Αφηρημένο

Οι δραστηριότητες κατά του καρκίνου του berberine (BBR) έχουν αναφερθεί εκτενώς σε διάφορες καρκινικών κυττάρων γραμμές. Ωστόσο, οι ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις BBR ποικίλει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών και έχουν πολύ λίγες μελέτες έχουν αφιερωθεί στην διαλεύκανση αυτής της πτυχής. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές, HepG2, HeLa και SY5Y, να συγκρίνει τη μεταφορά και διανομή του BBR. αποτελέσματα της HPLC έδειξε ότι BBR ήταν ικανά να διεισδύουν όλες τις κυτταρικές σειρές ενώ οι αθροιστικές συγκεντρώσεις ήταν σημαντικά διαφορετικές. κύτταρα HepG2 συσσωρευμένη υψηλότερο επίπεδο BBR για μεγαλύτερη διάρκεια από ό, τι τα άλλα δύο κυτταρικές σειρές. μελέτες μοριακής σύνδεσης αποκάλυψε την θέση πρόσδεσης BBR στο P-γλυκοπρωτεΐνη 1 (P-gp). Επιπλέον, διευκρινίσθηκε ότι BBR ρυθμίζεται P-gp τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. BBR προκάλεσε την μεταγραφή και μετάφραση της P-gp σε κύτταρα HeLa και SY5Y, ενώ BBR ανέστειλε την έκφραση Ρ-σρ σε κύτταρα HepG2. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι BBR ρυθμίζει την έκφραση της P-gp, ανάλογα με διαφορετικούς μηχανισμούς (ή επηρεάζονται από διαφορετικούς παράγοντες) σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Για να συνοψίσουμε, η μελέτη μας έδειξε αρκετές μηχανιστικές πτυχές της ρύθμισης BBR στο P-gp σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές και μπορεί να ρίξει μερικές χρήσιμες γνώσεις σχετικά με τη χρήση του BBR στην ανάπτυξη φαρμάκων κατά του καρκίνου

Παράθεση:. Pang YN, Liang YW, Feng TS, Zhao S, Wu Η Chai YS, et al. (2014) Μεταφορά Βερβερίνη σε HepG2, HeLa και SY5Y κύτταρα: συσχέτιση με το Anti-Cancer δράση του. PLoS ONE 9 (11): e112937. doi: 10.1371 /journal.pone.0112937

Επιμέλεια: Ντραγκάνα Nikitovic-Τζανακάκη, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Ελλάδα |

Ελήφθη: 21 του Ιουνίου, 2014? Αποδεκτές: 17η Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Νοέμβρη 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση: Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81374006 και 81073092) και το Εθνικό S & amp? T Major ειδικό πρόγραμμα για νέο φάρμακο R & amp? D Πρόγραμμα. Κίνα (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008 και 2011ZX09101-002-11). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. Hao Wu απασχολείται από NGM Biopharmaceuticals, Inc. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Βερβερίνη (BBR), ένα αλκαλοειδές ισοκινολίνης , μπορεί να απομονωθεί από φαρμακευτικά φυτά, όπως

Rhizoma coptidis

,

Scutellaria baicalensis

και

phellodendron amurense

. Αν και χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία μολυσματικών ασθενειών σε παραδοσιακούς ιατρική πρακτική, BBR έχει πρόσφατα διερευνηθεί για υπολιπιδαιμικά, κατά του διαβήτη, ανοσορύθμιση, προστασία του ισχαιμικού μυοκαρδίου, αντι-υπέρταση, αντι-αρρυθμίας και σκοπούς αντικαρκινική σε αρκετές μελέτες [1], [2].

Η αντικαρκινική δράση του BBR έχει αναφερθεί σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων PC12 κυττάρων [3], κύτταρα μελανώματος [4], καρκινικά κύτταρα μαστού [5] , ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα κόλου [6], 3Τ3-L1 λιποκύτταρα [7], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ανθρώπου κύτταρα [8], κύτταρα καρκίνου του προστάτη [9], του καρκίνου του ήπατος κυττάρων [10], του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα [11], κλπ έχει αναφερθεί ότι η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του BBR ποικίλουν σημαντικά μεταξύ διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, από 10 ηΜ (3,73 ng /ml) στο κελί καρκίνωμα κόλου έως 400 μm (149,2 μg /ml) σε κύτταρα MHCC97-L, μέσω μιας άγνωστο μηχανισμό [12], [13]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι BBR, μια κατηγορία αλκαλοειδές DNA παρεμβολείς, εισήχθη μέσω ενός κατιονικού μεταφορέα. Όμως, η ενδοκυτταρική κατανομή του BBR είναι ακόμη ασαφής [14]. P-gp, η πιο εκτεταμένα μελετηθεί μέλος του δέσμευσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) μεμβράνη μεταφορέων εκροής, έχει ταυτοποιηθεί ως κύριος μεταφορέας υπεύθυνος για την εκροή του BBR. Η αναστολή της Ρ-gp βρέθηκε να αυξάνει την ενδοκυτταρική συγκέντρωση της BBR [15]. Πρόσφατες μελέτες ανέφεραν ότι BBR ρυθμίζει P-gp σε διαφορετικές εκτείνεται σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [16]. Ωστόσο, η ρύθμιση του P-gp στο mRNA και της πρωτεΐνης επίπεδα με BBR δεν έχει αναφερθεί ακόμα.

Σε αυτή τη μελέτη επιλέξαμε τρία ευρέως χρησιμοποιούμενη καρκινικές κυτταρικές σειρές, HepG2, HeLa και SY5Y να αξιολογηθεί η ενδοκυτταρική μεταφορά, τη διανομή και εκροή του BBR, με στόχο να κατανοήσουν τον μηχανισμό που διέπει τις διαφορετικές απαντήσεις στο BBR μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών σειρών.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και κυτταροτοξικότητα δοκιμασία

κύτταρα HepG2 ήταν που παρέχονται από τον Δρ Λι Cao, Ινστιτούτο φαρμακευτικών φυτών Ανάπτυξης (IMPLAD). κύτταρα HeLa αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Rockvill, Maryland, USA). Αμφότερες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml). κύτταρα δΥ5Υ δόθηκαν από την Τράπεζα Κυττάρων του Ινστιτούτου των Θεμελιωδών Ιατρικής, Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα), καλλιεργημένα σε RPMI Medium 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /ml). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C κάτω από

2 και 90% υγρασία 5% CO. Η IACUC (Θεσμικές φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση) του Πανεπιστημίου Tsinghua ενέκρινε όλα τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (ID Έγκριση: 2013-DuLJBBR001).

Η κυτταροτοξικότητα των BBR στις τρεις κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκε από ΜΤΤ ( 3- (4,5-διμεθυλο-lthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο) δοκιμασίας. Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από Chai et al. [17].

συνεστιακή μικροσκοπία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με BBR (0,5 μg /ml σε νερό) ή νερό μόνο μετά την επίτευξη του 70% συρροή [14]. Μετά τη θεραπεία φάρμακο για 12 ώρες, τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση μικροσκοπία. Ο φθορισμός της ενδοκυτταρικής BBR παρατηρήθηκε με διέγερση στα 405 nm και εκπομπή στα 520 nm. Εικόνες ελήφθησαν κάτω από ένα Zeiss LSM Meta 710 Ομοεστιακή μικροσκόπιο εφοδιασμένο με αργό και το ήλιο-νέον λέιζερ (Carl Zeiss, Γερμανία) και αναλύθηκαν περαιτέρω με Zen 2011 Λογισμικό.

υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC)

δοκιμασία

ένα σύστημα HPLC που περιέχει ένα Agilent 1260 σύστημα HPLC (1260 Quat αντλία, 1260 DAD, 1260 ALS) και μία στήλη HPLC C-18 (150 mm × 3,9 χιλιοστά, 5 μm σωματιδίων πυριτίου μεγέθους, Waters, Ιρλανδία) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ενδοκυτταρική συγκέντρωση BBR. Μία κινητή φάση αποτελείται από ακετονιτρίλιο /νερό (28/72, ν /ν) που περιέχει 0.5% τριαιθυλαμίνη αντλήθηκε μέσω της στήλης με 0,8 ml /min. BBR ανιχνεύθηκε με UV απορρόφηση σε μήκος κύματος 347 nm του [18]. Υπό αυτές τις συνθήκες, ο χρόνος κατακράτησης της BBR ήταν 6,8 λεπτά. Η ποσοτική γραμμική περιοχή ήταν μηδέν έως 5000,0 ng /ml για BBR. Πρότυπες καμπύλες του BBR αντλήθηκαν χρησιμοποιώντας σταθμισμένη γραμμική παλινδρόμηση των μέγιστων τιμών αναλογία περιοχής των προτύπων βαθμονόμησης. Ο συντελεστής συσχέτισης (R

2) ήταν 0.999.

φασματόμετρο χρωματογραφία μάζας Liquid (LC /MS) δοκιμασία

Μια Agilent 1200/6340 LC /MS χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό ενδοκυτταρική BBR . Η ενδοκυτταρική BBR εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μεθανόλη και έρευσε διαμέσου μιας στήλης HPLC C-18 (150 mm × 3,9 mm, 5 μm μέγεθος σωματιδίων διοξειδίου του πυριτίου, Waters, Ιρλανδία) με ταχύτητα 0,2 mL /min στους 25 ° C. Η κινητή φάση αποτελείται από διαλύτη Α (10 mM οξικό αμμώνιο, 0.1% μεθανοϊκό οξύ σε νερό και ρύθμιση του ρΗ σε 3) και διαλύτη Β (ακετονιτρίλιο) χρησιμοποιήθηκε για την εξισορρόπηση της στήλης με την ακόλουθη διαβάθμιση: 15% διαλύτη Β για 2 λεπτά, 30% διαλύτη Β επί 11 λεπτά, το 90% του διαλύτη Β επί 12 λεπτά και τελικά 15% διαλύτη Β επί 5 λεπτά. Υπό αυτές τις συνθήκες, ο χρόνος κατακράτησης της BBR ήταν 12,6 λεπτά. BBR παρακολουθήθηκε σε αναλογία μάζας /φορτίου (m /z) των 336,0.

Computer βάση μελέτη σύνδεσης

Η αναφερόμενη κρυσταλλική δομή της P-gp, κατεβάσει από Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης ιστοσελίδα (κωδικός ΠΣΠ : 2YL2, https://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=2YL2) επιλέχθηκε ως το πρότυπο σύνδεσης. Τα δεδομένα πυκνότητα ηλεκτρονίων αποκτήθηκε από την ιστοσελίδα Electron Πυκνότητα διακομιστή (https://eds.bmc.uu.se/cgi-bin/eds/uusfs?pdbCode=2YL2). Τα αρχεία δομή του μορίου πρωτεΐνης και BBR αναλύθηκαν με AutoDockTools-1.5.4. Το κουτί πλέγμα περιελάμβανε το σύνολο διαμεμβρανική περιοχή.

χειραγώγηση νουκλεοτιδικές οξύ και το μετασχηματισμό

Η κατασκευή του υποκινητή λιωμένο έκφρασης GFP P-gp (P-gp προαγωγού-GFP) δημιουργήθηκε με τη χρήση γενικών μοριακών τεχνική . Για να αντικαταστήσετε το

SpeI

και

XbaI

θραύσμα του φορέα pEGFP-N1, ένα 1 kb υποκινητή P-gp ενισχύθηκε με PCR από μια αντίστροφη PCR του HepG2 κυττάρων [19]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: 1 Kb-AseI-F: 5′-TTTATTAATCTGCAGAAAAATTTCTCCTAG και 1Kb-BamHI-R:. 5′-CGCGGATCCCTGCAGGGGCTTTCCT

Αυτή η P-gp υποκινητή συγχωνευμένο κατασκευή GFP επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας και υποβλήθηκε για την επιμόλυνση σε HepG2 , HeLa και SY5Y κύτταρα με ηλεκτροδιάτρηση ξεχωριστά. Τα κύτταρα σε μέσο άνευ ορού που περιέχει 20 μg DNA ηλεκτροδιατρήθηκαν σε ηλεκτροδιατρητή (Model ECM 630, ΒΤΧ). Οι παράμετροι ηλεκτροδιάτρησης που ήταν 250 V Τάση (μοντέλο χαμηλής τάσης), 1575 αντίσταση Ω και 1000 μF χωρητικότητα. Τα κύτταρα σημάνθηκαν δύο φορές με μεσοδιάστημα 1 λεπτό. Μετά την ηλεκτροδιάτρηση, τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε 10 ml πιάτα με 10% ορό και ανακτάται για 24 ώρες που ακολουθείται από φαρμακευτικές αγωγές [20].

Ποσοτική RT-PCR

Τα επίπεδα mRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο ποσοτική kit PCR βασίζεται (Tiangen, Κίνα). Ολικό RNA απομονώθηκε από ολικό RNA ΤπζοΙ κιτ απομόνωσης (Tiangen, Κίνα). δείγμα RNA από 50 ng μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit (διαγονιδιακής, Κίνα). Τα προϊόντα cDNA επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής DNA. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 5′-GCTGGATGTTTCCGGTTTGG και 5′-TTCCGTGCTGTAGCTGTCAA για P-gp, 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC και 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT για

β

ακτίνης. 5′-GCAGAAGAACGGCATCAAGG και 5′-CGGACTGGGTGCTCAGGTAG για GFP. Οι συνθήκες κυκλοποίησης ήταν: 94 ° C για 3 λεπτά? 40 κύκλοι των 94 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 10 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 20 δευτερόλεπτα? 72 ° C για 10 λεπτά και ψύχθηκε στους 4 ° C. Τα δεδομένα υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα λογισμικού LC-480 II (Roche, USA).

κηλίδος Western

Τα δείγματα πρωτεΐνης παρασκευάσθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης Bio-Rad. Τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε 8% πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, USA). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (ρυθμιστικό TBS που περιείχε 0,05% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζονται με το πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο με 3% γάλα σε TBST στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-Ρ-gp (1:500, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), GFP (1:3000, Abmart, Σαγκάη, Κίνα) και β-ακτίνη (1:2000, Boster Βιολογική Τεχνολογία , Wuhan, Κίνα). Το δεύτερον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν κατσίκας-αντι-ποντικού HRP αντισώματος (1:1000, ZSGB-BIO, Κίνα), που ακολουθείται από χημειοφωταύγεια όπως περιγράφεται [21].

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα ήταν παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD και αναλύθηκαν στατιστικώς χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Η δοκιμή F πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Excel Λογισμικού για το Office 2007 (Microsoft, ΗΠΑ). Μετά τη δοκιμή F,

t-test

μεταξύ δύο ομάδων πραγματοποιήθηκε το μαθητή. Μονόδρομη ANOVA

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να αναλύσει τις διαφορές μεταξύ των συνόλων των δεδομένων χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 5.0 λογισμικό (Graph Pad, Σαν Ντιέγκο, ΗΠΑ).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Κυτταρική πρόσληψη BBR

Η ενδοκυτταρική κατανομή των BBR είναι σημαντική για την κατανόηση του ρόλου των BBR ως αντικαρκινικό φάρμακο. Χρησιμοποιήσαμε τρεις αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές: HepG2, HeLa και SY5Y να αναλύσει διανομή BBR [23] – [26]. Ένα μη-τοξική δόση του BBR (0,5 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε καθ ‘όλη τη μελέτη με βάση τα αποτελέσματα της δοκιμασίας κυτταροτοξικότητας και καμπύλες θνησιμότητα (Σχ. 1Α-Ρ). Το ομοεστιακό μικροσκόπιο απεικονίζεται διανομή BBR σε ζωντανά κύτταρα (Εικ. 2Α), αποκαλύπτοντας ότι BBR μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα HepG2, HeLa και SY5Y μέσα σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία φαρμάκου (Σχ. 2Β, C). Η πλειοψηφία των BBR ήταν στο κυτταρόπλασμα και δεν παρατηρήθηκε προφανής πυρηνική είσοδο. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν BBR εισάγετε πυρήνα και να ανταγωνιστεί με TBP (TATA ασφαλείας πρωτεΐνη Binding) για ΤΑΤΑ σε PC12 κυττάρων [14]. Ωστόσο, δεν καταφέραμε να παρατηρήσουμε την κατανομή πυρήνα της BBR σε αυτές τις τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές.

(Α-ΣΤ) Η κυτταροτοξικότητα και η θνησιμότητα των BBR χρήση δοκιμασίας ΜΤΤ. (Α, Β) HepG2, (C, D) HeLa. (Ε, F) SY5Y. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.005, στατιστική σημαντικότητα των BBR αντιμετωπίζονται ομάδων σε σχέση με τον έλεγχο των ομάδων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από έξι ανεξάρτητα πειράματα (η = 6).

Η

(Α-Ι) Εικόνες του υποκυτταρικός εντοπισμός του BBR σε κύτταρα πριν και μετά από 0,5 μγρ χορήγηση /ml BBR για 1 ώρα. (Α-Ο) κύτταρα HepG2? κύτταρα (D-F) HeLa? κύτταρα (G-I) SY5Y. Ο φθορισμός της BBR εμφανίζεται με πράσινο χρώμα, αντίθεση διαφορικής παρεμβολής (DIC) Τα ποσά αντιπροσωπεύουν το μέγεθος των κυττάρων και το μπαρ κλίμακα είναι 10 μm.

Η

Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε HPLC και LC /MS για να αναλύσει ποσοτικά το ενδοκυτταρικό συγκέντρωση BBR σε κύτταρα HepG2, HeLa και SY5Y μετά κυτταρική είσοδο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BBR μπορούν να διαχωριστούν αποτελεσματικά και ανιχνεύεται με τη χρήση HPLC υπό τις υποδεικνυόμενες συνθήκες (Σχ. 3A-C). Οι πρότυπες καμπύλες του BBR επιδείξει ισχυρή αναλογία σήματος προς θόρυβο και ένα καλό γραμμική σχέση (R

2 = 0.999) μεταξύ της περιοχής κορυφής και η συγκέντρωση του BBR (Σχ. 3D). Υπήρχαν διαφορές στην πρόσληψη των BBR μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών. δοκιμασία HPLC έδειξε ότι σε κύτταρα HepG2, η μέγιστη συγκέντρωση BBR (C

max) ήταν περίπου 2188,8 pmol /mg σε περίπου 12 ώρες μετά τη θεραπεία (Εικ. 3Ε). Το C

max της BBR σε HeLa και SY5Y ήταν 357,8 pmol /mg και 65,5 pmol /mg, αντιστοίχως (Σχ. 3F, G). Μετά από τρεις ώρες, οι συγκεντρώσεις BBR σε κύτταρα HeLa και SY5Y κατέβηκε. Έχει αποδειχθεί ότι BBR συσσωρεύθηκε σε υψηλότερο επίπεδο σε κύτταρα HepG2 από τους άλλους.

(Α-Ο) χρωματογραφήματα HPLC. (Α) Πρότυπο BBR? (Β) Λευκά δείγμα από BBR επεξεργασμένα κύτταρα? (Γ) Δείγματα από κύτταρα με τη χορήγηση BBR για 12 ώρες. (D) Πρότυπο καμπύλες της BBR συγκέντρωσης στίχο ένταση ΑΕ χρησιμοποιώντας ανάλυση HPLC. (Ε-G) Κινητική συμπεριφορά των BBR στα κύτταρα σε οικόπεδο με το χρόνο χορήγησης σε 24 ώρες. (Ε) HepG2? (F) HeLa? κύτταρα (G) SY5Y. (Η, Ι) LC /MS χρωματογραφήματα BBR σε κύτταρα HepG2 μετά τη χορήγηση για 24 ώρες. (H) το φάσμα μάζας του BBR? (Ι) το χρωματογράφημα του BBR. Πρότυπο BBR παρουσιάστηκε στο πράσινο? το δείγμα εμφανίζεται σε μωβ χρώμα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από έξι ανεξάρτητα πειράματα (n = 6).

Η

Επιπλέον, για να καταλάβουμε εάν η υψηλότερη συγκέντρωση BBR στα κύτταρα HepG2 οφείλεται στο ρόλο του HepG2 στην ενεργό μεταβολισμό BBR, έχουμε δημιουργήσει LC /MS για να αναλύσει τα προϊόντα μεταβολίτη της BBR στα κύτταρα. Όπως αναφέρθηκε, υπάρχουν μεταβολίτης προϊόντα BBR μετά από του στόματος ή με ένεση σε αρουραίους πρόσληψη [27]. Ωστόσο, δεν είχαμε εντοπίσει κάποιο από αυτά στα κύτταρα HepG2 (Σχ. 3Η, Ι), γεγονός που υποδηλώνει BBR παρέμεινε άθικτο στα κύτταρα HepG2 [28].

P-gp είναι ο κύριος μεταφορέα εκροής της BBR

Για να επικυρώσετε το ρόλο της P-gp στην εκροή του BBR σε HepG2, κύτταρα HeLa και δΥ5Υ, μία εκλεκτικός αναστολέας της P-gp, Zosuquidar (LY335979, Selleckchem, USA) χρησιμοποιήθηκε [29], [30]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, Zosuquidar αύξησε αποτελεσματικά την συγκέντρωση του BBR σε κύτταρα HepG2, HeLa και SY5Y, υποδηλώνοντας ότι η Ρ-gp είναι ο κύριος BBR μεταφορέα εκροής σε αυτά τα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σε καλή συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [28], [31].

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,5 μg /ml BBR και 0,3 μπιοί Zosuquidar, ο αναστολέας της Ρ-gp δραστικότητα, για 12 ώρες. Οι ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις BBR προσδιορίστηκαν με δοκιμασία HPLC. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± Τ.Α από τρία ανεξάρτητα πειράματα (η = 3). . *

π.ισχ

τον έλεγχο,

P

& lt? 0,05. **

vs

τον έλεγχο,

P

& lt? 0.005,

t-test

Η

Μοριακή σύνδεσης του BBR στο P-gp.

Έχουμε αναλύσει περαιτέρω την αλληλεπίδραση της P-gp και BBR από τον υπολογιστή με βάση το μοριακό docking. Η κρυσταλλική δομή της ανθρώπινης Ρ-gp έχει ταυτοποιηθεί από τη βάση δεδομένων του NCBI. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιείται την ίδια δομή με τον υποδοχέα για να εκτελέσει το μοριακό docking του BBR. Τα αποτελέσματα πρότειναν ότι BBR ήταν σε θέση να συνδεθούν με το φάρμακο δέσμευσης-τσέπη του P-gp (σχ. 5Α, Β). Η θέση σύνδεσης του BBR βρισκόταν στη «κάτω» μέρος του θύλακα σύνδεσης (Σχ. 5C, D). Η ενέργεια καθόδου είναι -9,1 kcal /mol, γεγονός που υποδηλώνει την υψηλή συγγένεια σύνδεσης του BBR στο P-gp.

(Α) Side και (Β) κάτοψη του θύλακα σύνδεσης BBR της P-gp. (Γ, Δ) οι συνολικές απόψεις σύνδεσης του BBR στο θύλακα σύνδεσης της P-gp. Μπλε ματιών: ηλεκτρονίων isodensity χάρτη πρωτεΐνης γύρω από τη θέση σύνδεσης. Πρωτεΐνη αντιπροσωπεύονται ως κινούμενα σχέδια (διαφάνεια = 20%), μικρά μόρια και σημαντικά αμινοξέα (όπως επισημασμένα) αντιπροσωπεύονται ως γραμμές (λευκό και πράσινο, άνθρακας. Κόκκινο, οξυγόνο. Μπλε, άζωτο). Κίτρινη διακεκομμένη γραμμή, δεσμός υδρογόνου.

Η

BBR επηρεάζει P-gp έκφραση

Για να διαλευκανθεί αν BBR ρυθμίζει την έκφραση της P-gp, εξετάσαμε το mRNA και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης της P-gp σε κύτταρα HepG2, HeLa και SY5Y μετά τη θεραπεία BBR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το mRNA της Ρ-gp αυξήθηκε σε κύτταρα HeLa και SY5Y, ενώ μειώθηκε σε κύτταρα HepG2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από θεραπεία BBR (Σχ. 6Α). Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος Western επικυρωμένα αυτά τα αποτελέσματα, που δείχνουν ότι BBR αυξημένη P-gp έκφραση σε κύτταρα HeLa και SY5Y, αλλά μείωσε την έκφραση σε κύτταρα HepG2 (εικ. 6Β, Γ).

(Α) εκφράσεις mRNA του ενδογενή P-gp χρησιμοποιώντας PCR δοκιμασία πραγματικού χρόνου. (Β) Δυτική δοκιμασία κηλίδωσης έδειξαν αλλαγές της πρωτεΐνης P-gp με τη θεραπεία BBR. (Γ) ο λόγος αλλαγές P-gp έναντι β-ακτίνης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από 3 ανεξάρτητα πειράματα (η = 3). Η συγκέντρωση του BBR ήταν 0,5 μg /ml. *

π.ισχ

τον έλεγχο,

P

& lt?. 0,05? . **

π.ισχ

τον έλεγχο,

P

& lt? 0.005,

t-test

. Για πάνελ σε (Α) και (Γ), Αριστερά, HepG2? Μέση, HeLa? Δεξιά, SY5Y.

Η

Πώς BBR ρυθμίζει P-gp έκφραση είναι άγνωστη. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της BBR για έναρξη μεταγραφής P-gp, ένα P-gp 1 kb υποκινητή συγχωνευμένο GFP κατασκευάσθηκε (Σχ. 7Α) και επιμολύνθηκε σε τρεις κυτταρικές γραμμές [19]. Αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς BBR και ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής επιλογή και την ανάλυση RT-PCR (Σχ. 7Β-D). Αποτελέσματα RT-PCR αποκάλυψε ότι BBR έχει καμία ρύθμιση ρόλο στην δραστηριότητα προαγωγέα του P-gp. Εκτός αυτού, το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης του GFP δεν επηρεάστηκε από BBR σύμφωνα με τα κηλίδωση Western αποτελέσματα στα Σχ. 7Ε-Η. Από GFP συντήχθηκε με υποκινητή P-gp στο πλάσμα και δεν υπάρχει στα κύτταρα των θηλαστικών, τα δεδομένα έκφρασης πρωτεΐνης GFP έδειξαν ότι BBR δεν θα μπορούσε να δράσει με υποκινητή P-gp στο επίπεδο μεταγραφής.

(Α ) σχηματικός χάρτης του P-gp 1 kb υποκινητή συγχωνευμένο GFP (P-gp υποκινητή-GFP) κατασκεύασμα. Μαύρο, υποστηρικτής της P-gp. Πράσινο, διαβάζοντας πλαίσιο της EGFP. (Β-D) εκφράσεις mRNA της Ρ-gp 1 kb υποκινητή συγχωνευμένο GFP με την παρουσία ή απουσία BBR με δοκιμασία PCR πραγματικού χρόνου. (Β), HepG2? (C), HeLa? (D), SY5Y. (Ε) Western στύπωμα δοκιμασία έδειξε μεταβολές της Ρ-gp 1 kb πρωτεΐνη υποκινητή συγχωνευμένο GFP με θεραπεία BBR. (F-Η) ο λόγος αλλαγές της GFP έναντι β-ακτίνης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. από 3 ανεξάρτητα πειράματα (η = 3). «

ns»

σημαίνει ότι δεν υπάρχει στατιστική σημαντικότητα.

Η

Συζήτηση

Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να κατανοήσουμε την αλληλεπίδραση μεταξύ BBR, μια ισχυρή ένωση κατά του καρκίνου, και P-gp, ένα ευρέως διαδεδομένο μεταφορέα εκροής φαρμάκου. Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι σε συγκέντρωση 0,5 μg /ml BBR ήταν αποτελεσματικό στην προστασία καλλιεργημένα κύτταρα νευρώνων από βλάβες μετά στέρηση οξυγόνου και γλυκόζης [22] και επαληθεύσαμε ότι δεν προκαλεί καμία ζημιά στο HepG2, HeLa ή κύτταρα SY5Y βασίζεται σε δοκιμασία ΜΤΤ . Στην παρούσα εργασία μας, παρατηρήσαμε την είσοδο του BBR από ομοεστιακό μικροσκόπιο και καταγράφεται η δυναμική συσσώρευσης του BBR χρησιμοποιώντας HPLC και LC /MS. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών, HepG2 συσσωρεύσει πάνω BBR για μεγαλύτερη διάρκεια από ό, τι τα άλλα δύο κυτταρικές σειρές. Με δοκιμασία /MS LC βρήκαμε δεν υπήρχαν μεταβολίτες της BBR σε κύτταρα HepG2 μετά την χορήγηση BBR, υποδεικνύοντας την υψηλή συγκέντρωση BBR σε κύτταρα HepG2 είναι η ίδια μόνο BBR. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι HepG2 θα μπορούσαν να συσσωρευτούν περισσότερα BBR και να κρατήσει για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στα κύτταρα.

Καθώς η βιβλιογραφία αναφέρεται [15], P-gp είναι κυρίως υπεύθυνη για την εκροή του BBR. Γι ‘αυτό χρησιμοποιείται ένα ειδικό αναστολέα της Ρ-gp, η οποία μπλοκάρει αποτελεσματικά την εκροή του BBR και αυξημένη συγκέντρωση BBR σε κύτταρα HepG2. Ένα ειδικό θύλακα σύνδεσης του P-gp για BBR αποκαλύφθηκε στην πρόβλεψη μοριακής σύνδεσης. Αυτό εξηγεί εν μέρει τη θέση μέσω της οποίας θα μπορούσε να BBR επηρεάσει την ικανότητα του P-gp στη μεσολάβηση BBR εκροή, αν και ένας λεπτομερής μηχανισμός συσχετίζοντας αυτά τα δύο φαινόμενα (η σύνδεση του BBR και την αποτελεσματικότητα εκροής της Ρ-gp) είναι ακόμη άγνωστη.

Με την εφαρμογή μεθόδων μοριακής βιολογίας και βιοχημείας, μετρήσαμε τα επίπεδα του mRNA και της πρωτεΐνης του P-gp στα κύτταρα μετά την επεξεργασία BBR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BBR επάγεται τις εκφράσεις mRNA και η πρωτεΐνη του P-gp σε κύτταρα HeLa και SY5Y, και, κατά συνέπεια, προώθησε την εκροή του BBR και μείωσε τη συγκέντρωση του ενδοκυτταρικού BBR. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να εξηγήσει την παρατήρηση ότι η ενδοκυτταρική συγκέντρωση BBR κορυφώθηκε και μειώθηκε πολύ γρήγορα σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, P-gp έκφραση μειώθηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις BBR σε κύτταρα HepG2, η οποία ήταν σε καλή συμφωνία με το γεγονός ότι η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του BBR συνεχώς δημιουργήθηκαν σε κύτταρα HepG2.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 6 και Σχ. 7, mRNA και πρωτεΐνη εκφράσεις P-gp σε κύτταρα HeLa και SY5Y ρυθμίστηκαν προς τα πάνω μετά την χορήγηση BBR, ενώ η έκφραση του mRNA της Ρ-gp στον προαγωγό επιμολυσμένα στα κύτταρα δεν ήταν πάνω ρυθμισμένα. Για να επαληθεύσετε το αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε ένα συμπληρωματικό πείραμα, χρησιμοποιώντας την έκφραση της πρωτεΐνης GFP. Τα αποτελέσματα έδειξαν εκφράσεις πρωτεΐνης GFP δεν ήταν πάνω ρυθμισμένα μετά τη χορήγηση BBR, που υποστηρίζουν τα δεδομένα έκφρασης του mRNA της Ρ-gp στον προαγωγό επιμολυσμένα σε κύτταρα HepG2, HeLa και SY5Y. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει πρωτεΐνη GFP σε κύτταρα θηλαστικών, τα δεδομένα έκφρασης πρωτεΐνης GFP υποστηρίζουν σθεναρά ότι BBR δεν δρουν στον προαγωγέα του P-gp.

BBR αναφέρθηκε ότι αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα αρκετών ενώσεων με αναστολή P- gp σε Caco-2 κύτταρα του εντέρου [16]. Προώθησε επίσης την έκφραση της Ρ-gp αντοχή πολυφαρμάκου των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του στόματος (ΚΒ, OC2), γαστρικό (SC-Μ1, NUGC-3) και του παχέος εντέρου (COLO 205, CT 26) καρκινικών κυττάρων [32], [33 ], γεγονός που υποδηλώνει την πολυπλοκότητα των σχέσεων μεταξύ BBR και P-gp σε διαφορετικά κελιά.

από BBR δεν θα μπορούσαν να εισέλθουν οι πυρήνες, δεν είναι πιθανό ότι BBR έχει οποιαδήποτε ενέργεια σχετικά με τις ακολουθίες DNA /Gene, οδηγώντας χωρίς αποτέλεσμα του BBR στη μεταγραφή υποκινητή P-gp. Συνδυάστε με τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης P-gp επάγεται από BBR, προβλέπουμε ότι η επίδραση του BBR στην έκφραση της P-gp θα πρέπει να συμβεί μετά τη μεταγραφή γονιδίων, για παράδειγμα mRNA και την σταθερότητα της πρωτεΐνης, ή πρωτεΐνη μετα-μεταγραφικό τροποποίηση. Η απασχόληση της λειτουργίας αναστολέα της P-gp δραστικά ανέστειλε P-gp, η μεταφορά του BBR στις τρεις κυτταρικές γραμμές, υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχουν διαφορές μεταξύ της λειτουργίας της Ρ-gp πρωτεΐνης στα κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει ότι μπορεί να υπάρχουν διαφορετικές κυτταρικών παραγόντων για την έκφραση της πρωτεΐνης Ρ-gp στα κύτταρα και οι interplays μεταξύ BBR, P-gp και διάφορες οδούς μεταγωγής σήματος μπορεί να είναι δραστικά διαφορετική σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, η οποία οδηγεί στα διάφορα απόκριση του όγκου κύτταρα να BBR. Αυτό απαιτεί περαιτέρω μελέτη.

Συμπεράσματα

Εν ολίγοις, αυτή είναι η πρώτη αναφορά για το πώς BBR ρυθμίζονται οι δραστηριότητες της P-gp μεταξύ καρκινικές κυτταρικές σειρές HepG2, HeLa και SY5Y. P-gp συνδυάζει με BBR, προκειμένου να εκπληρώσει BBR, και ταυτόχρονα BBR παρεμβαίνει με την έκφραση της P-gp μπορούν να ρυθμίζουν την εκροή του από το κυτταρόπλασμα. BBR προκάλεσε την έκφραση της Ρ-gp σε κύτταρα HeLa και SY5Y, αλλά ανέστειλε την έκφραση της Ρ-gp στα κύτταρα HepG2, πιθανόν να προκλήθηκε από διακριτά μοτίβα της μετάφρασης πρωτεΐνης P-gp. Δεν υπήρχε άμεση ρύθμιση της μεταγραφής υποκινητή P-gp, αναφέροντας τις διαφορές στη ρύθμιση ή /και τους μηχανισμούς που υπάρχουν στα κύτταρα HepG2 και τα κύτταρα HeLa και SY5Y. Οι διαφορές μεταξύ των τριών κυτταρικών σειρών που αναφέρεται στην παρούσα μελέτη μπορεί να μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τις ικανότητες των καρκινικών κυττάρων »να προσλαμβάνει και να μεταφέρει αντικαρκινικά φάρμακα, επίσης, βοηθά στην γνώση των πιθανών μηχανισμών ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε όλους τους συναδέλφους στο εργαστήριο μας. Ευχαριστούμε τον Δρ Yu Tian, ​​Drug Discovery διευκόλυνση του Πανεπιστημίου Tsinghua, για τη βοήθεια των LC ανίχνευσης /MS.