Abstract

ορμόνη απελευθέρωσης γοναδοτροπίνης είναι (GnRH) υποδοχείς που εκφράζονται σε καρκίνο του προστάτη, ειδικά με τον πιο επιθετικό στάδιο του όγκου (ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο προστάτη, CRPC) για τις οποίες η τυπική θεραπεία, docetaxel- χημειοθεραπεία με βάση, μπορεί να βελτιώσει μόνο το διάμεσο χρόνο επιβίωσης από λίγους μήνες. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι GnRH αγωνιστές ασκούν αντικαρκινική δράση σε CRPC κύτταρα? Ωστόσο, μια σύνδεση μεταξύ των υποδοχέων GnRH και αποπτωτικής μηχανήματα παραμένει να καθοριστεί. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει κατά πόσον, στην CRPC κύτταρα, GnRH αγωνιστών μπορεί να επηρεάσει την έκφραση /δραστικότητα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση και μπορεί να ευαισθητοποιούν, ή επαναευαισθητοποιήσουν, τα καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικά. Δείξαμε ότι, στα κύτταρα DU145 ρ53-θετικά, GnRH αγωνιστές: α) αυξάνουν την έκφραση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax? αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται από την φωσφορυλίωση (ενεργοποίηση) του ρ53, η οποία προκλήθηκε από την ΜΑΡΚ p38? β) να ενισχύσει την αντι-πολλαπλασιαστική /προαποπτωτικής δράση της docetaxel? γ) επαναευαισθητοποιήσουν docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα στην αντικαρκινική δράση του κυτταροτοξικού φαρμάκου. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι αγωνιστές GnRH ευαισθητοποιήσει και, το πιο σημαντικό, επαναευαισθητοποιήσουν κύτταρα DU145 CRPC στη χημειοθεραπεία σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. Για να επιβεβαιωθεί η κρίσιμο ρόλο της ρ53 στη δραστηριότητα των αγωνιστών GnRH, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε κύτταρα PC3 ρ53-ηυΙΙ. Βρήκαμε ότι GnRH αγωνιστές δεν αυξάνουν την έκφραση Bax και δεν ενισχύουν την κυτταροτοξική δράση της docetaxel. Τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να παρέχει μια λογική για τα νέα στρατηγικές θεραπείας συνδυασμού, ειδικά για CRPC ασθενείς docetaxel ανθεκτικά εκφράζει μια λειτουργική πρωτεΐνη p53

Παράθεση:. Moretti RM, Marelli MM, Taylor DM, Martini PGV, Marzagalli Μ, Limonta P (2014) απελευθέρωσης των γοναδοτροπινών αγωνιστές ευαισθητοποιήσει και επαναευαισθητοποιήσουν, τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη με docetaxel σε ένα p53-εξαρτώμενο τρόπο. PLoS ONE 9 (4): e93713. doi: 10.1371 /journal.pone.0093713

Επιμέλεια: Antimo Migliaccio, ΙΙ Università di Napoli, Ιταλία

Ελήφθη: 14 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 5, Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 10η, Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Moretti et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από Università degli Studi di Milano, το πρόγραμμα PUR (επιχορηγήσεις ν. 12.01.95 και 12-1-104). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο σχετίζονται μεταξύ των ανδρών στις δυτικές χώρες [1]. Οι περισσότεροι καρκίνοι του προστάτη είναι εξαρτώμενη από την παρουσία ανδρογόνων για την ανάπτυξη και επιβίωση, καθώς και η θεραπεία ανδρογόνων, με στόχο να εμποδίσει την έκκριση ανδρογόνων /δραστηριότητας, αντιπροσωπεύει την πιο αποτελεσματική αρχική θεραπεία [2], [3]. Αυτή η θεραπεία περιλαμβάνει χειρουργική ή χημικό ευνουχισμό, που επιτυγχάνεται με: χορήγηση γοναδοτροπίνης απελευθέρωσης ορμόνης (GnRH) ανάλογα? μπλοκάρισμα της δέσμευσης των ανδρογόνων στον υποδοχέα τους με αντιανδρογόνα? αναστολή στεροειδογόνων ενζύμων. Δυστυχώς, παρά την εξαιρετική πρώτη απάντηση, σε περίπου 2 με 3 χρόνια, οι περισσότεροι καρκίνοι του προστάτη θα προχωρήσουν προς ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) στάδιο με αυξημένο πολλαπλασιασμό και κακοήθειας [4], [5]. Για CRPC ασθενείς, ταξάνη χημειοθεραπεία με βάση αντιπροσωπεύει την θεραπεία επιλογής [6], [7]. Docetaxel δρα με σύνδεση σε τουμπουλίνη για την προώθηση του πολυμερισμού και αποτρέπει μικροσωληνίσκων αποπολυμερισμό απουσία τριφωσφορική γουανοσίνη. Έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει θάνατο κυττάρου όγκου επηρεάζοντας την έκφραση /δραστικότητα του πολλαπλών καρκίνο συγκεκριμένους στόχους, συμπεριλαμβανομένης της προς τα κάτω ρύθμιση αντιαποπτωτικού πρωτεΐνης Bcl-2 και προς τα πάνω ρύθμιση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax [8], [9]. Ωστόσο, παρά την αρχική επίδειξη καλύτερη επιβίωση με ντοσεταξέλη χημειοθεραπεία με βάση, η βελτίωση βρέθηκε να είναι μόνο μια επιβίωση χωρίς εξέλιξη της λίγους μήνες [6], [10]. Ετσι, η θεραπεία των ασθενών με CRPC που εξελίσσεται μετά ντοσεταξέλη χημειοθεραπεία με βάση παραμένει σημαντική κλινική πρόκληση. Η ταυτοποίηση νέων στρατηγικών που αποσκοπούν στην υπέρβαση αντίσταση docetaxel είναι πιθανό να βελτιώσει τις θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς αυτούς.

GnRH εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως υποθαλάμου βασικό ρυθμιστή των αναπαραγωγικών λειτουργιών. Με τη δέσμευση σε ειδικούς υποδοχείς (GnRH-R) επί της υπόφυσης gonadotropes GnRH ενεργοποιεί τον υπόφυσης-γονάδων άξονα. αγωνιστές GnRH, όταν χορηγείται συνεχώς και σε υψηλές δόσεις, απευαισθητοποιήσει υπόφυσης GnRH-R, καταστέλλοντας έτσι γοναδικών έκκριση στεροειδών? επί τη βάσει της δραστηριότητάς τους, αυτές οι ενώσεις αντιπροσωπεύουν την πλέον ευρέως και επιτυχώς χρησιμοποιηθεί για ιατρική θεραπεία που αποκρίνονται στο ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη [2], [11].

Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι οι GnRH υποδοχείς εκφράζονται στον προστάτη καρκινικά κύτταρα, ειδικά σε CRPC κύτταρα και ιστούς [12] – [15]

οι υποδοχείς αυτοί (καθώς και τους υποδοχείς GnRH στο στήθος και γυναικολογικές καρκινικά κύτταρα και ιστούς) έχουν πρώτα που χαρακτηρίζεται από την άποψη της συγγένειας δέσμευσης.. Ωστόσο, σε αντίθεση αποτελέσματα έχουν αναφερθεί: μία κλάση των θέσεων σύνδεσης χαμηλής συγγένειας [12], [13], [16] – [18]? δύο τύποι υποδοχέων (το ένα με υψηλή συγγένεια και ένα με χαμηλή συγγένεια) [19] – [21]? μία ενιαία κατηγορία της υψηλής συγγένειας GnRH θέσεις σύνδεσης [22] – [25]. Συγκεκριμένα, ανέφεραν την παρουσία χαμηλής συγγένειας GnRH υποδοχέων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [12], [13]. Ο λόγος για αυτή τη διαφορά είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης? Ωστόσο, θα μπορούσε να οφείλεται στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες που εγκρίθηκαν (διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές και συνδετήρες, αξιολόγηση της συγγένειας σύνδεσης σε καρκινικά κύτταρα /ιστούς που εκφράζουν τις θέσεις δέσμευσης

vs

. κύτταρα τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν τους υποδοχείς, κύτταρο -ειδικές μετα-μεταφραστική τροποποίηση του υποδοχέα,

κλπ.

).

Αυτές οι αρχικές αντικρουόμενες παρατηρήσεις τόνωσε τον χαρακτηρισμό των υποδοχέων του καρκίνου GnRH σε μοριακό επίπεδο. Συγκεκριμένα, ανέφερε ότι τόσο η mRNA που κωδικοποιεί για τον ανθρώπινο υποδοχέα υπόφυσης GnRH και της αντίστοιχης πρωτεΐνης εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα προστάτη, είτε εξαρτώμενων από ανδρογόνα ή ευνουχισμός ανθεκτικών [26]. Επιπλέον, η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του cDNA που κωδικοποιεί για τους υποδοχείς του όγκου έχει δείξει ότι αντιστοιχεί στη θέση που αναφέρθηκαν προηγουμένως για τους υποδοχείς της υπόφυσης [27], [28].

περαιτέρω έδειξαν ότι οι αγωνιστές GnRH, μέσω της ενεργοποίησης του τοπικά εκφράζονται υποδοχείς της GnRH, ασκούν μια ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, τόσο

in vitro

και

in vivo

[12], [29], [30]? Αυτό αντικαρκινική δραστηριότητα είναι ειδική καθώς είναι πλήρως καταργείται μετά την αποσιώπηση του υποδοχέα GnRH με τη βοήθεια ενός ειδικού siRNA [31].

Εκτός από μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, απόπτωση έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην αντικαρκινική δραστικότητα των αναλόγων GnRH. Ωστόσο, τα δεδομένα μέχρι στιγμής διαθέσιμα για το θέμα αυτό εξακολουθούν να είναι αμφιλεγόμενα [30], [32] – [35]

Εδώ, επιβεβαιώνουν τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας ότι η GnRH αγωνιστές δεν, από μόνες τους, επάγουν απόπτωση σε. CRPC κύτταρα. Ωστόσο, σε ρ53 που εκφράζουν DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα, αυξάνουν την έκφραση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax, μέσω φωσφορυλίωσης σε Ser-15 (

δηλαδή

., Ενεργοποίηση) του p53, ο κύριος ρυθμιστής της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι ? ενεργοποίηση αυτού σηματοδότησης αποπτωτικών p53-Ββχ ενεργοποιείται με φωσφορυλίωση ρ38 ΜΑΡΚ. Δείχνουμε επίσης ότι η GnRH αγωνιστές ευαισθητοποιήσει κύτταρα DU145 την αντιμιτωτική δραστικότητα του docetaxel. Το πιο σημαντικό, GnRH αγωνιστές επαναευαισθητοποιήσουν docetaxel-ανθεκτικά κύτταρα DU145 με τη δραστικότητα που επάγει θάνατο του χημειοθεραπευτικού παράγοντα. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι, σε ρ53-θετικά κύτταρα καρκίνου προστάτη, η στόχευση τοπικά εκφράζεται υποδοχείς GnRH μέσω αγωνιστών GnRH ευαισθητοποιεί και επανα-ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα στη χημειοθεραπεία, σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. Ο κρίσιμος ρόλος που διαδραματίζουν οι p53 αποδεικνύεται περαιτέρω από την παρατήρηση ότι GnRH αγωνιστές δεν επηρεάζουν την έκφραση Bax και αδυνατούν να ενισχύει την αποπτωτική δράση της docetaxel σε p53-null PC3 κύτταρα καρκίνου προστάτη. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά αντιπροσωπεύουν το σκεπτικό για τις στρατηγικές συνδυασμού θεραπείας για CRPC ασθενείς docetaxel-ανθεκτικά, εκφράζει μια λειτουργική πρωτεΐνη p53.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών

Το ανθρώπινο ευνουχισμός ανθεκτικά DU145 (ρ53-θετικά) και PC3 (ρ53-ηυΙΙ) κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη αγοράστηκαν από την American Tissue Culture Collection. Και τα δύο κύτταρα PC3 και DU145 αποτελούν την πλέον κατάλληλη και ευρέως χρησιμοποιούμενη μοντέλο CRPC στη βιβλιογραφία [36] – [40]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σαν ρουτίνα σε Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) μέσο συμπληρωμένο με 5% Εμβρυϊκό Βόειο Ορό (FBS), γλουταμίνη (1 mmol /L) και αντιβιοτικά (100 IU /ml πενικιλίνη G νατρίου και 100 μg /mL θειική στρεπτομυκίνη), σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα αέρα 5% CO

2/95% στους 37 ° C.

Υλικά και Αντισώματα

Ο οξικός GnRH αγωνιστή γοσερελίνη [D-Ser (tBu )

6Aza-Gly

10-GnRH, Zoladex, GnRH-Α] παρασχέθηκε ευγενώς από την AstraZeneca Pharmaceuticals. Η GnRH ανταγωνιστής Antide (μυρμήγκι) και docetaxel (Doc) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich.

Σε όλα τα πειράματα, ο αγωνιστής GnRH έχει χρησιμοποιηθεί στη δόση των 10

-6 mol /L, με βάση προηγούμενες μελέτες, από το εργαστήριο των συγγραφέων, καθώς και από τους άλλους, με στόχο να διερευνήσει τις μοριακές πτυχές της αντικαρκινική δράση των αναλόγων GnRH σε CRPC κύτταρα [29], [41] – [46]. Η ίδια περιοχή δόσεων χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να διερευνηθεί η αντικαρκινική δράση των αγωνιστών GnRH σε διάφορα πειραματικά μοντέλα των καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα GnRH [16], [47] – [49].

Pifithrin-α, ο ειδικός αναστολέας της δραστηριότητας ρ53 μεταγραφικής και SB203580, ο ειδικός αναστολέας της p38 ΜΑΡΚ, αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology και από την Sigma-Aldrich, αντίστοιχα

τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα Western blotting:. κουνελιού αντι-ανθρώπινο Βαχ (1 :500? # 2772), κουνελιού αντι-ανθρώπινης ρ38 ΜΑΡΚ (1:1,000 ;. # 9212) και αντι-ανθρώπινη ρ-ρ38 ΜΑΡΚ κουνέλι (1:1,000? # 9211) από την Cell Signaling Technology? μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο Bcl-2 (1:250? # Sc-7382), μονοκλωνικό ποντικού αντι-ανθρώπινο ρ53 (1:1,000? # Sc-53394), κουνέλι αντι-ανθρώπινο p-p53 (Ser-15? 1: 1,000? # Sc-101762) και γίδινο αντι-ανθρώπινης ακτίνης 1-19 (1:1,000?. # Sc-1616) από την Santa Cruz Biotechnology

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν (5 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο) σε τρυβλία 10 cm καλλιέργειας ιστών? μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για 24 ώρες και το ολικό RNA παρασκευάσθηκε με τη χρήση του κιτ RNeasy μίνι (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τον έλεγχο της ποιότητας χρησιμοποιώντας ένα BioAnalyzer (Agilent 2100), τα RNA σημάνθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο Affymetrix χρησιμοποιώντας ένα Κιτ Κύκλου Labeling (Affymetrix). 15 μg της προκύπτουσας cRNAs υβριδοποιήθηκαν σε ολόκληρο το U133 γονιδίωμα μικροσυστοιχιών συν 2.0. Μετά την υβριδοποίηση σε Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 μάρκες, τιμές γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν για κάθε σετ ανιχνευτή χρησιμοποιώντας πακέτα στη σουίτα Bioconductor [50]. Γονίδια ομαλοποιήθηκαν και αναλύθηκαν με τη μέθοδο Στιβαρή πολλαπλών μικροπλακετών Ανάλυση (RMA) εντός του Affy πακέτο [51] και το πακέτο GCRMA [52]. Οι διαφορές στα επίπεδα έκφρασης καταγραφής τόσο για RMA και GCRMA κανονικοποιημένα δεδομένα αξιολογήθηκαν από τα δύο-tailed t-test, όπως εφαρμόζεται στο πακέτο limma [53]. Γονίδια με

P

-τιμές & lt? 0.05 και η απόλυτη έκφραση φορές μεταβολή μεγαλύτερη από 1.5 θεωρήθηκαν ως σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων (DE) μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων. Μια λίστα γονίδιο δημιουργήθηκε με τη λήψη της επικάλυψης των γονιδίων DE παράγεται από limma τόσο από τις μεθόδους κανονικοποίησης RMA και GCRMA.

Ανάλυση Western Blot

Στο τέλος των πειραμάτων, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (0.05 mol /L Tris · HCl ρΗ 7,7, 0,15 mol /L NaCl, 0,8% SDS, 10 mmol /L EDTA, 100 μmol /L NaVO4, 50 mmol /L NaF, 0,3 mmol /L PMSF , 5 mmol /L ιωδοοξικό οξύ) που περιέχει λευπεπτίνη (50 μg /mL), απροτινίνη (5 μl /ml) και πεπστατίνη (50 μg /mL). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (30 μg) επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (0.5 mol /L Tris · HCl ρΗ 6,8, 20% γλυκερόλη, 10% SDS, 0,2% 2β-μερκαπτοαιθανόλη, 0,05% μπλε βρωμοφαινόλης) και θερμάνθηκε στους 95 ° C για 5 λεπτά . Μετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισμό με SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 3% άπαχο ξηρό γάλα πριν από την επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες με τα ειδικά πρωτεύοντα αντισώματα στις κατάλληλες αραιώσεις. Η ανίχνευση έγινε χρησιμοποιώντας ένα δευτερογενές αντίσωμα χράνου-συζευγμένου με υπεροξειδάση και αυξημένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (SuperSignal Χημειοφωταύγειας Σύστημα Ανίχνευσης). Σε κάθε έκφραση κηλίδος Western ακτίνης πείραμα αξιολογήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Για κάθε ανάλυση πρωτεϊνών, τρία διαφορετικά πειράματα έγιναν? η πυκνομετρική ανάλυση αναφέρθηκε στα στοιχεία που διεξήχθη σχετικά με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τα τρία διαφορετικά πειράματα.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Κυτταρικής Βιωσιμότητας Μελέτες

DU145 και τα κύτταρα PC3 σπάρθηκαν (1 × 10

4 κύτταρα ανά τρυβλίο) σε τρυβλία 6 cm. Μετά από 2 ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για 24 ώρες, είτε μόνο του ή σε παρουσία του GnRH ανταγωνιστή Antide (Ant, 10

-6 mol /L) , που ακολουθείται από δοκεταξέλη (10 nmol /L) για 48-72 ώρες. Κύτταρα κατεργασμένα με καθένα από τα δύο φάρμακα μόνο του ή χωρίς επεξεργασία χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Στο τέλος των θεραπειών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο. Για τις μελέτες βιωσιμότητας, DU145 και PC3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται και η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων μετρήθηκε με μέτρηση των κυττάρων Trypan μπλε χρώση.

Caspase-3 Δοκιμασία Ενζύμου Δραστηριότητα

δραστικότητα Caspase-3-όπως εκτιμήθηκε με τη χρήση της χρωματομετρικής κιτ δοκιμασίας CaspACE (Promega). DU145 κύτταρα σπάρθηκαν (2 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο) σε τρυβλία 10 cm. Μετά από 2 ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με docetaxel (10 nmol /L) για 72 ώρες. Στο τέλος των θεραπειών, τα κύτταρα (τόσο προσκολλημένα και αποσπώνται) λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχεται στο κιτ που ακολουθείται από φυγοκέντρηση (15000 χ

g

για 10 λεπτά στους 4 ° C). Caspase-3-παρόμοια δραστικότητα αξιολογήθηκε ακολουθώντας την πρωτεολυτική διάσπαση του χρωματομετρικό υπόστρωμα Ac-DEVD-ρΝΑ. Τα δείγματα μετρήθηκαν στα 405 nm σε ένα φασματοφωτόμετρο με 100 μL Quarz κυψελίδα. Ο αναστολέας παν-κασπάσης z-VAD-fmk χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί η εξειδίκευση του προσδιορισμού.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Για την ανάπτυξη του docetaxel-ανθεκτικών κυττάρων (DU145-R), τα κύτταρα σπάρθηκαν σε DU145 πιάτα 10-cm σειριακά σε επεξεργασία με docetaxel (10 nmol /L, μία φορά την εβδομάδα) μέχρι να αναπτύξει την ικανότητα να αναπτύσσονται και διαιρούνται με την παρουσία του φαρμάκου (8 εβδομάδες). Για να διερευνηθεί αν οι αγωνιστές GnRH ενδέχεται επαναευαισθητοποιήσουν κύτταρα DU145-R με τη δραστηριότητα του docetaxel, ένα πρότυπο κλωνογόνο δοκιμασία διεξήχθη. DU145-R κύτταρα σπάρθηκαν στα 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για 24 ώρες που ακολουθείται από docetaxel (10 nmol /L) για 72 ώρες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες σε 5% FBS μέσο που περιέχει και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Εικόνες χρωματίστηκαν αποικίες συλλαμβάνονται από ένα photocamera Nikon.

Στατιστική Ανάλυση

Όπου κρίνεται σκόπιμο, τα δεδομένα αναλύθηκαν με δοκιμή Bonferroni, ύστερα μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης.

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

GnRH αγωνιστές Αύξηση Bax Έκφραση σε DU145 κύτταρα

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι GnRH αγωνιστές ασκούν μια αντι-πολλαπλασιαστική αποτέλεσμα επί του καρκίνου του προστάτη DU145 κύτταρα. Ωστόσο, εξακολουθεί να είναι ασαφές αν η απόπτωση μπορεί επίσης να εμπλέκονται στην αντικαρκινική δραστικότητα αυτών των ενώσεων [30], [32] – [35]. Η οικογένεια Bcl-2 των ρυθμιστών κυτταρικού θανάτου (τόσο προ-αποπτωτικών και prosurvival) αντιπροσωπεύει ένα κρίσιμο σημείο ελέγχου στην ενδογενή οδό της απόπτωσης. Το υπόλοιπο αυτών των δύο κατηγορίες πρωτεϊνών καθορίζει την τύχη του κυττάρου. Η προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax, μέσω ολιγομερισμού με Bak, μετατοπίζεται από το κυτταρόπλασμα στα μιτοχόνδρια για την αύξηση της μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης, προκαλώντας το κυτόχρωμα

γ

δραστικότητα κασπάσης-3 [54] απελευθέρωσης και. Εδώ, ερευνήσαμε αν αγωνιστές GnRH μπορεί να επηρεάσει την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην αποπτωτική παθολογική οδό. DU145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GnRH-A για 24 ώρες και οι αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης αξιολογήθηκαν με γονιδιώματος σε επίπεδο transcriptomic ανάλυση. Ανάμεσα στα γονίδια των οποίων η έκφραση αυτή τροποποιήθηκε από την επεξεργασία εστιάσαμε την προσοχή μας στην έκφραση του

Bax

.

Βαχ

έκφραση αυξήθηκε σημαντικά με 1,67 φορές (Πίνακας 1)? Η αύξηση αυτή επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western (Εικ. 1Α). Η διεγερτική δράση της GnRH-Α επί της έκφρασης Bax βρέθηκε να είναι ειδική καθώς ακυρώθηκε από τη ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων με το GnRH ανταγωνιστή Antide (Εικ. 1Β). Από την άλλη πλευρά, ο αγωνιστής GnRH δεν επηρέασε την έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτείνης Bcl-2 (Σχ. 1 C).

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (10

-6 mol /L) είτε για 24 ή 48 ώρες. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων με τη χρήση ενός αντισώματος αντι-Βαχ. Όπως αναμενόταν, η GnRH-A θεραπεία αυξάνει την έκφραση της πρωτεΐνης Bax στις 24 ώρες της θεραπείας. (Β) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (10

-6 mol /L) και με τον GnRH ανταγωνιστή Antide (Ant, 10

-6 mol /L), είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, για 24 ώρες. Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Α). Αντ, χορηγείται μόνο του, δεν επηρεάζει την έκφραση Bax, ενώ GnRH-Α, όπως αναμενόταν, αυξάνει την έκφραση του Bax. Αυτή η διεγερτική δράση της GnRH-A είναι ειδική, δεδομένου ότι καταργείται από το ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων με τον ανταγωνιστή GnRH. (Γ) Κατεργασία των κυττάρων DU145 με GnRH-Α (10

-6 mol /L) είτε για 24 ή 48 ώρες, δεν επηρεάζει την έκφραση Bcl-2, όπως αξιολογήθηκε με κηλίδωση Western. Τόσο για Βαχ και ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης Bcl-2 από έναν εκπρόσωπο από τρία διαφορετικά πειράματα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05

έναντι

C (χωρίς θεραπεία ελέγχους)? **

P

& lt? 0,05

έναντι

κύτταρα GnRH-Α-θεραπεία

Η

Σε DU145 κύτταρα Έκφραση GnRH αγωνιστές upregulate Bax, μέσω της Σηματοδοσίας p53. μονοπάτι

Ο βασικός ρόλος του p53 στον εγγενή αποπτωτικό μονοπάτι είναι καλά εδραιωμένη [55]. Αφού ενεργοποιηθεί μέσω φωσφορυλίωσης σε Ser-15, ρ53 μετατοπίζεται εντός του πυρήνα για να ρυθμίζουν την έκφραση των αποπτωτικών γονιδίων, όπως

Βαχ

[56]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση ρ53 αναφέρθηκε ότι εξαρτάται από τη δραστικότητα της ΜΑΡΚ p38 [57]. Με ανάλυση κηλίδας Western βρήκαμε ότι, στα κύτταρα DU145, GnRH-A θεραπεία (1-48 ώρες) δεν επηρεάζει την έκφραση του p53? Ωστόσο, τα επίπεδα των σερίνη-15 φωσφορυλιωμένη (

δηλ

., ενεργό) μορφή της πρωτεΐνης αυξήθηκαν σημαντικά μετά από 1 και 5 ώρες θεραπείας (Εικ. 2Α). Όταν τα κύτταρα προκατεργάστηκαν (2 ώρες) με pifithrin-α (ο αναστολέας ρ53) την διεγερτική δράση της GnRH-Α (24 ώρες) επί της έκφρασης Bax καταργήθηκε πλήρως (Εικ. 2Β). Βρήκαμε επίσης ότι η θεραπεία των κυττάρων με GnRH-Α (5-15 λεπτά) δεν επηρέασε το επίπεδο έκφρασης της ρ38 ΜΑΡΚ? ωστόσο αύξησε σημαντικά τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του ΜΑΡΚ, κατά χρονικά διαστήματα λεπτά 5 και 10 (Σχ. 3Α). Προεπεξεργασίας (30 λεπτά) των κυττάρων με SB203580 (1 mmol /L), το ειδικό αναστολέα ρ38, μείωσε σημαντικά τις διεγερτικές επιδράσεις της GnRH-Α επί της φωσφορυλίωσης ρ53 (1 και 5 ώρες) (Σχ. 3Β). Έτσι, σε κύτταρα DU145 GnRH αγωνιστές ρυθμίζουν προς τα πάνω την έκφραση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax μέσω ρ53 φωσφορυλίωση? p38 ΜΑΡΚ είναι ένα ανάντη ενεργοποιητής αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης ρ53-Bax.

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (1-48 ώρες). Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων χρησιμοποιώντας (Ser-15) αντισωμάτων ρ53 ή ρ-p53. Η θεραπεία με GnRH-A δεν επηρεάζει την έκφραση του p53 κατά τα χρονικά διαστήματα του χρόνου θεωρείται? Ωστόσο, τα επίπεδα της σερίνης-15 φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης αυξήθηκε σημαντικά μετά από 1 και 5 ώρες θεραπείας. (Β) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (10

-6 mol /L) είτε μόνο του είτε μετά από μια προεπεξεργασία με pifithrin-α (PIF, 30 mmol /L, για 2 ώρες), τον συγκεκριμένο αναστολέα ρ53. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων χρησιμοποιώντας Βαχ antiobody. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δείχνουν ότι pifitrhin-α, όταν χορηγείται μόνο του, δεν επηρεάζει την έκφραση Bax. Όπως αναμενόταν, η GnRH-Α αυξάνει την έκφραση του Bax? αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε πλήρως όταν τα κύτταρα προκατεργάζονται με pifithrin-α. Ένα αντιπροσωπευτικό τριών διαφορετικών πειραμάτων, για κάθε μία από τις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν, δείχνεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05

έναντι

C (χωρίς θεραπεία ελέγχους)? **

P

& lt?. 0.05

έναντι

GnRH-Α-επεξεργασμένα κύτταρα

Η

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GnRH-Α (10

-6 mol /L) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (5-15 λεπτά). Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων με τη χρήση αντισωμάτων ρ38 και ρ-p38. Η θεραπεία με GnRH-A δεν επηρεάζει την έκφραση του p38 σε οποιοδήποτε χρονικό διάστημα θεωρείται. Από την άλλη πλευρά, η GnRH-Α αυξάνει σημαντικά τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του ρ38 (ρ-p38) στους 5 και 10 λεπτά της θεραπείας. (Β) Όπως αναμενόταν, GnRH-Α αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης της ρ-p53, επιβεβαιώνοντας προηγούμενα αποτελέσματα? πυκνομετρική ανάλυση των δεδομένων δείχνουν ότι αυτή η επίδραση μειώνεται σημαντικά όταν τα κύτταρα προκατεργάζονται με τον συγκεκριμένο αναστολέα ρ38 SB203580 (SB, 1 mmol /L, για 30 λεπτά). Ένα αντιπροσωπευτικό τριών διαφορετικών πειραμάτων, για κάθε μία από τις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν, δείχνεται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05

έναντι

C (χωρίς θεραπεία ελέγχους)? **

P

& lt?. 0.05

έναντι

κύτταρα GnRH-Α-αγωγή

Η

αγωνιστές GnRH ευαισθητοποίηση ρ53-θετικά κύτταρα DU145 στην κυτταροτοξική δράση του Docetaxel

μια διαταραχή στην ισορροπία μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικά παράγοντες είναι ένα κρίσιμο βήμα στην απόφαση των κυττάρων να υποβληθούν σε απόπτωση ή την επιβίωση. Με βάση την διεγερτική δράση των αγωνιστών GnRH στην έκφραση Bax, που προκαλείται από την ενεργοποίηση της ρ53, ερευνήσαμε αν αγωνιστές GnRH ενδέχεται να επάγουν απόπτωση σε κύτταρα DU145. Με ανάλυση FACS δεν θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε κανένα προαποπτωτική επίδραση της GnRH-Α σε αυτά τα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι παρατηρήσεις δεν ήταν απρόσμενη δεδομένου ότι προηγουμένως αναφέρθηκε ότι, σε CRPC κύτταρα, GnRH αγωνιστές μειώνουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων χωρίς να επάγουν απόπτωση [30], [32], [35]. Ο λόγος για τον οποίο, σε κύτταρα DU145, GnRH αγωνιστές αυξάνουν τα επίπεδα Bax χωρίς την ενεργοποίηση του αποπτωτικών περίπτωση είναι ενδιαφέρουσα. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι τα κύτταρα DU145 υπερεκφράζουν αντιαποπτωτικού πρωτεΐνη Bcl-2, και τα επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης δεν επηρεάζονται από την GnRH-Α θεραπείας (βλέπε Σχ. 1C). Έτσι, είναι πιθανό ότι, σε αυτά τα κύτταρα, η αυξημένη έκφραση του Βαχ που προκαλείται από ΟηΚΗ-Α δεν είναι επαρκής για να ενισχύσει αποτελεσματικά την αναλογία Βαχ /Bcl-2 για να προκαλέσει απόπτωση. Με βάση αυτές τις εκτιμήσεις, εμείς αιτιολογημένη ότι GnRH αγωνιστές, μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της προ-αποπτωτικών παραγόντων, θα μπορούσαν να ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα του προστάτη με τη δραστηριότητα των κυτταροτοξικών φαρμάκων, που είναι γνωστό ότι δρουν αυξάνοντας την έκφραση του προ-αποπτωτικών παραγόντων ενώ μειώνεται αυτή των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών. Εστιάσαμε την προσοχή μας σε docetaxel από: α) αντιπροσωπεύει τη θεραπεία επιλογής για CRPC [4], [5]? β) έχει δειχθεί ότι επάγει θάνατο κυττάρου όγκου, μέσω προς τα πάνω ρύθμιση της προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax και προς τα κάτω ρύθμιση του αντιαποπτωτικού πρωτεΐνης Bcl-2 [8], [9]. Πρώτον, με κηλίδωση Western, επιβεβαιώσαμε ότι docetaxel (48 ώρες) μειώνει σημαντικά την έκφραση του Bcl-2, ενώ η αύξηση αυτή του Βαχ (Σχ. 4Α). Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί κατά πόσο αγωνιστές GnRH μπορεί να ενισχύουν την αντικαρκινική δράση της docetaxel. Αρχικά διαπιστώθηκε ότι, όταν χορηγείται μόνο του, GnRH-Α (24 ώρες) δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων DU145. Αυτό δεν ήταν απροσδόκητο, αφού έχουμε ήδη αναφερθεί ότι, στην CRPC κύτταρα, GnRH αγωνιστές μπορούν να ασκήσουν μια σημαντική αντι-πολλαπλασιαστική δράση μόνο όταν οι θεραπείες που εκτελούνται για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα (4-7 ημέρες) [29]. Παρόμοια δεδομένα έχουν αναφερθεί για άλλους τύπους όγκων [58], [59]. Τότε αποδείξαμε ότι προκατεργασία κυττάρων DU145 με GnRH-Α (24 ώρες) βελτιώνει σημαντικά τις αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις του docetaxel (48-72 ώρες) σε όλα τα χρονικά διαστήματα (Εικ. 4Β). Επιπλέον, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι η δράση ευαισθητοποίησης της GnRH-Α έως docetaxel ήταν ειδική, δεδομένου ότι ήταν εντελώς καταργήθηκε με την ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων με το GnRH ανταγωνιστή Antide (Εικ. 4C). Υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες, η εκτίμηση της βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. GnRH-A, όταν χορηγείται μόνο του, δεν επηρέασε την βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 4D). Όπως ήταν αναμενόμενο, η docetaxel αύξησε σημαντικά τον αριθμό των θετικών Trypan μπλε χρώση κυττάρων (νεκρά κύτταρα). Αυτή η επίδραση ήταν σημαντικά ενισχύεται από την προεπεξεργασία των κυττάρων με GnRH-Α σε όλα τα χρονικά διαστήματα (Εικ. 4D). Για να επιβεβαιωθεί ότι η προ-θεραπεία με αγωνιστές GnRH ευαισθητοποιεί CRPC κυττάρων στην αντικαρκινική δράση της docetaxel, τα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με GnRH-Α (24 ώρες) και στη συνέχεια με το κυτταροτοξικό φάρμακο για 72 ώρες. δραστικότητα κασπάσης-3 στη συνέχεια αξιολογήθηκε ως ένας δείκτης της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. GnRH-Α, χορηγείται μόνο του, δεν επηρέασε δραστικότητα κασπάσης-3? όπως αναμενόταν, docetaxel αυξημένη ενζυματική δραστικότητα. Προκατεργασία των κυττάρων με GnRH-Α ενίσχυσε σημαντικά την proapototic επίδραση του χημειοθεραπευτικού παράγοντα. Το αποτέλεσμα είναι ειδικό δεδομένου ότι αντισταθμίζεται από την ταυτόχρονη επεξεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα της κασπάσης παν-z-VAD-fmk (Εικ. 4Ε).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί ότι η κυτταροτοξική δραστικότητα του docetaxel (Doc) διαμεσολαβείται από μια διαταραχή των πρωτεϊνών αναλογία προ-προς-αντιαποπτωτικών. κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή με docetaxel (10 nmol /L) για 48 ώρες. Όπως ήταν αναμενόμενο, η docetaxel μειώνει την έκφραση της αντιαποπτωτικής πρωτείνης Bcl-2, ενώ η αύξηση της έκφρασης Bax. Ένα αντιπροσωπευτικό τριών διαφορετικών πειραμάτων παρουσιάζεται. (Β) κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με GnRH-Α (10

-6 mol /L) επί 24 και στη συνέχεια με docetaxel (10 nmol /L) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (48-72 ώρες). Στο τέλος των θεραπειών, τα κύτταρα μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο. Προκατεργασία των κυττάρων με GnRH-Α αυξάνει σημαντικά την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της docetaxel σε όλα τα χρονικά διαστήματα εξετάζεται. (C) κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με GnRH-Α (10

-6 mol /L) και με τον GnRH ανταγωνιστή Antide (Ant, 10

-6 mol /L), είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, για 24 ώρα, και στη συνέχεια με docetaxel (10 nmol /L) για 60 ώρες. Στο τέλος των θεραπειών, τα κύτταρα μετρήθηκαν με αιμοκυτταρόμετρο. Προκατεργασία των κυττάρων με GnRH-Α αυξάνει σημαντικά την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της docetaxel? η επίδραση αυτή είναι ειδική καθώς είναι πλήρως καταργείται από την ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων με Αντ. (D) Στο τέλος των θεραπειών (εκτελείται όπως περιγράφεται στο Β), η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία εξαίρεσης κυανούν τρυπανίου. Ο αριθμός των νεκρών κυττάρων μετρήθηκε με μέτρηση των κυττάρων Trypan μπλε χρώση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως επί τοις εκατό των χρωματισμένων κυττάρων /σύνολο των κυττάρων. Docetaxel αυξάνει σημαντικά τον αριθμό των νεκρών κυττάρων? σε όλα τα χρονικά διαστήματα, η επίδραση αυτή είναι σημαντικά ενισχύεται από την προεπεξεργασία των κυττάρων με GnRH-A. (Ε) κύτταρα DU145 προκατεργάστηκαν με GnRH-A για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με docetaxel για 72 ώρες. Στο τέλος της κασπάσης θεραπείας 3-σαν δραστικότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση της χρωματομετρικής CaspACE κιτ δοκιμασίας. Προκατεργασία των κυττάρων με GnRH-Α ενισχύει σημαντικά την proapototic επίδραση της docetaxel σε όρους δραστηριότητας κασπάσης-3. Το αποτέλεσμα είναι ειδική επειδή αντισταθμίζεται από την ταυτόχρονη θεραπεία με τον αναστολέα της κασπάσης παν-z-VAD-fmk. Σε Β-Ε κάθε πειραματική ομάδα αποτελείτο από έξι επαναλήψεις και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM. *

P

& lt? 0,05

έναντι

C (χωρίς θεραπεία ελέγχους)? **

P

& lt?. 0.05

έναντι

κύτταρα docetaxel έλαβαν

Η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, σε p53-θετικά DU145 του προστάτη καρκινικά κύτταρα GnRH αγωνιστές ευαισθητοποιήσει ειδικά τα κύτταρα με την κυτταροτοξική δράση της docetaxel? Η επίδραση αυτή είναι πιθανό η συνέπεια της GnRH-Α-επαγόμενη ενεργοποίηση της p38 /p53 /Bax απόπτωση μονοπάτι σηματοδότησης.

αγωνιστές GnRH επαναευαισθητοποιήσουν ρ53-θετικά κύτταρα DU145 προς την κυτταροτοξική δραστικότητα του Docetaxel

για να αποκτήσετε docetaxel-ανθεκτικών κυττάρων (DU145-R), τα κύτταρα DU145 σειριακά σε επεξεργασία με docetaxel (μία φορά την εβδομάδα για 8 εβδομάδες), έως ότου αναπτύξει την ικανότητα να αναπτύσσονται παρουσία του φαρμάκου. Σε αυτά τα κύτταρα, η αντίσταση στην κυτταροτοξική ένωση συσχετίστηκε με μία σημαντική μείωση των επιπέδων Βαχ, χωρίς καμία μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης του Bcl-2 (Εικ. 5Α), επιβεβαιώνοντας τις προηγούμενες παρατηρήσεις αναφορά μικρή συναίνεση μεταξύ ταξάνης-αντίσταση και υπερέκφραση Bcl-2 [60]. Από την άλλη πλευρά, τα δεδομένα μας δείχνουν σαφώς ότι τα κύτταρα DU145 μπορούν αντίθεση και να ξεπεράσουν την αντικαρκινική δράση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων με αύξηση της αναλογίας μεταξύ αντι- και προαποπτωτική πρωτεΐνες. Με κλωνογονική δοκιμασία, μπορούμε στη συνέχεια διερευνήσαμε εάν αγωνιστές GnRH ενδέχεται επαναευαισθητοποιήσουν docetaxel ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη στην προαποπτωτική δραστηριότητα του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου. Θεραπεία της DU145-R κυττάρων με GnRH-Α (24 ώρες) από μόνη της δεν επηρέασε την ικανότητα των κυττάρων να σχηματίζουν αποικίες (Εικ. 5Β). Όπως αναμενόταν, DU145-R κύτταρα σχημάτισαν αποικίες με την παρουσία του docetaxel (72 ώρες), επιβεβαιώνοντας την απόκτηση τους αντοχής στο φάρμακο. Ωστόσο, ο συνδυασμός της θεραπείας (GnRH-A για 24 ώρες ακολουθούμενη από ντοσεταξέλη για 72 ώρες) κατήργησε εντελώς την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων DU145-R (σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι GnRH αγωνιστές μπορούν επαναευαισθητοποιήσουν docetaxel ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα του προστάτη με την αντικαρκινική δράση του χημειοθεραπευτικού φαρμάκου.

DU145 καρκίνου του προστάτη κύτταρα έγιναν ανθεκτικά σε docetaxel (Doc) μετά από αγωγή με το χημειοθεραπευτικό φάρμακο (10 nmol /L) μία φορά την εβδομάδα για 8 κύκλους. (Α) ανάλυση κηλίδας Western των Bcl-2 και Bax σε κύτταρα docetaxel ανθεκτικά (DU145-R).