Αφηρημένο

Ιστορικό

Ήταν γνωστό ότι η κλινική χρήση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων περιορίζεται από σοβαρές ανεπιθύμητες αντιδράσεις και αντιστάσεις του φαρμάκου. Έτσι, είναι απαραίτητο να καταλάβουμε μια στρατηγική για την αύξηση του ειδικού αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Απιγενίνη, ένα είδος φλαβονοειδή, έχει αναφερθεί ότι διαθέτει αντικαρκινική δραστηριότητες με πολύ χαμηλή κυτταροτοξικότητα στο φυσιολογικό ιστό.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Τα αποτελέσματά μας από κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας, δυτική-blots και TdT μεσολάβηση dUTP nick-βιοτίνης τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας κατέδειξαν τα συνεργιστικά προ-αποπτωτικά αποτελέσματα μιας χαμηλής δόσης απιγενίνη και paclitaxel σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Για την ανάλυση του υποκείμενου μηχανισμού, εξετάσαμε χρώση αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό απιγενίνη και paclitaxel, ή το καθένα από αυτά και μόνο. Τα δεδομένα από κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι υπεροξειδίων αλλά όχι μείωση των υπεροξειδίων συσσωρευτεί σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με απιγενίνη, ή συνδυασμός των απιγενίνη και πακλιταξέλη. Απιγενίνη και πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HeLa είχε σχέση με το επίπεδο του ROS στα κύτταρα. Αξιολογήσαμε την περαιτέρω δραστηριότητα και πρωτεΐνη επίπεδο της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD). Απιγενίνη ανέστειλε σημαντικά δραστηριότητας SOD, αλλά δεν μεταβάλλουν το επίπεδο της πρωτεΐνης SOD που υποδηλώνει ότι η απιγενίνη προωθείται η συσσώρευση των ROS μέσω καταστολή ενζυμική δραστηριότητα της SOD. Προσθήκη Zn

2+, Cu

2 + και Mn

2+ στην κυτταρική λύματα αναστέλλεται επιπτώσεις απιγενίνη για δραστηριότητα SOD. Ταυτόχρονα, τα δεδομένα από την κασπάση-2 υπερέκφραση και πειράματα νοκ-κάτω απέδειξαν ότι κασπάσης-2 συμμετείχαν σε απιγενίνη και πακλιταξέλη επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HeLa.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Λαμβανόμενα μαζί, η μελέτη μας έδειξε ότι η απιγενίνη μπορεί να ευαισθητοποιήσει τα καρκινικά κύτταρα σε πακλιταξέλη απόπτωση που επάγεται μέσω καταστολής δραστηριότητα SOD, η οποία στη συνέχεια οδήγησε στη συσσώρευση των ROS και η διάσπαση της κασπάσης-2, γεγονός που υποδηλώνει ότι η συνδυασμένη χρήση των απιγενίνη και πακλιταξέλης ήταν ένας αποτελεσματικός τρόπος για να μειωθεί η δόση του paclitaxel που

Παράθεση:. Xu Y, Xin Υ, Diao Υ, Lu C, Fu J, Luo L, et al. (2011) Synergistic Επιδράσεις απιγενίνη και πακλιταξέλη σε απόπτωση κυττάρων του καρκίνου. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10.1371 /journal.pone.0029169

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Ιουλίου, 2011? Αποδεκτές: 22 Νοέμβρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 21, Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας (αρ. 81072433 και 31071000), Jiangsu Σημαντικές Φύση Ίδρυμα Επιστημών της υψηλής Παιδείας (Αρ 07KJA18026) και ένα έργο που χρηματοδοτείται από την Προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η χημειοθεραπεία είναι ένας από τους πιο ευρέως χρησιμοποιούνται θεραπείες για τον καρκίνο. Ωστόσο, πολλοί χημειοθεραπευτικά φάρμακα μπορούν να παράγουν δυσάρεστες παρενέργειες, ιδιαίτερα όταν λαμβάνονται σε υψηλές δόσεις. Ένα από τα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, πακλιταξέλη, έναν αναστολέα μιτωτικό, μπορεί να οδηγήσει σε αντιδράσεις υπερευαισθησίας [1], ουδετεροπενία [2], η νευροτοξικότητα [3], καρδιακή διαταραχή ρυθμού [4] και διάφορα άλλα τοξικά αποτελέσματα [5], η οποία επιδεινώνεται σοβαρά η την ποιότητα ζωής των ασθενών με καρκίνο και τα αποτελέσματα σε μείωση της δόσης και διακοπή της θεραπείας. Επομένως, είναι σημαντικό να μειωθούν οι παρενέργειες των χημειοθεραπευτικών παραγόντων στην κλινική θεραπεία του καρκίνου. Επιπλέον, η αντίσταση του φαρμάκου στην κλινική θεραπεία συχνά παρεμβαίνει στην αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών παραγόντων.

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), συμπεριλαμβανομένων ρίζα υπεροξειδίου, υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2), ρίζα υδροξυλίου, μονοξείδιο του αζώτου, και διάφορα είδη αντιδραστικού νιτρο νιτρικού οξειδίου που προέρχεται από (RNS) διαμορφώνονται ως φυσικά υποπροϊόντα του κανονικού μεταβολισμού του οξυγόνου σε ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς. Λόγω της υψηλής δραστικότητας χαρακτήρα τους, έχουν την τάση να εμπλακούν σε ανεπιθύμητες αντιδράσεις που προκαλούν βλάβες στα κύτταρα και τελικά να οδηγήσει σε ασθένειες. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αυξημένη γλυκόλυση σε συνδυασμό με ένα μειωμένο ρυθμό αναπνοής και αυτές οι μεταβολές στο μεταβολισμό έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με αυξημένη οξειδωτικό στρες [6] – [8]. Μια κατάσταση οξειδοαναγωγής υψηλής κυτταρικής θα μπορούσε να τονώσει σχηματισμό όγκου μέσω της δημιουργίας μιας ενισχυμένης κυτταρικής πολλαπλασιαστικής περιβάλλον, προκαλώντας βλάβη στο DNA, και απενεργοποιώντας τις λειτουργίες καταστολής όγκων [9], [10]. Η ανάπτυξη του όγκου και η μετανάστευση θα μπορούσε να ανασταλεί

in vitro από

αλλοίωση του περιβάλλοντος γύρω από τα κύτταρα του όγκου σε ένα πιο μειώνοντας ένα. Σε αντίθεση με αυτό, μια οξειδοαναγωγική κατάσταση υψηλής κύτταρο θα ήταν επίσης υποστηρίζουν αυξημένη απόπτωση, η οποία θα μπορούσε να αναστείλει το σχηματισμό όγκων. Έτσι, σε καρκινικά κύτταρα, η υψηλή κατάσταση οξειδοαναγωγής θα μπορούσαν να ενισχύσουν την ανοχή τους στις περιβαλλοντικές πιέσεις και χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Τα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν ένα υψηλότερο επίπεδο MnSOD δείχνουν φτωχή πρόγνωση [11], [12]. Έχει αποδειχθεί ότι ROS έχουν πιθανή ικανότητα να επεξεργάζονται κασπάση-2 [13], [14] η οποία είναι ένα κασπάσης εκκινητή οδήγησε σε διαπερατοποίηση μιτοχονδριακής μεμβράνης [15] και είναι επίσης ένα σημαντικό μέλος στην απόπτωση βρόχο ενίσχυσης σήματος [16]. Εκτός αυτού, προηγούμενες μελέτες σε κασπάση-2 νοκ-out ποντίκια έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-2 σχετίζονται με τη συσσώρευση ROS [17]. Μειωμένος συντελεστής απόπτωση ανιχνεύθηκε επίσης σε

κασπάσης-2

– /-.

Ωοκυττάρων [18]

απιγενίνη (4 ‘, 5, 7-trihydroxyflavone) είναι ευρέως περιέχεται σε πολλά φρούτα και λαχανικά. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι η απιγενίνη είχε μια δυνητικά αποτελέσματα κατά του όγκου σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές με χαμηλή κυτταροτοξικότητα και καμία μεταλλαξιογόνο δράση. [19] – [21]. Απιγενίνη μπορούσε να ενισχύσει την ενδοκυτταρική συσσώρευση των ROS και είχε την προ-οξειδωτικό δυναμικό [22], [23] και να μειώσει δραστηριότητα SOD σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα [24].

Στην παρούσα εργασία, δείξαμε ότι η απιγενίνη μπορούσε ευαισθητοποιούν καρκινικά κύτταρα σε απόπτωση που επάγεται από paclitaxel μέσω καταστολής δραστηριότητα SOD και οδηγεί σε συσσώρευση των ROS και η διάσπαση της κασπάσης-2, υποδηλώνοντας τη συνδυασμένη χρήση απιγενίνη και πακλιταξέλης αποτελεσματικό για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

ανθρώπινο τραχήλου καρκινικών κυττάρων του επιθηλίου γραμμή HeLa, ανθρώπινου πνεύμονα Α549 επιθηλιακού καρκινώματος κυτταρική γραμμή, τα ανθρώπινα νεγροειδούς καρκινικών κυττάρων ηπατοκυττάρων γραμμή Hep3B και τα κύτταρα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά 293Α (HEK293A) που λαμβάνεται από το Ινστιτούτο Biochemistry and Cell Biology, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Shanghai, PR China), διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Invitrogen) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone) και αντιβιοτικά (100 μg /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη) με 5% CO

2 στους 37 ° C. Παροδική διαμόλυνση εκτελέστηκε με μία τροποποιημένη μέθοδο φωσφορικού ασβεστίου ή με τη χρήση του αντιδραστηρίου Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε όλες τις περιπτώσεις, η συνολική ποσότητα του DNA ομαλοποιήθηκε από τα κενά πλασμίδια ελέγχου.

Αντισώματα, Regents και κατασκευάσματα DNA

Ποντίκια μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Flag-tag αγοράστηκε από τη Sigma. Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (PARP), κασπάσης-3 και β-ακτίνης ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology. Ποντίκι πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι κασπάσης-2 προήλθε από Santa Cruz Biotechnology. Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι διασπασμένης κασπάσης-3 προήλθε από Bioworld Technology, Inc. Mouse μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι SOD1 και πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού έναντι SOD2, Endo G και ΟΕΕ ελήφθησαν από Abcam. Κασπάση-2 αναστολέα βενζυλοξυκαρβονυλ-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom αιθυλοκετόνη (z-VDVAD-fmk) ελήφθη από την Calbiochem. αντιδραστήρια ROS ανίχνευσης (CM-H

2DCFDA και dihydroethidium (DHE)) και αποπτωτικών ανίχνευση αντιβασιλέας (FITC-αννεξίνης V και ρυθμιστικό ιωδιούχου προπιδίου) ήταν από την Molecular Probes ™ (Invirogen). Διμεθυλοσουλφοξειδίου από Amresco. Απιγενίνη, πακλιταξέλη και DETC αγοράστηκαν από τη Sigma.

pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT) και pRNAU6-caspase2 κατασκευάστηκαν με χρήση πρότυπων τεχνικών. pcDNA3.1 υπέστη πέψη με XhoI και ΚρηΙ. Οι εκκινητές (νόημα: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, αντι-νόημα: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) σχεδιάστηκαν για να παράγουν pcDNA3.1-σημαία-caspase2 (WT).

κασπάσης-2

γονίδιο (NM_032982.2) συντέθηκε από την Invitrogen. pRNAU6 υπέστη πέψη με Bam ΗΙ και Hind III, και τα ανοπτημένα ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης ACAGCTGTTGTTGAGCGAA για

κασπάσης-2

συνδέθηκε εντός του φορέα [25].

Κυτταρική βιωσιμότητα και δοκιμασία TUNEL

για την αξιολόγηση paclitaxel επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, Colorimetric Κυτταροτοξικοί 96 μη ραδιενεργό δοκιμασία κυτοτοξικότητας (Promega) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με μέτρηση ενδογενούς αφυδρογονάσης γαλακτικού ποσοτικά.

dUTP nick-βιοτίνης τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας TdT μεσολάβηση εκτελέστηκε σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας Guava® TUNEL Kit όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Τα κύτταρα ανιχνεύθηκαν σε ένα Σύστημα γκουάβα EasyCyte ™, και τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση γκουάβα TUNEL Software (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA). Ολες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν για τρεις επαναλήψεις.

αννεξίνης V /PI δοκιμασία

δοκιμασία αννεξίνης V /PI, χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /PI διπλή χρώση των μη ρυθμισμένων κυττάρων, διακρίνει μεταξύ πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων και αργά αποπτωτικών /νεκρωτικών κυττάρων. Αμφότερες επέπλευσε και συνδεδεμένα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 500 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM ΟαΟ

2, 0,1% BSA). Annexin V-FITC (5 μL) και ΡΙ (5 μL) κατόπιν προστέθηκε σε κάθε δείγμα. Μετά από 15 λεπτά επώασης στο σκοτάδι, η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Συστήματος γκουάβα EasyCyte ™. Για κάθε δείγμα 5.000 κύτταρα αναλύθηκαν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση γκουάβα TUNEL Software (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA).

ROS

ανίχνευση

κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και μετά 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με ROS ειδικές βαφές, dihydroethidium (DHE, 5 μΜ) ή CM-H

2DCFDA (5 μΜ), για 30 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια κατεργάζεται με απιγενίνη (15 μΜ), πακλιταξέλη (4 ηΜ) ή και τα δύο από αυτά για άλλα 30 λεπτά. ROS ανιχνεύθηκαν με τη χρήση ενός γκουάβα EasyCyte ™ και αναλύθηκαν με το Pro Λογισμικό γκουάβα Express (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA). DHE εντοπίστηκε κάτω από μια εκπομπή στο 580-583 nm (PM1) και CM-H

2DCFDA εντοπίστηκε κάτω από μια εκπομπή 525 nm (PM3).

Απομόνωση του μιτοχονδρίου και Μέτρηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό ( MMP)

Ακέραια μιτοχόνδριο διαχωρίστηκε από κυτοσολικό συστατικό των κυττάρων HeLa για περαιτέρω ανάλυση πρωτεϊνών, χρησιμοποιώντας μιτοχόνδρια κιτ απομόνωσης από Thermo-Pierce Dounce ομογενοποίηση και διαφορική φυγοκέντρηση διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) κυττάρων HeLa μετρήθηκε με τη χρήση του γκουάβα EasyCyte ™ MitoPotential Kit (γκουάβα Technologies, Hayward, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. χρωστική φθορισμού με βάση 5, 5 ‘, 6, 6′-τετραχλωρο-1, 1’, 3, 3 ‘-tetrethyl benzimidalyl καρβοκυανίνη ιωδιούχο (JC-1) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις αλλαγές ΜΜΡ. Η βαφή διαπερνά κύτταρο 7-AAD χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση ταυτόχρονα αλλαγές διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα Σύστημα γκουάβα EasyCyte ™.

Δοκιμασία της υπεροξειδικής δισμουτάσης δραστηριότητας

Η ενζυματική δράση της SOD σε κύτταρα HeLa μετρήθηκε με τη χρήση εμπορικών κιτ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Σε αυτή τη δοκιμασία, το άλας τετραζολίου χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ριζών υπεροξειδίου που παράγεται από οξειδάση ξανθίνης και υποξανθίνης. Για τη μέτρηση της δραστικότητας MnSOD, κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 10,000 χ g για να διαχωριστεί MnSOD από CuZnSOD και CuZnSOD ανεστάλη υπό την παρουσία κυανιούχου καλίου.

RT-PCR ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη με τη χρήση υψηλής καθαρότητας κιτ απομόνωσης RNA (Roche) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον κατασκευαστή. RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ανάστροφης μεταγραφάσης Μ-ΜΕν (Invitrogen) με υποδεικνυόμενα εναύσματα (

κασπάσης-2

, αίσθηση: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, αντι-νόημα: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG? GAPDH, την αίσθηση: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, αντι-νόημα: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). PCR διεξήχθη σε Tm 58 ° C για 30 κύκλους σε μίγμα αντίδρασης 25 κ.εκ. ατομικά από κάθε πρωτεΐνη. PCR προϊόντα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε πηκτές αγαρόζης 1% και βάφεται με βρωμιούχο αιθίδιο. Το σπίτι κρατώντας γονίδιο GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Western κηλίδας ανάλυση

κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση (15000 g) στους 4 ° C για 15 λεπτά. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Τα σύμπλοκα αντισώματος-αντιγόνου κατέστησαν ορατά με το σύστημα απεικόνισης LI-COR Odyssey υπερύθρων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας IRDye800 αντίσωμα flurophore-συζευγμένο (LI-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ).

Προσδιορισμός Συνέργια

Ο συνδυασμός φαρμάκου προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Chou-Talalay. Η CI υπολογίστηκε από την εξίσωση Chou-Talalay, η οποία λαμβάνει υπόψη τόσο την ισχύ (IC

50 ή D

m) και η απότομη της καμπύλης δόσης-αποτελέσματος (τιμή m) [28], [29 ]. Το κλασικό isobolgram (CI = 1) δίνεται από: (Α)

Στα παρονομαστές, (D

x)

1 και (D

x)

2 είναι η συγκεντρώσεις για D

1 (απιγενίνη) και D

2 (paclitaxel) χρησιμοποιούνται μόνα που δίνουν x% αναστολή, ενώ στους αριθμητές, (D)

1 και (D)

2 είναι οι δόσεις της απιγενίνη και πακλιταξέλη χρησιμοποιείται σε συνδυασμό που αναστέλλουν isoeffectively x%. CI & lt? 1, CI = 1, και CI & gt?. 1 δείχνουν συνέργεια, πρόσθετης ύλης και του ανταγωνισμού, αντίστοιχα

Από την εξίσωση μέσου-αποτελέσματος των Chou και Chou et al. [29], [30], η (D

x)

1 και (D

x)

2 μπορεί εύκολα να υπολογιστεί. (Β)

Εδώ D

m είναι η δόση μέσου-αποτελέσματος που λαμβάνεται από την αντι-log του X-τομής του οικοπέδου μέσου-αποτελέσματος, X-log (D) σε σχέση με το Υ = log [f

α /(1-f

α)] ή D

m = 10

– (Y-τομής) /m, και m είναι η κλίση του οικοπέδου διάμεσου-αποτελέσματος. Αυτοματοποιημένη υπολογισμό του m, D

m, D

x, και οι τιμές CI επιτρέπεται επίσης με το λογισμικό του υπολογιστή.

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. έλεγχος τ εφαρμόστηκε για να αναλυθεί η στατιστική σημαντικότητα της διακύμανσης κατά ζεύγη σύγκριση. Σε όλες τις αναλύσεις, η P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η συνδυασμένη θεραπεία της απιγενίνη με πακλιταξέλη βελτιώνει σημαντικά την κυτταροτοξικότητα σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Από την τοξικότητα του paclitaxel είναι. συζευγμένο με αντικαρκινική δραστηριότητα της και απιγενίνη έχει αναφερθεί ότι έχει δραστικότητα κατά του όγκου με χαμηλή τοξικότητα, παρατηρήσαμε πρώτα τα συν-επιδράσεων του comcination paclitaxel με απιγενίνη. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις απιγενίνη, paclitaxel ή και τα δύο και στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν οι κυτταρικές βιωσιμότητες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α και Β, και οι δύο απιγενίνη και πακλιταξέλη δόση εξαρτώμενο επαγόμενη κυτταροτοξικότητα με μείωση περίπου 29% της βιωσιμότητας των κυττάρων που προκαλείται από απιγενίνη στη δόση των 25 μΜ (Εικ. 1Α) και 24% μείωση που προκαλείται από την πακλιταξέλη σε δόση 10 ηΜ (Σχ. 1Β), αντίστοιχα. Όταν κατεργασμένα κύτταρα HeLa με 15 μΜ απιγενίνη και 4 ηΜ paclitaxel, πάνω από το 50% μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων ανιχνεύθηκε, παρ ‘όλα αυτά, λιγότερο από 20% μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με απιγενίνη ή πακλιταξέλη αντίστοιχα (Εικ. 1 C). Πραγματοποιήσαμε υπολογισμό Chou-Talalay να επιβεβαιώσει τα συνεργιστικά αποτελέσματα των απιγενίνη και πακλιταξέλη σε κύτταρα HeLa. Ο δείκτης συνδυασμού (CI) ήταν 0,3918 ± 0,0436 στη δόση των 15 μΜ απιγενίνη και 4 ηΜ paclitaxel υποδεικνύοντας συνεργιστικά αποτελέσματα των απιγενίνη και πακλιταξέλη. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ένα σημαντικά αυξημένο κυτταροτοξικότητα όταν απιγενίνη και πακλιταξέλη χορηγήθηκαν σε κύτταρα HeLa ταυτόχρονα. Επίσης φαίνεται στο Σχ. 1C, συνδυασμός των απιγενίνη με πακλιταξέλη επαγόμενη τα παρόμοια αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα εκτός από τα κύτταρα Hela συμπεριλαμβανομένων Hep3B και τα κύτταρα Α549. Ωστόσο, 15 μΜ απιγενίνη, 4 ηΜ paclitaxel ή συνδυασμό αυτών δεν οδήγησε σε κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα HEK293A αντίστοιχα (Εικ. 1 C). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν υπήρχαν συνεργιστικά αποτελέσματα των απιγενίνη και πακλιταξέλη για ειδικά θανάτωση καρκινικών κυττάρων

Α, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξημένες συγκεντρώσεις των απιγενίνη (0-100 μΜ) για 24 ώρες. ζωτικότητα των κυττάρων μετρήθηκε. Το πείραμα επαναλήφθηκε ανεξάρτητα για τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Β, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξημένες συγκεντρώσεις της πακλιταξέλης (0-50 ηΜ) για 24 ώρες. ζωτικότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε και αναλύθηκε όπως περιγράφεται στο Α, C, HeLa, Α549, Hep3B και τα κύτταρα HEK293A υποβλήθηκαν σε θεραπεία με απιγενίνη (15 μΜ) συνδυασμό με πακλιταξέλη (4 ηΜ) για 24 ώρες. ζωτικότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε όπως περιγράφεται στο Α D, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη ή πακλιταξέλη αντίστοιχα, εκτός αυτού, σε άλλες ομάδες, απιγενίνη προστέθηκε σε κύτταρα HeLa 2 ώρες πριν ή μετά την αγωγή με πακλιταξέλη, ή απιγενίνη και πακλιταξέλη προστέθηκαν σε κύτταρα HeLa Την ίδια στιγμή. χρώση TUNEL έγινε και ανιχνεύονται με ένα κιτ Guava® TUNEL. Αριθμοί απεικονίζεται το ποσοστό των TUNEL θετικών κυττάρων. Ε, τα κύτταρα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή αγωγή όπως περιγράφεται προηγουμένως στο D. στον υποδεικνυόμενο χρόνο, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με χρωστική αννεξίνη V /PI. Οι αναλύσεις διεξήχθησαν σε 5.000 κύτταρα σε κάθε ίχνος. F, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξημένες συγκεντρώσεις των απιγενίνη ή paclitaxel αντίστοιχα, ή και τα δύο από αυτά για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western για να προσδιοριστεί το επίπεδο της πρωτεΐνης της κασπάσης-3 και PARP. V παριστά όχημα (διμεθυλοσουλφοξείδιο). * Ρ & lt? 0,05 σύγκριση με μη επεξεργασμένα ομάδα? ** Ρ & lt?. 0,01 σύγκριση με μη επεξεργασμένα ομάδα

Η

Έχει αναφερθεί ότι τόσο paclitaxel [31], [32] και απιγενίνη [21] μπορούν να επάγουν κυτταρική απόπτωση. Είμαστε δίπλα εξακριβώσει αν ο συνδυασμός χρήση απιγενίνη και πακλιταξέλη θα μπορούσε να προκαλέσει πιο έντονη απόπτωση στα κύτταρα HeLa. Σε σύγκριση με εκείνες τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με απιγενίνη ή πακλιταξέλη μεμονωμένα, απιγενίνη και πακλιταξέλη συν-επεξεργασία ομάδες έδειξαν πιο TUNEL θετικά κύτταρα χρώση. Τα ποσοστά των TUNEL κύτταρα θετική χρώση ήταν κυρίως αυξήθηκε από 17,95% σε ομάδα που υπέστη αγωγή paclitacel και 19,65% της ομάδας αντιμετωπίζονται απιγενίνη σε περίπου 40% στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό αυτών (Σχ. 1D). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της απόπτωσης, ανάλυση FACS διεξήχθη μετά την χρώση κυττάρων με FITC-αννεξίνης-ν συν ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο Σχ. 1E έδειξε ότι ο αριθμός των επιζώντων κυττάρων μειώνεται σταδιακά μετά από συν-θεραπεία με απιγενίνη και πακλιταξέλη και μόνο λιγότερο από το 60% είχαν επιζήσει 24 ώρες μετά την απιγενίνη και πακλιταξέλη θεραπεία.

Από την ενεργοποίηση των κασπασών είναι ένας σημαντικός λόγος για την απόπτωση , ανιχνεύσαμε περαιτέρω τις διασπάσεις της κασπάσης-3 και PARP χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1F, τόσο οι διασπάσεις της κασπάσης-3 και PARP ήταν σημαντικά ενισχυμένη με απιγενίνη /paclitaxel συν-θεραπεία σε σύγκριση με απιγενίνη ή θεραπεία paclitaxel μόνο. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι η απιγενίνη /πακλιταξέλη συν-θεραπεία προκάλεσε μια σημαντική αποπτωτικό θάνατο κυττάρων HeLa που υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός χρήση απιγενίνη και paclitaxel θα παρήγαγε ένα καλύτερο αποτέλεσμα κατά του όγκου από ό, τι η χρήση των απιγενίνη ή paclitaxel μόνο. ​​

ROS παράγονται από απιγενίνη είναι απαραίτητη για την απιγενίνη /paclitaxel επαγόμενη HeLa κυτταρικής απόπτωσης

Εν τω μεταξύ φλαβονοειδών συμπεριλαμβανομένων απιγενίνη ήταν ευρέως αναγνωρισμένη ως αντιοξειδωτικά, προ-οξειδωτικές ιδιότητες τους έχουν επίσης αναφερθεί [33]. Έχουμε σκεφτεί τα αντικαρκινικά αποτελέσματα του συνδυασμού απιγενίνη /πακλιταξέλη μπορεί να σχετίζονται με την παραγωγή των ROS στα κύτταρα HeLa που προκαλείται από απιγενίνη. Ως εκ τούτου, παρατηρήσαμε τα επίπεδα σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με με απιγενίνη, πακλιταξέλη ή και τα δύο. Δύο ROS-ειδικών βαφών, DHE και CM-H

2DCFDA εμφανίζεται είδη υπεροξειδίου και H

2O

2 σε κύτταρα-στόχους αντίστοιχα [24]. CM-H

2DCFDA οξειδώνεται κυρίως από υπεροξείδια του υδρογόνου (H

2O

2) και ρίζα υδροξυλίου, DHE οξειδώνεται από ανιόντα υπεροξειδίου (O

2

-). κύτταρα HeLa βάφτηκαν με DHE και CM-H

2DCFDA που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, DHE-ειδική ROS αυξημένη (Σχ. 2Α), ενώ CM-H

2DCFDA-ειδική ROS μειωμένη (Εικ. 2Β) σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με απιγενίνη μέσα στα 30 λεπτά. Καμία αλλαγή ανιχνεύθηκε στα κύτταρα κατεργασμένα μόνο με paclitaxel. Μια παρόμοια τάση και μια πιο σημαντική αλλαγή στην κατάσταση ROS »παρατηρήθηκαν σε αυτά τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με συνδυασμό των απιγενίνη και paclitaxel σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με απιγενίνη μόνο (Εικ. 2). χρώση DHE παρατηρήθηκαν στα πειράματα αυτά προέκυψε από την οξείδωση κατά είδος υπεροξειδίου που υποδηλώνει ότι η απιγενίνη specie αυξημένη υπεροξειδίου σχετίζονται ROS στα κύτταρα HeLa.

Α, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) μόνο του ή μαζί με πακλιταξέλη (4 ηΜ), για υποδεικνύεται περιόδους. Διυδροεργοταμίνης (5 μΜ) προστέθηκαν σε κυτταρικές καλλιέργειες 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία. χρώση DHE σε κύτταρα ανιχνεύθηκαν και αναλύθηκαν με γκουάβα System EasyCyte ™. χρώση DHE σε μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Β, CM-H

2DCFDA (5 μΜ) χρώση πραγματοποιήθηκε και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Α

Η

Στη συνέχεια αξιολογήθηκε το εάν απιγενίνη /paclitaxel απόπτωση εξηρτάτο από συσσώρευση ROS. Ν-ακετυλο-L-κυστεΐνη (NAC), μια καλά εγκριθεί ROS καθαριστή, έχει χρησιμοποιηθεί για να ανταγωνίζεται τη δράση των ROS. Προκατεργασία των κυττάρων HeLa με 100 μΜ NAC κατέστειλε αποτελεσματικά τη δημιουργία των ειδών υπεροξειδίου (Εικ. 3Α) και αναστέλλεται σημαντικά την απόπτωση κυττάρων που προκαλείται από απιγενίνη και πακλιταξέλη συν-θεραπεία (Εικ. 3Β). Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ότι ROS ήταν απαραίτητα για απιγενίνη /paclitaxel επαγόμενη απόπτωση κυττάρων HeLa.

Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και ανιχνεύονται με γκουάβα System EasyCyte ™ όπως περιγράφεται στο Σχ. 2Α. Β, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με NAC (100 μΜ) για 2 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 24 ώρες. Κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε με δοκιμασία TUNEL όπως περιγράφεται στο Σχ. 1.

Η

απιγενίνη προκαλεί συσσώρευση των ROS μέσω καταστολή της δραστηριότητας της SOD

Παρατηρήσαμε ότι μετά από τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με απιγενίνη, η αφθονία των ειδών υπεροξειδίου αυξήθηκαν ενώ H

2O

2 μειώθηκε. Λαμβάνοντας υπόψη SOD ήταν ένα κυτταρικό ένζυμο που μπορεί να μετατρέψει υπεροξειδίου με H

2O

2, έχουμε σκεφτεί ότι η απιγενίνη μπορεί να μειώσει τη δραστικότητα των SOD και, κατά συνέπεια, οδήγησε στη συσσώρευση των ειδών υπεροξειδίου. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση των απιγενίνη σε επίπεδο πρωτεΐνης όπως επίσης και τη δραστικότητα ενζύμου της SOD. Μία σημαντική καταστολή τόσο της CuZnSOD (SOD1) και MnSOD (SOD2) δραστηριότητα παρατηρήθηκε σε κύτταρα HeLa εντός 30 λεπτών μετά την απιγενίνη ή απιγενίνη /paclitaxel αλλά όχι αγωγή με πακλιταξέλη (Σχ. 4Α). Ωστόσο, δεν υπήρχε εμφανής μεταβολή παρατηρείται στο επίπεδο πρωτεΐνης του CuZnSOD και MnSOD μετά τη χορήγηση απιγενίνη (Εικ. 4Β). Κατά συνέπεια, ήταν αποδεικτική ότι απιγενίνη καταστέλλεται δραστηριότητα SOD και επομένως επαγόμενη από τη συσσώρευση των ROS.

Α, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ), πακλιταξέλη (4 ηΜ), ή και τα δύο για 30 λεπτά . δραστηριότητα SOD μετρήθηκε με Cayman κιτ ανίχνευσης SOD. Το πείραμα επαναλήφθηκε ανεξάρτητα για τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν με μέσες ± Τ.Α. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου? ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Β, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 30 λεπτά. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε Protein Western κηλίδας για τον προσδιορισμό των επιπέδων των SOD1 και SOD2. C, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) για 30 λεπτά και λύθηκαν με υπερήχηση. Τα κυτταρικά λύματα επωάστηκαν στη συνέχεια με CuCl

2 (8 μΜ), ΖηΟΙ

2 (8 μΜ) και ΜηΟ

2 (8 μΜ) για 30 λεπτά επί πάγου. Η δραστηριότητα SOD μετρήθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται στο Α D, κύτταρα HeLa λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους και τα κυτταρικά προϊόντα λύσης στη συνέχεια επωάστηκαν με προαναφερθέντων μεταλλικών ιόντων επί 30 λεπτά επί πάγου. δραστικότητα SOD μετρήθηκε όπως αναφέρθηκε παραπάνω. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα απιγενίνη επεξεργασμένο? ** P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα απιγενίνη επεξεργασμένο

Η

Όπως και παραπάνω, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απιγενίνη καταστέλλεται δραστηριότητα SOD, και είχε αναφερθεί ότι η απιγενίνη μπορεί να αποτελέσει σταθερή σύμπλεξη με μεταλλικά ιόντα

in vitro

[34], μπορούμε συνεπώς, αποφασισμένοι, αν απιγενίνη μπορεί να αποτελέσει σύμπλεξη με μεταλλικά ιόντα και την καταστολή της δραστηριότητας SOD μέσω της πρόληψης SOD από τη συναρμολόγηση με συμπαράγοντες του. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 15 μΜ απιγενίνη για 30 λεπτά και τα προϊόντα λύσης των κυττάρων επωάστηκαν με 8 μΜ ΖηΟ

2 (aq), CuCl

2 (aq) ή ΜηΟ

2 (aq) αντίστοιχα επί πάγο για άλλα 30 λεπτά. Η δραστηριότητα της SOD μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την Cayman δισμουτάση του υπεροξειδίου Assay Kit όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Όπως ήταν αναμενόμενο, απιγενίνη κατέστειλε σημαντικά τις δραστηριότητες τόσο CuZnSOD και MnSOD, αλλά η δραστηριότητα CuZnSOD αυξήθηκε μετά Cu

2+, Ζη

2+, και Mn

2+ έκθεση και η δραστικότητα του MnSOD αυξήθηκε επίσης προφανώς μετά Mn

2+ έκθεσης (Εικ. 4C). Επιπλέον, καμία σημαντική μεταβολή της δραστηριότητας SOD βρέθηκε όταν τα λύματα των κυττάρων απευθείας εκτεθειμένη στον Cu

2+, Zn

2+ ή Mn

2+ χωρίς θεραπεία απιγενίνη (Εικ. 4D), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα μεταλλικά ιόντα δεν ενίσχυσε βασικοκυτταρικό αποτελέσματα SOD activity.These πρότεινε ότι απιγενίνη κατασταλεί δραστικότητα SOD πιθανώς μέσω σχηματισμού ενός σταθερού συμπλόκου με τα ανωτέρω μέταλλα σε κύτταρα [34], και απιγενίνη μπορεί να έχουν υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης με Mn

2+.

μείωσης της δραστηριότητας SOD είναι κρίσιμη σε απιγενίνη /paclitaxel επαγόμενη απόπτωση

απιγενίνη ανέστειλε τη δραστηριότητα της SOD και ο συνδυασμός των απιγενίνη /paclitaxel ήταν πιο αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων από κάθε ένα από αυτά και μόνο. Για να επιβεβαιωθεί ότι η απιγενίνη προκληθείσα μείωση της δραστηριότητας της SOD ήταν κρίσιμη στην απόπτωση που προκλήθηκε από απιγενίνη /paclitaxel συν-θεραπεία, παρατηρήσαμε paclitaxel απόπτωση μετά το κλείδωμα δραστικότητα του ενζύμου SOD. DETC (διαιθυλθειοκαρβαμιδικό), μια καλά εγκεκριμένη αναστολέας τόσο CuZnSOD και MnSOD εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη μας [35]. Ομοιάζουν ως απιγενίνη, DETC κατέστειλε την δραστηριότητα της SOD και ενισχυμένη επαγόμενη απόπτωση paclitaxel, καθώς και (Εικ. 5Α). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι η μείωση της δραστηριότητας SOD από απιγενίνη είναι κρίσιμη στην ενίσχυση της πακλιταξέλης απόπτωση.

Α, κύτταρα HeLa επωάστηκαν με απιγενίνη (15 μΜ) /paclitaxel (4 ηΜ), ή paclitaxel ( 4 ηΜ) μαζί με ή χωρίς 1 mM DETC (ένας αναστολέας της SOD) για 24 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία TUNEL όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Β, κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC (100 μΜ) για 2 ώρες, ακολουθούμενο από την κατεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 24 ώρες. Διάσπαση της κασπάσης-2 ανιχνεύθηκε με ανάλυση Western blot με τον έλεγχο της β-ακτίνης. C, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με z-VDVAD-fmk (25 μΜ), ένας ειδικός αναστολέας της κασπάσης-2, και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 24 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της διασπασμένης ΡΑΚΡ και procaspase-3 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση Western-κηλίδος. D, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με z-VDVAD-fmk (25 μΜ) για 30 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 8 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ γκουάβα EasyCyte ™ MitoPotential και αναλύθηκαν με γκουάβα System EasyCyte ™. ΜΜΡ έδειξε ως την καταμέτρηση των εκπολωμένο κυττάρων. Το πείραμα επαναλήφθηκε ανεξάρτητα για τρεις φορές και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με μη ομάδα. Ε, κύτταρα HeLa επωάστηκαν με απιγενίνη (15 μΜ) και paclitaxel (4 ηΜ) για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση RT-PCR. GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο σπίτι τερματοφύλακα.

Η

Η ενεργοποίηση της κασπάσης-2 είναι σημαντική για την απιγενίνη /πακλιταξέλη-ενεργοποιείται HeLa κυττάρων απόπτωση

Το μιτοχονδριακό μονοπάτι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ROS προκάλεσε απόπτωση [36], [37] και της κασπάσης-2 έχει θεωρηθεί ως η κορυφαία κασπάσης στο μιτοχονδριακό βρόχο ενίσχυσης σήματος θάνατο [38], [39]. ROS προκαλούμενη κασπάσης-2 διάσπασης και την ανατροφοδότηση ενίσχυση του αποπτωτικού σήματος έχουν επίσης ερευνηθεί [40]. Για να εξεταστεί η επίδραση των απιγενίνη στη μιτοχονδριακή μονοπάτι της απόπτωσης, κασπάσης-2 πρόδρομο διάσπαση ανιχνεύθηκε σε απιγενίνης επεξεργασμένα κύτταρα HeLa με ανάλυση δυτικής κηλίδας. Συν-κατεργασία των κυττάρων HeLa με απιγενίνη και πακλιταξέλη έδειξε πολύ χαμηλό επίπεδο προδρόμου κασπάσης-2. Όταν τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NAC, το επίπεδο πρόδρομος κασπάσης-2 ανακτάται (Εικ. 5Β). Η κασπάση-2 αναστολέα Ζ-VDVAD-fmk, μείωσε σημαντικά τη διάσπαση της κασπάσης-3 και ΡΑΚΡ σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με απιγενίνη σε συνδυασμό με πακλιταξέλη (Εικ. 5C). ΜΜΡ μπορεί να είναι αιτιώδης εκδήλωση στην κατακρήμνιση της απόπτωσης. Τα δεδομένα στην Εικ. 5D έδειξαν ότι η απιγενίνη, αλλά δεν paclitaxel προκάλεσε μια αύξηση των εκπόλωση των ΜΜΡ που υποδηλώνει τη σημασία της απιγενίνη σε απιγενίνη /προκαλείται από πακλιταξέλη καρκινικών κυττάρων απόπτωση. Όπως αναμενόταν, ζ-VDVAD-fmk ανέστειλε την αύξηση του ΜΜΡ σε απιγενίνη και ομάδες που έλαβαν /paclitaxel απιγενίνη (Σχ. 5D). Σύκο. 5Ε έδειξαν ότι η θεραπεία της απιγενίνη, η πακλιταξέλη ή απιγενίνη /paclitaxel δεν μεταβάλλουν το επίπεδο του mRNA της κασπάσης-2 δείχνει απιγενίνη /πακλιταξέλη συν-θεραπεία μόνο αυξημένη ενεργοποίηση της κασπάσης-2.

Για να επιβεβαιώσετε τη σημασία της caspase- 2 σε απιγενίνη /διαπερατότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης πακλιταξέλη προκάλεσε και την απόπτωση, εκτελούμε κασπάση-2 υπερέκφραση και knock-down πειράματα και μετρώνται ΟΕΕ, Endo G και κυτόχρωμα c αποδεσμεύει από μιτοχόνδριο σε κύτταρα HeLa. Υπερ-έκφραση της κασπάσης-2 σημαντικά ενισχυμένη απιγενίνη ή απιγενίνη /paclitaxel προκαλούμενη αύξηση του ΟΕΕ, Endo G και κυτόχρωμα c στο κλάσμα κυτταροπλάσματος και μείωση του ΟΕΕ, Endo G και κυτόχρωμα c σε μιτοχονδριακό κλάσμα (Σχ. 6Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, κασπάσης-2 knock-down οδήγησε στην αντίθετη στις απιγενίνη ή απιγενίνη /μεταβολές που προκαλούνται πακλιταξέλη του ΟΕΕ, Endo G και κυτόχρωμα c σε κύτταρα HeLa (Σχ. 6Α). Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η υπερ-έκφραση της κασπάσης-2 προφανώς αυξημένη απιγενίνη /paclitaxel-επαγόμενη διάσπαση της κασπάσης-3 και PARP και knock-down της κασπάσης-2 ανέστειλε τέτοια επίδραση του απιγενίνη /paclitaxel. Εμείς επόμενη ανιχνεύεται ζωτικότητα των κυττάρων για να αξιολογηθεί προκαλούμενο αποτέλεσμα της κασπάσης-2 επί απιγενίνη /paclitaxel προκάλεσε απόπτωση των κυττάρων HeLa. Υπερ-έκφραση της κασπάσης-2 προκάλεσε περίπου 10% μείωση της ζωτικότητας των κυττάρων τόσο σε απιγενίνη και συν-θεραπεία ομάδες, και της κασπάσης-2 σιωπή σημαντικά αυξημένη ζωτικότητα των κυττάρων.