Αφηρημένο

Ιστορικό

Toll-όπως υποδοχείς (TLRs) είναι βασικοί παράγοντες στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα και να κινήσει τη φλεγμονώδη απόκριση σε ξένα παθογόνα, όπως βακτήρια, μύκητες και ιούς. Στο μικροπεριβάλλον της ογκογένεσης, TLRs μπορεί να προωθήσει τη φλεγμονή και την κυτταρική επιβίωση. ΤοΙΙ υποδοχέα 2/6 (TLR2 /6) σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου θεωρείται ως ένας από τους μηχανισμούς της χρόνιας φλεγμονής, αλλά μπορεί επίσης να μεσολαβήσει ανοσοποιητικό διαφυγή των κυττάρων του όγκου και της εξέλιξης του όγκου. Ωστόσο, η έκφραση των TLR2 και η βιολογική λειτουργία της στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του ηπατοκαρκινώματος δεν έχουν διερευνηθεί. Αυτή η μελέτη είχε ως στόχο να προσδιοριστεί η έκφραση των TLRs 1-10 στην καθιερωμένη ανθρώπινη κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος BLE-7402, να ερευνήσει τη βιολογική επίδραση του TLR2 στην κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση.

Μέθοδοι

έκφραση TLR σε BLE-7402 κύτταρα προσδιορίστηκε με RT-PCR, PCR πραγματικού χρόνου και κυτταρομετρία ροής (FCM). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η λειτουργία του TLR2 σε ανάπτυξη ηπατοκαρκινώματος, BLE-7402 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ανασυνδυασμένα πλασμίδια που εκφράζουν μία από τις τρεις μορφές του TLR2 siRNA (sh-TLR2 RNAi (Α, Β και C)). TLR2 knockdown επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας RT-PCR, PCR πραγματικού χρόνου και μικροσκοπία φθορισμού. πολλαπλασιασμός καρκινικών κυττάρων παρακολουθήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ και εκκρίνεται κυτοκινών στο υπερκείμενο των επιμολυσμένων κυττάρων μετρήθηκαν με FCM με βάση σφαιρίδια, η λειτουργία του TLR2 siRNA διερευνήθηκε επίσης in vivo.

Αποτελέσματα

Η BLE-7402 κυτταρική γραμμή εξέφρασε TLRs 2 έως 10 και στα δύο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. TLR2 ήταν η πιο υψηλή έκφραση TLR. Ενώ όλες οι τρεις siRNAs ανέστειλαν TLR2 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης, SH-TLR2 RNAi (Β) είχε την ισχυρότερη επίδραση knockdown. TLR2 νοκ ντάουν με sh-TLR2 RNAi (Β) μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Επιπλέον, η έκκριση της IL-6 και IL-8 μειώθηκε επίσης. Το αποτέλεσμα έδειξε μια δραστική μείωση στον όγκο του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με SH-TLR2 RNAi (Β).

Συζήτηση

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το TLR2 knockdown αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καλλιεργημένων κυττάρων ηπατοκαρκινώματος και να μειώσει την έκκριση κυτοκινών. Προτείνεται ότι TLR2 σίγηση μπορεί να αξίζει περαιτέρω έρευνες για γονιδιακή θεραπεία siRNA που βασίζεται στην επεξεργασία του ηπατοκαρκινώματος

Παράθεση:. Huang Υ, Cai Β, Xu Μ, Qiu Ζ, Τάο Υ, Zhang Y, et al. (2012) γονιδιακή σίγηση του ΤοΙΙ υποδοχέα 2 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρωπίνων ηπατικών κυττάρων Καρκίνος και έκκριση φλεγμονωδών κυτοκινών. PLoS ONE 7 (7): e38890. doi: 10.1371 /journal.pone.0038890

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Ταϊβάν

Ελήφθη: 4 Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 14, Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 16 Ιούλη, 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Jiangsu Provincial Φυσικών Επιστημών (BK2011175). YZH υποστηρίζεται από Jiangsu Provincial Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (BK2011164), Υγεία Ερευνητικό Πρόγραμμα της επαρχίας Jiangsu (X200736, X201110). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα ή καρκίνο του ήπατος θεωρείται ότι είναι ένα πρωτεύον καρκίνου που προέρχεται από τα κύτταρα του ήπατος? είναι ένα από τα πιο καταστροφική μορφή καρκίνου, ειδικά στην Κίνα. Επί του παρόντος, λείπει αποτελεσματικών μολύβδου θεραπεία για αναζήτηση νέα στρατηγική θεραπείας, όπως η γονιδιακή θεραπεία. Σύντομης παρεμβολής RNA, siRNA μπορεί να προσφέρεται ως μια νέα θεραπεία μόλις βρεθεί ένας καλός στόχος. Είναι πρότεινε πρόσφατα TLRs εκφράζονται σε πολλούς ανθρώπινους όγκους [1],

ΤοΙΙ υποδοχέων (TLRs) είναι μία άκρως συντηρημένη οικογένεια του τύπου Ι διαμεμβρανικών υποδοχέων που αναγνωρίζουν ειδικά μοριακά πρότυπα παθογόνο που σχετίζεται (PAMPs), π.χ. λιποπολυσακχαρίτης, lipotechoic οξύ και άλλα συστατικά του βακτηριακού τοιχώματος [1], [2], και μπορεί επίσης να μεσολαβήσει ανοσοποιητικό διαφυγή των κυττάρων του όγκου και της εξέλιξης του όγκου. Ανθρώπινο TLRs έχουν μια κυτταροπλασματική περιοχή η οποία είναι ομόλογη με την κυτταροπλασματική περιοχή της ανθρώπινης ιντερλευκίνης (IL) -1 υποδοχέα [3]. Μέχρι σήμερα, έχουν 11 TLRs θηλαστικών έχουν αναγνωριστεί και χαρακτηριστεί.

Πρόσφατα, νέα έρευνα έχει αποκαλύψει ότι TLRs εκφράζονται από πολλούς ανθρώπινους όγκους [2], [3], [4], [5], [6 ], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, ο καρκίνος του πνεύμονα, ο καρκίνος του μαστού και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Αν και οι TLRs έχουν διαφορετικές λειτουργίες σε διαφορετικά κύτταρα του όγκου, μερικά αποτελέσματα έχουν δείξει ότι TLR σηματοδότηση μπορεί να παίξει ένα ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. Για παράδειγμα, TLR2 σηματοδότηση μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα και αντοχή σε απόπτωση [7], [8]? TLR3 εξαρτώμενη σηματοδότηση μπορεί να οδηγήσει άμεσα σε απόπτωση σε ανθρώπινα καρκίνο του μαστού [6]? μέσω των δράσεών τους για μεταλλοπρωτεάσες και ιντεγκρίνες, TLR2 και TLR9 μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της εισβολής και της μετάστασης [8], [9]? TLR4 μπορούν να μεσολαβήσουν μετάσταση που προωθεί ενεργά εισβολής καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [10].

υποδοχέα ΤοΙΙ 2/6 (TLR2 /6) σηματοδότηση σε κύτταρα όγκου έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως θεωρείται ως ένας από τους μηχανισμούς της χρόνιας φλεγμονής, αλλά μπορεί επίσης να μεσολαβήσει ανοσοποιητικό διαφυγή των κυττάρων του όγκου και της εξέλιξης του όγκου. Επιπλέον, TLR2 πράξη ως πιθανή αντιική μηχανισμός σε κυτταρικές γραμμές ηπατοκυττάρου ηπατίτιδα Β που έχουν μολυνθεί [11].

Οι TLRs εκφράζονται σε μια ευρεία ποικιλία κυττάρων όγκου και υπάρχουν υποψίες ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνο, ωστόσο, η έκφραση των TLRs από κύτταρα ηπατοκαρκινώματος δεν έχει εξετασθεί με συστηματικό τρόπο και λίγα είναι γνωστά για TLR αλληλεπίδραση με την εξέλιξη της νόσου. Σε αυτή τη μελέτη, με στόχο να προσδιοριστεί η έκφραση του TLRs 1-10 στην καθιερωμένη ανθρώπινη κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος BLE-7402. Εμείς επιπλέον ως στόχο να διερευνήσει τη βιολογική επίδραση του TLR2 στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση, και να αξιολογήσει τις δυνατότητές της στον τομέα της θεραπείας του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα πειράματα συμμορφωθεί με τους ισχύοντες νόμους της Κίνας.

κυτταρική γραμμή

το ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρική σειρά BEL-7402 αγοράστηκε από το κύτταρο τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). BEL-7402 αναπτύχθηκε χωρίς αντιβιοτικά σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) που περιέχει 10% FBS.

Δόμηση των πλασμιδίων που εκφράζουν siRNA

Τρεις μικρό παρεμβαλλόμενο ολιγονουκλεοτίδια (Α: 5′-aactatccactggtgaaacaa-3 ‘, Β: 5′-aaacttgtcagtggccagaaa-3′, C: 5’-aaagtcttgattgattggcca-3 ‘) σχεδιάστηκαν με βάση τις αλληλουχίες του ανθρώπινου TLR 1 -10 (Πίνακας 1) και συντεθεί. RNAi φορείς πλασμιδίου (Σχήμα S1) που εκφράζουν siRNAs για TLR2 κάτω από τον έλεγχο ενός ανθρώπου υποκινητή CMV, παρήχθησαν εισάγοντας ζεύγη των ανοπτημένων DNA ολιγονουκλεοτίδια ειδικά για TLR2 στις θέσεις HindIII και BamHI διαδοχικά στο πλασμίδιο pGenesil-1 (shTLR2, πίνακας 2). Μια pGenesil-1-κωδικοποιημένα φορέας χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

Ποιοτική RT-PCR

ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να απομονωθεί ολικό RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα κλάσμα 4 μg ολικού RNA αναμίχθηκαν με έναν εκκινητή ολιγο-άΤ και ιό μυελοβλάστωσης (MLV) αντίστροφης μεταγραφάσης (Promega, Madison, WI). PCR εναρκτήρες για TLR 1-10, μαζί με GAPDH ως έλεγχος, σχεδιάστηκαν όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. Οι συνθήκες της PCR ήταν οι εξής: 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους των 95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 1 λεπτό. Η τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε 1.5% (β /ο) πηκτές αγαρόζης που περιείχε 0. 5 μg /mL βρωμιούχο αιθίδιο και κατέστησαν ορατά υπό υπεριώδες φως. πυκνότητα Band αναλύθηκε και ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Real-time PCR

Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε 45 μί ϋΕΡΟ-H

2Ο, 1.0 μί cDNA σε αραίωση 1:100, 2,0 μL (10 μΜ) του κάθε εκκινητή και ξηράνθηκε με κατάψυξη σκόνης σύμφωνα τις οδηγίες του manfacturer του προμίγματος AccuPower Greenstar® qPCR. Η διαδικασία για την PCR ήταν ως ακολούθως: 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από 40 κύκλους των 94 ° C για 30 sec, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 30 sec. Ο φθορισμός μετρήθηκε μετά από κάθε στάδιο επέκτασης 72 ° C για 30 sec (Eppendorf, Γερμανία). Στο τέλος της αντίδρασης, η καμπύλη τήξεως κάθε δείγμα αναλύθηκε. λογισμικό ανάλυσης BIONEER Exicycler ™ (Bioneer Corp., Daejeon, Κορέα) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η C

t τιμές. Σχετική έκφραση των γονιδίων στόχων καθορίστηκε από το

-ΔΔ μέθοδο 2 CT [12].

κυτταρομετρίας ροής Ανίχνευση TLR έκφρασης της πρωτεΐνης

Ένα εναιώρημα 2 × 10

6 καλλιεργήθηκαν BEL-7402 κύτταρα παρασκευάστηκε και διαπερατά για την ανίχνευση της έκφρασης της πρωτεΐνης TLR. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν δύο φορές με 1 χ PBS, μετά χρωματίστηκαν με 5 μΙ καθαρισμένο αντι-ανθρώπινο TLR2 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) στους 4 ° C για 1 ώρα προστατευμένο από το φως. Μετά από πλύση δύο φορές με 1 χ PBS, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας (1500 g, 10 λεπτά) και επωάστηκαν με 2 μι ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG mAb (Santa Cruz Biotechnology) σε 4 ° C για 30 λεπτά σε το σκοτάδι, ακολουθούμενο από δύο πλύσεις με 1 χ PBS. Τέλος, τα χρωματισμένα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 500 μL 1 × PBS, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACScalibur? Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest BD. Ο αρνητικός μάρτυρας υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο αλλά χωρίς το αντίσωμα anti-TLR2.

παρεμβολή RNA Δοκιμασία

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με την GFP που εκφράζει πλασμίδιο pGsil-1 (Genesil, Wuhan, Κίνα ) που περιέχει siRNA που κατευθύνεται έναντι TLR2, όπως φαίνεται στον πίνακα 2. Τα επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα μέχρις ότου έφθασε το 70% συρροή. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με χρήση Lipofectamine ™ 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τέσσερα μg πλασμιδίου DNA (sh-TLR2 RNAi (Α), SH-TLR2 RNAi (Β), SH-TLR2 RNAi (C), τον φορέα pGenesil-1 και κωδικοποιημένα siRNA) χρησιμοποιήθηκαν για επιμόλυνση σε κύτταρα αντίστοιχα (SunShineclean ™ Without- ενδοτοξίνη πλασμίδιο Mini Extraction Kit, SunShineBio, Κίνα). Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες, στη συνέχεια ο φθορισμός παρατηρήθηκε με τη χρήση μικροσκοπίου φθορισμού. Κατά το χρόνο αυτό τα κύτταρα συλλέχθηκαν επίσης για προσδιορισμό FCM και ανοσοφθορισμού.

Η

Ανάλυση Ανοσοφθορισμού

BEL-7402 κύτταρα επιμολύνθηκαν με διάφορες siRNA πλασμίδια και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με αλκοόλη για 30 min και αποκλείστηκε σε 1 χ PBS (ρΗ 7,4) διαλύματος με 3% BSA. Το anti-TLR2 αντίσωμα (SC-166900, Santa Cruz Biotechnology) προστέθηκε σε μία αραίωση 1:200 και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένη κουτί. Μετά την πλύση, το φθορίζον δεύτερο αντίσωμα (SC-22766, Santa Cruz Biotechnology) προστέθηκε σε μία αραίωση 1:100 και επωάστηκαν για 2 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με 1 χ PBS, και αντι-βάφτηκαν με DAPI. Συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη και ο φθορισμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Leica DMI4000B, Buffalo Grove, IL).

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Η δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma, St. Louis, ΜΟ) ήταν χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων κυττάρων (1 χ 10

4 /φρεάτιο, 5 φρέατα ανά κατάσταση) όλη τη νύκτα, και επιμολύνσεις κυττάρων διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48 ώρες, ένα δείγμα των επιμολυσμένων κυττάρων συλλέχθηκε ως το δείγμα 0 h, ενώ τα άλλα κύτταρα συνέχισαν σε καλλιέργεια για 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες. Στο τέλος της κάθε περιόδου θεραπείας, ΜΤΤ προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας σε κάθε φρεάτιο σε συγκέντρωση 5 mg /mL (Sigma Chemical Co., St Louis, ΜΟ), και στη συνέχεια επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C. Το υπερκείμενο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα κύτταρα αναμείχθηκαν με 100 μL /φρεάτιο διμεθυλοσουλφοξειδίου. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αυτόματο φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας (340st? Anthos Zenyth, Salzburg, Austria) σε 490 nm

Ανθρώπινο Φλεγμονώδεις Δοκιμασία κυτοκίνης

Το υπερκείμενο συλλέχθηκε από τα επιμολυσμένα κύτταρα.. IL-6 και IL-8 επίπεδα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη φλεγμονώδης κυτοκίνη kit (BD ™ κυτταρομετρίας Στεφάνη Array) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πείραμα του Mouse Μοντέλο in vivo

αθυμικά γυμνά αρσενικό ποντικοί (Balb /c -nu /ηυ? 5-7 εβδομάδων) διαιρέθηκαν σε πέντε ομάδες αγωγής με δέκα ποντίκια ανά ομάδα θεραπείας. μεταχείρισης των ζώων και πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από την Επιτροπή τα πειράματα σε ζώα της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ένα εναιώρημα BEL-7402 κύτταρα (1 χ 10

7) σε 500 μΙ PBS εγχύθηκε σε υποδόριες του abodomen. Αυτή η συγκέντρωση των κυττάρων ήταν αναγκαία για να επιτευχθεί συνεκτική τοπική ανάπτυξη του όγκου εντός 10 ημερών από την εμφύτευση. Τις ημέρες 10 και 15 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι εγχύθηκαν αντίστοιχα με DNA πλασμιδίου (sh-TLR2 RNAi (Α), SH-TLR2 RNAi (Β), SH-TLR2 RNAi (C), τον φορέα pGenesil-1 και κωδικοποιημένα siRNA) , με 150 μg κάθε φορά. Η κλίμακα του όγκου προσδιορίστηκε με οπτική επιθεώρηση και μετράται με Vernier δαγκάνα 15 ημέρες μετά τη δεύτερη ένεση.

Στατιστική Ανάλυση

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα και παρουσιάζονται ως τα μέσα ± τυπική απόκλιση (SD). Μαθητή

t-test

και ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σημασία και οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

P

τιμή μικρότερη του 0,05.

Αποτελέσματα

η έκφραση του TLRs στην BEL-7402 Κυτταρικής γραμμής

ανάλυση Ημι-ποσοτική RT-PCR αποκάλυψε ότι το mRNA για TLRs (TLR 2-10) εκφράζεται σε BEL-7402 κύτταρα (Σχήμα 1Α), ενώ TLR1, 7 mRNA έκφραση ήταν μόλις ανιχνεύσιμη. Περαιτέρω ανάλυση με PCR πραγματικού χρόνου έδειξε ότι TLR7 εκφράζεται σε χαμηλότερο επίπεδο. Γι ‘αυτό επέλεξε να παραπέμψει όλες τις λοιπές επίπεδα TLR mRNA σε σχέση με το επίπεδο του TLR7 mRNA. TLR2 και TLR4 έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης, που μπορεί να δείχνουν ότι έχουν κάποια λειτουργία στο BEL-7402 της ανάπτυξης και της εξέλιξης (Σχήμα 1Β).

ημι-ποσοτικό αποτέλεσμα RT-PCR των TLRs σε BEL-7402 κυττάρων. GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (Α). Real-time RT-PCR των TLRs σε BEL-7402. Η έκφραση του TLR7 κανονικοποιήθηκε σε 1,0 ως επίπεδο της ήταν χαμηλότερη μεταξύ όλων TLRs (Β). τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης TLR σε BEL-7402 με κυτταρομετρία ροής (C). Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης TLR προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (FCM). TLR2 εκφράστηκε σε υψηλότερα επίπεδα TLR1-10, τα άλλα TLRs ήταν όλα εκφράζεται σε μέτρια επίπεδα εκφράζονται ή ασθενώς (Σχήμα 1C). Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BEL-7402 κύτταρα σε καλλιέργεια εκφράζουν TLR2-TLR10, με TLR2 είναι η πιο υψηλή έκφραση. Το αποτέλεσμα αυτό μας ενθάρρυνε να ερευνήσει περαιτέρω την λειτουργία του TLR2 στην ανάπτυξη και την εξέλιξη της BEL-7402 κύτταρα.

Η αποτελεσματική εξόντωση TLR2 Έκφρασης στην BEL-7402 Γραμμή κυττάρων από τρεις siRNAs

Για να περαιτέρω διερεύνηση των δυνατοτήτων λειτουργίας του TLR2 σε ηπατοκαρκινώματος, χρησιμοποιήσαμε μικρά RNAs φουρκέτα με νοκ ντάουν ενδογενούς γονιδιακής έκφρασης TLR2 [ID Gene: 10333]. Οι πλασμιδικοί φορείς κατασκευάστηκαν για να εκφράζουν τρεις διαφορετικές siRNAs, SH-TLR2 RNAi (Α), SH-TLR2 RNAi (Β), SH-TLR2 RNAi (C). Και οι τρεις πειραματικές φορείς siRNA επιμολύνθηκαν σε BEL-7402 κύτταρα αντίστοιχα, με περιπλεγμένο διάνυσμα siRNA και τον κενό φορέα ως έλεγχοι. Μετά από 48 ώρες, η μέση αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ήταν περίπου 70% όπως εκτιμάται από πράσινο φθορισμό θετικά κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Και οι τρεις πειραματικές siRNAs μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση TLR2 mRNA σε επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2I). επίπεδα TLR2 mRNA ήταν 29,85% ± 9,2%, 50,75 ± 6,7% και 31,34 ± 8,3% του κενού φορέα ελέγχου με SH-TLR2 RNAi (Α), SH-TLR2 RNAi (Β) και sh-TLR2 RNAi (C) αντίστοιχα, μια στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση σε σύγκριση με τα κενά κύτταρα ελέγχου φορέα (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2II). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση παρατηρήθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με το κωδικοποιημένο siRNA (

P & gt?

0.05). έκφραση πρωτεΐνης TLR2 μειώθηκε από τα τρία siRNAs με επίπεδα 33,0% ± 3,0% (sh-TLR2 RNAi (Α)), 57,9% ± 4,7% (sh-TLR2 RNAi (Β)) και 43,7% ± 4,5% (SH- TLR2 RNAi (C)) του κενού φορέα ελέγχου (Σχήμα 2III). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης TLR2 παρατηρήθηκε στην ομελέτα ελέγχου siRNA (

P & gt?

0.05). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι sh-TLR2 RNAi (Β) είναι το πιο αποτελεσματικό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο σε φίμωση TLR2. Ως εκ τούτου, επιλέγεται για να χρησιμοποιήσει μόνο sh-TLR2 RNAi (Β) σε περαιτέρω πειραματισμό.

I, RT-PCR του TLR2 από pGenesil-1 φορέα, ScrambledsiRNA, SH-TLR2 RNAi (A, B, C) επιμολυσμένα BEL-7402. II, η έκφραση TLR2 σε επίπεδο mRNA σε pGenesil-1 φορέα, ScrambledsiRNA, και SH-TLR2 RNAi (A, B, C) επιμολυσμένα BEL-7402 με πραγματικού χρόνου PCR. III, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης TLR2, μαθητή

t-test

και ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σημασία.

Η

πρωτεϊνική έκφραση TLR2 σε BEL-7402 κύτταρα περαιτέρω προσδιορίστηκε με ανοσοχρώση με ένα αντίσωμα anti-TLR2 και ορατά κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Θετική χρώση μειώθηκε δραματικά με SH-TLR2 RNAi (Β) σε σύγκριση με τον κενό φορέα ελέγχου (Εικ. 3iV). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα χρώσης του κωδικοποιημένα ελέγχου siRNA σε σχέση με τον κενό φορέα ελέγχου (Εικ. 3iV).

I, ανάλυση ΜΤΤ της πολλαπλασιαστικής ποσοστού pGenesil-1 φορέα, ScrambledsiRNA και SH-TLR2 RNAi (Β) επιμολυσμένων κυττάρων. II και III, IL-6 και IL-8 παρουσία στο υπερκείμενο που εκκρίνεται από pGenesil-1 φορέα, Κωδικοποιημένα siRNA και SH-TLR2 RNAi (Β) επιμολυσμένων κυττάρων. υπερκείμενο κυττάρων συλλέχθηκε και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Όλα τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων, μαθητή

t-test

και ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η σημασία. IV, ανάλυση ανοσοφθορισμού του γονιδίου-ειδικών siRNA επί της έκφρασης πρωτεΐνης TLR2 σε pGenesil-1 φορέα (i), Κωδικοποιημένα siRNA (ii) και sh-TLR2 RNAi (Β) (iii) επιμολυσμένων κυττάρων. Πυρηνική χρώση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DAPI (μπλε) (200 ×). TLR2 σίγηση καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού. Σύγκριση του όγκου των όγκων από κάθε ομάδα αγωγής δείχθηκε. Η θεραπεία με BEL-7402 κυττάρων (VI_i), sh-TLR2 RNAi (Β) εποικοδομητική DNA εγχύθηκε στην ομάδα του όγκου (VI_ii), σημαντικές διαφορές από τις ομάδες ελέγχου (V.▪, VI_iii) εκπροσωπήθηκε από αστερίσκους (

P

& lt?. 0.05)

η

Έτσι, έχουμε παρουσιάσει ειδικές siRNA που κατευθύνεται knockdown του γονιδίου TLR2 στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά ηπατοκυτταρικού καρκινώματος BEL-7402, και έδειξε ότι sh-TLR2 RNAi (Β ) ήταν το πιο αποτελεσματικό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο στην φίμωση TLR2.

Πολλαπλασιασμός των επιμολυσμένων BEL-7402 Γραμμή κυττάρων Μετά TLR2 Gene Knock Down

Χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία ΜΤΤ για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της sh-TLR2 RNAi (Β) μεσολάβηση ΤΙ_Ρ2 φίμωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 0 ​​ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση. Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων μειώθηκε με την παρουσία του TLR2 siRNA κατά ~ 50% κατά μέσο όρο, σε σύγκριση με τα κύτταρα χωρίς καμία επεξεργασία. Η πολλαπλασιαστική ικανότητα των BEL-7402 κύτταρα μειώθηκε κατά SH-TLR2 RNAi (Β) την επιμόλυνση (Σχήμα 3θ). Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στα κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA (

P & gt?

0.05).

κάτω ρύθμιση του TLR2 με siRNA Blocks καθοδική σηματοδότηση του στην BEL-7402 κύτταρα

Οι βιολογικές αλλαγές που προκαλούνται από TLR2 ρύθμιση προς τα κάτω μπορεί να οφείλεται σε αλλοίωση του TLR2 μεσολάβηση κατάντη σηματοδότησης που οδηγούν σε αλλαγές στις επόμενες λειτουργίες.

TLR2 μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στην TLR2 /σηματοδότηση MyD88 και μεταγενέστερους λειτουργίες [17], και υποθέτουμε ότι η έκκριση κυτοκινών είναι αποτέλεσμα της TLR2 σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, σχεδιάσαμε ένα πρωτόκολλο για να εξετάσει το επίπεδο των φλεγμονωδών κυτοκινών στα κύτταρα BEL-7402 μετά από γονιδιακή νοκ ντάουν TLR2. BEL-7402 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SH-TLR2 RNAi (Β). Μετά από 72 ώρες υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα επίπεδα της IL-6 και IL-8 προσδιορίζεται με δοκιμασία κυτταρομετρίας χάντρα. IL-6 και IL-8 επίπεδα βρέθηκαν να είναι καταθλιπτικοί σημαντικά. IL-6 μειώθηκε κατά 50,2 ± 2,6% και IL-8 κατά 49,7 ± 3,5%, σε σύγκριση με τα κενά στοιχεία ελέγχου φορέα (

P

& lt? 0,05)? καμία σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε σε siRNA επιμολυσμένα ελέγχους (Σχήμα 3ii και Εικόνα 3III).

TLR2 Gene από siRNA Αναστέλλει Ογκογένεση σε άτριχα ποντίκια

Με έχοντας διαπιστώσει τις σημαντικές επιπτώσεις της TLR2 νοκ ντάουν με RNAi σε BEL-7402 κύτταρα

in vitro

, αναρωτιόμαστε αν TLR2 RNAi θα καταστείλει επίσης τη ογκογονικότητας BEL-7402 όγκων σε γυμνά ποντίκια. Τις ημέρες 7 και 14 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι εγχύθηκαν με DNA πλασμιδίου που εκφράζει TLR2 siRNA. εξετάστηκαν το ακαθάριστο μορφολογία των πρωτογενών όγκων. Οι όγκοι μετρήθηκαν και μια δραστική μείωση στον όγκο του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με SH-TLR2 RNAi (Β) (Σχήμα 3V-VI ii).

Συζήτηση

ΤοΙΙ υποδοχέων (TLRs ) είναι μια συντηρημένη οικογένεια υποδοχέων που ανιχνεύουν την παρουσία παθογόνων αναγνωρίζοντας PAMPs [13], [14]. Επιπλέον είναι επίσης εμπλέκονται στη ρύθμιση της φλεγμονής [15], ένα ρόλο που έχει προταθεί να είναι τουλάχιστον εν μέρει εξαρτάται από την ικανότητα των TLRs να αναγνωρίζουν διάφορα ενδογενή προσδέματα TLR γνωστή ως μοριακό μοτίβα βλάβη σχετιζόμενη (αποσβένει). Πρόσφατα, πολλές μελέτες για TLRs και πιθανό ρόλο τους στην έρευνα και θεραπεία του καρκίνου έχουν αναφερθεί. Yang et al [16] ερεύνησε τις πιθανές ρόλους των TLR2 σηματοδότησης σε μετάσταση όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού με ενδοφλέβια ένεση Β16 κύτταρα μελανώματος. Το αποτέλεσμα αποδεικνύει ότι το TLR2 είναι ένας ελκυστικός στόχος εναντίον της μετάστασης, anti-TLR2 αντίσωμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην καταπολέμηση των κίνδυνο για τη ζωή metastasis.Thompson et al [11] έδειξε ότι ηπατώματος κυτταρικές σειρές εκφράζουν λειτουργικούς υποδοχείς TLR2, η οποία, όταν διεγείρονται, κινεί μια καταρράκτης που αναστέλλει τον ιό της ηπατίτιδας Β σηματοδότησης. Xu et al [17] ανιχνεύεται μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος από ασθενείς με HBV λοίμωξη εμφάνισαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης TLR7 και TLR9 mRNA, αλλά μία αύξηση στην έκφραση TLR9 στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

Από τις μελέτες αυτές, γνωρίζουμε ότι TLR2 , TLR7 και TLR9 παίζουν ρόλους κλειδιά σε ασθένειες του ήπατος και TLR2 έχει δυναμικό λειτουργία στη ρύθμιση της ανοχής του όγκου, την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [13]. Orihara et al [18] έχουν αποκαλύψει ότι TLR2 και /ή TLR4 για κυκλοφορούντα μονοκύτταρα είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε βακτηριακή λοίμωξη. επίπεδα έκφρασης TLR2 σε μονοκύτταρα έχει δειχθεί ότι παρέχουν κρίσιμες πληροφορίες, κατά το σχεδιασμό της θεραπείας έναντι βακτηριακών μολυσματικών νόσων [18] και φιλάρια ασθένειες [19], τον καρκίνο των ωοθηκών [20], ασθένειες του ήπατος [21], και βακτηριακή μολυσματική ασθένεια [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Ωστόσο, η ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος είναι πολύπλοκες και δυναμικές διαδικασίες. Κάθε διεργασία είναι πιθανό να συνδέονται με τις δράσεις (και αλληλεπίδραση) αρκετών TLRs [26]. Υπό το πρίσμα αυτό, αποφασίσαμε να διερευνήσει την έκφραση των άλλων TLRs σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και να διερευνήσει κατά πόσον αυτές θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη, την εξέλιξη και την επιβίωση του καρκίνου του ήπατος. Τα πειράματά μας δείχνουν ότι TLR 2-10 εκφράζονται σε BEL-7402 κύτταρα σε αμφότερα τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Έχουμε δείξει, με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση και κυτταρομετρία ροής, ότι το TLR2 είναι η πιο υψηλή έκφραση του TLRs.

Υπάρχουν αναδυόμενες αποδείξεις ότι πολλά διαφορετικά είδη κυττάρων στο ήπαρ εκφράζουν TLR2 [27]. όπως κύτταρα Kupffer, ηπατοκύτταρα και χολικά επιθηλιακά κύτταρα. Προκαλούμενη από TLR σήματα οδηγούν σε ηπατίτιδα Β, ηπατίτιδα C, η αλκοολική ηπατική νόσο, μη αλκοολούχα ασθένειες του ήπατος, πρωτογενή χολική κίρρωση, πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειίτιδα, η ηπατική ίνωση, ισχαιμική-επαναιμάτωσης απόρριψη τραυματισμό και το ήπαρ αλλομοσχεύματος [27]. Huang et al. έδειξε ότι

Listeria monocytogenes

ενεργοποιημένη ενεργοποιείται από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης και πυρηνικού παράγοντα-κΒ σε κύτταρα όγκου μέσω TLR2 σηματοδότηση, με αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή νιτρικού οξειδίου και της ιντερλευκίνης-6 και αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [7]. Kim et al. έδειξαν ότι ο Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα (LLC) ήταν το πιο ισχυρό μακροφάγων ενεργοποιητή οδηγεί στην παραγωγή της ιντερλευκίνης-6 και ογκο-νέκρωσης παράγοντα-α μέσω της ενεργοποίησης του υποδοχέα ΤοΙΙ μέλη της οικογένειας (TLR) TLR2 και TLR6 [9] και τα αποτελέσματά τους εξήγησε πώς προχωρημένο καρκίνο κύτταρα αλλάξετε τον οικοδεσπότη έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα και έτσι να δημιουργήσει μια φλεγμονώδη μικροπεριβάλλον. Huang et al. έδειξε ότι το μικροπεριβάλλον των μεγάλων όγκων ευνοεί βακτηριακής επιβίωσης, το οποίο με τη σειρά του επιταχύνει άμεσα την ανάπτυξη του όγκου, με την ενεργοποίηση των κυττάρων του όγκου ΤοΙΙ υποδοχέα 2 [7].

Οι προφλεγμονώδεις παράγοντες όπως το μονοξείδιο του αζώτου, IL-6 και IL- 12 δείχθηκε να απελευθερωθεί από τα κύτταρα του όγκου σε προηγούμενες μελέτες [10]. Τόσο η IL-6 και IL-12 είναι γνωστό ότι βοηθούν τα κύτταρα του όγκου να αντισταθεί κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα και φυσικά κύτταρα φονείς, οδηγώντας σε διαφυγή από το ανοσοποιητικό επιτήρησης [10]. Στη μελέτη μας, επιλέχθηκε ΤΙ_Ρ2 να διερευνήσει τη λειτουργία του TLRs στην ανάπτυξη της BEL-7402 κύτταρα. Η μελέτη μας επιβεβαιώνει τη σημασία του πολλαπλασιασμού καρκινικών TLR2 μεσολάβηση, η ανάλυση των φλεγμονωδών κυτοκινών κατέδειξε κατάθλιψη παραγωγή της έκφρασης TLR2 μετά TLR2 knockdown, και έδειξε ότι η ικανότητα του BEL-7402 κύτταρα να αντισταθούν ανοσολογική επίθεση κυττάρων και να διευκολυνθεί η διαφυγή από το ανοσοποιητικό επιτήρησης θα μπορούσε να μειωθεί . Αυτό υποδηλώνει ότι όλες οι φαινοτυπικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα που προκαλείται από την καταστολή της δράσης του TLR2.

Ο τρόπος ποντικού καρκίνου διερευνήθηκε επίσης, και ο όγκος του όγκου από την αγωγή siRNA δείχθηκε. Με έχοντας διαπιστώσει τις σημαντικές επιπτώσεις της TLR2 νοκ ντάουν με RNAi στο BEL-7402 κύτταρα in vitro, αναρωτιόμαστε αν TLR2 RNAi θα καταστείλει επίσης τη ογκογονικότητας BEL-7402 όγκων σε γυμνά ποντίκια. Τις ημέρες 10 και 15 μετά την εμφύτευση, οι όγκοι εγχύθηκαν με πλασμίδιο που εκφράζει DNA sh-TLR2 RNAi. εξετάστηκαν το ακαθάριστο μορφολογία των πρωτογενών όγκων. Η δραστική μείωση στον όγκο του όγκου παρατηρήθηκε σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με SH-TLR2 RNAi (Β).

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο παρόν έγγραφο παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία ότι TLR2 knockdown όχι μόνο in vitro αλλά in vivo θα μπορούσαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη των ηπατικών όγκων. TLR2 μεσολάβηση ανάπτυξη του καρκίνου φαίνεται να είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην εξέλιξη των όγκων. Η χρήση των συστημικά παραδοθεί TLR2 siRNA μπορεί έτσι να δώσει μία νέα θεραπεία για την πρόληψη της εξέλιξης του καρκίνου που οδηγεί σε καλύτερες προοπτικές επιβίωσης.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

RNAi φορείς πλασμιδίου (pGenesil-1 πλασμίδιο).

doi: 10.1371 /journal.pone.0038890.s001

(JPG)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Dongxu Liu (Σχολή Επιστημών Ζωής, Πανεπιστήμιο Hubei, Hubei, PR Κίνα) για την παροχή τεχνικής υποστήριξης.