Αφηρημένο

Ιστορικό

Long μη-κωδικοποίησης RNAs (lncRNAs) παίζουν διαδεδομένη ρόλους στη ρύθμιση των γονιδίων και κυτταρικών διαδικασιών. Ωστόσο, οι λειτουργικές ρόλοι των lncRNAs σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) δεν είναι ακόμη καλά διαλευκανθεί. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η μέτρηση των επιπέδων έκφρασης 91H lncRNA στο CRC και να αξιολογήσει την κλινική σημασία του και βιολογικούς ρόλους στην ανάπτυξη και εξέλιξη της CRC.

Μέθοδοι

έκφραση 91H και αντίγραφο παραλλαγή αριθμός (CNV) μετρήθηκαν σε 72 καρκινικούς ιστούς CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών με πραγματικού χρόνου PCR. Οι βιολογικοί ρόλοι των 91H αξιολογήθηκαν από ΜΤΤ, δοκιμασία μηδέν πληγή, τη μετανάστευση και εισβολή προσδιορισμούς, και κυτταρομετρία ροής.

Αποτελέσματα

91H ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται σε καρκινικό ιστό και κυτταρικές γραμμές CRC σε σύγκριση με τις παρακείμενες φυσιολογικό ιστό και ένα φυσιολογικό ανθρώπινο εντερικών επιθηλιακών κυτταρική γραμμή. Επιπλέον, 91H υπερέκφραση συνδέθηκε στενά με μακρινή μετάσταση και φτωχή πρόγνωση σε ασθενείς με CRC, εκτός από CNV των 91H. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση 91H ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης, καθώς και μακρινή μετάσταση. in vitro δεδομένα μας έδειξαν ότι νοκ ντάουν του 91H ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και εισβολής των κυττάρων CRC.

Συμπεράσματα

91H έπαιξε σημαντικό ρόλο στη μοριακή αιτιολογία της CRC και θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένα μυθιστόρημα δείκτης πρόγνωση σε ασθενείς με CRC

Παράθεση:. Deng Q, Εκείνος Β, Gao Τ, Παν Y, Ηλιόλουστη Η, Xu Y, et al. (2014) Up-κανονισμός του 91H Προωθεί μετάσταση όγκου και προβλέπει κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (7): e103022. doi: 10.1371 /journal.pone.0103022

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15η Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 23 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Deng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστημών της Κίνας, Nanjing Επιστήμη και Τεχνολογία Έργο Επιτροπής ((δεν υπάρχει 81172141, 81200401). no.201108025), Nanjing Ιατρικής Τεχνολογίας Ανάπτυξης Έργων (αρ. ZKX11025), Nanjing Υγείας Νέων Ταλέντων του έργου, Jiangsu επαρχιακό κλειδί Ιατρική Ταλέντα σε SKW, Nanjing Ιατρικό Ίδρυμα Επιστήμης και τεχνικής Ανάπτυξης YQP (Αρ. QRX11255) και B.S.H. (Αρ. QRX11254). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο, λόγω της καθυστερημένης υποβολής του όγκου και ταχεία εξέλιξη, με περίπου 14,1 εκατ νέα κρούσματα καρκίνου και 8,2 εκατομμύρια θάνατοι από καρκίνο το 2012 σε όλο τον κόσμο [1]. Σε οικονομικά αναπτυσσόμενες χώρες, CRC γίνεται όλο και πιο διαδεδομένη, ειδικά στην Κίνα [2]. Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει επιτευχθεί στη διάγνωση και θεραπεία για CRC κατά τα τελευταία χρόνια, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5-ετών παραμένει μη ικανοποιητική λόγω της μετάστασης που οδηγεί σε κακή έκβαση [3]. . Ως εκ τούτου, να αναζητήσουν νέες μοριακούς δείκτες ή παράγοντες είναι αναγκαία και επείγουσα για την έγκαιρη ανίχνευση πριν από μακρινή μετάσταση εμφανίζεται και να προβλέψει την πρόγνωση σε ασθενείς με CRC

Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι lncRNAs, & gt? 200 νουκλεοτίδια σε μήκος, το παιχνίδι ένα κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Παρά λιγότερο καλά κατανόηση lncRNAs σύγκριση με microRNAs [3], [4], [5], συσσωρεύοντας αποδείξεις δείχνουν ότι lncRNAs μεσολάβηση βιολογία θα μπορούσαν να εμπλέκονται στη ρύθμιση των διαφόρων κυτταρικών διαδικασιών, όπως κυτταρική ανάπτυξη και την απόπτωση, βλαστοκυττάρων pluripotency και ανάπτυξη, μειωτικά εισόδου και τελομερών μήκος [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Ωστόσο, παρόμοια με τα γονίδια και micorRNAs που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, lncRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή καταστολή του όγκου, και παρεκκλίνουσα έκφραση τους συσχετίστηκε με την καρκινογένεση. Υψηλή έκφραση του PVT-1 έκφραση σε καρκινικούς ιστούς θεωρήθηκε ως ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για τη συνολική επιβίωση των ασθενών CRC [12], και Hotair, λειτουργώντας ως ένα ογκογονίδιο ή ογκοκατασταλτικό, είχε εμπλακεί σε επιγενετική ρύθμιση για καρκίνους [7], [13], η οποία θεωρήθηκε ως ένα ισχυρό maker πρόγνωση που συνέβαλαν για να προβλέψει τη μετάσταση και την επιβίωση των ασθενών με πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού [7].

91H, Η19 αντιπληροφοριακό RNA, ήταν ένα μυθιστόρημα lncRNA που βρισκόταν στη θέση του Η19 /locus IGF2 (αριθμός προσχώρησης NC_000011.9) με 119.329 KBS σε μήκος. Η μεταγραφή του 91H υπερεκφράστηκε σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης IGF2 σε trans [14]. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τις λειτουργίες 91H σε άλλες μορφές καρκίνου στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένης της CRC. Να διερευνήσουν τις δυνατότητες βιολογικές λειτουργίες 91H στην ανάπτυξη και την πρόοδο του CRC, η τρέχουσα μελέτη διεξήχθη με την εξέταση του προτύπου έκφρασης του 91H σε ιστούς όγκων CRC και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών και τη διερεύνηση των βιολογικών λειτουργιών με αξιολόγηση της διεισδυτικότητας, η μετανάστευση, και την απόπτωση των κυττάρων CRC με 91H knockdown in vitro.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές

72 καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν από εγγράφονται CRC ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Nanjing Πρώτη Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, μεταξύ 2011 και 2014. ειδικότερα, δίπλα φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν 5-10 cm μακριά από τους ιστούς όγκων. Όλα τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο μετά από χειρουργική επέμβαση και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του DNA και του RNA. Δεν ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία σε προ-λειτουργίας. Οι κλινικές πληροφορίες από αυτούς τους ασθενείς συλλέχθηκε συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, του φύλου, την τοποθεσία του όγκου, το στάδιο TNM, βαθμός όγκου και microstellite αστάθεια (MSI) κατάσταση με την προηγούμενη μελέτη [15] που αναφέρθηκαν. Οι περίοδοι παρακολούθησης κυμαίνεται από 2 μήνες έως 3 έτη, με μέση τιμή 26,6 μηνών. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν με έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και ήταν ιστολογικά επιβεβαιωμένη. Η ιατρική επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Πρώτη Νοσοκομείο Ενταγμένο στο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing ενέκρινε τη μελέτη.

Οι κυτταρικές σειρές HCT8, ΗΤ29, HCT116, SW620 (γραμμές ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου) και FHC (κανονική ανθρώπινη εντερική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή) ελήφθησαν από τη Σαγκάη Συλλογή κυττάρων, κινεζική Ακαδημία Επιστημών. Όλα τα παραπάνω κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Hyclone, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Hyclone) και καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2

Εκχύλιση. του ολικού RNA και γονιδιωματικό ϋΝΑ, σύνθεση cDNA, και qRT-PCR

Ολικό RNA και γονιδιωματικό DNA (gDNA) εκχυλίστηκαν από ιστούς και κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA) και EZNA Kit Tissue DNA (Omega, USA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο των κατασκευαστών ξεχωριστά. cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας το PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίου με gDNA γόμα (Takara, Κίνα) και χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση επίπεδο έκφρασης 91H μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) με τους ακόλουθους εκκινητές: προς τα εμπρός, 5′-GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC-3? και να αντιστρέψει, 5-CATCCAGTTGACCGAGCTTG-3. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος με τις ακόλουθες αλληλουχίες: προς τα εμπρός, 5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3? αντίστροφη: 5-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3. Το 2

-ΔΔCt μέθοδος διεξήχθη για να υπολογίσει τη σχετική ποσότητα 91H σύγκριση με την έκφραση β-ακτίνης. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SYBR Προμίγματα Ex TagTM II (Takara, Κίνα) και ΑΒΙ 7500 Σύστημα (Applied Biosystems, USA).

Αντιγραφή ταυτότητας παραλλαγή αριθμό 91H

Ανάλυση της CNV για gDNA διεξήχθη επίσης με qRT-PCR που περιγράφεται παραπάνω μέθοδο. RNase Ρ χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Ο αριθμός αντιγράφων του 91H μετρήθηκε σύμφωνα με την εξίσωση 2 × 2

-ΔΔCT.

Η επιμόλυνση του siRNA

παρεμβολή RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συνθετικών siRNA δίπολα, όπως περιγράφεται από προηγούμενες μελέτες [ ,,,0],16], [17]. Δύο συνθετικά siRNA δίπολα (SI-91H: si91H1, 5′-GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 ‘και si91H2, 5′- UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT-3′) που αντιστοιχούν στις αλληλουχίες 91H RNA και ένας αρνητικός έλεγχος (SI-NC, 5’-CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT-3 ‘) επιμολύνθηκαν σε HCT-116 κυττάρων με 400 pmol αντιστοίχως με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) εις την πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από 48 ώρες, τα επίπεδα έκφρασης 91H εξετάστηκαν μέσω qRT-PCR.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες όπως περιγράφεται παραπάνω, που έχουν μολυνθεί HCT-116 κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για τη δοκιμασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (ΜΤΤ δοκιμασία) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα μολυσμένα κύτταρα (1 χ 10

4) απλώθηκαν σε επίπεδου πυθμένα πλάκες των 96 φρεατίων που έχει συμπληρωθεί με 100 μΙ ϋΜΕΜ ανά φρέαρ. Μετά από επώαση για 6, 24, 48, 72 και 96 ώρες αντίστοιχα, 10 μΐ ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, στη συνέχεια το μέσο απομακρύνθηκε μετά από 4 ώρες καλλιέργειας και ακολούθως συμπληρώνεται με 150 μΐ DMSO ανά φρέαρ. Χρωματομετρική ανάλυση διεξήχθη σε μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας σε μήκος κύματος 490 nm. Κάθε υποομάδα επαναλήφθηκε για πέντε φρεάτια.

Μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

Για δοκιμασία μετανάστευσης, μολυσμένα HCT-116 κύτταρα (1 χ 10

5 σε 200 μΐ DMEM χωρίς ορό) , ακριβώς όπως περιγράφηκε προηγουμένως, σπάρθηκαν μέσα στον άνω θάλαμο των πλακών transwell σε μορφή 24 φρεατίων με διαμέτρους 8 mm (Corning Costar, USA). 600 μΙ ϋΜΕΜ που περιέχει 5% FBS προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά από 24 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Υπόλοιπα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του διαπερατή μεμβράνη χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που μετανάστευσαν μέσω του άνω θαλάμου μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία πεδία κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο, και η μέση τιμή των πέντε πεδίων εκφράστηκε.

Για την ανίχνευση εισβολής, τα κορυφαία τμήματα καλύφθηκαν με υπόγειο μεμβράνης Matrigel (40 mg /ml, Becton-Dickinson, USA) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα μολυσμένα κύτταρα (3 χ 10

5) με DMEM ελεύθερο ορού προστέθηκαν στην κορυφαία θαλάμους, οι κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με DMEM που περιείχε 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που εισέβαλαν στην αντίστροφη πλευρά των κορυφαίων θαλάμων σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν, και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας ένα ελαφρύ μικροσκόπιο. Κάθε δοκιμασία εισβολή έγινε σε τρεις ή περισσότερες επαναλήψεις.

Ξυστό πληγή

δοκιμασία

πλάκες έξι φρεατίων επικαλυμμένα με μολυσμένα κύτταρα HCT-116. Τα τραύματα δημιουργήθηκαν στην συρρέοντα κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 10 μl σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ακολούθως ελεύθερα επιπλέοντα κύτταρα και τα θραύσματα απομακρύνθηκαν με τη χρήση PBS, και προστέθηκε FBS μέσο ελεύθερο. Στη συνέχεια παρατηρήσαμε την επούλωση των πληγών σε διαφορετικές χρονικές περιόδους και φωτογραφήθηκε εκπρόσωπος γραμμές ξύστε χρησιμοποιώντας το οπτικό μικροσκόπιο. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε εις τριπλούν.

Η απόπτωση ανάλυση

κυτταρικής απόπτωσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με Annexin V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, BD Bioscience, CA). HCT-116 κύτταρα μολύνθηκαν με SI-91H ή SI-NC σε πλάκα 6 φρεατίων. Η απόπτωση αναλύθηκε μετά τη μόλυνση 48 ώρες. Όλες οι δοκιμασίες απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η στατιστική ανάλυση

Βέλτιστη επίπεδα αποκοπής του 91H σε καρκινικούς /noncancerous υπολογίστηκαν με την εφαρμογή του λειτουργικού χαρακτηριστικού δέκτη ανάλυση καμπύλης (ROC) [18], [19]. Σύγκριση των συνεχών δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανεξάρτητη

t-test

, και κατηγορικά δεδομένα αναλύθηκαν με το τεστ chi-square. Εν τω μεταξύ, τα ποσοστά επιβίωσης υπολογίστηκαν με ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. Μια αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η επίδραση της έκφρασης 91H και κλινικοπαθολογική παραμέτρων στη συνολική επιβίωση (OS). Νομόγραμμα για το OS ιδρύθηκε με την εφαρμογή λογισμικού R. δείκτη αντιστοιχία Harrell του (c-index) χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η προγνωστική ακρίβεια του. Στατιστικά με

P

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Όλες αυτές οι στατιστικοί υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του IBM SPSS 20.0 λογισμικού (IBM, ΗΠΑ), R 3.0.3 λογισμικού (Ινστιτούτο Στατιστικής και Μαθηματικών, Βιέννη, Αυστρία), OriginLab 8.5.1 λογισμικού (OriginLab Corp, Northampton, USA) και GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, USA).

Αποτελέσματα

Συσχέτιση μεταξύ 91H σχετικής έκφρασης και κλινικοπαθολογική παράγοντες CRC

Το 91H επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν από qRT-PCR για 72 καρκινικούς και των παρακείμενων ιστών noncancerous από ασθενείς CRC. επίπεδα 91H σε καρκινικούς ιστούς ήταν προφανώς υψηλότερο από ό, τι εκείνα των noncancerous ιστούς (

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1). ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι τα βέλτιστα επίπεδα αποκοπής για έκφραση 91H ήταν 2,86-φορές για το OS σε καρκινικούς /noncancerous (Σχήμα 2). Στη συνέχεια, οι 72 ασθενείς με CRC διαιρέθηκαν σε μία ομάδα έκφραση υψηλού 91H (n = 42), ότι αναλογία έκφραση 91H ≥2.86 και μια ομάδα έκφραση χαμηλού 91H (n = 30), ότι αναλογία έκφραση 91H & lt? 2,86 (σχήμα 3), σύμφωνα με cut-off επίπεδο. Κλινικοπαθολογικοί παράγοντες συγκρίθηκαν μεταξύ δύο ομάδες έκφραση 91H (Πίνακας 1). έκφραση 91H συσχετίστηκε σημαντικά με μακρινή μετάσταση (

P

= 0,027). Ωστόσο, η έκφραση 91H ήταν δύσκολα σχετίζεται με το φύλο των ασθενών, την ηλικία, τη θέση του όγκου, το στάδιο TNM, Ν σταδίου ή βαθμού. Για να εκτιμηθεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης 91H και την πρόγνωση των ασθενών με CRC, ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier και log-rank τεστ πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μετεγχειρητική χρόνο επιβίωσης των ασθενών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση 91H είχε προφανώς χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με χαμηλή έκφραση 91H (

P

& lt? 0.001, Εικόνα 4).

Η

Η

Unvariate ανάλυση της συνολικής ανάλυση αποκάλυψε ότι 91H σχετική έκφραση, το στάδιο TNM, μακρινή μετάσταση ή βαθμό ήταν προγνωστικοί δείκτες (Πίνακας 2). Επιπλέον, 91H σχετική έκφραση και μακρινή μετάσταση ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί δείκτες για το συνολικό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με CRC (HR: 3,66,

P

= 0.001? HR: 8,97,

P

& lt? 0.001 ) αντίστοιχα από πολυπαραγοντική ανάλυση (Πίνακας 2). Επιπλέον, προγνωστικούς νομογράμματος με κλινικοπαθολογική παράγοντες και η έκφραση 91H καθιερώθηκε να προβλέψει την πιθανότητα ότι οι ασθενείς με CRC θα πεθάνει εντός 3 ετών από την αρχική επέμβαση του, υποθέτοντας ασθενείς δεν πεθαίνουν από άλλες αιτίες πρώτης (Σχήμα 5). Εν τω μεταξύ, προγνωστική ακρίβεια του νομογράφημα μετρήθηκε μέσω ενός δείκτη αντιστοιχίας (γ-index). Για CRC, νομογράφημα που περιέχουν 91H είχαν περισσότερο προγνωστική ακρίβεια από ότι χωρίς 91H (c-index: 0,90 έναντι 0,85 αντίστοιχα)

Η

μεταβολής αριθμού αντιγράφων του DNA (CNV) δεν είχε ανάμειξη στην ενημερωμένη. ρύθμιση της έκφρασης 91H

Για να καθοριστεί εάν το επίπεδο έκφρασης 91H σε CRC συνδεόταν με CNV, το πρότυπο έκφρασης του 91H μετρήθηκε με qRT-PCR, και περαιτέρω κατ ‘εκτίμηση της αντιστοιχίας μεταξύ του αριθμού αντιγράφων του DNA και 91H σχετικό επίπεδο έκφρασης 91H . Μόνο 2,8% (2/72) των ζευγών φυσιολογικών και καρκινικών ιστών με CNV έδειξε την υπερέκφραση του 91H. Ωστόσο, η παρεκκλίνουσα έκφραση του 91H ανιχνεύθηκε σε 95,8% (69/72) των ζευγών φυσιολογικών και καρκινικών ιστών χωρίς αριθμού αντιγράφων αλλοίωση (Εικόνα 6).

Α, ο 91H σχετική έκφραση σε συμφωνημένα καρκινικούς και μη καρκινικούς ιστούς μετρήθηκε με qRT-PCR. β-ακτίνη θεωρήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Β, η διακύμανση αριθμός αντιγράφων 91H σε καρκινικούς και μη καρκινικούς ιστούς μετρήθηκε επίσης με qRT-PCR. RNase Ρ χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς.

Η

91H προωθείται πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων in vitro CRC

Για την αξιολόγηση των βιολογικών λειτουργιών του 91H, 91H επίπεδα έκφρασης μετρήθηκαν σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών (FHC, HCT-8, ΗΤ-29, ΗΟΤ-116, και SW-620) με qRT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, η έκφραση 91H ανιχνεύθηκε τα υψηλότερα επίπεδα σε HCT-8, ΗΤ-29 και HCT-116 σε σύγκριση με FHC, εκτός από SW-620. Στη συνέχεια, HCT-116 κύτταρα επιμολύνθηκαν με SI-91H ή si-NC. Μετά την επιμόλυνση για 48 ώρες, 91H ήταν αποτελεσματικά σιγήσει σε HCT-116 κύτταρα (Σχήμα 8).

Η

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν 91H νοκ ντάουν επηρεάζονται κυτταρικού πολλαπλασιασμού με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα, σε σύγκριση με την HCT-116 κύτταρα μολυσμένα με si-NC, έδειξε ότι η διάδοση των HCT-116 κυττάρων με si-91H κατοικήθηκε σε 36,7% (

P

& gt? 0.05), 45,4% (

P

& lt? 0.05), 43,2% (

P

& lt? 0.05), 65,6% (

P

& lt? 0,01) και 65,3% (

P

& lt? 0.01) στις 6, 24, 48, 72 και 96 h, αντίστοιχα (Σχήμα 9). Επιπλέον, η επαγωγή της απόπτωσης μετά από 48 ώρες επεξεργασίας με SI-91H ή SI-NC μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. HCT-116 κύτταρα με 91H νοκ ντάουν δεν εμφανίζει προφανώς την απόπτωση σε σύγκριση με εκείνα του ελέγχου (Σχήμα 10).

Η

Στη συνέχεια, να έχουν πρόσβαση στα αποτελέσματα της καταστολής 91H για HCT-116 κύτταρα κινητικότητα, μια δοκιμασία μηδέν πληγή διεξήχθη για να μετρηθεί η επίδραση της 91H νοκ ντάουν στην κυτταρική κινητικότητα. καταστολή 91H οδήγησε σε εξασθένιση της κινητικότητας των HCT-116 κυττάρων. Ειδικότερα, σε σύγκριση με τα μολυσμένα κύτταρα με SI-NC, η ανάκτηση πληγή καθυστέρησε σημαντικά σε κύτταρα siRNA μολυσμένα (Σχήμα 11). Επιπλέον, αναλύσεις μετανάστευση και την εισβολή χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω πρόσβαση σε αυτήν την επίδραση του 91H νοκ ντάουν για τη μετανάστευση και τη διεισδυτικότητα των κυττάρων CRC. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η μετανάστευση και διεισδυτικότητα ήταν σημαντικά ανέστειλε σε μολυσμένα κύτταρα με SI-91H, σε σύγκριση με si-NC-μολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 12). Επιπλέον, HCT-116 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μειώθηκαν κατά 49.4% (Ρ & lt? 0,05) και 43,9% (Ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα, μετά την καταστολή 91H (Σχήμα 13). Τα ευρήματα έδειξαν ότι η αναστολή 91H μπορεί να συσχετίζεται στενά με τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυτταρικών σειρών CRC.

Η

Ο αριθμός των χωροκατακτητικών ή μετανάστευσαν κύτταρα για κάθε πειραματική ομάδα μετρήθηκε ως ο μέσος όρος 5 πέντε οπτικά πεδία κάτω από ένα μικροσκόπιο (*

P

& lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

Ως νέες μοριακές αστέρι για lncRNA, συσσωρεύοντας μελέτες έχουν. επικεντρώθηκε στον αντίκτυπο της lncRNA στην παθογένεση του καρκίνου, και θα μπορούσε να προσφέρει νέες γνώσεις για τη βιολογία αυτών των καρκίνων [20], [21], [22]. Παρά τη σημαντική πρόοδο των lncRNAs στην παθογένεση του καρκίνου, βιολογικών ρόλων των lncRNAs δεν είναι σαφές στην CRC. Για να εξερευνήσετε τη βιολογία των lncRNA στην CRC, η μελέτη αυτή διεξήχθη για να διερευνήσει αφενός τις βιολογικές τους ρόλους των 91H στην εξέλιξη CRC και να αξιολογήσει την επίδραση της 91H για κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την πρόγνωση.

Σε αυτή τη μελέτη, τα στοιχεία έδειξαν ότι επίπεδα έκφρασης 91H στο CRC ιστού ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες που αντιστοιχούν noncancerous ιστό. Το αποτέλεσμα ταυτίστηκε in vitro με κυτταρικές γραμμές CRC και φυσιολογική εντερική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή ανθρώπου (Σχήμα 7). Επιπλέον, η υπερέκφραση του 91H συνδέθηκε με μακρινή μετάσταση κλινικοπαθολογική παραγόντων (

P

& lt? 0,05). 91H ανιχνεύθηκε για να είναι σταθερή έκφραση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, και παρατηρήθηκε να είναι up-ρυθμίζονται σε ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο του μαστού [14]. Πιο σημαντικό, σε μυοβλάστες ποντικού, 91H προσδιορίστηκε να είναι εμπλέκονται στην συν-ρύθμιση των γονιδίων στον τόπο Η19 /IGF2 συμβάλλουν στην καρκινογένεση και της εξέλιξης του καρκίνου [16]. Ωστόσο, η έκφραση 91H δεν συνδέθηκε με μακρινή μετάσταση κλινικοπαθολογική παράγοντες οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (ESCC) [23]. Οι ασυνεπής συμπεράσματα για τη σύνδεση της έκφρασης 91H με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικούς τύπους ιστοπαθολογικές. Επιπλέον, με τη χρήση in vitro δεδομένα, δείξαμε ότι 91H knockdown ανέστειλε την κυτταρική κινητικότητα, μετανάστευση και διηθητικότητα των κυττάρων CRC. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 91H μπορεί να παίζει έναν πιθανό ρόλο στην προώθηση της μετάστασης CRC.

Επιπλέον, περιγράφεται πρώτα το αποδείξεις ότι τα επίπεδα έκφρασης υψηλά 91H σε ιστό όγκου σχετίζονταν με κακή πρόγνωση, και 91H σχετικά επίπεδα έκφρασης ήταν στενά αλληλένδετη με κακή κλινική έκβαση των ασθενών, που δείχνει την έκφραση του 91H θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα πολύτιμο ανεξάρτητη ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη για τα μεγάλα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, εκτός από την κατάσταση μετάσταση. Στην πραγματικότητα, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι lncRNAs θεωρήθηκαν επίσης ως μοριακοί βιοδείκτες σε καρκίνους. PVT-1, παράγοντας αντιαποπτωτικών δραστηριότητα στην CRC, ταυτοποιήθηκε ως νέο προγνωστικός δείκτης για ασθενείς CRC [12], [24]. Εν τω μεταξύ, Hotair συμμετείχε στην εξέλιξη του όγκου και θεωρήθηκε ως νέο επιγενετικές μοριακές βιοδείκτη σε ασθενείς με ESCC ή CRC [18], [25], [26]. Ως εκ τούτου, θεωρούμε ότι 91H μπορεί να είναι ένα νέο δυναμικό προγνωστικός δείκτης σε ασθενείς με CRC.

Γενικά, νομογράμματα έχουν αναπτυχθεί στο μεγαλύτερο μέρος της τύπους καρκίνου [27], [28], [29], τα οποία δημιουργούν ένα απλή γραφική αναπαράσταση ενός στατιστικού μοντέλου πρόβλεψης που παράγει μια αριθμητική πιθανότητα μιας κλινικό συμβάν [30]. Επιπλέον, η ικανότητα του να παράγει νομογράμματα εξατομικευμένη προβλέψεις επιτρέπει τη χρήση τους για τον εντοπισμό και τη διαστρωμάτωση των ασθενών για συμμετοχή σε κλινικές δοκιμές [30]. Σε αυτή τη μελέτη, με βάση την σχετική έκφραση 91H στον όγκο και κλινικοπαθολογικών παράγοντες, ένας πρόβλεψης νομογράμματος διεξήχθη για να προβλέψει την πιθανότητα ότι μετεγχειρητικούς ασθενείς θα πεθάνουν από CRC εντός 3 ετών, με εξαίρεση πεθαίνουν από μια άλλη αιτία πρώτα. Εν τω μεταξύ, νομογράφημα που περιέχουν 91H είχαν περισσότερο προγνωστική ακρίβεια από ότι χωρίς 91H (c-index: 0,90 έναντι 0,85 αντίστοιχα), υποδεικνύοντας ότι η έκφραση 91H στον όγκο επηρεάζεται προφανώς νομογράφημα προγνωστική ακρίβεια. Πιο σημαντικό, το νομογράφημα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί από τους γιατρούς για τον εντοπισμό ασθενών με υπολογισμό πιθανοτήτων τους μετεγχειρητικούς ασθενείς με CRC, και να προσφέρουν κατάλληλη θεραπεία και η βέλτιστη στρατηγική. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς με υπερέκφραση του 91H θα πρέπει να παρακολουθούνται στενά και να λαμβάνονται τα κατάλληλα επικουρική θεραπεία μετά CRC εκτομή.

Η υπερέκφραση του 91H συμμετείχε στην εξέλιξη του καρκίνου [14], [23]. Ωστόσο, λόγος για τον οποίο 91H ήταν απορυθμίζεται σε όγκο παρέμεινε άγνωστη. παραλλαγή αριθμός αντιγραφής ήταν μια σημαντική μορφή γονιδιωματικής δομής αλλοίωση, συμβάλλοντας σε ορισμένες γενετικές και αναπτυξιακές ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού [31], [32]. Η19 /IGF2 με παραλλαγές αριθμού αντιγράφων, που βρίσκεται στην αποτυπώνεται περιοχή 11p15, αναφέρθηκε στο Beckwith-Wiedemann και Silver-Russell σύνδρομα [33], [34]. Εν τω μεταξύ, το γονίδιο 91H, Η19 αντιπληροφοριακό RNA, επίσης βρίσκεται στο 11ρ15.5 χρωμόσωμα [14]. Ως εκ τούτου, θα μπορούσε να σκεφτεί ότι η υπερέκφραση του 91H σε CRC μπορεί να σχετίζεται με CNV. Στην παρούσα μελέτη, CNV των 91H παρατηρήθηκε σε δύο ασθενείς με υψηλή έκφραση 91H, και σημειώθηκαν αριθμού αντιγράφων διαγραφή 91H σε έναν ασθενή με CRC (Σχήμα 2). Αν και το αποτέλεσμα δεν έδειξε στατιστικά σημαντική, παρείχε μια πιθανή νέα στρατηγική στη διερεύνηση 91H μεσολάβηση ρύθμιση του γονιδίου για τον καρκίνο. Λόγω του περιορισμένου μεγέθους των περιπτώσεων που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη, η περαιτέρω μελέτη θα πρέπει στο μέλλον να επεξηγήσουν την πιθανή σχέση.

Ορισμένοι από τους περιορισμούς της μελέτης αυτής θα πρέπει να αναγνωριστεί. Πρώτον, ο αριθμός των ασθενών με CRC δεν ήταν μεγάλη. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να εκτελείται για την επαλήθευση της σύνδεσης μεταξύ της έκφρασης 91H και CRC, και για να καθοριστεί εάν η έκφραση 91H συσχετίστηκε με CNV σε ασθενείς με CRC. Δεύτερον, οι περίοδοι παρακολούθησης δεν ήταν αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα (εύρος 2-36 μήνες), η οποία δεν προβλέψει με ακρίβεια τη συνολική επιβίωση των ασθενών με CRC. Αναλήφθηκαν περαιτέρω έρευνες για να επικυρώσει αυτό το αποτέλεσμα ύστερα από παρατεταμένη παρακολούθηση της κοόρτης ασθενών ή άλλη ομάδα ασθενών με CRC. Τέλος, όλα τα in vitro αναλύσεις για τις βιολογικές λειτουργίες διεξήχθησαν σε ένα μόνο κυτταρική γραμμή. Παρά τους περιορισμούς έδειξαν σε αυτή τη μελέτη, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζονται τη σημασία του ρόλου των 91H σε διάφορα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου προώθηση μετάσταση του CRC.

Εν περιλήψει, η έκφραση 91H ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε δείγματα ιστών CRC και κυτταρικές γραμμές. Η αυξημένη έκφραση του 91H συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση και μακρινή μετάσταση. Επιπλέον, 91H CNV εξηγηθεί μόνο ένα μικρό ποσοστό των παρατηρούμενων υπερέκφραση. Αθροιστικά, αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι 91H έπαιξε ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο της CRC. Με την κατανόηση της ακριβούς ρόλου της 91H στην παθογένεση του CRC, μία νέα και πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική θα πρέπει να αναπτυχθεί για περαιτέρω επεξεργασία CRC, με βάση την ρύθμιση προς τα κάτω των εν λόγω ογκογόνο lncRNAs.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1 . .

Η σχέση μεταξύ μεταβολής αριθμού αντιγράφων και της έκφρασης 91H σε ιστούς όγκων και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών

doi: 10.1371 /journal.pone.0103022.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

91H σχετική έκφραση ποσοτικά σε τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC και ένα φυσιολογικό ανθρώπινο εντερικά επιθηλιακά κυτταρική σειρά από qRT-PCR (μέση τιμή ± SEM? **

P

& lt? 0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

HCT-116 κύτταρα επιμολυσμένα με si-NC και si-91H. Μετά από 48 ώρες, η έκφραση 91H ανεστάλη αποτελεσματικά με qRT-PCR σε σύγκριση με το si-NC (μέση τιμή ± SEM? **

P

& lt? 0,01)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022. S003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

91H προώθησε τον πολλαπλασιασμό των HCT-116 κύτταρα μέσω δοκιμασίας ΜΤΤ (μέσος όρος ± SEM?

P

& lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s004

( TIF)

Εικόνα S5.

απόπτωση ερευνήθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ανάλυση σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση με si-91H ή Si-NC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6.

Η δοκιμασία μηδέν τραύμα αξιολογήθηκε με κυτταρική κινητικότητα. Το νοκ ντάουν του 91H ανέστειλε την κινητικότητα των κυττάρων ΗΟΤ-116

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s006

(ΔΕΘ)

Εικόνα S7.

91H προωθείται εισβολή και τη μετανάστευση των HCT-116 κυττάρων με βάση φρεατίων δοκιμασία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s007

(ΔΕΘ)

Εικόνα S8.

ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν ή μετανάστευσαν διαμέσου του θαλάμου αξιολογήθηκε σε 5 πεδία για κάθε πειραματική ομάδα και ο μέσος όρος. Ο αριθμός των χωροκατακτητικών ή μετανάστευσαν κύτταρα για κάθε πειραματική ομάδα μετρήθηκε ως ο μέσος όρος των 5 πέντε οπτικά πεδία κάτω από ένα μικροσκόπιο (*

P

& lt? 0,05)

doi: 10.1371 /journal.pone.. 0103022.s008

(ΔΕΘ)

πίνακα S1. πληροφορίες

Ασθενών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s009

(DOCX)

Πίνακας S2.

Τα αποτελέσματα της qRT-PCR για κάθε δείγμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0103022.s010

(XLSX)