Αφηρημένο

Bezielle (BZL101) είναι ένα υποψήφιο του στόματος φάρμακο που έχει δείξει ελπιδοφόρα αποτελεσματικότητα και εξαιρετική ασφάλεια στις κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση για τον προχωρημένο καρκίνο του μαστού. Bezielle είναι ένα υδατικό εκχύλισμα από το βότανο

Scutellaria barbata

. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι Bezielle ήταν επιλεκτικά κυτταροτοξική σε καρκινικά κύτταρα ενώ διαφυλάσσει μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Σε όγκου, αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα, Bezielle επαγόμενη παραγωγή ROS και σοβαρή βλάβη του DNA που ακολουθείται από υπερενεργοποίηση του PARP, εξάντληση της κυτταρικής ΑΤΡ και NAD, και η αναστολή της γλυκόλυσης. Δείχνουμε εδώ ότι τα μιτοχόνδρια καρκινικά κύτταρα »είναι η κύρια πηγή του αντιδραστικά είδη οξυγόνου που προκαλείται από Bezielle. Η θεραπεία με Bezielle επάγει προοδευτικά υψηλότερα επίπεδα των μιτοχονδριακών υπεροξειδίου, καθώς και υπεροξείδιο τύπου ROS. Αναστολή της μιτοχονδριακής αναπνοής αποτρέπει παραγωγή και των δύο τύπων των ROS και προστατεύει τα κύτταρα από την επαγόμενη Bezielle θάνατο. Εκτός από την γλυκόλυση, Bezielle αναστέλλει την οξειδωτική φωσφορυλίωση σε κύτταρα όγκου και εξαντλεί μιτοχονδριακή εφεδρική δυναμικότητα στερώντας κύτταρα την ικανότητα να παράγουν ΑΤΡ. καρκινικά κύτταρα που στερούνται λειτουργικά μιτοχόνδρια διατηρήσει γλυκολυτική δραστηριότητα στην παρουσία Bezielle στηρίζοντας έτσι την υπόθεση ότι τα μιτοχόνδρια είναι ο πρωταρχικός στόχος της Bezielle. Οι μεταβολικές επιδράσεις της Bezielle προς τα φυσιολογικά κύτταρα δεν είναι σημαντικές, σε συμφωνία με τα χαμηλά επίπεδα της οξειδωτικής βλάβης που προκαλεί Bezielle τους. Bezielle εκ τούτου, είναι ένα φάρμακο που επιλεκτικά στοχεύει καρκινικών κυττάρων μιτοχόνδρια, και διακρίνεται από άλλα τέτοια φάρμακα από την ικανότητά του να επάγει όχι μόνο την αναστολή της OXPHOS αλλά και της γλυκόλυσης. Αυτή η μελέτη παρέχει μια καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της κυτταροτοξικότητας Bezielle, καθώς και τη βάση της επιλεκτικότητας της προς τα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Chen V, Staub RE, Fong S, Tagliaferri M, Cohen Ι, Shtivelman Ε (2012 ) Bezielle στοχεύει επιλεκτικά μιτοχόνδρια των κυττάρων του καρκίνου να Αναστέλλουν γλυκόλυση και OXPHOS. PLoS ONE 7 (2): e30300. doi: 10.1371 /journal.pone.0030300

Επιμέλεια: Marianne Koritzinsky, Πανεπιστήμιο Δίκτυο Υγείας, Καναδάς

Ελήφθη: 20 Ιουλίου του 2011? Αποδεκτές: 12 Δεκ 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Φεβρουαρίου του 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε πλήρως από BioNovo, Inc. Καμία εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για τη μελέτη αυτή. Ο χρηματοδότης έπαιξε ρόλο στην απόφαση για την έρευνα Bezielle ως αντικαρκινικού παράγοντα, αλλά δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Ανταγωνιστικά συμφέροντα.: οι συγγραφείς αναγνωρίζουν ότι είναι έμμισθους υπαλλήλους και τους κατόχους μετοχών της BioNovo, Inc, και ότι αυτή η μελέτη, στο σύνολό της, υποστηρίχθηκε από κεφάλαια από BioNovo. Bezielle (BZL101) είναι ιδιόκτητο βοτανικό υποψήφιο φάρμακο Bionovo (FDA-IND: 59521) για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του μαστού. Bionovo των Ηνωμένων Πολιτειών Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας Νο 7.700.136 καλύπτει μία μέθοδο θεραπείας του καρκίνου του μαστού χρησιμοποιώντας ένα εκχύλισμα Scutellaria barbata. Αυτό το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας καλύπτει επίσης τη χρήση του ιδιόκτητο διατύπωση BezielleR Bionovo ως μονοθεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Bezielle (BZL101, FDA IND # 59.521) είναι ένα εκχύλισμα που παρασκευάστηκε από τα εναέρια τμήματα του βοτάνου

Scutellaria barbata

που έχει αντικαρκινικές ιδιότητες.

S. barbata

εκχύλισμα δειχθεί ότι έχουν κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών όγκου

in vitro

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7 ], [8], [9], [10] και δράση κατά των όγκων

in vivo

[11], [12], [13] σε μοντέλα της νεφρικής, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και του προστάτη. Το πιο σημαντικό, τα δύο πρώτα στάδια κλινικών δοκιμών με Bezielle έδειξαν υποσχόμενα αποτελεσματικότητα και εξαιρετική ασφάλεια για τη θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του μαστού [14], [15]. Στην φάση Ια δεκαέξι κλινική δοκιμή ασθενών, τα οποία πέρασαν από πολλαπλές θεραπείες θεραπεία πριν από την εγγραφή αξιολογήθηκαν ως προς την απόκριση. Τέσσερις ασθενείς είχαν σταθερή νόσο για Λαμβάνοντας υπόψη ότι η δισμουτάση είναι ένα βραχύβια είδη αντιδραστικού οξυγόνου, τα υψηλά επίπεδα παρατήρησε στις 6 ώρες είναι πιθανό να οφείλεται στην συνεχή παραγωγή από μιτοχόνδρια. Τα αντίστοιχα υψηλά επίπεδα υπεροξείδιο τύπου ROS μπορεί να προκύπτει από τη μετατροπή του σουπεροξειδίου σε υπεροξείδιο με δισμουτάση υπεροξειδίου.

Για να εξεταστεί ο ρόλος του μιτοχονδριακού υπεροξειδίου σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Bezielle, έχουμε απασχολούνται μια καλά δοκιμασμένη μέθοδος απενεργοποίησης μιτοχονδριακή αναπνοή με καλλιέργεια κυττάρων σε παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. Μετά καλλιέργεια των κυττάρων σε χαμηλή συγκέντρωση βρωμιούχου αιθιδίου για 6 εβδομάδες, τα κύτταρα αυτά (MDAMB231Rho-0) έχουν χάσει την έκφραση μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, καθιστώντας τα μιτοχόνδρια δεν είναι λειτουργικό. Αυτό επιβεβαιώθηκε με την εξέταση των μιτοχονδρίων κατανάλωση οξυγόνου του MDAMB231 Rho-0 κύτταρα, τα οποία ήταν πολύ μειωμένη (βλέπε παρακάτω, Εικ. 6). Τα κύτταρα Rho-0 υπέστησαν κατεργασία με Bezielle, και εξετάσθηκαν για επαγωγή των ROS και κυτταρικού θανάτου. Το Σχήμα 1D δείχνει ότι τα κύτταρα MDAMB231 Rho-0, όπως αναμενόταν, δεν δημιουργούν μιτοχονδριακό υπεροξειδίου σε απόκριση Bezielle, επιβεβαιώνοντας το ρόλο του μιτοχονδριακού μεταφοράς ηλεκτρονίων στην επαγωγή των ROS από Bezielle. Επίπεδα του υπεροξειδίου που παράγεται στο Bezielle αγωγή Rho-0 κύτταρα κάπως αυξημένη στα 30 λεπτά της επώασης, αλλά δεν έδειξαν περαιτέρω αύξηση συναρτήσει του χρόνου (Σχήμα 1 D), υποστηρίζοντας σθεναρά πρότασή μας ότι τα υψηλά επίπεδα υπεροξειδίου θα μπορούσε να οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στην μετατροπή των μιτοχονδριακών υπεροξειδίου. Το πιο σημαντικό, τα κύτταρα MDAMB231 Rho-0 ήταν πολύ έντονα προστατεύονται από τον κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Bezielle (Σχήμα 1 Ε) υποδηλώνοντας τον κεντρικό ρόλο των μιτοχονδρίων στο θάνατο των καρκινικών κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με Bezielle.

Πιθανές άλλες κυτταρικές πηγές ROS που προκαλείται από Bezielle

Τα δεδομένα που περιγράφονται παραπάνω σε μεγάλο βαθμό εμπλέκουν την μιτοχονδριακά δημιουργείται υπεροξειδίου σε Bezielle κυτταροτοξικότητα. Ωστόσο, ενώ η επαγωγή του μιτοχονδριακού υπεροξειδίου με Bezielle εμποδίστηκε εντελώς σε Rho-0 κύτταρα, το CM-H

2DCFDA ανιχνεύσιμο υπεροξείδιο τύπου ROS, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, δεν ήταν εντελώς καταργηθεί (Σχήμα 1 D). Έχουμε εξετάσει το ενδεχόμενο ότι ορισμένοι άλλοι κυτταρικά ένζυμα ικανά να παράγουν υπεροξείδιο ή εξω-μιτοχονδριακής υπεροξειδίου μπορεί να συνεισφέρει στην οξειδωτικό στρες που προκαλείται από Bezielle. Έχουμε χρησιμοποιήσει αναστολείς αρκετών κυτταρικών ενζύμων τα οποία παράγουν ROS: διφαινυλενικό ιώδιο (DPI) και αποκυνίνης για την αναστολή της οξειδάσες NADPH? αλλοπουρινόλη να αναστέλλουν ξανθίνη οξειδάση, νορδιυδρογουαϊαρετικό οξύ (NDGA) να αναστέλλουν LOX, και Nitro-L-αργινίνη μεθυλεστέρα (L-ΝΑΜΕ) να αναστέλλουν συνθάσης νιτρικού οξειδίου. MDAMB231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Bezielle σε παρουσία καθενός από αυτούς τους αναστολείς, και η έκταση του κυτταρικού θανάτου, καθώς και επαγωγή ROS ποσοτικοποιήθηκε σε σχετικές δοκιμασίες. Κανένας από τους αναστολείς μειωμένων επιπέδων ROS σε Bezielle-κατεργασμένα κύτταρα με την εξαίρεση του DPI (δεν φαίνεται και στο Σχήμα 2Α). Ομοίως, με την εξαίρεση του DPI, κανείς δεν έδειξε καμία προστατευτική δράση επί του κυτταρικού θανάτου (δεν φαίνεται).

A. MDAMB231 κύτταρα επωάστηκαν με Bezielle σε απουσία ή παρουσία 0,75 μΜ DPI για 6 ώρες και εξετάζονται για παραγωγή ROS. Β κυτταρικό θάνατο σε MDAMB231cells κατεργάζεται με Bezielle για 24 ώρες σε απουσία ή παρουσία 0,75 μΜ DPI. Όλα τα αποτελέσματα σε Α και Β είναι μέσες ± S.E. (N = 3). Σημαντική διαφορά (Ρ * & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01) μεταξύ των ομάδων που αναφέρονται απεικονίζονται. C, κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα καρκινώματος του μαστού SKBR3 σε επεξεργασία με Bezielle για 24 ώρες σε απουσία ή παρουσία 0,75 μΜ DPI. Τα αποτελέσματα είναι μέσος όρος των δύο πειραμάτων.

Η

Το σχήμα 2Α δείχνει την αναστολή της τόσο υπεροξείδιο τύπου ROS και μιτοχονδριακή παραγωγή υπεροξειδίου από DPI στην Bezielle-επεξεργασμένα κύτταρα. Η παρατηρούμενη ισχυρή αναστολή της μιτοχονδριακής υπεροξειδίου από DPI ήταν απρόσμενη, δεδομένου ότι η αναστολή των οξειδασών NADPH (NOX), δεν θα πρέπει να έχει μια βαθιά επίδραση στην μιτοχόνδρια, ακόμα κι αν μερικοί δημοσιευμένες μελέτες υποδηλώνουν την ύπαρξη ενός cross-talk μεταξύ της ενεργοποίησης NOx και μιτοχονδριακή παραγωγή υπεροξειδίου [28], [29]. Ωστόσο, DPI αναφέρθηκε επίσης να είναι ένας ισχυρός αναστολέας της μιτοχονδριακής παραγωγής υπεροξειδίου πιθανώς μέσω της μη-ειδική αναστολή της NADH-ουβικινόνης οξειδορεδουκτάσης στο μιτοχονδριακό σύμπλοκο Ι [30].

Δεν αποτελεί έκπληξη, η αναστολή της επαγόμενης Bezielle παραγωγή ROS με DPI είχε προστατευτική επίδραση επί Bezielle-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 2Β). Ακόμα κι αν μόνο του DPI ήταν κάπως κυτταροτοξικά για τα κύτταρα, εξασθενημένα έντονα κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Bezielle (Σχήμα 1 Ε). Για να αποκλειστεί το ενδεχόμενο ότι τα αποτελέσματα της θεραπείας DPI είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της MDAMB231 κυττάρων, έχουμε εξετάσει επιπτώσεις της DPI σε κυτταρικό θάνατο σε μια πρόσθετη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού SKBR3. Τα κύτταρα SKBR3 παρουσίασαν ακόμη μεγαλύτερη προστασία από DPI από MDAMB231, υποδεικνύοντας ότι η προστατευτική δράση της DPI προς Bezielle δεν είναι ένα μεμονωμένο φαινόμενο (Σχήμα 2C).

Έχουμε, συνεπώς, εξετάζεται αν η μη φαγοκυτταρική NOX είναι γνωστό ότι να εκφράζεται σε όγκους του μαστού [29], [31] θα μπορούσε να συμμετέχει στην Bezielle κυτταροτοξικότητα. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων φαίνονται στην Εικόνα S2. Εν συντομία, ακόμα κι αν NOX4 φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω από Bezielle στα καρκινικά κύτταρα, μερική αποσιώπηση της έκφρασης του σε MDAMB231 κύτταρα έδειξαν ότι NOX4 παράγεται ROS δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από Bezielle.

Το ερώτημα, ωστόσο, εξακολουθεί να παραμένει σχετικά με το μηχανισμό της μιτοχονδριακής μείωση ROS από DPI. Έχουμε βρει ότι DPI, ακόμα και σε χαμηλή συγκέντρωση που χρησιμοποιείται εδώ, αναστέλλει μιτοχονδριακή αναπνοή (βλέπε παρακάτω), και ως εκ τούτου, στην πραγματικότητα, λειτουργεί ως αναστολέας της OXPHOS, παρόμοια με την εκτομή της μιτοχονδριακής λειτουργίας σε Rho-0 κύτταρα.

Διέγερση της βλάβης του DNA

Bezielle προκαλεί βλάβη στο DNA οξειδωτική η οποία είναι κρίσιμη για την ικανότητά της να σκοτώσει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα [8]. Έχουμε εξετάσει πώς η έλλειψη λειτουργικών μιτοχονδρίων και της θεραπείας με DPI επηρεάσει την επαγωγή της βλάβης του DNA από Bezielle στο MDAMB231 κύτταρα. Κύτταρα κατεργασμένα με Bezielle αναλύθηκαν με Comet δοκιμασίας για δύο παραμέτρους βλάβης DNA: τοις εκατό των κυττάρων με κατεστραμμένα DNA, και η στιγμή της ελιάς (αντανακλώντας την έκταση της βλάβης του DNA σε μεμονωμένα κύτταρα). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η θεραπεία με Bezielle οδήγησε σε προοδευτική αύξηση του αριθμού των κυττάρων με βλάβες στο DNA για έως 6 ώρες. Μετά από αυτό το χρονικό σημείο, τα νεκρά κύτταρα με μερικώς υποβαθμισμένη ή σοβαρά κατεστραμμένο DNA ξεκίνησε συσσωρεύονται, κάνοντας ο κομήτης ποσοτικοποίησης δύσκολη. Ανάλυση του κομήτη ουράς στιγμή (Σχήμα 3Β) αποκάλυψε μια απότομη αύξηση του DNA βλάβη ανά κυττάρων που προκαλείται από Bezielle πάροδο του χρόνου. Η αυξανόμενη ποσότητα της βλάβης του DNA ανά κύτταρο σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο συσχετίζεται καλά με την παρατηρούμενη αύξηση των επιπέδων ROS (Εικόνα 2Β).

Α. MDAMB231 κύτταρα ελέγχου (MM231), MDAMB231 Rho-0 παραλλαγή (RHO-), ή MDAMB231 κύτταρα σε παρουσία του DPI (+ DPI) υποβλήθηκαν σε αγωγή με Bezielle για τους χρόνους που υποδεικνύονται και υποβάλλεται σε αλκαλική ανάλυση προσδιορισμού Comet. Τα αποτελέσματα δείχνονται ως ποσοστά των κυττάρων που σχηματίζουν κομήτες, μέση ± S.E. (N = 3). Σημαντικές διαφορές (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01) μεταξύ των Rho-0 και τον έλεγχο των ομάδων, καθώς και μεταξύ DPI-θεραπεία και οι ομάδες ελέγχου που φαίνεται. B. ίδια πειράματα όπως στο Α, αλλά τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι μέσοι στιγμές ελιών των κομητών που προκαλείται από Bezielle σε τρεις πληθυσμούς κυττάρων. Τουλάχιστον το 50 κομήτες αναλύθηκαν ανά κάθε χρονικό σημείο σε τέσσερα ξεχωριστά πειράματα. παρατηρήθηκαν μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και τόσο Rho- και DPI-αγωγή ομάδες? σημαντικές διαφορές (0,01 ** P & lt). C. Τα ποσοστά των κυττάρων ΜΟΡ10Α δείχνει βλάβη του DNA σε διαφορετικούς χρόνους μετά την επώαση με Bezielle, τα αποτελέσματα είναι μέσες ± S.E. (N = 3). Σημαντικές διαφορές (* Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0,01) είναι μεταξύ των κυττάρων σε αγωγή για 30 λεπτά σε σύγκριση με τα δύο 2 και 6 ώρες φαίνονται. Η ανάλυση στυπώματος Western D. ενεργοποίησης ΡΑΚΡ (PAR) στις ενδεικνυόμενες κύτταρα επεξεργασμένα με Bezielle για 1 ώρα. Επίσης παρουσιάζονται είναι η έλλειψη έκφρασης του μιτοχονδριακά κωδικοποιημένης πρωτεΐνης (σύμπλοκο IV υπομονάδα II) σε Rho-0 κύτταρα, η έκφραση της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης VDAC κωδικοποιούνται σε πυρηνικό DNA, καθώς επίσης και β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Κύτταρα Ε MDAMB231 και MDAMB231-Rho-0 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Bezielle για τους υποδεικνυόμενους χρόνους και αναλύθηκαν για την παρουσία πολυ-ΑϋΡ-ριβοσυλιωμένων πρωτεΐνες. β-ακτίνη χρησιμεύει ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

MDAMB231 Rho-0 κύτταρα, λιγότερο από το ήμισυ των κυττάρων στο υπό αγωγή πληθυσμό έδειξε την παρουσία βλάβης του DNA, ακόμη και μετά από 6 ώρες (Σχήμα 3Α), και ελιές ανάλυση στιγμή ανιχνευθεί χαμηλά επίπεδα βλάβης του DNA ανά κύτταρο που δεν αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3Β). Παρουσία DPI είχε περιορισμένη επίδραση στον αριθμό των κυττάρων με βλάβες στο DNA, αλλά είχε μια ισχυρή ανασταλτική επίδραση στην αύξηση της βλάβης του DNA ανά κύτταρο πάροδο του χρόνου. Η ασθενής επίδραση του DPI στον αριθμό των κυττάρων με βλάβες στο DNA μπορεί να σχετίζεται με την ασθενέστερη προστατευτική δράση του DPI κατά Bezielle θάνατο που προκαλείται σε σχέση με την προστασία σε Rho-0 κύτταρα (Σχήμα 1 Ε και 2Β).

Έχουμε επίσης αναλύθηκαν Bezielle προκαλούμενη βλάβη του DNA σε κύτταρα ΜΟΡ10Α, και έχουν παρατηρήσει ότι ακόμα και στη συνεχή παρουσία του Bezielle στο μέσο ανάπτυξης, βλάβη του DNA σε αυτά τα κύτταρα μειώθηκε σταδιακά την πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3C). Προτείνουμε ότι πολύ χαμηλότερα επίπεδα των ROS που επάγεται σε κύτταρα ΜΟΡ10Α (Εικόνα 1Β) οδήγησε σε περιορισμένα επίπεδα της βλάβης του DNA που επισκευάστηκε με επιτυχία. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει το χρόνο μείωσης εξαρτώμενη από το βλάβη του DNA σε κύτταρα ΜΟΡ10Α.

Έχουμε τεκμηριωμένες υπερ ενεργοποίηση της PARP σε καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Bezielle, και ο ρόλος της στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου. Έχουμε εξετάσει αν PARP ενεργοποιήθηκε σε MDAMB231 Rho-0 κύτταρα ή σε DPI-επεξεργασμένα κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, PARP έντονα ενεργοποιείται σε MDAMB231 κύτταρα. Στο Rho-0 κύτταρα, την ενεργοποίηση PARP ήταν σημαντικά λιγότερο ισχυρή. Σε DPI-επεξεργασμένα κύτταρα, Bezielle ενεργοποιημένα PARP σε επίπεδα μεταξύ αυτών που παρατηρήθηκαν σε έλεγχο έναντι Rho-0 κύτταρα (Σχήμα 3D). PAR-ylation πρωτεϊνών σε κύτταρα MDAMB231 συνεχίστηκε για ώρες μετά την έναρξη της θεραπείας με Bezielle, αλλά σε Rho-0 κύτταρα η ενεργοποίηση της PARP δεν ήταν μόνο πολύ ασθενέστερη, αλλά και παροδικής φύσης (Σχήμα 3Ε). Συνολικά, τα παραπάνω στοιχεία δείχνουν ότι η έλλειψη λειτουργικών μιτοχονδρίων έντονα ανέστειλε την επαγωγή των ROS, βλάβη του DNA, ενεργοποίηση της PARP και κυτταρικού θανάτου από Bezielle. Ως εκ τούτου, καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα μιτοχόνδρια είναι η κύρια κυτταρική στόχος της Bezielle.

Τα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με Bezielle υποβληθεί σε μια κατάρρευση του συστήματος οξειδωτικής άμυνας

Προηγουμένως δημοσίευσε ανάλυση των μεταγραφικών αλλαγών που προκαλούνται από Bezielle στα καρκινικά κύτταρα [8] έδειξε ότι το σύστημα της γλουταθειόνης οξειδοαναγωγής ασχολείται με την κυτταρική απόκριση σε Bezielle, ένα συμπέρασμα που υποστηρίζεται από τις πρόσφατες πρωτεομική και μεταβολομική αναλύσεις [24]. Ετσι, η αυξημένη έκφραση του κυσταθειονίνης-β-συνθάσης και γλουταμικού κυστεΐνη λιγάση τροποποιητής GCLM παρατηρήθηκαν σε Bezielle αγωγή καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Επομένως, εξετάσαμε τα επίπεδα ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH) σε κύτταρα επεξεργασμένα με Bezielle. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 4Α δείχνουν μια ισχυρή και ταχεία μείωση της GSH σε MDAMB231 κύτταρα. Τα επίπεδα της GSH ήταν κάπως μειωμένη σε ΜΟΡ10Α, αλλά η μείωση της GSH ήταν σχετικά ήπιες και δεν υπέστη. Σε μεγαλύτερους χρόνους επώασης, GSH ήταν σχεδόν εξ ολοκλήρου εξαντληθεί σε MDAMB231 κύτταρα (δεν δείχνεται). GSH είναι ένα σημαντικό αντιοξειδωτικό, και τη μετατροπή της οξειδωμένης GSH (GSSG) προς GSH απαιτεί NADPH. Επομένως, έχουμε εξέτασαν τα επίπεδα της NADPH σε κύτταρα κατεργασμένα με Bezielle. Ακόμη και μετά από μόλις 4 ώρες (Εικόνα 4Β) υπήρχε μια βαθιά εξάντληση του NADPH σε MDAMB231 κύτταρα. Προφανώς, το υπόλοιπο οξειδοαναγωγής σε MDAMB231 κύτταρα, αλλά όχι ΜΟΡ10Α κύτταρα κατεργασμένα με Bezielle βρισκόταν σε μια ταχεία κατάρρευση. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.