTOR, p70S6K, φωσφο-p70S6K, ATG7, Beclin1, ΑΜΡΚ-α, και φωσφο-ΑΜΡΚ-α αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technologies. Anti-CHMP4b και αντι-TSG101 αγοράστηκε από Abcam? αντι-β-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma? και το αντίσωμα Alix αγοράστηκε από την Thermo Scientific. Western blots αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα SuperSignal West Pico (Thermo Scientific) και ανοσοκαταβυθίσεις διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα (2 χ 10

4) σπάρθηκαν σε μια καλυπτρίδα σε μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με GIPC siRNA ή ομελέτα siRNA (Dharmacon) και το μέσο αλλάχθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Μετά από αποκλεισμό με 10% ορό κατσίκας για 15 λεπτά, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Τα πλακίδια στη συνέχεια χρωματίζονται με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια LC3 για 2 ώρες σε 1% ορό κατσίκας. Μετά την επώαση τα πλακίδια με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με AlexaFluor 488 (1:200? Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) για 1 ώρα, τα πλακίδια τοποθετημένα με Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) που περιέχει 4 ‘, 6-διαμιδινο-2 -phenylindole (DAPI) και συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη. Σε μια άλλη σειρά πειραμάτων, τα κύτταρα που εκφράζουν mCherry-EGFP-LC3B σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με GIPC siRNA ή ομελέτα siRNA. Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα πλακίδια τοποθετήθηκαν με Vectashield που περιείχε ϋΑΡΙ όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

γλυκόζη πρόσληψη και ενδοκυτταρική μέτρηση της γλυκόζης δοκιμασία

Σταθερό κύτταρα, είτε επιμολυσμένα με GIPC shRNA ή τον φορέα ελέγχου, σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Η πρόσληψη γλυκόζης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την πρόσληψη γλυκόζης με βάση τα κύτταρα κιτ δοκιμασίας (Cayman Chemical, Αηη Arbor, ΜΙ) χρησιμοποιώντας ένα σημασμένο με φθορισμό ανάλογο δεοξυγλυκόζη. Για μια ενδοκυτταρική μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης, το Amplex Red γλυκόζης Assay Kit (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε με μία ελαφρά τροποποίηση με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [39]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και το προκύπτον κυτταρικό ίζημα πλύθηκε δύο φορές σε PBS και διασπείρονται σε 1Χ ρυθμιστικό αντίδρασης από το κιτ. Τα κύτταρα λύθηκαν με κατεργασία υπερήχων με τρεις κύκλους των 10 δευτερολέπτων για 30 δευτερόλεπτα από 20% ενέργειας, ενώ διατηρείται συνεχώς σε πάγο. Πενήντα μΙ διαλύματος αντίδρασης (10 mM Amplex Red, 10 U /ml HRP, 100 U /ml οξειδάσης γλυκόζης, 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού νατρίου, ρΗ 7.4) προστέθηκε σε 50 μΐ κυτταρολύματος σε μια πλάκα 96 φρεατίων και επωάζονται σε σκοτάδι στους 37 ° C για 30 λεπτά. Ο φθορισμός (διέγερση: 544, Εκπομπή: 590). Μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός SpectraMax και οι τιμές εκφράζονται ως σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU) /mg πρωτεΐνης

εξωσωμάτων απομόνωση

Εξωσώματα ήταν απομονώνεται από ρυθμισμένο μέσο των PANC-1 και AsPC-1 κύτταρα με διαφορική φυγοκέντρηση. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70-80% συρροή και μέσα αντικαταστάθηκαν με μέσα που περιέχουν 10% ορό εμβρύου μόσχου στερούνται μικροσωματιδίων μέσω φυγοκέντρησης (60 λεπτά στα 100.000 χ

ζ

). Μετά από 72 ώρες επώασης, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και καθαριστεί από τα κυτταρικά θραύσματα και τα νεκρά κύτταρα με δύο διαδοχικές περιστροφές στους 4 ° C, 3000 χ

g

για 10 λεπτά. Εγκεκριμένο υπερκείμενα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν περαιτέρω σε 4 ° C, 60.000 χ

g

για 70 λεπτά. Τα προκύπτοντα σφαιρίδια εξωσωμάτων πλύθηκαν με διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και πάλι στους 4 ° C, 100,000 χ

g

για 70 λεπτά. Τα τελικά σφαιρίδια εξωσωμάτων επαναιωρήθηκαν σε PBS ή νερό, ανάλογα με το πείραμα.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Πρόσφατα παρασκευασμένο εξωσώματα επαναιωρείται σε νερό περαιτέρω διασπείρονται σε στερεωτικό διάλυμα ατού, που αποτελείται από 4 % (v) φορμαλδεΰδη και 1% (v) γλουταραλδεΰδη σε ρυθμιστικό 0,1 Μ φωσφορικό σε ρΗ 7.2. Τα εξωσώματα στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό 0,1 Μ φωσφορικό, 1% τετροξείδιο του οσμίου σε ρυθμιστικό φωσφορικού 0.1 Μ, απεσταγμένο νερό, 2% (ν) οξικό ουρανύλιο, απεσταγμένο νερό, αιθανόλη, και απόλυτη ακετόνη σε ακολουθία. Τέλος, εξωσώματα τοποθετήθηκαν σε ένα πλέγμα TEM για την εξέταση χρησιμοποιώντας ένα

Philips Τέχναι

Τ12.

Πρωτεομική ανάλυση

ταυτοποίηση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται μέσω πέψης με θρυψίνη σε γέλη χρησιμοποιώντας nanoLC- MS /MS με υβριδικό Orbitrap /γραμμική φασματομετρία μάζας παγίδας ιόντων. Εν συντομία, πρωτεΐνης από τα εξωσώματα του GIPC ανεπάρκεια σταθερές κυτταρικές σειρές επιλύθηκε σε ένα 4-12% NuPage γέλη (ρυθμιστικό MOPS) με 20 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος SDS-PAGE που περιείχε 50 mM DTT. Τα πήγματα βάφτηκαν με κολλοειδές Biosafe μπλε χρωστική (BioRad) και τα επιθυμητά ζώνες αποκόπηκαν από την πηκτή για ανάλυση φασματομετρίας μάζας χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες διαδικασίες. Κολλοειδές μπλε χρωματισμένο ζώνες γέλης αποχρωματίστηκαν σε 50% ακετονιτρίλιο /50 mM Tris ρΗ 8,1 μέχρι να γίνει διαυγές. Οι ζώνες στη συνέχεια ανάγεται με 50 mM TCEP /50 mM Tris, ρΗ 8,1 στους 55 ° C για 40 λεπτά και αλκυλιώθηκε με 20 mM ιωδοακεταμιδίου /50 mM Tris ρΗ 8.1 σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά στο σκοτάδι. Οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε πέψη

in situ

με 30 μΙ (0.005 μg /μΙ) θρυψίνη (Promega Corporation, Madison WI) σε 20 mM Tris ρΗ 8.1 /0,0002% Zwittergent 3-16, στους 55 ° C για 2 ώρες, που ακολουθείται από εκχύλιση του πεπτιδίου με 10 μΐ 2% τριφθοροοξικό οξύ και έπειτα 60 μΙ ακετονιτριλίου. Τα ενωμένα εκχυλίσματα συμπυκνώθηκαν σε λιγότερο από 5 μl σε συμπυκνωτή Speed-Vac (Savant Instruments, Holbrook, ΝΥ) και στη συνέχεια φέρεται σε 0,2% τριφθοροοξικό οξύ για ταυτοποίηση πρωτεϊνών με υγρή χρωματογραφία νανο-ροής ηλεκτροψεκασμού διαδοχική φασματομετρία μάζας (nanoLC-ESI -MS /MS) χρησιμοποιώντας ένα ThermoFinnigan Orbitrap Elite Hybrid Φασματόμετρο μάζας (Thermo Fisher Scientific, Βρέμη, Γερμανία) σε συνδυασμό με ένα σύστημα Eksigent nanoLC-2D HPLC (Eksigent, Dublin, CA). Η πέψη μίγμα πεπτιδίων φορτώνεται σε 250 NL παγίδα OPTI-PAK (Βελτιστοποίηση Technologies, Oregon City, OR), έθιμο γεμάτο με Michrom Magic C8 στερεά φάση (Michrom Bioresources, Auburn, CA). Η χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 0,2% μυρμηκικό οξύ σε τόσο στο διαλύτη Α (98% νερό /2% ακετονιτρίλιο) και διαλύτη Β (80% ακετονιτρίλιο /10% ισοπροπανόλη /10% νερό), και ένα 2% Β έως κλίση 45% Β επί 70 λεπτά σε 300 nl /min με ένα χέρι γεμάτο PicoFrit (New Στόχος, Woburn, ΜΑ) mm στήλη 75 μm × 200 (Michrom Magic C18, 3 μm). Το πείραμα φασματόμετρο μάζας Orbitrap Elite ορίστηκε να εκτελέσει μια FT πλήρη σάρωση από 340-1500 m /z με ανάλυση ορίζεται σε 120.000 (σε απόσταση 400 m /z), ακολουθούμενη από γραμμική παγίδα ιόντων σαρώσεις CID MS /MS στην κορυφή δεκαπέντε ιόντα. Δυναμική αποκλεισμού ορίστηκε σε 1 και επιλεγμένα ιόντα τοποθετήθηκαν σε έναν κατάλογο αποκλεισμού για 30 δευτερόλεπτα

Database αναζήτηση

Tandem φάσματα μάζας εξήχθησαν από msconvert (έκδοση 3.0.4019? ProteoWizard). Και όλα δείγματα MS /MS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μασκότ (Matrix Science, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο? έκδοση 2.4.0), Sequest (Thermo Fisher Scientific? έκδοση 27, rev. 12) και Χ1 Tandem (Η GPM, thegpm.org? έκδοση κυκλώνα (2.010,12 .01.1)). Μασκότ, Sequest, και Χ1 Tandem στήθηκαν για να αναζητήσετε τη βάση δεδομένων Φεβρουάριο 2012 Swissprot, περιορίζεται στην ανθρώπινη με δόλωμα αντίστροφη βάση δεδομένων, και υποθέτοντας ότι το ένζυμο πέψη με θρυψίνη. Μασκότ και Χ1 Tandem αναζητήθηκαν με ανοχή θραυσμάτων μάζας ιόντων 0,60 Da και μια μητρική ανοχή ιόντων των 10,0 ppm. Sequest ερευνήθηκε με ανοχή θραυσμάτων μάζας ιόντων 0,60 και γονέα ανοχή ιόντων 0,01 Da. Η οξείδωση της μεθειονίνης και ιωδοακεταμιδίου παράγωγο της κυστεΐνης προσδιορίζονται στο Mascot, Sequest, και Χ1 Tandem ως μεταβλητή τροποποιήσεις.

απομόνωση RNA και ποσοτική PCR ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές και εξωσώματα χρησιμοποιώντας η miRCURY Απομόνωση RNA Kit – τηλέφωνα & amp? Plant (Exiqon, Woburn, ΜΑ) ακολούθησε με φασματοφωτομετρία (NanoDrop, Thermo Scientific) για την ποσοτικοποίηση και ποιοτική ανάλυση. Ίσες ποσότητες ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με ολίγο (dT) εκκίνησης χρησιμοποιώντας το κιτ iScript cDNA Synthesis (Bio-Rad, Hercules, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) και το SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) όπως περιγράφεται προηγουμένως [40]. GLUT1 και β-ακτίνης εναρκτήρες αγοράστηκαν από SABiosciences (Frederick, MD).

ευαισθησία φαρμάκου

δοκιμασίας

Εν συντομία, 5 χ 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο εις τριπλούν, σε 96 -Καλά πλάκες επίπεδου πυθμένα με 100 μΐ μέσου. Μετά από 24 ώρες, προστέθηκαν μεταβλητές συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης (μg /ml) και τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 72 ώρες. Στο τέλος της περιόδου θεραπείας, 20 μΙ διαλύματος MTS περιέχει PMS (MTS:. PMS = 20:01 κατ ‘όγκο αναλογία) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 έως 2 ώρες. Η απορρόφηση στα 490 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα SpectraFluor PLUS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) και η μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (IC50) τιμές ήμισυ υπολογίστηκαν ως συγκεντρώσεις αντιστοιχεί σε μείωση κατά 50% της κυτταρικής ανάπτυξης. Πριν από τις δοκιμές ευαισθησίας φαρμάκου, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία MTS (Promega, Madison, WI).

Στατιστική ανάλυση

Τα στοιχεία στα γραφήματα ράβδων αντιπροσωπεύουν την μέση ± τυπική απόκλιση των τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκαν με δείγματα εις τριπλούν. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση t-test του Student, με δίπλευρη τιμή της P & lt? 0,05 ώστε να θεωρούνται σημαντικά

Αποτελέσματα

εξάντληση GIPC προκαλεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Αξιοποιώντας τις GIPC εξαντλημένο παγκρέατος κυτταρικές σειρές AsPC-1 και PANC-1, διερευνήσαμε εάν GIPC διαμορφωμένο αυτοφαγία με την αξιολόγηση της αυτοφαγία που σχετίζονται με ελαφριά αλυσίδα πρωτεΐνης μικροσωληνίσκων που σχετίζεται 3 (LC3) μετατροπές (LC3-Ι LC3-II) μέσω ανάλυσης στυπώματος Western. Είναι γνωστό ότι η μετατροπή της ελαφριάς αλυσίδας 3-Ι (LC3-I), μετά σύζευξη προς φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ), σχηματίζει την συζυγική ένωση ελαφριά αλυσίδα 3-ΙΙ (LC3-ΙΙ) το οποίο στη συνέχεια προσλαμβάνονται στις μεμβράνες του αυτοφαγοσώματα [13], [20]. έκφραση LC3 έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την παρακολούθηση και τον καθορισμό της κατάστασης αυτοφαγία και το ποσό της LC3II συσχετίζεται με τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα [41]. Μετά από ενδελεχή έρευνα του επιπέδου LC3-II των παγκρεατικών σταθερές κυτταρικές σειρές, παρατηρήσαμε ένα υπερυψωμένο επίπεδο LC3-II σε κύτταρα ανεπαρκή για GIPC, υποδεικνύοντας την ενεργοποίηση αυτοφαγία (Εικόνα 1Α). Παρατηρήσαμε επίσης μία αύξηση στον σχηματισμό LC3-ΙΙ (πράσινο) puncta στα GIPC-εξαντλημένο κύτταρα με μελέτη ανοσοφθορισμό (Σχήμα 1Β). GIPC knockdown σε παρουσία αναστολέων πρωτεάσης λυσοσωμικών, πεπστατίνη-Α και Ε-64d, αυξάνεται περαιτέρω επίπεδα LC3-ΙΙ με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε σύγκριση με GIPC knockdown μόνο, υποδεικνύοντας βελτίωση της αυτοφαγικά ροής (Σχήμα S1A). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό πρωτεΐνης σύντηξης mCherry-ΕΟΡΡ-LC3B περιέχουν οξύ-insensitive mCherry και ευαίσθητα σε οξύ EGFP σαν ένα αυτοφαγικά σύστημα ροής ρεπόρτερ [42], [43]. Κατά τη διάρκεια του σχηματισμού autophagosome, τόσο EGFP και mCherry ανιχνεύονται σε αυτοφαγοσώματα που εμφανίζονται ως κίτρινο puncta. Ωστόσο, από τη στιγμή αυτοφαγοσώματα ασφάλεια με λυσοσώματα, το πράσινο φθορισμό χάνεται λόγω της υποβάθμισης της EGFP από οξύ λυσοσωμικές πρωτεάσες με αποτέλεσμα μόνο το κόκκινο puncta. Ως εκ τούτου, η παρουσία του τόσο κίτρινο και κόκκινο puncta δείχνει ένα λειτουργικό αυτοφαγικά διαδικασία ροής. Εδώ έχουμε χρησιμοποιήσει και τις δύο AsPC-1 και PANC-1 κυτταρικών γραμμών που εκφράζουν σταθερά mCherry-EGFP-LC3B να δείξει την αύξηση τόσο κίτρινο και κόκκινο puncta κατόπιν GIPC knockdown οποία έδειξε επίσης μια αύξηση στη ροή αυτοφαγικά (Σχήμα S1B). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι GIPC knockdown επάγει το σχηματισμό αυτοφαγοσώματα σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Α) AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊούς εκφράζουν Τα siRNAs να GIPC και κωδικοποιημένα ελέγχου. Μία ίση ποσότητα των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου από AsPC-1 και PANC-1 GIPC εξαντλημένα κύτταρα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση (ΙΒ) με τα αντισώματα για GIPC και LC3II. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Ένα αντιπροσωπευτικό ανάλυση ανοσοφθορισμού των κυττάρων PANC-1 για την έκφραση της LC3 II (πράσινο) σε GIPC απεμπλουτισμένο PANC-1 κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Τα κύτταρα αντίθετα με DAPI (μπλε).

Η

Ερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση των δύο γονιδίων αυτοφαγία σχετίζονται, ATG7 και Beclin1, για GIPC μεσολάβηση ρύθμιση αυτοφαγικά. Για να εκτιμηθεί η αλληλεπίδραση των ATG7 και Beclin1, μειώσαμε το επίπεδο της ATG7 και Beclin1 με παρεμβολή RNA (RNAi) και στα δύο κύτταρα PANC-1 και AsPC-1. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2Α και 2Β, δεν παρατηρήσαμε οποιαδήποτε σημαντική αλλαγή στην έκφραση ή ATG7 Beclin1 μετά την εξάντληση GIPC στα δύο παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Όπως ATG7 και Beclin1 αποτελούν δύο βασικά συστατικά για autophagosome βιογένεση, παρατηρήσαμε επίσης μια μείωση της μετατροπής LC3 II από LC3 εγώ μετά νοκ ντάουν της ATG7 και Beclin1 τόσο στα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Σε AsPC-1 κύτταρα, παρατηρήσαμε ότι η επαγωγή της αυτοφαγία με εξάντληση της GIPC ήταν παρεμποδίζεται σημαντικά από τη μείωση των ATG7 και Beclin1. Αντιθέτως, σε κύτταρα PANC-1, ATG7 και Beclin1 δεν θα μπορούσε να επηρεάσει την LC3II μετατροπή υπόκειται σε εξάντληση GIPC. Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω η σύνδεση των GIPC με ATG7 και Beclin1 από πειράματα συνανοσοκαθίζησης και βρέθηκε Beclin1 να είναι στο ίδιο συγκρότημα με GIPC (Σχήματα 2C), αλλά δεν έχετε καταλήξει σε συγκεκριμένο αποτέλεσμα για ATG7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ανάλυση Α) ανοσοκηλίδας της έκφρασης ATG7 σε λύματα AsPC-1 και PANC-1 κυττάρων επιμολυσμένα με siRNA να GIPC, ATG7 και κωδικοποιημένα ελέγχου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Ανάλυση ανοσοκηλίδας της έκφρασης Beclin1 στο AsPC-1 και λύματα κυττάρων PANC-1 επιμολυσμένα με siRNA να GIPC, Beclin1, και κωδικοποιημένα ελέγχου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Γ) συνανοσοκαθίζησης (IP) από τα λύματα των κυττάρων PANC-1 επιμολυσμένα με siRNA να GIPC, και ομελέτα ελέγχου χρησιμοποιώντας GIPC αντισώματος. Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση (ΙΒ) με αντισώματα προς Beclin1 και GIPC.

Η

GIPC μεσολαβεί autophagy μέσω μεταβολικών μονοπατιών στρες

GLUT1 σχετίζεται με την πρόσληψη της γλυκόζης στα καρκινικά κύτταρα και GIPC είναι γνωστές για τη σταθεροποίηση GLUT1 στην κυτταρική μεμβράνη ως ΡΟΖ εταίρος αλληλεπίδρασης που περιέχει την περιοχή [14]. Από αυτή την άποψη, εξετάσαμε αν χτυπήσει κάτω GIPC σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα θα αποσταθεροποιούσε GLUT1 και να διαταράξουν την πρόσληψη γλυκόζης σε αυτά τα κύτταρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε μια σημαντική μείωση της έκφρασης GLUT1 τόσο mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης μετά GIPC knockdown σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1 (Σχήμα 3Α & amp? 3Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η σχετική πρόσληψη γλυκόζης για AsPC-1 και τα κύτταρα PANC-1 ήταν σημαντικά μειωμένη σε απουσία GIPC, σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχήμα 3C). Για να καθοριστεί εάν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της γλυκόζης ήταν επίσης εξαρτάται από την κατάσταση του GIPC, παρακολουθήσαμε το ενδοκυτταρικό επίπεδο της γλυκόζης μετά GIPC knockdown στις ίδιες παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και βρέθηκε επίπεδα για να μειωθεί σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου (Σχήμα 3D). Είναι σημαντικό ότι, υπό συνθήκες στρες, την κυτταρική ΑΜΡ ρυθμίζει συνήθως το ενδοκυτταρικό επίπεδο της γλυκόζης. επίπεδα ΑΜΡ ήταν αυξημένα σε λιμοκτονία γλυκόζης, η οποία, με τη σειρά του, περαιτέρω ενεργοποιημένα τη δράση κινάσης της AMPK-α μέσω φωσφορυλίωσης [44], [45]. Για να διερευνήσουν αυτό το μηχανισμό σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, εξετάσαμε την AMPK-α κατάσταση με ανοσοαποτύπωση σε GIPC κύτταρα σταθερά νοκ ντάουν. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ένα υψηλό επίπεδο φωσφορυλιωμένης ΑΜΡΚ-α κατόπιν GIPC εξάντληση (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να ρυθμίζουν GIPC τις οδούς ΑΜΡΚ.

Α) Ποσοτική PCR και Β) ανάλυση κηλίδας Western των GLUT1 να αναλυθεί η επίδραση της GIPC-εξάντληση στην έκφραση glut1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τόσο GLUT1 mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά κατά την εξάντληση GIPC σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1. Γ) Η πρόσληψη γλυκόζης μειώθηκε σημαντικά σε GIPC εξαντλημένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σε AsPC-1 και κύτταρα PANC-1 (** σημαίνει ρ & lt? 0,01). Δ) Ενδοκυτταρικά επίπεδα της γλυκόζης μειώθηκαν επίσης σημαντικά στο GIPC εξαντλημένο κυτταρικές σειρές PANC-1 επιβεβαιώνοντας το ρόλο GIPC στο μεταβολισμό της γλυκόζης (** σημαίνει ρ & lt AsPC-1 και? 0,01)

Η

Α) Ανοσοστύπωμα. του κυττάρου προϊόντα λύσης από GIPC εξαντλημένο και τον έλεγχο AsPC-1 και PANC-1 κύτταρα που δοκιμάζεται με ρ-ΑΜΡΚ-α, συνολικό ΑΜΡΚ-α. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Περαιτέρω, ανοσοαποτύπωμα των προϊόντων της λύσης των κυττάρων από την παραπάνω συνθήκη είχαν ανιχνεύθηκαν με π-mTOR, συνολικής mTOR, π-p70S6K και συνολική p70S6K. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό της αυτοφαγία εξετάζοντας κατάντη μορίων του μονοπατιού ΑΜΡΚ-α. Παρατηρήσαμε μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης mTOR μετά GIPC νοκ ντάουν στα κύτταρα AsPC-1 και-1 PANC? Ωστόσο, η συνολική έκφραση mTOR δεν άλλαξε. Επιπλέον, παρατηρήσαμε μία μείωση κατά ένα γνωστό καθοδικός τελεστής του mTOR, το φωσφο-p70S6K να p70S6K αναλογία, σε GIPC-εξαντλημένο προϊόντα λύσης κυττάρων σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 4Β). Απομάκρυνση της εξωκυττάριας γλυκόζης ενισχυθεί περαιτέρω ΑΜΡΚ-α φωσφορυλίωση και μειωμένη φωσφορυλίωση mTOR, καθώς και η φωσφορυλίωση p70S6K (Εικόνα S2). Ωστόσο, τα επίπεδα LC3 μειώθηκαν μετά την αφαίρεση της εξωκυττάριας γλυκόζης που επιβεβαιώνει με τις προηγούμενες εκθέσεις [46] προτείνοντας εξωκυττάριο απομάκρυνση της γλυκόζης σκοτώνει τα κύτταρα είτε με απόπτωση ή νέκρωση στη θέση της επαγωγής αυτοφαγία ως prosurvival αποτέλεσμα. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι GIPC ελέγχει αυτοφαγία μέσω της ρύθμισης των μεταβολικών μονοπατιών στα παγκρεατικά κύτταρα αδενοκαρκινώματος.

GIPC επηρεάζει την έκκριση εξωσωμάτων και βιογένεση

Με τα εξωσώματα που συλλέγονται από τις σταθερές επιμολύνσεις, πραγματοποιήσαμε ενζυματική δοκιμασίες για δραστικότητα εστεράσης ακετυλοχολίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Αυτή η δοκιμασία αποκάλυψε μεγαλύτερη αφθονία εξωσωμάτων στο ρυθμισμένο μέσο της GIPC ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές. Μια αύξηση 3,5 ή μεγαλύτερη φορές σε παραγωγή εξωσωμάτων παρατηρήθηκε σε ρυθμισμένο μέσο που συλλέγεται από GIPC-εξαντλημένο AsPC-1 κύτταρα σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 5Α). Έχουμε λάβει παρόμοιο αποτέλεσμα με GIPC-εξαντλημένο κύτταρα PANC-1, καθώς και (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Προσδιορίσαμε επίσης την συγκέντρωση του ολικού RNA σε αυτά τα εξωσώματα ως ένα άλλο μέτρο της εξωσωμάτων αφθονίας και διαπίστωσε παρόμοια αποτελέσματα (Σχήματα 5Β & amp? 5C). Νανοσωματιδίων ανάλυσης εντοπισμού χρησιμοποιώντας το NanoSight LM10 επιβεβαίωσε την κατανομή του μεγέθους των παρασκευασμάτων εξωσωμάτων μας. Με έναν τρόπο περίπου 100 nm, το μέγεθός τους ήταν σύμφωνη με τον ισχύοντα ορισμό εξωσωμάτων (Σχήμα 5D).

Εξωσώματα απομονώθηκαν από μέσα καλλιέργειας των AsPC-1 και PANC-1 GIPC εξαντληθεί και καλλιέργεια κυττάρων ελέγχου. Για τις ποιοτικές μετρήσεις ίδια ποσότητα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας. Α) Από τη σύγκριση της δραστικότητας της ακετυλοχολίνης εστεράσης απεικονίζεται για εξωσώματα συλλέγονται από GIPC εξαντλημένο και τον έλεγχο AsPC-1 κυτταρική γραμμή. Εμφανίζεται Γ) Από τη σύγκριση της συνολικής περιεκτικότητας σε RNA του παρασκευάσματος εξωσωμάτων από AsPC-1 και καλλιέργεια κυττάρων PANC-1? B & amp. Δ) Ένα αντιπροσωπευτικό προφίλ κατανομής μεγέθους του παρασκευάσματος εξωσωμάτων λαμβάνεται με χρήση Nanosight. Ε) Ένας εκπρόσωπος μικρογραφία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) εξωσωμάτων παρουσιάζεται σε αυτό το σχήμα. μπαρ κλίμακας είναι 500 nm. ΣΤ) Ένα υψηλότερο ΤΕΜ μεγέθυνση της εικόνας εξωσωμάτων παρουσιάζεται. Το μπαρ κλίμακα είναι 200 ​​nm. G) Ανοσοστύπωμα διεξάγεται με κύτταρα λύματα που συλλέγονται από κύτταρα knockdown GIPC όπως επίσης και κύτταρα μάρτυρες που δοκιμάζεται με TSG 101, Alix, και CHMP 4Β. PLC γ χρησιμοποιείται ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Στην συνέχεια εκτελείται μορφολογικό χαρακτηρισμό του παρασκευάσματος εξωσωμάτων με ένα υπερ-δομική ανάλυση των σφαιριδίων εξωσωμάτων από βαρύ μέταλλο μικροσκοπία αρνητική χρώση και μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ). Η ανάλυση των εικόνων ΤΕΜ επιβεβαίωσε τις διαστάσεις εξωσωμάτων σε δείγματα μας. Σχήμα 5Ε αντιπροσωπεύει την τυπική μορφολογία του συνολικού πληθυσμού εξωσωμάτων σε χαμηλότερη ΤΕΜ μεγέθυνση. Περαιτέρω ανάλυση των εικόνων ΤΕΜ σε μεγαλύτερη μεγέθυνση επιβεβαίωσε την τυπική δομή κοίλο σχήμα εξωσωμάτων (Σχήμα 5F). Αυτές οι αναλύσεις επιβεβαίωσαν ότι η παρουσία ή η απουσία GIPC δεν επηρέασε εξωσωμάτων μορφολογία.

Για να επιβεβαιώσει εάν οι αυξημένες εξωσώματα σε GIPC-εξαντλημένα κύτταρα συσχετίζεται με την ενεργοποίηση του μηχανισμού βιοσύνθεσης εξωσωμάτων, ελέγξαμε την έκφραση των βασικών γονιδίων ( Alix, TSG101, CHMP4B) που συμμετέχουν στην εξωσωμάτων βιογένεση με ανοσοαποτύπωση. Παρατηρήσαμε μια αυξημένη έκφραση του Alix, TSG101, και CHMP4B σε κύτταρα knockdown GIPC σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5G).

GIPC επηρεάζει περιεχόμενο εξωσωμάτων και ευαισθητοποιεί παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα

για να συγκρίνετε το περιεχόμενο εξωσωμάτων στο GIPC νοκ ντάουν και άγριου τύπου κύτταρα, πραγματοποιήσαμε πρωτεομική ανάλυση σχετικά με τα εξωσώματα που συλλέγονται από τις σταθερές κυτταρικές σειρές PANC-1. Για την ανάλυση πρωτεώματος, πρωτεΐνη εξήχθη από τις εκκρινόμενες εξωσώματα και βρήκαμε ότι το περιεχόμενο της εξωσωμάτων ποικίλει σε μεγάλο βαθμό ανάλογα με την κατάσταση GIPC. Προς στήριξη της ευρωστία και την ευαισθησία των μεθόδων ανάλυσης μας, δεδομένων πρωτεομική επιβεβαίωσε την απουσία των GIPC πρωτεΐνης σε εξωσώματα απομονώθηκαν από τα ελλειμματικά κύτταρα GIPC αλλά όχι στα δείγματα ελέγχου. Αυτό έδειξε επίσης για πρώτη φορά η παρουσία GIPC σε εξωσώματα. Επιπλέον, πρωτεομική ανάλυση των εξωσωμάτων απομονώνεται από τα σταθερά κύτταρα PANC-1 αποκάλυψε σημαντική εμπλουτισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του φαρμάκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).