Αφηρημένο

Μια ανακαλύφθηκαν πρόσφατα gammaretrovirus, που ονομάζεται XMRV, αναφέρθηκε πρόσφατα να είναι παρόντες στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη CWR22Rv1. Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό των δύο ανοσοϊστοχημεία με ευρέως αντιδραστικά ιό λευχαιμίας ποντικού (MLV) αντι-ορούς και PCR, προσδιορίσαμε αν επιπλέον καρκίνο του προστάτη ή άλλες κυτταρικές γραμμές περιέχουν XMRV ή MLV που σχετίζονται με ιούς. Η μελέτη μας περιελάμβανε ένα σύνολο 72 κυτταρικών σειρών, η οποία περιελάμβανε 58 από τις 60 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του χρησιμοποιούνται σε οθόνες αντικαρκινικών φαρμάκων και διατηρείται στην NCI-Frederick (NCI-60). Έχουμε εντοπίσει gammaretroviruses σε δύο πρόσθετες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη: LAPC4 και vCap, και δείχνουν ότι αυτοί οι ιοί είναι ικανό αντιγραφής. Viral γονιδιώματος εντοπιστεί ο ιός σε LAPC4 και vcap ως σχεδόν πανομοιότυπη με μια άλλη γνωστή ξενοτροπικά MLV,

BXV

-1. Εντοπίσαμε επίσης μια gammaretrovirus στην κυτταρική γραμμή καρκινώματος μη μικροκυτταρικό πνεύμονα EKVX. καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη φαίνεται να έχουν προδιάθεση για μόλυνση με μυϊκό gammaretroviruses, και προτείνουμε ότι αυτό μπορεί εν μέρει να οφείλεται στην εγκατάσταση γραμμή των κυττάρων με πέρασμα ξενομοσχεύματος σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς. Δεν είναι σαφές εάν η λοίμωξη με τους ιούς αυτούς είναι απαραίτητη για τη δημιουργία κυτταρική γραμμή, ή ποια σύγχυση ρόλο που μπορεί να παίξει σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με αυτά που χρησιμοποιούνται συνήθως γραμμές. Είναι σημαντικό, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν την ανάγκη για τακτικό έλεγχο των καρκινικών κυτταρικών σειρών για ρετροϊική «μόλυνση», σαν εξέταση ρουτίνας μυκόπλασμα

Παράθεση:. Sfanos KS, Aloia AL, Hicks JL, Esopi DM, Steranka JP, Shao W, et al. (2011) Στοιχεία της αναπαραγωγής αρμόδιες Ποντικού Gammaretroviruses στο Χρησιμοποιείται συνήθως γραμμές κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (6): e20874. doi: 10.1371 /journal.pone.0020874

Επιμέλεια: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Γαλλία

Ελήφθη: 24, Φεβρουαρίου, 2011? Αποδεκτές: 11 Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 17, Ιουνίου, 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. K.S.S. υποστηρίχθηκε από μεταδιδακτορικός βραβείο υποτροφία από το Ίδρυμα πρόληψη του καρκίνου. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο. μελέτες IHC υποστηρίχθηκαν από NCI-SPORE στο P50CA58236 καρκίνο του προστάτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Xenotropic λευχαιμίας των ποντικών που σχετίζονται με ιό Virus (XMRV) αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 2006, ως νέο gammaretrovirus βρέθηκαν σε ιστούς του προστάτη από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [1]. Μεταγενέστερες μελέτες απέτυχαν να καταλήξουν σε συναίνεση σχετικά με τον επιπολασμό του ιού στον καρκίνο του προστάτη, με δηλωθέντα αριθμούς που κυμαίνονται από 0% έως περίπου 27% (αναθεωρηθούν [2], [3]). Το 2009, αναφέρθηκε ότι η συχνά χρησιμοποιούμενη καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή CWR22Rv1 περιέχει αρμόδια XMRV αντιγραφή, και παράγει τον ιό σε υψηλά επίπεδα στον πολιτισμό [4].

Δεν είναι σήμερα γνωστό ακριβώς πώς η κυτταρική σειρά CWR22Rv1 μολύνθηκαν με τον XMRV. Μία εξήγηση είναι ότι ο ιός ήταν στον όγκο του προστάτη από το οποίο καθιερώθηκε η κυτταρική γραμμή. Αν αποδειχθεί, αυτή η ανακάλυψη θα στηρίξει το επιχείρημα ότι XMRV είναι παρούσα στους ανθρώπους, και μπορεί να δημιουργήσει μια μόλυνση στο ανθρώπινο προστάτη. Μια άλλη εξήγηση θα μπορούσε να είναι ότι η κυτταρική σειρά μολύνθηκε μετά τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από τον ασθενή, για παράδειγμα, κατά την διάρκεια ξενομεταμόσχευση σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς (ένα σύνηθες και συχνά αναγκαία πρακτική στη δημιουργία του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών). Πράγματι, τα τελευταία στοιχεία που παρουσίασε ο Πάθακ

et. al.

σε το 17

ου Συνέδριο για ρετροϊούς και ευκαιριακές λοιμώξεις (CROI) παρέχουν ένα ακαταμάχητο επιχείρημα ότι XMRV πιθανόν προήλθε από ανασυνδυασμό μεταξύ δύο χωριστών και ελαττωματικά ενδογενή Μίν που έχουν μολυνθεί τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα CWR22 σε κάποιο σημείο κατά τη διάρκεια της διαδικασία σειριακή διέλευση των κυττάρων από το ξενομόσχευμα (βλέπε [5] για ανασκόπηση). Αυτό ξενομόσχευμα χρησιμοποιήθηκε αργότερα για να παραχθεί μία κυτταρική γραμμή, CWR22Rv1, που καλλιεργείται σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο που μελετούν τον καρκίνο του προστάτη. Αναφορές της μόλυνσης των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών με ρετροϊούς ζώο είναι αρκετά συχνές στη βιβλιογραφία [6], [7], [8], (που επισκοπείται στο [9]) και είναι καλά τεκμηριωμένο να συμβεί μετά ξενομεταμόσχευση κυττάρων και ιστών σε ανοσοκατεσταλμένους ποντίκια (αναθεωρηθούν [10]). Υπάρχουν επίσης αναφορές για ρετροϊική μόλυνση των κυτταρικών σειρών που σημειώθηκαν σαφώς κατά το πέρασμα στην καλλιέργεια, καθώς οι γραμμές δεν πέρασαν σε ποντίκια [9], [11]. Πρόσθετες πιθανές πηγές μόλυνσης γραμμή κυττάρων με ρετροϊούς περιλαμβάνουν εργαστηριακή μόλυνση και τη χρήση των φορέων ρετροϊών στον τομέα της έρευνας [9]. Είναι σημαντικό, υπάρχουν μόνο σπάνια παραδείγματα όπου ρετροϊικοί παρουσία σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα θα μπορούσαν να αναχθούν σε μια πραγματική μόλυνση του ασθενούς. Ένα καθιερωμένο παράδειγμα είναι η ανακάλυψη του ανθρώπινος Τ-λεμφοτροπικός ιός τύπου 1 (HTLV-1) σε καλλιεργημένα κύτταρα από ασθενείς με Τ-κυτταρικά λεμφώματα [12].

Η ανακάλυψη του XMRV στο CWR22Rv1 κυτταρική σειρά μας ώθησε να ανακρίνουν επιπλέον καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών για την παρουσία XMRV ή άλλου ποντικού gammaretroviruses. Εάν η πηγή του ρετροϊική μόλυνση δεν είναι από τον ασθενή με καρκίνο του προστάτη, αλλά εισάγεται με πέρασμα διαμέσου ζώα ή εργαστηριακής μόλυνσης, τότε η παρουσία των αρμόδιων ρετροϊών αντιγραφής σε κοινώς χρησιμοποιούμενα κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη για την έρευνα θα μπορούσε δυνητικά να έχει συγκεχυμένα αποτελέσματα σε πειραματικά αποτελέσματα.

Υλικά και Μέθοδοι

γραμμές κυττάρων

Πηγή των κυτταρικών σειρών και την περιγραφή των μικροσυστοιχιών κυτταρικής σειράς ιστού (ΤΜΑ) κατασκευή παρέχεται στο κείμενο S1. Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν επικυρώνεται μέσω μικρών διαδοχική επανάληψη (STR) των χαρακτηριστικών των 9 γονιδιωματικής τόπων με το σύστημα Powerplex 1.2 (Promega) πριν από τη συμπερίληψη στο ΤΜΑ.

XMRV /MLV ανοσοϊστοχημεία (IHC)

τα πλακίδια που περιέχουν τα τμήματα των κυττάρων ελέγχου σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ή TMAs αποπαραφινοποιήθηκαν και ατμό για 25 λεπτά. στην αποκάλυψη διάλυμα κιτρικού-based για την ανάκτηση αντιγόνου (Vector Laboratories). IHC (συμπεριλαμβανομένων θετικών και αρνητικών μαρτύρων) είτε με αντι-Ρ30 (MLV30) ή αντι-gp70 (MLV70) αντιοροί διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [3].

XMRV και MLV PCR

Genomic DNA (gDNA) εκχυλίστηκε από καλλιεργημένο κύτταρο σφαιρίδια από κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην TMA χρησιμοποιώντας το DNeasy αίματος και Kit Tissue (Qiagen). Όλα DNA ενισχύθηκε πρώτα με γενωμική εκκινητών GAPDH PCR (GAPgen-F 5′-GGGCTCTCCAGAACATCATCC-3 ‘και GAPgen-R 5′-GTCCACCACTGACACGTTGG-3′) να ελέγχει την ποιότητα του προτύπου DNA. MLV-ειδικό εκκινητή (In-For), καθώς και ο XMRV-ειδικό αντίστροφο εκκινητή (διαγραφή-Rev) έχουν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13] με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος 104 bp. Η εκφυλισμένη αλληλουχίες των εκκινητών Pan-MLV είχαν ως εξής: Pan-MLV-F 5’-GCARCCCWGGGAGACGTC-3 ‘και Pan-MLV-R 5′-AGACRCGCRGCGCGGYT-3’ με ένα αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος των περίπου 206 bp (181 bp για XMRV ). PCR διεξήχθη σε ένα συνολικό όγκο 25 μΐ (που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ PCR, 1.5 mM MgCl

2, 200 μΜ dNTPs, 400 ηΜ F και R εκκινητή, 1U AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας περίπου 100 ng gDNA για προτύπου και η ακόλουθη ποδηλασία παραμέτρους: 95 ° C για 2 λεπτά .; 40 κύκλοι 95 ° C για 30 sec., 54 ° C για 1 λεπτό. (Εναύσματα Pan-MLV) ή 64 ° C για 30 sec. (XMRV-ειδικούς εκκινητές), 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα .; τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Serial δοκιμές αραίωση CWR22Rv1 gDNA έδειξε ότι η εκφυλισμένη ανίχνευση Pan-MLV PCR είχε ευαισθησία ανίχνευσης του ιού σε μέχρι 0.1 ng του CWR22Rv1 gDNA (ισοδύναμο με ~ 100-200 ιικών γονιδιωμάτων ή ~ 10-20 μολυσμένα κύτταρα [3], [ ,,,0],4]) και η XMRV-ειδική δοκιμασία PCR ήταν ικανή να ανιχνεύει τα κάτω σε 1-2 ιικά γονιδιώματα (Σχήμα S1). Η διαφορά στην ευαισθησία μπορεί πιθανώς να εξηγηθεί εν μέρει από τη χρήση των εκφυλισμένων εκκινητών για την Pan-MLV PCR.

Long-range PCR και αλληλούχιση των ιικών γονιδιωμάτων

Ολόσωμη ή κοντά πλήρους ιικά γονιδιώματα μήκους ενισχύθηκαν από γονιδιωματικό ϋΝΑ παρασκευές από τις κυτταρικές γραμμές LAPC4, VCAP και EKVX και η αλληλουχία τους όπως περιγράφεται στο κείμενο S1 και S2 πίνακα.

φυλογενετική ανάλυση

Ολόσωμη γονιδιώματα από γνωστές ενδογενείς αλληλουχίες MLV [14] και τα γονιδιώματα του ιού που απομονώθηκε από LAPC4, vcap και EKVX ευθυγραμμίστηκαν χρησιμοποιώντας ClustalW. Με βάση την ευθυγράμμιση, ένα δέντρο γείτονα-που ενώνει δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του MEGA έκδοση 5 (MEGA 5) [15].

μολυσματικότητα Δοκιμασία

υπερκείμενα γραμμή κυττάρων συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες . καλλιέργεια και διηθείται μέσω φίλτρου 0.45 μm. Η δοκιμασία μολυσματικότητας χρησιμοποιεί κύτταρα iGLuc-Derse, μία βάση κυτταρικής γραμμής 293 MCAT που παράγει το ένζυμο

Gaussia

λουσιφεράσης (gluc) μόνο μετά από μόλυνση με ένα ικανότητα αντιγραφής MLV. κύτταρα iGLuc-Derse σπάρθηκαν στα 3,5 × 10∧4 κύτταρα /φρεάτιο σε μια 12 φρεατίων πλάκα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 20 μg /ml ϋΕΑΕ-δεξτράνη για 30 λεπτά. ΫΕΑΕ-δεξτράνη απομακρύνθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με τα μέσα ενημέρωσης. Στη συνέχεια, 500 μΙ από κάθε υπερκείμενο προστέθηκε στα κύτταρα iGLuc-Derse εις τριπλούν. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ώρες. και 400 μλ πρόσθετων μέσων προστέθηκε. Δύο και τρεις ημέρες μετά τη μόλυνση, 10 μΙ του μέσου από κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε για δραστικότητα λουσιφεράσης. Στις 3 ημέρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν. Δύο ημέρες μετά το πέρασμα των κυττάρων, η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε πάλι. Τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν για συνολικά 13 ημέρες. Περαιτέρω λεπτομέρειες της κυτταρικής γραμμής θα δοθεί σε μια μελλοντική δημοσίευση.

ανυσματική PCR

ανυσματική PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, 2 μα γονιδιωματικού DNA υποβλήθηκε σε πέψη όλη την νύκτα στην κατάλληλη θερμοκρασία με τα ένζυμα περιορισμού εξής:

Άσε

I,

BspH

I,

BstY

I,

Hind

III,

Nco

Ι, και

Pst

I. Ανυσματική ολιγονουκλεοτίδια τότε ανοπτήθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C σε συγκέντρωση 1 μΜ χρησιμοποιώντας Τ4 DNA λιγάση (New England Biolabs). Ανυσματική PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα έναυσμα ιού-ειδικό (είτε Virus-VEC-F1 5′-GACTGAGTCGCCCGGGTACC-3 ‘, ή ιό-VEC-F2 5′-CGCTTCTCGCTTCTGTAACCGCG-3’, τόσο στην 3 ‘LTR σε θέση νουκλεοτιδίου 8525 και 8437 του Xmv43, αντίστοιχα) και μια ανυσματική ειδικό αντίστροφο εκκινητή (5’-CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA-3 ‘). Τα προϊόντα της PCR καθαρίστηκαν και κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pCR®2.1-ΤΟΡΟ (Invitrogen) γέλη. Μεταμορφωθεί βακτηριακές αποικίες επιλέχθηκαν τυχαία για αλληλούχιση.

Αποτελέσματα

LAPC4, οι καρκινικές κυτταρικές σειρές vcap και EKVX έχουν μολυνθεί με τον ιό της λευχαιμίας ποντικού το οποίο δεν είναι XMRV

Ως αρχική οθόνη για gammaretroviruses ποντικού σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήσαμε μια μικροσυστοιχία ιστού (ΤΜΑ) που περιέχει ένα σύνολο 72 κυτταρικών σειρών, η οποία περιελάμβανε 58 από τις 60 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του χρησιμοποιούνται σε οθόνες αντικαρκινικών φαρμάκων και διατηρείται στην NCI-Frederick (NCI -60) (Πίνακας S1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, IHC με ευρέως αντιδραστικά αντιορούς για ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (Μο-ΜΕν) Ρ30

CA (MLV30) ή gp70

SU (MLV70) [3] προσδιόρισε τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη (CWR22Rv1, LAPC4 [17], VCAP [18]) ως θετικά για τον ιό. Ενώ CWR22Rv1 προηγουμένως αναφέρθηκε να έχουν μολυνθεί με τις αρμόδιες XMRV αντιγραφή [4], LAPC4 και vcap δεν είναι γνωστό ότι περιέχουν ρετροϊούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε προηγούμενη μελέτη, καλλιέργειας κυττάρων πολυμέσων από vcap ήταν anecdotally αναφερθεί ότι εμφανίζουν ιική δράση [4]. Εντοπίσαμε επίσης μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου, EKVX, ως θετικά για τον ιό.

(Α) Παραδείγματα MLV-αρνητικό (DU145) και θετική (CWR22Rv1, LAPC4, vcap και EKVX) καρκινικές κυτταρικές γραμμές χρωματίστηκαν με MLV30 και MLV70 αντιορούς. (Β) Θετική χρώση σε LAPC4, vcap και EKVX δεν αντιπροσωπεύει XMRV. Οι διαδρομές 1-7, με PCR MLV-ειδικούς εκκινητές (1 = CWR22Rv1, 2 = LAPC4, 3 = Vcap, 4 = DU145, 5 = LNCaP, 6 = PC3, 7 = EKVX), λωρίδες 8-11, PCR με XMRV- ειδικούς εκκινητές (8 = CWR22Rv1, 9 = LAPC4, 10 = vcap, 11 = EKVX). Διαφορά στο μέγεθος του προϊόντος μεταξύ CWR22Rv1 (λωρίδα 1) και LAPC4, VCAP ή EKVX (λωρίδες 2,3,7) οφείλεται στην XMRV-ειδική 24-nt απαλοιφή [13]. L = μοριακό βάρος της σκάλας.

Η

Εμείς θα χρησιμοποιηθούν την επόμενη μια δοκιμασία που βασίζεται στην PCR για να καθοριστεί αν LAPC4, vcap και EKVX έχουν μολυνθεί με XMRV. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, PCR με εκφυλισμένους εκκινητές παν-MLV (σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν σε μεγάλο βαθμό MLV είδη) που προσδιορίζονται θετικά προϊόν όπως αναμένεται για CWR22Rv1, LAPC4, VCAP και EKVX. Επίσης όπως αναμενόταν με βάση τα αποτελέσματα IHC, η PCR με τα εκφυλισμένα εναύσματα MLV ήταν αρνητική για τους καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές DU145, LNCaP και PC3. PCR με εκκινητές που καλύπτουν ένα 24 νουκλεοτιδίων διαγραφή περιέχονται στο γονιδίωμα του XMRV, αλλά όχι με οποιοδήποτε άλλο γνωστό MLVs [13] ήταν θετικός μόνο για CWR22Rv1 (Σχήμα 1Β), υποδεικνύοντας ότι ο ιός (ES) που υπάρχουν στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές που ήταν θετική με IHC δεν είναι XMRV. Τα πλήρη αποτελέσματα της IHC και PCR στις κυτταρικές γραμμές 72 που φαίνονται στον Πίνακα S1. Για να ελεγχθεί η πιθανότητα ότι τα θετικά αποτελέσματα της PCR μπορεί να οφείλεται σε μόλυνση DNA ποντικού, ελέγξαμε όλες τις θετικές κυτταρικές σειρές με μία δοκιμασία PCR για ποντίκι εγκεφαλικής δεξαμενής ένα σωματίδιο (IAP) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, καμία από τις κυτταρικές σειρές βρέθηκαν να είναι θετικά για μολυσματικού DNA ποντικού. Η δοκιμασία IAP έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά ευαίσθητα για το DNA ποντικού και να έχουν καλύτερες επιδόσεις από δοκιμασίες που βασίζονται σε PCR για ποντίκι μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) [19].

Viral αλληλούχιση του γονιδιώματος, φυλογενετική ανάλυση και την ενσωμάτωση τοποθεσία χαρτογράφηση

για να προσδιοριστεί η ταυτότητα των ιών που υπάρχουν στο LAPC4, vcap και EKVX, πραγματοποιήσαμε μεγάλου βεληνεκούς PCR και αλληλούχιση όπως περιγράφεται στο S1 κειμένου. Μία αλληλουχία νουκλεοτιδίου 8046 (GenBank # JF908817) που λαμβάνεται από EKVX σύμπλεγμα με ένα ξενοτροπικών ομάδα MLV σε φυλογενετική ανάλυση, αλλά δεν ήταν ταυτόσημη με οποιαδήποτε Μίν για τα οποία είναι γνωστή η γονιδιωματική αλληλουχία πλήρους μήκους (Σχήμα 2, Σχήμα Στήριξη S3). Αυτή η αλληλουχία προσδιορίστηκε επίσης σε NCBI BLAST έρευνες σε βάσεις δεδομένων να είναι 98% όμοιο με έναν ρετροϊό προηγουμένως απομονωθεί από το-75 DG B-λεμφοβλαστοειδής κυτταρική γραμμή [20], και είναι πανομοιότυπα με μερική

pol

και

env

ακολουθίες απομονώθηκαν από EKVX σε μια άλλη πρόσφατη μελέτη [8].

Το φυλογενετικό δέντρο αντιπροσωπεύει γνωστή ξενοτροπικά ακολουθίες MLV. Αυτό το δέντρο αντιπροσωπεύει μόνο ξενοτροπικών MLVs για τα οποία είναι γνωστή η όλη προϊική αλληλουχία, η οποία είναι πιθανό μόνο ένα μικρό μέρος όλων των ενδογενών ξενοτροπικών MLVs παρόν στα ποντίκια.

Η

Για LAPC4 και vCap, ανυσματική PCR διεξήχθη για να καθορίζουν θέσεις ιική ενσωμάτωση και την 5 ‘και 3’ άκρα των ιικών γονιδιωμάτων. Σχεδόν ταυτόσημα (99% παρόμοιο) ιικά γονιδιώματα 8657 νουκλεοτίδια σε μήκος (GenBank # JF908815, JF908816) αλληλουχήθηκαν από την LAPC4 και κυτταρικές σειρές VCAP. NCBI BLAST και Ensembl έρευνες σε βάσεις δεδομένων αποκάλυψε ένα σχεδόν τέλειο ταίριασμα (99%) με μία αλληλουχία που περιέχονται σε χρωμοσώματος 1 της αλληλουχίας γονιδιώματος ποντικού C57BL /6J (θέση νουκλεοτιδίου 172.871.652 με 172.880.308). Αυτή η θέση χαρτογραφείται σε ένα γνωστό ξενοτροπικά gammaretroviral προϊό ποντικού που ονομάζεται

BXV

-1 (ή XMV43) [21]. Φυλογενετική ανάλυση έδειξε επίσης ότι οι ιοί LAPC4 και vcap είναι φυλογενετικά ίδιο με το

BXV

-1 (Σχήμα 2, Υποστήριξη Εικόνα S3).

BXV

-1 είναι ένα ανέπαφο και μολυσματικών προϊό και, παρόλο που χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη δεν είναι γνωστό ότι έχουν μολυνθεί με αυτόν τον ιό,

BXV

-1 είναι γνωστό ότι είναι ικανός να μολύνει καρκινικά κύτταρα περάστηκαν μέσα από ανοσοκατασταλμένους ποντικούς [22]. Δοκιμάσαμε την κυτταρική γραμμή VCAP άμεσα από την ATCC και επιβεβαίωσε ότι η κατανεμημένη VCAP είναι θετική για τον ιό. Για να επιβεβαιωθεί ότι η μόλυνση των κυττάρων LAPC4 αντιπροσωπεύει μία λοίμωξη που ήταν παρούσα στις αρχές LAPC4 πέρασμα (σε αντίθεση με τη μόλυνση από το εργαστήριο μας), λάβαμε κύτταρα LAPC4 καταψύχεται το 1998 καθώς επίσης και τα κύτταρα επί του παρόντος αναπτύσσονται στο εργαστήριο (δηλαδή, από το 2010 ) από το εργαστήριο CL Sawyers στο Memorial Sloan Kettering Cancer Center [17]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S4, όλα τα κύτταρα LAPC4 ελέγχθηκαν από το εργαστήριο Sawyers ήταν θετικά για τον ιό.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι ο κυτταρικές σειρές VCAP LAPC4 και μολύνονται με ενσωματωμένο

BXV

-1 προϊού, χαρτογραφήσαμε πολλαπλές θέσεις ιική ενσωμάτωση σε κάθε μία από αυτές τις δύο γραμμές χρησιμοποιώντας ανυσματική PCR [16]. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι θέσεις ιική ενσωμάτωση εντοπίστηκαν στις ιντρονικές περιοχές πολλαπλών γονιδίων τόσο LAPC4 και Vcap (Πίνακας 1). Δεν κοινές θέσεις ενσωμάτωσης εντοπίστηκαν ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές? Ωστόσο, αναμένουμε ότι ο κατάλογος των τόπων ολοκλήρωσης δίνονται στον Πίνακα 1 δεν είναι εξαντλητικός. Επιλέξτε θέσεις ενσωμάτωσης περαιτέρω επαλήθευση από LAPC4 και vcap χρήση μεγάλου βεληνεκούς PCR και εκκινητές που κράτησε τις θέσεις ενσωμάτωσης (Πίνακας 1).

Η

κυτταρικές σειρές Infected καρκίνο παράγει ιό ικανό για αντιγραφή

Για να βεβαιωθείτε ότι τα κοινώς χρησιμοποιούμενα κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη LAPC4 και vcap περιέχουν ενσωματωμένα και ικανότητα αντιγραφής του ιού, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία μολυσματικότητα του ιού. Η κυτταρική γραμμή δείκτης, κύτταρα iGLuc-Derse, θα εκκρίνει μόνο το

Gaussia

ένζυμο λουσιφεράση μετά από μόλυνση με ικανότητα αντιγραφής MLV.

Gaussia

δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε 48 ώρες μετά την μόλυνση των κυττάρων iGLuc-Derse με υπερκείμενο από τις κυτταρικές γραμμές CWR22Rv1, LAPC4 και vCap (Σχήμα 3). Είναι ενδιαφέρον, ένα τριπλούν μόλυνση των κυττάρων iGLuc-Derse με υπερκείμενο από την κυτταρική σειρά EKVX δεν έδειξε

Gaussia

δραστικότητα λουσιφεράσης μέχρι 13 ημέρες (και 3 περάσματα) μετά από τη μόλυνση (Σχήμα 3). Περαιτέρω, μόνο 2 από τα 3 λοιμώξεων εμφάνισαν δραστικότητα λουσιφεράσης πάνω από το υπόβαθρο. Έτσι, ο ιός από τα κύτταρα EKVX προφανώς έχει πολύ χαμηλή μολυσματικότητα, τουλάχιστον για την κυτταρική γραμμή iGLuc-Derse. Όχι

Gaussia

δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε από κύτταρα (ανακαλλιεργήθηκαν για ένα σύνολο 13 ημερών) εκτίθενται σε υπερκείμενο από το DU145, MycCaP (μια προστάτη ποντικού καρκινική κυτταρική σειρά που λαμβάνεται από το εργαστήριο CL Sawyers) ή PC3 κυτταρικές γραμμές ( Σχήμα 3). CWR22Rv1 είχε αναφερθεί στο παρελθόν για την παραγωγή αρμόδια XMRV αντιγραφή [4], αλλά δεν έχει αναφερθεί ότι οι αρμόδιες ιός LAPC4, VCAP και EKVX αντιγραφή προϊόντα.

10 μΐ μέσου αναλύθηκε 2 ημέρες μετά την έκθεση σε 24 ώρες. υπερκείμενο καλλιέργειας κυττάρων από CWR22Rv1, LAPC4 και vCap, και 13 ημέρες (και 3 περάσματα) μετά από έκθεση σε υπερκείμενο από EKVX, DU145, MycCaP (μυϊκή κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη) και PC3. Κόκκινη γραμμή δείχνει την έκφραση λουσιφεράσης υποβάθρου όπως καθορίζεται από μια ψευδο-μολυσμένα ελέγχου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής για 3 πειράματα.

Η

Εκτός από την ανησυχία ότι ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές που παράγουν ιούς αρμόδια αντιγραφή μπορούσε να διασχίσει-μολύνουν άλλες κυτταρικές σειρές στο εργαστήριο μας, που είναι αρνητικές για τα MLV, εμείς δοκιμαστεί ρεύμα καλλιέργειες στο εργαστήριο μας για την παρουσία MLVs. Μας εξέπληξε για να βρείτε δύο περιπτώσεις όπου MLV-αρνητικές κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στο εργαστήριο (DU145, LNCaP) έχουν μολυνθεί με Μίν (Σχήμα S5). Για παράδειγμα, όταν αυτές οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν απευθείας από ATCC (LNCaP) ή το NCI (DU145) ήταν αρνητικά για τον ιό, υποδεικνύοντας ότι οι γραμμές μολύνθηκαν σε κάποιο σημείο κατά την διάρκεια καλλιέργειας στο εργαστήριο. ανάλυση PCR με XMRV-ειδικούς εκκινητές έδειξε ότι η μολυσματικού ιού ήταν πιθανό XMRV, πιθανώς από καλλιέργεια, παράλληλα CWR22Rv1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι, αν τα κύτταρα CWR22Rv1 συνήθως καλλιεργούνται σε ένα τυπικό εργαστηριακό περιβάλλον βιοϊατρική έρευνα (π.χ. με τη χρήση τυποποιημένων Τάξης II ντουλάπια βιοασφάλεια και διαδικασίες για την καλλιέργεια κυττάρων στην οποία δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές δεν είναι ποτέ παρόν κάτω από το καπό, ταυτόχρονα), ότι XMRV μπορεί να μολύνει και να μολύνουν άλλες κυτταρικές σειρές.

Συζήτηση

η μελέτη μας δείχνει ότι ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές γραμμές φαίνεται να έχουν μια προδιάθεση για μόλυνση από ποντικού gammaretroviruses. Προτείνουμε ότι αυτή η τάση μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι οι περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη δημιουργήθηκαν με διέλευση μέσω ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια. Στην πραγματικότητα,

BXV

-1 είναι παρούσα σε SCID και

nude

ποντίκια και τα καρκινικά κύτταρα περάστηκαν μέσα από αυτά τα ζώα μπορούν να μολυνθούν με ξενοτροπικά Μίν [22]. Αν και η μόλυνση των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών με μυϊκό gammaretroviruses έχει περιγραφεί προηγουμένως στην βιβλιογραφία, τι κάνει τρέχουσα μελέτη μας ιδιαίτερα σημαντικό είναι ότι πριν από αυτή τη μελέτη δεν ήταν γνωστό ότι τα πολλαπλά χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη έχουν μολυνθεί με MLVs. Στην πραγματικότητα, ανακαλύψαμε κατά τη διάρκεια της μελέτης μας είναι ότι άλλες κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στο εργαστήριο (DU145, LNCaP) έχουν προφανώς μολυνθεί με XMRV στο εργαστήριο.

Σε συμφωνία με τα δεδομένα που παρέχονται στην παρούσα μελέτη , σε μια πρόσφατη μελέτη από Hue

et. al.

, η οποία προβλήθηκε 411 ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου από τον Κατάλογο σωματικές μεταλλάξεις εις τον Καρκίνο (COSMIC) συλλογή, EKVX βρέθηκε να είναι θετικό για μια ξενοτροπικών MLV που σχετίζονται με τον ιό με άμεση αλληλούχιση των ιικών

gag

,

pol

και

env

γονίδια [8]. Επιπλέον, το Hue

et. al.

μελέτη εξέτασε όλα, αλλά 14 από τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν στην παρούσα μελέτη (με την εξαίρεση της LAPC4, LNCaP, PrEC, vcap, CWR22Rv1, RWPE, Abl, pRSC, C4-2B, 957 E /h, PacMet UT1, MDA-PAC2b, DLD-1 και Hep3B) και βρέθηκε επίσης να είναι αρνητικό για MLV. Αν και οι συγγραφείς της μελέτης δεν προσπάθησε να ληφθεί μια ακολουθία πλήρους μήκους του ιού που μολύνουν EKVX ή να αποδείξει ότι ο ιός είναι ικανός για αντιγραφή, μερική

pol

και

env

αλληλουχίες από το απόχρωση

et. al.

μελέτη (GenBank # FR670589 και FR670597, αντίστοιχα) αγώνα στο 100% ομοιότητα με άμεσο ιική ακολουθία πλήρους μήκους που λαμβάνονται στην παρούσα μελέτη (GenBank # JF908817). Έχουμε τώρα αποδείξει ότι ο ιός που περιέχεται στην κυτταρική σειρά EKVX είναι ικανό αντιγραφής (Σχήμα 3), συστάδες σε φυλογενετική ανάλυση με γνωστές ξενοτροπικών MLVs (Εικόνα 2, Στήριξη Σχήμα S3) και είναι κατά 99% όμοια με έναν ρετροϊό προηγουμένως απομονωθεί από το ΓΔ -75 κυτταρική γραμμή Β-λεμφοβλαστοειδή. Όπως όλα του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές που βρέθηκαν να περιέχουν Μίν στην παρούσα μελέτη, η κυτταρική γραμμή EKVX ιδρύθηκε από το πέρασμα ξενομόσχευμα στο

nude

ποντίκια [23].

Υπάρχουν πολλά παραδείγματα που αναφέρθηκαν του ρετροϊικής μόλυνσης που τροποποιεί τις βιολογικές ιδιότητες των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών. Για παράδειγμα, το

in vivo

ανοσογονικότητα των κυτταρικών γραμμών έχει φανεί ότι μεταβάλλεται έντονα μετά από μόλυνση ρετροϊική μετά από μία μοναδική δίοδο σε

γυμνούς

ποντικούς [24]. Ομοίως, ξενοτροπικών MLVs αποκτήθηκαν σε κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην έρευνα HIV μετά

in vivo

πέρασμα σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς έδειξαν να μεταβάλλει τις βιολογικές ιδιότητες του HIV-1 [25]. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η MLV τείνει να ενσωματώσει κοντά σε θέσεις έναρξης της μεταγραφής (μέσα σε 5 kb ανοδικά ή καθοδικά) των ενεργά μεταγράφονται τα γονίδια [26]. Είναι ενδιαφέρον ότι, δύο από τους επτά θέσεις ιική ενσωμάτωση προσδιορίστηκαν για VCAP είναι εντός 5 kb από μία θέση έναρξης της μεταγραφής (Πίνακας 1). Μια θέση ολοκλήρωσης εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1 βρίσκεται περίπου 2 kb καθοδικά της θέσης έναρξης μεταγραφής του EFCAB2 (περιοχή δέσμευσης EF-χέρι ασβέστιο 2) γονίδιο. Παρομοίως, μια θέση ολοκλήρωσης προσδιορίζονται χρωμοσώματος 7 βρίσκεται περίπου 1.4 kb ανοδικά της LFNG (O-fucosylpeptide 3-βητα-Ν-ακετυλγλυκοζαμινυλτρανσφεράση), ένα γονίδιο που εμπλέκεται στη σηματοδότηση Notch. Δεν είναι γνωστό τι συγκεχυμένα αποτελέσματα μπορεί να έχει η μόλυνση των κοινώς χρησιμοποιούμενων κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη με ικανό αντιγραφής ποντικού gammaretroviruses σε πειραματικά αποτελέσματα. Είναι ενδιαφέρον, έχει αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες XMRV είναι πιο άφθονα σε μέσα κυτταρικής καλλιέργειας των κυττάρων CWR22Rv1 από οποιαδήποτε ανθρώπινη πρωτεΐνη [4]. Για λόγους όπως αυτό, προτείνουμε ότι καρκινικές κυτταρικές σειρές πρέπει να υποβάλλονται σε έλεγχο ρουτίνας για την μόλυνση Μίν, μοιάζει πολύ με την τρέχουσα πρακτική δοκιμή ρουτίνας των καλλιεργημένων κυττάρων για μυκόπλασμα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Κείμενο S1.

Στήριξη μεθόδους

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s001

(DOC)

Εικόνα S1.

Προσδιορισμός της ευαισθησίας της Pan-MLV και αναλύσεις PCR XMRV ειδικών. Διαδοχικές αραιώσεις CWR22Rv1 γενωμικού DNA εμπλουτίστηκαν σε 100 ng του LNCaP (MLV-αρνητικό) γενωμικού DNA και χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για PCR. (Α) Pan-MLV εκκινητές (Β) XMRV-ειδικούς εκκινητές. Τα δείγματα εξετάστηκαν εις διπλούν: 1 ng CWR22Rv1 (λωρίδα 1-2), 0,1 ng CWR22Rv1 (λωρίδα 3-4), 0,01 ng CWR22Rv1 (λωρίδα 5-6), 0.001 ng CWR22Rv1 (λωρίδα 7-8), αρνητικό μάρτυρα (λωρίδα 9-10). . L = μοριακό βάρος σκάλα

doi: 10.1371 /journal.pone.0020874.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Δοκιμές MLV-θετικές κυτταρικές σειρές για την παρουσία μολυσματικών DNA ποντικού με PCR δοκιμασία για ΙΑΡ. Λωρίδα 1 = C57BL /6J γονιδιωματικό DNA ποντικού (θετικός έλεγχος), η λωρίδα 2 = CWR22Rv1, λωρίδα 3 = LAPC4, λωρίδα 4 = VCAP, λωρίδα 5 = EKVX, λωρίδα 6 = αρνητικός έλεγχος. Όλες οι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν ήταν αρνητικές για την μόλυνση του DNA ποντικού. . L = μοριακό βάρος σκάλα

doi: 10.1371 /journal.pone.0020874.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

φυλογενετική ανάλυση των γονιδιωμάτων ιού από κυτταρικές σειρές EKVX LAPC4, vcap και. Το φυλογενετικό δέντρο αντιπροσωπεύει γνωστούς ενδογενείς αλληλουχίες MLV, συμπεριλαμβανομένων των πολυτροπικών (PMV), όπως τροποποιήθηκε πολυτροπικά (ΜΡΜν) και ξενοτροπικών (Xm) ιούς. Αυτό το δέντρο αντιπροσωπεύει μόνο ενδογενή MLVs για τα οποία είναι γνωστή η όλη προϊική αλληλουχία, η οποία είναι πιθανό μόνο ένα μικρό μέρος όλων των ενδογενών MLVs παρόν στα ποντίκια. Εξωγενείς Μίν (CAS-BR-Ε, ÅKV, MLMCG και φίλο) περιλαμβάνονται επίσης για σύγκριση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Δοκιμές νωρίς πέρασμα LAPC4 για την παρουσία του ιού. Οι παν-MLV εκκινητές που περιγράφεται στο Σχήμα 1 χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο των κυττάρων LAPC4 από το εργαστήριο μας (διαδρομή 1), νωρίς το πέρασμα LAPC4 παγώσει κάτω από το 1998 από το εργαστήριο Γ Sawyers (λωρίδα 2), κύτταρα LAPC4 παγώσει κάτω το 2010 από τον Γ . Sawyers εργαστήριο (λωρίδα 3), και ένα αρνητικό έλεγχο εκχύλισης mock DNA (λωρίδα 4). Όλα τα κύτταρα LAPC4 αναλύθηκαν ήταν θετικά για τον ιό

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

Παραδείγματα MLV-αρνητικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη που έχουν μολυνθεί με MLV διάρκεια σειριακή διέλευση μέσω καλλιέργειας κυττάρων στο εργαστήριο. Καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές που προέρχονται άμεσα από το NCI (DU145) ή ATCC (LNCaP) είναι αρνητικές όταν χρωματίζονται με MLV30 και MLV70 αντιοροί. Αυτές οι γραμμές είχαν απρόσμενα βρέθηκε να είναι θετική για τον ιό μετά από σειριακή διέλευση στο εργαστήριο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s006

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Πλήρης αποτελέσματα των IHC και PCR σε 72 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s007

(DOC)

Πίνακας S2.

αστάρια χρησιμοποιούνται για την ακολουθία ιικών γονιδιωμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020874.s008

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ John Isaacs ( Johns Hopkins) για την παροχή αρκετές κυτταρικές σειρές για την κυτταρική γραμμή μικροσυστοιχίας. Θα θέλαμε, επίσης, να αναγνωρίσουμε και να ευχαριστήσουμε τον Δρ Charles Sawyers (MSKCC) για την παροχή δειγμάτων LAPC4 νωρίς πέρασμα και ο Δρ John M. Coffin (Πανεπιστήμιο Tufts) για την παροχή εμπειρογνωμοσύνης και βοήθειας προς τις φυλογενετικές αναλύσεις.