Αφηρημένο

Σημαντική πρόοδος έχει επιτευχθεί προς την αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού? ακόμα, πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τις συναφείς κυτταρική βιοφυσική χαρακτηριστικά. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιούμε χρονικά καταπίπτουν συνεστιακή μικροσκοπία να διερευνήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ κυτταρικής κινητικότητας, τρισδιάστατη (3D) μήτρα δυσκαμψία, αρχιτεκτονική μήτρας, και το δυναμικό μετασχηματισμού σε ένα μαστικό επιθηλιακό κύτταρο (MEC) σειρά εξέλιξης του καρκίνου. Χρησιμοποιούμε ένα καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου του μαστού, όπου ανθρώπινης προέλευσης MECs ΜΟΡ10Α υπερεκφράζουν είτε ErbB2, 14-3-3ζ, ή και τα δύο ErbB2 και 14-3-3ζ, με κενό φορέα ως μάρτυρα. προσδιορισμοί κυττάρων κινητικότητα έδειξαν ότι MECs υπερεκφράζουν ErbB2 μόνος παρουσίασαν κυρίως υψηλά μετανάστευση ταχύτητες όταν καλλιεργούνται κορυφή δύο διαστάσεων (2D) μήτρες, ενώ η υπερέκφραση του 14-3-3ζ μόνη πλέον καταστέλλεται μετανάστευση κορυφή 2D μήτρες (σε σύγκριση με μη-μετασχηματισμένα MECs). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι η ταυτόχρονη υπερέκφραση του 14-3-3ζ και ErbB2 πρωτεΐνες διευκολύνει μεταναστευτικών ικανότητα των κυττάρων σε 3D μήτρες, όπως αντανακλάται στην ταχύτητα μετανάστευση των κυττάρων. Επιπλέον, 3D μήτρες επαρκή ακαμψία μπορεί να παρεμποδίσει σημαντικά τη μεταναστευτική ικανότητα των μερικώς μετασχηματισμένα κύτταρα, αλλά αυξήθηκε 3D μητρώο δυσκαμψίας έχει μικρότερη επίδραση στην επιθετική μεταναστευτική συμπεριφορά επέδειξαν με την πλήρη μετασχηματισμένα κύτταρα που συν-υπερεκφράζουν τόσο ErbB2 και 14-3-3ζ. Τέλος, η μελέτη αυτή δείχνει ότι για MECs διαθέτουν μερική ή πλήρες δυναμικό μετασχηματισμού, εκείνοι που υπερεκφράζουν ErbB2 δείχνουν μόνο του την μεγαλύτερη ευαισθησία της ταχύτητας κυτταρικής μετανάστευσης στην μήτρα αρχιτεκτονική, ενώ εκείνοι που υπερεκφράζουν 14-3-3ζ και μόνο έκθεμα το λιγότερο ευαισθησία στην αρχιτεκτονική της μήτρας. Λαμβάνοντας υπόψη την τρέχουσα γνώση των mechanobiology καρκίνο του μαστού, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η συνολική κυτταρική κινητικότητα διέπεται από μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ μηχανική των μητρών και τις δυνατότητες μετασχηματισμού

Παράθεση:. Baker EL, Srivastava J, Yu D, Bonnecaze RT, Zaman MH (2011) Cancer Cell μετανάστευση: Ολοκληρωμένη Ρόλοι της Μηχανικής Matrix και Μετασχηματισμός δυναμικό. PLoS ONE 6 (5): e20355. doi: 10.1371 /journal.pone.0020355

Επιμέλεια: Donald Gullberg, Πανεπιστήμιο του Μπέργκεν, Νορβηγία

Ελήφθη: 9 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 19η Απριλίου 2011? Δημοσιεύθηκε: May 27, 2011

Copyright: © 2011 Baker et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο κατέστη δυνατή από το Ηνωμένο Negro Ταμείο College (UNCF) /Merck Μεταπτυχιακό Επιστήμης διατριβή της έρευνας Fellowship να ELB, η Φιλανθρωπική Εκπαιδευτικός Οργανισμός (ΠΕΟ) Μελετητής Βραβείο για ELB, ο Σπόρος Grant Charles Tate Ίδρυμα UT σε MHz και DY, και Εθνικά Ινστιτούτα χρηματοδότησης για την υγεία (1R01CA132633) για να MHZ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συντριπτική πλειοψηφία των θανάτων από καρκίνο του μαστού που σχετίζονται προκύπτουν από μεταστατικούς όγκους? Έτσι, η κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του κυψελωτού μικροπεριβάλλον και ο καρκίνος του μαστού μεταστατικό δυναμικό είναι εξαιρετικά σημαντικό για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών για την ασθένεια αυτή. Σημαντική πρόοδος έχει επιτευχθεί προς την αποκάλυψη των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού [1], [2]? Ωστόσο, ποσοτικός χαρακτηρισμός των συνδεδεμένων κυτταρικών βιοφυσικών χαρακτηριστικών παραμένει ατελής. Ουσιαστικά, η μετάσταση προχωρά μέσω της μετανάστευσης και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων μέσω της μεταβλητής εξωκυττάρια μήτρα (ECM) περιβάλλοντα, και μελέτες έχουν δείξει ότι η κυτταρική μετανάστευση είναι πράγματι ευαίσθητο σε μήτρα μηχανικές ιδιότητες [3], [4], [5]. Ωστόσο, οι σχέσεις μεταξύ των συστημάτων επίπεδο μηχανική μήτρας, την εξέλιξη της νόσου, και την κυτταρική κινητικότητα σε καρκίνο μαστού δεν είναι καλά κατανοητοί, ειδικά σε σχέση με φυσιολογικώς σχετικό τρισδιάστατη (3D) περιβάλλοντα μήτρα.

Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων δεκαετιών , έχουν βασικά βιοδείκτες του καρκίνου του μαστού έχουν εντοπιστεί και να συνδέεται με συγκεκριμένα στάδια της νόσου. Δύο αξιοσημείωτα παράγοντες είναι το ErbB2 (HER2 /neu) και 14-3-3ζ πρωτεΐνες, και οι δύο των οποίων η υπερέκφραση έχει συσχετιστεί με φτωχή κλινική πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού [6], [7]. ErbB2 και 14-3-3ζ έχουν παρομοίως αποδειχθεί ότι επάγουν κυτταρική χαρακτηριστικά in vitro που είναι συγκρίσιμες με την κλινική παρουσιάσεις. ErbB2 είναι ένας υποδοχέας διαμεμβράνης κινάσης τυροσίνης της οικογένειας υποδοχέων επιδερμικού αυξητικού παράγοντα των πρωτεϊνών και εμπλέκεται σε πολλαπλές οδούς σηματοδότησης που ρυθμίζουν την κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση, την απόπτωση, και άλλες κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες [8]. Αναλόγως, MECs που κατασκευάζονται για να υπερεκφράζουν ErbB2 έχουν δειχθεί ότι εμφανίζουν υπερπλασία και πλήρωση του αυλού σε 3D καλλιέργεια, αν και όχι πλήρη μεταμόρφωση και εισβολή [9], [10]. ErbB2 είναι αναμφίβολα ένα από τα πιο μελετημένα μόρια στον τομέα του καρκίνου του μαστού [11], και είναι μια κρίσιμη στόχο για την ανάπτυξη φαρμάκων. Στην πραγματικότητα, δεδομένης της ικανότητάς του να προσδίδουν ανθεκτικότητα σε ορισμένα είδη θεραπείας του καρκίνου και προγνωστική αξία του, τον καθορισμό του καθεστώτος του όσον αφορά την νέα κρούσματα καρκίνου του μαστού έχει γίνει καθιερωμένη πρακτική [12]. Εντυπωσιακά, η πρωτεΐνη ErbB2 υπερεκφράζεται σε πάνω από 50% του σταδίου μη επεμβατική καρκίνους του μαστού νωρίς (πορογενές καρκίνωμα in situ, DCIS) [13]? Ωστόσο, είναι υπερεκφράζεται σε μόνο περίπου 25% των μεταγενέστερο στάδιο επεμβατική και μεταστατικών καρκίνων του μαστού [7]. Επεξήγηση αυτών των φαινομενικά αντιφατική ErbB2 προφίλ έκφρασης έχει ξεφύγει από τους ερευνητές μέχρι σήμερα? Ωστόσο, τα αποτελέσματα που αναφέρονται εδώ υποδεικνύουν ότι το φαινόμενο αυτό μπορεί να εξηγηθεί εν μέρει από ένα μαστικό επιθηλιακό κύτταρο (MEC) ευαισθησία σε αρχιτεκτονική μήτρας.

Η 14-3-3ζ πρωτεΐνη ανήκει σε μια ευρύτερη οικογένεια των επτά 14- 3-3 ρυθμιστικές πρωτεΐνες που εκφράζονται ευρέως και εμπλέκονται σε μία ποικιλία κυτταρικών ομοιοστατική διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της γενικής κυτταρικής επιβίωσης /αντι-αποπτωτικό μηχανισμό [14]. Έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση του 14-3-3ζ προσδίδει MECs σε 3D καλλιέργεια με σημαντική αντοχή σε anoikis [15] (ένας τύπος απόπτωσης που εμφανίζεται όταν τα επιθηλιακά κύτταρα αποσπώνται από εξωκυτταρικό συνδετήρες), η οποία προωθεί την πλήρωση του αυλού και κινεί MECs προς μετασχηματισμός [16]. Η υπερέκφραση του 14-3-3ζ έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει αξιοσημείωτο μορφολογικά χαρακτηριστικά του επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης, οι οποίες είναι χαρακτηριστικές της εξέλιξης προς μια επεμβατική φαινότυπο [9], [15], [17]. Επιπλέον, οι αναλύσεις των βιοψιών ασθενών δείχνουν ότι πάνω από το 40% των μεταστατικών καρκίνων του μαστού υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη αυτή [6]. Παρά τις ικανότητές τους για να παραχωρήσει τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα με ογκογόνο χαρακτηριστικά, η υπερέκφραση του ούτε ErbB2 ούτε 14-3-3ζ και μόνο αρκεί για να προσδώσει μια πλήρη μεταμόρφωση in vitro. Ωστόσο, η συνεργατική υπερέκφραση τους έχει αποδειχθεί ότι προάγει την εξέλιξη από μη διηθητικό καρκίνωμα σε διηθητικό καρκίνο in vitro και συνδέεται επίσης με την εξέλιξη του DCIS σε διηθητικό και μεταστατικό καρκίνο του μαστού σε ασθενείς [9].

δόθηκε προηγουμένως καθοριστεί συσχετίσεις μεταξύ βιοδείκτες του καρκίνου του μαστού και μεταστατική εξέλιξη, καθώς και την τρέχουσα γνώση της κινητικότητας των κυττάρων και κυττάρου-μήτρας υπόστρωμα-εξαρτώμενη, τα ακόλουθα θεμελιώδη ερωτήματα παραμένουν αναπάντητα για μεμονωμένες MECs σε σχέση με μηχανική μήτρα: (1) είναι MEC κινητικότητα αποκρίνεται σε 3D μητρώο δυσκαμψίας; (2) Αυτή είναι η ανταπόκριση που σχετίζονται με την μετατροπή δυνητικών; Και (3), υπάρχει μια σχέση μεταξύ κυτταρική κινητικότητα και το δυναμικό μετασχηματισμού, δίνεται ένα αποφασισμένο αρχιτεκτονική μήτρας; Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ποσοτικά διερευνήθηκε σε αυτές τις ερωτήσεις με την χρησιμοποίηση χρόνου καταπίπτουν συνεστιακή μικροσκοπία να διερευνήσει την επίδραση της δυσκαμψίας της μήτρας και της αρχιτεκτονικής στην ταχύτητα μετανάστευση και την επιμονή των επιμέρους MECs που καλλιεργούνται κορυφή 2D μήτρες και εκείνων που είναι ενσωματωμένα εντός 3D μήτρες των διαφορετικών ελαστικών συντελεστές. Εξετάσαμε ανθρώπινης προέλευσης MECs ποικίλων μετασχηματισμού δυνατότητας σε σχέση με μήτρες διαμορφώνονται από φυσικό κολλαγόνο τύπου Ι, η οποία είναι το κύριο δομικό συστατικό του μαστικού στρώματος. Οι μελέτες μας δώσει νέες ιδέες σε mechanobiology καρκίνου του μαστού, αποδεικνύοντας ότι η ακαμψία της μήτρας και ζευγάρι αρχιτεκτονική με τη μετατροπή δυνατότητα να ρυθμίζουν τα μεταναστευτικά δυνατότητες της MECs.

Αποτελέσματα

Για να διερευνήσει τις σχέσεις μεταξύ καρκίνου του μαστού μετασχηματισμό δυναμικού και κυτταρική κινητικότητα σε σχέση με την μηχανική μήτρα, αναλύσαμε ένα καλά χαρακτηρισμένο σειρά εξέλιξης του καρκίνου καταρτισθεί από το μη-μετασχηματισμένο, προερχόμενα από άνθρωπο ΜΟΡ10Α κυτταρική γραμμή. Εξετάσαμε τέσσερις sublines ΜΟΡ10Α, της οποίας η έκταση της μετατροπής δυνητικών χαρακτηρίζεται σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά της ανάπτυξής τους και μορφολογικά χαρακτηριστικά, όταν σχηματίζουν κυψελωτά δομών σε 3D πολιτισμού [9]. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [17], οι υποσειρές (Εικ. 1

A

) αποτελείτο από [1] 10A.vec-μη μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή ελέγχου, [2] 10A.ErbB2-a υπερπλαστική, απόπτωση ανθεκτικά μερικώς μετασχηματισμένη κυτταρική σειρά που υπερεκφράζει ErbB2, [3] 10A.14-3-3ζ-a αποπολωμένο, απόπτωση ανθεκτικά, και μορφολογικά ανώμαλα μερικώς μετασχηματισμένη κυτταρική σειρά που υπερεκφράζει 14-3-3ζ, και [4] 10A.ErbB2.ζ-επεμβατική, πλήρως μετασχηματισμένη κυτταρική γραμμή που overepxresses τόσο ErbB2 και 14-3-3ζ.

(

Α

) πορογενές /ενιαίου λοβού απεικόνιση της διατομής του ΜΟΡ10Α μαστού καρκίνο σειρά εξέλιξης: 10A.vec (μη-μετασχηματισμένα), 10A.ErbB2 (μερικώς μεταμορφώνεται), 10A.14-3-3ζ (μερικώς μεταμορφώνεται), και 10A.ErbB2.ζ (μεταμορφωθεί πλήρως). (

Β

) Μέση ταχύτητα μετανάστευσης των κυττάρων μάλλον, διέπεται από μια ισορροπία των βιοφυσικών χαρακτηριστικών εγγενούς κελί μαζί με τους μηχανικούς της μήτρας. Η ελαφρά αύξηση της λεπτής, που μοιάζει με ράβδο επεκτάσεις παρουσιάζεται από 10A.ErbB2 κύτταρα σε πιο σκληρή μήτρες (Εικ. 4), αν και λεπτή, μπορεί να φέρει ένωση με την ικανότητα ανίχνευσης υψηλή ακαμψία που έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν αυτού υπογραμμή [17]. Ωστόσο, αν και μορφολογικά χαρακτηριστικά ενός δεδομένου υποσειρά ήταν παρόμοιες σε 3D μήτρες διαφορετικής ακαμψίας (Σχ. 4), τα προφίλ της ταχύτητας μετανάστευσης του όλου συστήματος παρουσιάζουν διαφορετικά πρότυπα σε σχέση με την μήτρα ακαμψία (Εικ. 2

B

και

C

και Σχ. 3). Και στις δύο περιβάλλοντα μήτρα, μη μετασχηματισμένα MECs μετανάστευσε πιο αργά από πλήρως μεταμορφωθεί MECs, που μετανάστευσαν με τις ταχύτερα ταχύτητες. Ωστόσο, στα πιο σκληρή μήτρες (391 Ρα), μερικώς μετασχηματισμένα κύτταρα (10A.ErbB2 και 10A.14-3-3ζ) μετανάστευσε σημαντικά πιο αργή από μη μετασχηματισμένα κύτταρα. Αυξημένη ακαμψία μήτρα οδήγησε σε μειωμένη ικανότητα των μεταναστευτικών για πλήρως μετασχηματισμένα κύτταρα, αλλά αυτό το αποτέλεσμα ήταν ακόμη πιο έντονη για μερικώς μετασχηματισμένα κύτταρα (Εικ. 2

D

). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι υπάρχουν επαρκή πυκνότητα εξαρτώμενη 3D ακαμψία μήτρα μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην παρεμπόδιση σημαντικά τη μεταναστευτική ικανότητα μερικώς μετασχηματισμένα κύτταρα? Ωστόσο, αυτή η αύξηση σε 3D δυσκαμψίας μήτρα μπορεί να μην είναι αρκετό για να ξεπεραστεί η επιθετική συμπεριφορά που παρουσιάζεται από πλήρως επεμβατική κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από τη μέτρια μόνο μείωση της ταχύτητας μετανάστευσης των κυττάρων 10A.ErbB2.ζ (Εικ. 2

D

). Τα αποτελέσματα από την προηγούμενη μας μελέτη αυτών sublines έδειξε ότι στις πιο άκαμπτο μήτρες, τα κύτταρα 10A.ErbB2 εμφανίζουν την υψηλότερη ενδοκυτταρική ακαμψία, ενώ πλήρως μετασχηματισμένα κύτταρα 10A.ErbB2.ζ εμφανίζουν μια μέτρια ακαμψία, και τα κύτταρα 10A.14-3-3ζ εμφανίζουν μια σχετικά χαμηλή ακαμψία [17]. Συνολικά, λαμβάνοντας υπόψη τα τρέχοντα δεδομένα κινητικότητα σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των προηγούμενων ερευνών μας δείχνουν ότι MEC μετανάστευσης σε 3D περιβάλλοντα προχωρά σε μια βέλτιστη ισορροπία μεταξύ των προφίλ γενετικού μετασχηματισμού, ενδοκυτταρική δυσκαμψία, συμφέρουσα μορφολογικά χαρακτηριστικά, και την ακαμψία της μήτρας. Έτσι, η αύξηση στο κελί μεταναστευτικών ταχύτητα που μπορεί διαφορετικά να προκύψουν από τη μερική ή πλήρη μεταμόρφωση μπορεί να μετριαστεί εν μέρει από την πυκνότητα που εξαρτάται από την ακαμψία της μήτρας.

Η τελική ανάλυση αυτής της μελέτης (Εικ. 2

F

) παρουσιάζει μια πολύ προκλητική αποτέλεσμα, δεδομένου ότι το ογκογονίδιο ErbB2 ανιχνεύεται με χαμηλότερη συχνότητα σε επεμβατικές και μεταστατικούς καρκίνους του μαστού από ό, τι είναι σε καρκίνους του μαστού πρώιμο στάδιο. Στην πραγματικότητα, ο επιπολασμός της υπερέκφραση ErbB2 στην επεμβατική και μεταστατικό καρκίνο του μαστού είναι μόνο

μισό

ότι πρόωρης καρκίνων σταδίου [9], η οποία έχει ένα περίπλοκο φαινόμενο. Τα αποτελέσματα από προσδιορισμούς κινητικότητα μας υποδηλώνουν ότι μια μετατόπιση στην αρχιτεκτονική μήτρα μπορεί να σχετίζεται με αυτή τη συμπεριφορά. Όταν μετάβαση MECs από ένα μη-διηθητικού καρκίνου πρώιμο στάδιο σε μια επεμβατική και έπειτα μεταστατικό καρκίνο, μεταναστεύουν από την κορυφή ενός επιφάνεια της βασικής μεμβράνης 2D μέσα σε ένα περιβάλλοντα 3D στρώμα και έτσι βιώσουν μια μετατόπιση στην αρχιτεκτονική μήτρα (σχ. 1

A

). Σε αυτή τη μελέτη, η κινητικότητα των κυττάρων 10A.ErbB2 δείχνει την μεγαλύτερη ευαισθησία σε μια μετατόπιση στην αρχιτεκτονική μήτρας, σε σύγκριση με τα άλλα sublines που διαθέτουν μερική ή πλήρες δυναμικό μετασχηματισμού (Σχ. 2

F

). Προκύπτει ότι τα κύτταρα που εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη στρωματικά μεταναστευτική ικανότητα μπορεί να είναι λιγότερο πιθανό να εισβάλει εντελώς τοπικό όριά τους και την περαιτέρω διασχίζουν τη γύρω στρώμα αργότερα εκδηλώνεται ως μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η υπερέκφραση του 14-3-3ζ σημαντικά κατέστειλε μετανάστευση 2D (Εικ. 1

B

), ενώ συνεργικά ενισχύοντας 3D μετανάστευση όταν ErbB2 επίσης υπερεκφράστηκε (Εικ. 2

B

και

C

). Έτσι, η κινητικότητα των κυττάρων που υπερεκφράζουν 14-3-3ζ μόνος εμφάνισαν την ελάχιστη ευαισθησία σε αρχιτεκτονική μήτρας, σε σύγκριση με 10A.ErbB2 και 10Α. κύτταρα ErbB2.ζ (Εικ. 2

F

).

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με την κινητικότητα του καρκίνου του μαστού, αποδεικνύοντας ότι η μετατροπή δυνητικών ζευγάρια με ακαμψία της μήτρας και την αρχιτεκτονική για να επηρεάσει το ταχύτητα μετανάστευσης και την επιμονή της MECs. Πολυάριθμες προκαταρκτικές έρευνες που έχουν συμβάλει σημαντικά στην παρούσα κατανόηση εξετάζοντας ErbB2 και 14-3-3ζ μεσολάβηση επιπτώσεις στην ενδοκυτταρική δυσκαμψία [17], MEC κινητικότητα σε διαλυτές χημικές κλίσεις [20], η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε σχέση με τη διαθεσιμότητα συνδέτη [5] , και την κινητικότητα που προκαλείται μήτρα αναδιαμόρφωση [28]. Με απασχολεί χρόνου έληξαν απεικόνισης, έχουμε προσθέσει σε αυτή τη γνώση με απευθείας μέτρηση της ταχύτητας μετανάστευσης MECs τόσο καλλιεργούνται στην κορυφή 2D πίνακες και τα ενσωματωμένα μέσα σε 3D πίνακες. Οι σχέσεις μεταξύ του καρκίνου του μαστού κυτταρική κινητικότητα και υποστρώματος χαρακτηριστικά είναι περίπλοκη? περαιτέρω διευκρινίσεις σχετικά με αυτές τις συνδέσεις ενδέχεται να προκύψουν από πρόσθετες μελλοντικές μελέτες που εξετάζουν τις επιπτώσεις της δυσκαμψίας 2D και πρωτεΐνες μήτρας Σύνταγμα για την κινητικότητα των sublines εξετάζονται εδώ. Μια σαφέστερη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων MEC-μήτρα κρατά ευρεία υπόσχεση ότι μπορεί τελικά να κατευθύνουν την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών και του καρκίνου εστιασμένη μεταγραφική έρευνα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

δοκιμασίες Κινητικότητα διεξήχθησαν σε σταθερές υποσειρές που καθορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9] από το μη-καρκινικές, προερχόμενα από άνθρωπο γραμμή ΜΟΡ10Α MEC (που παρέχεται από τον Dr. Robert Πόλυ του Ινστιτούτου Καρκίνου Karmonos, Detroit, ΜΙ). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε μονοστρωματική καλλιέργεια 2D σε μέσο DMEM /F12 ανάπτυξη [29] εντός ενός υγραινόμενου επωαστήρα στους 37 ° C, 5% CO

2 μέχρι τη στιγμή της πειραματισμό.

παρασκεύασμα μήτρας κολλαγόνου και χαρακτηρισμός

Δύο-διαστάσεων μήτρες δημιουργήθηκαν με αραίωση υψηλής συγκέντρωσης κολλαγόνου τύπου 1 έως 2 mg /mL χρησιμοποιώντας 20 μL του 2,0 μm καρβοξυλιωμένα, κίτρινο-πράσινο φθορίζοντα σφαιρίδια πολυστερίνης ιχνηθέτη αιθανόλη-διαπίδυση (Molecular Probes, Carlsbad, CA) (περίπου 2% στερεά) και ένα υπόλοιπο του 0.01 Μ HCl? 1,5 ml του διαλύματος στη συνέχεια εναποτίθενται μέσα στο φρεάτιο ενός γυάλινου πυθμένα πιάτο 35 mm και αφέθηκαν να επωαστούν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από αυτή την περίοδο, το διάλυμα αναρροφήθηκε, αφήνοντας μόνο τη χάντρα-εμποτισμένου παλτό κολλαγόνου που είχαν προσκολληθεί στο γυάλινο πάτο (βλέπε Εικ. S1

A

). Πιάτα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποθηκεύτηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 45 λεπτά μέχρι να επισημανθεί δια φθορισμού κύτταρα εναποτέθηκαν μέσα στην κάψα.

Τρισδιάστατο μήτρες συνταγοποιήθηκαν από υψηλή συγκέντρωση Type Ι κολλαγόνο (BD Biosciences, San Jose, CA), το οποίο αραιώθηκε σε δύο συγκεντρώσεις 2 και 4 mg /mL. Ίσα μέρη κολλαγόνο και διάλυμα εξουδετέρωσης (100 mM Hepes σε 2Χ PBS σε ρΗ 7,3) αναμίχθηκαν με 20 μL του εναιωρήματος σφαιριδίων και ισορροπίας των 5 × 10

5 σημασμένα με φθορισμό κύτταρα αιωρούνται σε μέσο ανάπτυξης για να επιτευχθεί η τελική συγκέντρωση [ ,,,0],30] (βλ. Σχήμα S1

Β

). Κάθε διάλυμα μήτρας (1 mL) στη συνέχεια εναποτίθεται σε όλη την επιφάνεια ενός γυάλινου 35 mm κάτω πιάτο (MatTek, Ashland, ΜΑ). διαλύματα Matrix αφέθηκαν να πήξει για 90 λεπτά στους 37 ° C, 5% CO

2, κατά την οποία 1,5 ml μέσων ανάπτυξης αποτέθηκαν πάνω στα 3D μήτρες για την παροχή κυττάρων με επαρκή θρεπτικά συστατικά κατά τη διάρκεια μιας μεταγενέστερης περιόδου επώασης 4,5 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2. Matrix ακαμψία μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κώνου και rheometry πλάκα και να ποσοτικοποιηθεί από την άποψη του χύδην διάτμησης μέτρο ελαστικότητας του πήγματος κολλαγόνου

G

‘

γ

, η οποία αναφέρεται ως 104 και 391 Ρα για 3D τύπου Ι κολλαγόνο πηκτές συγκέντρωσης 2 και 4 mg /mL, αντίστοιχα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Σε αυτό το χειρόγραφο, οι μήτρες του μέτρου ελαστικότητας 104 Ρα αναφέρονται ως σχετικά συμβατό, ενώ εκείνα του μέτρου 391 Pa περιγράφονται ως σχετικά δύσκαμπτο.