Οι

Αφηρημένο

ανθεκτικούς ιούς διατηρηθεί υπό έλεγχο από ειδικά λεμφοκύτταρα. Η κλωνική Τ κυτταρικό υποδοχέα (TCR) ρεπερτόριο κατά του ιού Epstein-Barr (EBV), μία φορά καταρτίζεται μετά πρωτογενή μόλυνση, επιδεικνύει μια ισχυρή σταθερότητα σε βάθος χρόνου. Ωστόσο, οι καθοριστικοί παράγοντες που συμβάλλουν σε αυτή την μακροπρόθεσμη εμμονή εξακολουθούν κακώς χαρακτηρίζεται. Εκμεταλλευόμενοι ένα

in vivo

κλινικό περιβάλλον όπου ομοιόσταση λεμφοκυττάρων παροδικά ενόχλησή της, μελετήσαμε EBV αντιγόνου-ειδικά CD8 Τ κυττάρων πριν και μετά την μη-μυελοαφανιστική λεμφο-καταστρέφουν τη χημειοθεραπεία των ασθενών με μελάνωμα. Παρά τις πιο προηγμένες διαφοροποίηση των Τ κυττάρων, οι ασθενείς τα Τ κύτταρα έδειξαν κλωνική σύνθεση συγκρίσιμη με υγιή άτομα, που μοιράζονται μια προτίμηση για

TRBV20

και

TRBV29

χρήση τμήματος του γονιδίου και πολλά συν-κυρίαρχο δημόσιο clonotypes TCR. Επιπλέον, τα στοιχεία μας αποκάλυψε την παρουσία σχετικά λίγα δεσπόζουσας EBV κυττάρων Τ clonotypes αντιγονο-ειδικών, οι οποίες ως επί το πλείστον επέμεινε μετά από παροδική λεμφο-εξάντληση (TLD) και ανάκτηση των λεμφοκυττάρων, πιθανόν σχετίζεται με την απουσία του EBV επανενεργοποίησης και

de novo

εκκίνηση των Τ κυττάρων σε αυτούς τους ασθενείς. Είναι ενδιαφέρον, εμμονή clonotypes συχνά συν-εκφράζονται μνήμης /γονίδια παλιννόστησης που σχετίζονται με (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /ΠΩΛΗΣΗ

και

CCR5

) υποστηρίζοντας την ιδέα ότι είναι ιδιαίτερα σημαντικό για μακροχρόνια αποκρίσεις CD8 Τ κυττάρων. Παρ ‘όλα αυτά, η κλωνική σύνθεση του EBV-ειδικά CD8 κύτταρα Τ συντηρήθηκε την πάροδο του χρόνου με την παρουσία των ίδιων δεσπόζουσας clonotypes μετά μη-μυελοαφανιστική χημειοθεραπεία. Η παρατηρούμενη επιμονή κλωνοτυπική επιδεικνύει υψηλή ανθεκτικότητα της ομοιόστασης CD8 Τ κυττάρων και ανασύσταση

Παράθεση:. Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta Β, Romero P, Michielin O, et al. (2013) Ανθεκτικότητα του EBV ειδικών για το αντιγόνο Clonotypes κυττάρων CD8 Τ κατά τη διάρκεια Ομοιοστατική ανοσολογική ανασύσταση σε ασθενείς με καρκίνο. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10.1371 /journal.pone.0078686

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Αυγ του 2013? Αποδεκτές: 15 Σεπτέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Iancu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε και υποστηρίζεται από την Ελβετική Εθνική Center of Competence στην Έρευνα (NCCR) Μοριακής Ογκολογίας και το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Ελβετίας χορηγεί 32003B0-118123 και 310030 με 129670. Ρ.Ο. Gannon είναι επίσης ο αποδέκτης μιας υποτροφίας από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR-IRSC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ιός Primary Epstein-Barr (EBV) συνδέεται με μαζική αντιγραφή του ιού. Παρά την παραγωγή ενός ισχυρού Τ κυττάρου ειδική ανοσολογική απόκριση, EBV καθιερώνει μια λανθάνουσα μόλυνση σε κύτταρα Β [1]. Παρ ‘όλα αυτά, υγιή EBV-μολυσμένα άτομα παραμένουν ασυμπτωματικοί σε όλη τη ζωή τους λόγω ιογενούς συγκράτηση του αντιγόνου-ειδική μνήμη CD8 Τ λεμφοκυττάρων [1-3]. Καθώς όλο και μεγαλύτερη προσοχή είναι αφιερωμένο στην βελτιστοποίηση των στρατηγικών θεραπευτικό εμβολιασμό εναντίον του καρκίνου, το ανοσοποιητικό έλεγχο της χρόνιας λοίμωξης EBV αντιπροσωπεύει μια ενδιαφέρουσα σύστημα μοντέλο για τη μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στην παραγωγή και τη συντήρηση των προστατευτικών ανοσολογικών αποκρίσεων βίου.

Η αντιγόνο γεμάτοι πισίνα κυττάρων CD8 Τ είναι εξαιρετικά ετερογενής και περιλαμβάνει υποπληθυσμών κυττάρων Τ σε διάφορους βαθμούς κυτταρικής διαφοροποίησης με βάση φαινότυπο, τη λειτουργία τους και ανατομική θέση, καθιστώντας έτσι τη διάκριση μεταξύ «τελεστή» και «μνήμη» κυτταρολυτικά Τ κύτταρα προκλητική [4- 6]. Γενικά, η μνήμη-όπως τα Τ κύτταρα εμφανίζουν μακροπρόθεσμη επιβίωση και τις ικανότητες αυτο-ανανέωση, υψηλή πολλαπλασιαστικό δυναμικό, και την ικανότητα να παράγει γρήγορα και αποτελεσματικά τα κύτταρα-τελεστές σε απόκριση αντιγόνου εκ νέου συνάντηση [7-9]. Σε αντίθεση, δραστικά Τ κύτταρα έχουν την ικανότητα να μεταναστεύουν στην θέση της φλεγμονής, για να σκοτώσει τα κύτταρα στόχους που φέρουν αντιγόνο και εκκρίνουν διάφορες κυτοκίνες (π.χ. ΙΡΝγ, TNFa) [10].

Είτε οι κυτταρικές αποκρίσεις μνήμης διατηρείται για παρατεταμένες χρονικές περιόδους ή περιοδικά «ανανεώνεται» εξακολουθεί να αποτελεί θέμα συζήτησης. Πρόκειται για ένα ιδιαίτερα δύσκολο ζήτημα για την αντιμετώπιση στον άνθρωπο, δεδομένου ότι απαιτεί σε βάθος ανάλυση των προστατευτικών ανοσολογικών αποκρίσεων πάνω από μεγάλες χρονικές περιόδους. Σε αυτό το πλαίσιο, ο υποδοχέας των Τ κυττάρων (TCR) είναι ένα εξαιρετικό δείκτη που επιτρέπει αντιγόνου-ειδικών αποκρίσεων που πρέπει να ακολουθούνται κατά μήκος της διαφοροποίησης των κυττάρων Τ και την πάροδο του χρόνου [11]. Λεπτομερής ανάλυση των δύο ιικών και όγκου αντιγόνου-ειδικών αποκρίσεων CD8 Τ κυττάρων έχουν αποκαλύψει ότι το ρεπερτόριο των Τ κυττάρων ειδικών για το αντιγόνο είναι γενικά αποτελείται από υψηλής συχνό (επίσης ορίζεται ως κυρίαρχο), καθώς και λιγότερο συχνή (που ορίζεται ως μη κυρίαρχη) κυττάρων Τ clonotypes [12,13]. Μέσα από μια διαδικασία γνωστή ως επιλογή κλωνοτυπική TCR, ορισμένες clonotypes μπορεί να γίνει πιο κυρίαρχη κατά μήκος της διαφοροποίησης των Τ κυττάρων [14-16] ή καθ ‘όλη τη χρονική πορεία της μόλυνσης [17]. Ανθεκτικότητα των ανθρώπινων κυττάρων Τ clonotypes ιού-ειδικό επί πολλά έτη έχει αποδειχθεί σε ανθρώπους με διάφορες ιογενείς λοιμώξεις: γρίππης [18], τον ιό του απλού έρπητα [19,20], EBV [21], ο κυτταρομεγαλοϊός (CMV) [14] και την ανθρώπινη ιός ανοσοανεπάρκειας (HIV) [22]. Πρόσφατα, Κλάρενμπικ και οι συνεργάτες του [23] εξέτασε το ζήτημα του κατά πόσον η κλωνική ρεπερτόριο που καθορίστηκε κατά την πρώιμη φάση των μολύνσεων από CMV και EBV διατηρείται για μεγάλες χρονικές περιόδους. Βρήκαν ότι οι ανοσολογικές αποκρίσεις ήταν πολύ σταθερή, και μετά την καθιέρωσή τους δεν εξελίχθηκε κατά τη διάρκεια της 5ετούς παρακολούθησης [23]. Ενώ έρπητα-ειδικές αποκρίσεις Τ κυττάρου αποκάλυψε μια άνευ προηγουμένου σταθερότητα του κλωνοτυπική ρεπερτόριο TCR συναρτήσει του χρόνου μετά πρωτογενή μόλυνση, λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με την επιμονή τους υπό συνθήκες ανοσολογικής στρες σε ασυμπτωματικούς φορείς.

Στην παρούσα μελέτη, εξέτασε την ευρωστία των EBV αντιγόνο-ειδικών αποκρίσεων σε ένα

in vivo

περιβάλλον όπου η ισορροπία μεταξύ του ιού και ανοσολογική απόκριση μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο προσωρινά μετά από παροδική λεμφο-εξάντληση (TLD). Συγκεκριμένα, αξιολογήσαμε την ΕΒν αντιγόνο-ειδική CD8 Τ κυττάρων σύνθεση κλωνοτυπική και επιμονή σε ασθενείς με μελάνωμα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μη-μυελοαφανιστική σχήμα χημειοθεραπείας, ακολουθούμενη από μεταφορά υιοθεσίας κυττάρων (ACT) του αυτόλογου μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) [24,25 ]. Για να εκτιμηθεί ποσοτικά αποκρίσεις Τ κυττάρου ιού-ειδική, άμεση

ex vivo

κλωνοτυπικό αναλύσεις συνδυάζονται για προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ατομικών αντιγονο-ειδικών Τ κυττάρων διεξήχθησαν [13]. Οι αντι-ιικές αποκρίσεις Τ κυττάρων σε ασθενείς ήταν περισσότερο διαφοροποιημένα σε σύγκριση με υγιή άτομα, η οποία περιλαμβάνει τόσο τη μνήμη και τελεστές CD8 Τ κύτταρα. Κυρίαρχα TCR clonotypes βήτα-αλυσίδας, συμπεριλαμβανομένων πολλών δημόσιων αλληλουχιών TCR, βρέθηκαν να επιμένουν με το χρόνο σε υγιή άτομα και μετά από TLD και ACT μεταξύ των ασθενών. Στη συνέχεια σπούδασε clonotypes Τ κυττάρων με κυμαινόμενες συχνότητες ακόλουθα TLD και το ανοσοποιητικό ανασύσταση, και παρατήρησε ότι clonotypes με αυξημένη συχνότητα πραγματοποιείται μια πολυλειτουργικά μνήμης /παλιννόστησης προφίλ γονιδιακής έκφρασης (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /ΠΩΛΗΣΗ

και

CCR5

). Συνολικά, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η EBV-ειδικών Τ κυττάρων ρεπερτόριο παραμένει όχι μόνο κάτω από συνθήκες σταθερής κατάστασης, αλλά και κατά τη διάρκεια της παροδικής ανοσολογικές διαταραχές.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Οι κλινικές μελέτες έχουν σχεδιαστεί και διεξάγονται σύμφωνα με τις σχετικές ρυθμιστικές προδιαγραφές και έχουν εγκριθεί από (i) την ηθική της επιτροπής του Πανεπιστημίου της Λωζάνης, (ii) την επιτροπή εξέτασης LICR πρωτοκόλλου, και (iii) την ελβετική εθνική ρυθμιστική αρχή (Swissmedic ). Έχουν εγγραφεί στις κλινικές δοκιμές NCI υπό τον αριθμό NCT00324623 και EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Όλα τα δείγματα αίματος από ασθενείς συλλέχθηκαν μετά από γραπτή συγκατάθεση. Περιφερική δείγματα αίματος από τέσσερις EBV θετικούς υγιείς δότες BCl3, BCL4, BCL7 και BCL8, ηλικίας μεταξύ 25 και 45 ετών, συλλέχθηκαν σε δύο χρονικά σημεία, κατά τα έτη 2002 και 2006, και όλοι οι χορηγοί έδωσαν γραπτή συγκατάθεση.

ασθενών και τη θεραπεία του μελανώματος

Τα δείγματα αίματος από πέντε ασθενείς με μελάνωμα EBV-θετικοί, ηλικίας 39 έως 75 ετών, εγγεγραμμένοι σε κλινικές δοκιμές φάσης Ι του Τμήματος Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Λωζάνης (Ελβετία) , ελήφθησαν σε διάφορα χρονικά σημεία πριν και μετά τη θεραπεία. Μετά τη συλλογή των PBMCs από λευκαφαίρεση (Λευκά), οι ασθενείς που έλαβαν μη μυελοαφανιστική χημειοθεραπευτικό σχήμα που αποτελείται είτε με βουσουλφάνη σε 2 mg /kg (ασθενείς ΤΔΜ 618 και ΤΔΜ 672) ή κυκλοφωσφαμίδη (CTX) στα 30 mg /kg (ΤΔΜ 1144 και τον πρώτο γύρο για LAU 1013) ή 60 mg /kg (LAU 936 και το δεύτερο γύρο για LAU 1013) για δύο ημέρες και φλουδαραβίνη στα 30 mg /m

2 για 3 ημέρες [24,25]. Τρεις ημέρες μετά την τελευταία ένεση φλουδαραβίνης, αυτόλογα PBMCs ήταν εγχέονται πάλι και το πεπτίδιο εμβολιασμό με το μελανο-α ανάλογο πεπτιδίου γαλακτωματοποιημένου σε ατελές ανοσοενισχυτικό Freunds ‘δόθηκε υποδορίως όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Ασθενής LAU 1144 έλαβε επίσης μία διαλυτή πρωτεΐνη LAG-3 ως ανοσοενισχυτικό.

επίπεδα αντισωμάτων κατά του ΕΒν σε ασθενείς με μελάνωμα

Δείγματα πλάσματος λήφθηκαν από όλους τους ασθενείς σε διάφορα χρονικά σημεία πριν και μετά τη θεραπεία λεμφο-καταστρέφουν και αναλύθηκαν για μεταβολές στα επίπεδα αντισώματος είναι γνωστό ότι σχετίζονται με μια κατάσταση του EBV επανενεργοποίηση. Συγκεκριμένα, συγκρίναμε τα επίπεδα αντισώματος στο πλάσμα έναντι τριών EBV εκφρασμένων πρωτεϊνών: ΕΒΝΑ-IgG (Epstein-Barr Nuclear Antigen), EA-IgG (Early αντιγόνο), VCA-IgG και IgM (Viral Καψιδίου αντιγόνο). EBV-ειδικά αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας EBV ATHENA Multi-Lyte (Zeus επιστημονικές, Sommerville, NJ, USA) σε αναγνώστη Luminex 200 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως αυθαίρετες μονάδες.

Προετοιμασία κυττάρων και κυτταρομετρία ροής

PBMCs ελήφθησαν με φυγοκέντρηση πυκνότητας χρησιμοποιώντας Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Σουηδία). CD8 Τ λεμφοκύτταρα θετικά εμπλουτισμένα από κρυοσυντηρημένα PBMCs χρησιμοποιώντας αντι-CD8-επικαλυμμένα μαγνητικά μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Γερμανία). ΡΕ-επισημασμένο ΗΙΑ-Α * 0201 /πεπτιδίου πολυμερή παρασκευάσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26] με το HLA-A2 περιορισμένο επίτοπο GLCTLVAML (αναφέρεται ως Α2 /GLC) που προέρχεται από την λυτική πρωτεΐνη EBV BMFL1. Τα κύτταρα πρώτα κηλιδώθηκαν με πολυμερή ΡΕ-επισημασμένο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε PBS, 0,2% BSA, 50 μΜ EDTA, και στη συνέχεια με κατάλληλα αντισώματα (20 λεπτά στους 4 ° C). Τα κύτταρα είτε άμεσα αναλύθηκαν (ροή LSR-ΙΙ κυτταρόμετρο? BD Biosciences, San Diego, CA) ή ταξινομημένα σε καθορισμένους πληθυσμούς με χρήση μηχανής FACSVantage SE (BD Biosciences). Τα ακόλουθα μονοκλωνικά Abs αγοράστηκαν από την BD Biosciences ή BD PharMingen? αντι-CD28-FITC, αντι-CD8-αλλοφυκοκυανίνη /Cy7, αντι-αρουραίου IgG CCR7 mAB, γίδινο αντι-αρουραίου IgG-αλλοφυκοκυανίνη, και CD3-AmCyan-A. Αντι-CD45RA-ΡΕ-Texas Red mAb αγοράστηκε από την Beckman Coulter (Μασσαλία, Γαλλία).

Δημιουργία Τ κυτταρικών κλώνων και τον πολιτισμό

HLA-A2 /πολυμερούς

+ CD8

+ υποσύνολα Τ κυττάρων ορίζεται ως τελεστές μνήμης (ΕΜ) CCR7

-CD45RA

-CD28

+ (EM28

pos), CCR7

-CD45RA

-CD28

– (EM28

αρν) και τελεστές CCR7

-CD45RA

+ CD28

– (Emra), και ταξινομήθηκαν από τη ροή

ex vivo

(Σχήμα S1) . Ταξινόμηση κύτταρα κλωνοποιήθηκαν με περιοριστική αραίωση και επεκτάθηκαν σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 8% ανθρώπινο ορό (HS), 150 U /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-2 (rhIL-2? Ένα δώρο από GlaxoSmithKline), 1 μικρογραμμάριο /ml φυτοαιμαγλουτινίνη (ΡΗΑ ? Sodiag, Losone, Ελβετία) και 1×10

6 /ml ακτινοβολημένα αλλογενή ΜΚΠΑ (3’000 rad) ως κύτταρα τροφοδότη. A2 /πολυμερούς

κλώνους κυττάρων + Τ επεκτάθηκαν με περιοδική (κάθε 15 ημέρες) επαναδιέγερση σε 24-φρεατίων με ΡΗΑ, ακτινοβολημένα κύτταρα τροφοδότες και hrIL-2.

Άμεση ex vivo διαλογή κυττάρων, ενίσχυση cDNA και μόνο κύτταρο του γονιδίου-ειδική PCR

Single ή πέντε κυττάρων δείγματα ταξινομήθηκαν απευθείας

ex vivo

από υποσύνολα κυττάρων Τ ενδιαφέροντος και η παρασκευή cDNA και η παγκόσμια ενίσχυση cDNA εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27,28]. Gene υπογραφή των μεμονωμένων κυττάρων Τ που προσδιορίζονται από ειδική γονιδιακή PCRs όπως περιγράφεται [28] και τα προϊόντα της PCR οπτικοποιήθηκαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 2,5%. Χρησιμοποιήσαμε τους ακόλουθους εκκινητές:

GAPDH

: 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘? rev-5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ‘,

β2 μικροσφαιρίνη

: 5′-GTC CCAGCAGAGAATGGAAA-3′? rev-5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 ‘,

CCR7

: 5′-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3′? rev-5′-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 ‘,

CD27

: 5′-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3′? rev-5′-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 ‘,

IL7R

(IL-7Ra /CD127): 5′-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3′? rev-5′-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 ‘?

EOMES

(eomesodermin): 5′-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 ‘? rev-5’-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 ‘,

CCR5

: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3′? rev-5′-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 ‘,

KLRD1

(CD94): 5′-GTGGGAGAATGGCTCTG CAC-3′? rev-5′-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 ‘,

IFNg

(ΙΡΝ): 5′-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3′? rev-5′-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 ‘,

PRF1

(περφορίνη): 5′-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3′? rev-5′-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 ‘,

GZMB

(Granzyme Β): 5′-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3′? rev-5′-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 ‘,

ΠΩΛΗΣΗ

(CD62L): 5′-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3′? rev-5′-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 ‘.

TCR spectratyping, αλληλούχιση και TCR clonotyping

ΤΟΚ spectratyping [14] χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό όλων clonotypes TCR, οι οποίες κατατάσσονται σύμφωνα με τις Ανοσογενετική (IMGT) ονοματολογία που προτείνει Lefranc και οι συνεργάτες του (http : //imgt.org/) [29]. Να εντοπίζονται γρήγορα TRBV χρήση τμήματος, cDNA πισίνες του EBV αντιγόνου-ειδικά CD8 Τ κύτταρα αρχικά υποβλήθηκαν σε μεμονωμένες PCR χρησιμοποιώντας ένα σύνολο προηγουμένως επικυρωθεί εκκινητών φθορίζουσα σήμανση προς τα εμπρός ειδικό για την 22 TCR

BV

υποοικογένειες και μία μη επισημασμένη αντίστροφο εκκινητή ειδικό για την σταθερή περιοχή της βήτα αλυσίδας του TCR [30]. Αυτή η ανάλυση spectratyping TRBV-CDR3 αντιπροσωπεύει ένα βήμα που επιτρέπει prescreening χρόνος και αντιδραστήρια αποθήκευση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μόλις ταυτοποιήθηκαν θετικά υποοικογένειες TRBV, δείγματα επιμέρους cDNA που παράγεται είτε από

ex vivo

ταξινομημένο δείγματα μόνο κύτταρο (n = 477) και τα δείγματα 5-κυττάρων (που αντιπροσωπεύει το ισοδύναμο των 300 έως 450 EBV-ειδικά CD8 Τ κύτταρα ανά υγιή δότη ή ασθενή με μελάνωμα) ή από

in vitro

δημιουργούνται κλώνοι Τ κυττάρων (υγιείς δότες, n = 530 κλώνους? ασθενείς με μελάνωμα, n = 779 κλώνοι) υποβλήθηκαν σε TRBV ειδικά PCRs. Διαχωρισμός και ανίχνευση των ενισχυμένων PCR θραυσμάτων που περιείχε ολόκληρο το τμήμα CDR3 εκτελέστηκαν με την παρουσία δεικτών φθορισμού μέγεθος σε έναν ΑΒΙ PRISM 310 Genetic Analyzer (AppliedBiosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Ελβετία) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με GeneScan 3.7.1 ( AppliedBiosystems). Στο τελευταίο στάδιο, τα προϊόντα PCR που μας ενδιαφέρουν άμεσα καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν με τον ανάστροφο εκκινητή (Fasteris SA, Geneva, Switzerland). Η πλειοψηφία των προϊόντων της PCR υποβλήθηκαν σε καθορισμό αλληλουχίας, ωστόσο, για διάφορους δεσπόζουσα clonotypes TCR (n = 8 για HDS? N = 10 για τους ασθενείς), μοναδικών εκκινητές που αντιστοιχούν στο

CDR3

τμήμα γονιδίου σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για clonotyping PCRs ως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Όλα

ex vivo

μόνο κύτταρο, 5-κυττάρων, και

in vitro

δημιουργούνται δείγματα cDNA κλώνο κυττάρων Τ από υγιείς δότες και ασθενείς με μελάνωμα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο αυστηρή προσέγγιση.

Στατιστικές αναλύσεις

Όπως αναφέρεται σε όλο το κείμενο, Kruskal-Wallis μη παραμετρική, μονόδρομη ANOVA και συσχετίσεις Spearman που πραγματοποιήθηκαν με Prism 5.0 (La Jolla, California, USA) και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. διαγράμματα πίτας συν-έκφρασης σε σύγκριση με κάθε άλλο χρησιμοποιώντας 10.000 μεταθέσεις υπολογίζεται με τον SPICE λογισμικού 5.2 (ΝΙΗ, Bethesda, USA).

Αποτελέσματα

Ενισχυμένη διαφοροποίηση των κυττάρων δραστών του EBV αντιγόνου-ειδικά CD8 Τ κυττάρων μετά από παροδική λεμφο-εξάντληση και του ανοσοποιητικού ανασύσταση

Πρόσφατες μελέτες ανοσοθεραπείας έχουν δείξει ότι λεμφο-εξάντληση που προκαλείται από μη-μυελοαφανιστική χημειοθεραπεία ευνοείται επακόλουθη επέκταση του θετώς μεταφέρεται Τ κυττάρων με ομοιοστατικών μηχανισμών ([31]? Σχήμα 1Α). Για να περιορίσετε περαιτέρω τη στρατηγική αυτή, είχαμε προηγουμένως ανέλυσε την επίδραση τριών διαφορετικών μη μυελοαφανιστική σχήματα προετοιμασίας χημειοθεραπείας σε λεμφο-εξάντληση και την ανασύσταση σε ασθενείς με μελάνωμα [24,25]. Οι τρεις χημειοθεραπευτικών σχημάτων που προκαλείται σημαντική παροδική μείωση των λεμφοκυττάρων, που ακολουθείται από την αποτελεσματική ανάκτηση του συνόλου των λεμφοκυττάρων [24,25] και CD8 Τ κυττάρων (Σχήμα 1Β, αριστερό πάνελ) μετρά σε φυσιολογικά επίπεδα τέσσερις εβδομάδες μετά την θετή μεταφορά κυττάρων (μετα-ACT).

Α. Σχηματική αναπαράσταση των μη myeloablating θεραπεία λεμφο-καταστρέφουν ακολουθούμενη από την πράξη PBMCs για ασθενείς με μελάνωμα. Τα δείγματα αίματος αναλύθηκαν για όλους τους ασθενείς κατά τη λευκαφαίρεση χρονικό σημείο (Λευκά) πριν από τη χημειοθεραπεία TLD και μετα-ACT (χρονικό σημείο Τ1), το οποίο αντιστοιχούσε σε ημέρες 32 (LAU ασθενής 1144), ημέρα 45 (LAU 1013), ή ημέρα 60 (ΤΔΜ 618, ΤΔΜ 936, και ΤΔΜ 672). B. Αριστερό πάνελ? συνολικές μετρήσεις των CD8 Τ κυττάρων από πέντε ασθενείς με μελάνωμα στα Λευκά και μετα-ACT. Δικαίωμα πάνελ? φαινοτύπου των συνολικών CD8 Τ κύτταρα που δείχνουν αναλογίες της έγκαιρης διαφοροποιούνται (EM28

pos? CCR7

negCD45RA

negCD28

POS) και αργά-διαφοροποιημένα (που αποτελείται από EM28

αρν? CCR7

negCD45RA

negCD28

αρνητικά και Emra? CCR7

negCD45RA

posCD28

αρν) υποσύνολα από τέσσερις υγιείς δότες (HDS) και από πέντε ασθενείς με μελάνωμα στα Λευκά και μετα-ACT. Γ Αριστερό πάνελ? συνολικές μετρήσεις του EBV-ειδικά CD8 Τ κυττάρων στο περιφερικό αίμα από πέντε ασθενείς με μελάνωμα σε Leuka και χρονικά σημεία μετά την ACT. Δικαίωμα πάνελ? φαινότυπο των EBV-ειδικών CD8 Τ κύτταρα που δείχνουν αναλογίες της έγκαιρης διαφοροποιούνται (EM28

pos? CCR7

negCD45RA

negCD28

POS) και αργά-διαφοροποιημένα (που αποτελείται από EM28

αρν? CCR7

negCD45RA

negCD28

αρνητικά και Emra? CCR7

negCD45RA

posCD28

αρν) υποσύνολα από τέσσερις υγιείς δότες και από πέντε ασθενείς με μελάνωμα στα Λευκά και μετα-ACT. Δ EBV-ειδικό επίπεδα αντισωμάτων μετρήθηκαν σε δείγματα πλάσματος από πέντε ασθενείς με μελάνωμα σε διάφορα χρονικά σημεία πριν και μετά τη θεραπεία λεμφο-καταστρέφουν. Ημέρα 0 στον χ-άξονας αντιπροσωπεύει την ημέρα του ACT. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως αυθαίρετες μονάδες σε σχετική κλίμακα δείκτη. Εξέλιξη επίπεδο πλάσματος παρουσιάζεται ξεχωριστά για κάθε αντίσωμα αντι-ΕΒν (αντι-VCA IgM και IgG, αντι-ΕΒΝΑ IgG και αντι-ΕΑ IgG), και η γκρίζα ράβδος αντιπροσωπεύει το cut-off μεταξύ αρνητικών και θετικών κατάστασης για κάθε δείκτη.

Στη συνέχεια αναλύσαμε τα CD8 Τ κύτταρα ειδικά για το EBV λυτική πρωτεΐνη BMFL1 από πέντε ασθενείς με μελάνωμα σταδίου IV πριν και μετά TLD (Σχήμα S1) και από τέσσερα υγιείς δότες. Το συνολικό ποσοστό των ΕΒν αντιγόνο-ειδικών Τ κυττάρων πριν και μετά τη θεραπεία παρέμεινε αμετάβλητη (Εικόνα 1C? Αριστερό πάνελ?

P

= 0.625, Kruskal-Wallis). Σε σύγκριση με υγιή άτομα, BMFL1-ειδικά CD8 Τ κύτταρα από ασθενείς με μελάνωμα έδειξε πιο προηγμένη διαφοροποίηση των κυττάρων δραστών με αυξημένα ποσοστά του EM28

αρνητικά (που ορίζεται ως CCR7

negCD45RA

negCD28

αρν) και Emra ( ορίζεται ως CCR7

negCD45RA

posCD28

αρν) υποσύνολα ήδη πριν από τη θεραπεία (δηλαδή κατά το χρόνο της λευκαφαίρεσης) (Εικόνα 1Γ? δεξί πάνελ). Αυτά τα υποσύνολα αυξηθεί περαιτέρω και έγινε κυρίαρχη μετα-ACT. Σε υγιείς δότες, όπως προηγμένα διαφοροποίηση κυττάρου τελεστή δεν παρατηρείται τυπικά εντός EBV-ειδικά CD8 κύτταρα Τ, η οποία μοιάζει περισσότερο με αποκρίσεις CMV-ειδικών Τ κυττάρων [14,32]. Σε ασθενέστερη βαθμό, διαφοροποίηση advanced ενεργού κυττάρου παρατηρήθηκε επίσης στο συνολικό πισίνα κυττάρου CD8 Τ (Σχήμα 1Β? Δεξιό πλαίσιο), υποδεικνύοντας ότι προηγούμενες ιστορίες της εξέλιξης όγκων και έλαβε θεραπείες, όπως χημειοθεραπεία και την ανοσοθεραπεία, μπορεί να επηρεαστεί η CD8 Τ διαμέρισμα κυψελίδας.

Παροδική λεμφο-εξάντληση δεν καταλήγει σε EBV επανενεργοποίηση

για να εξεταστεί η ικανότητα του ΕΒν αντιγονο-ειδική απόκριση CD8 Τ κυττάρων για τον έλεγχο ιική δράση κατά τη διάρκεια καταστάσεων μειωμένης ανοσολογικής ελέγχου, προσδιορίσαμε αν η μη-μυελοαφανιστική χημειοθεραπεία θα μπορούσε να έχει ως αποτέλεσμα EBV επανενεργοποίηση. επίπεδα αντισώματος στο πλάσμα για ιικό αντιγόνο καψιδίου (VCA) IgG και IgM, πυρηνικό αντιγόνο Epstein-Barr (ΕΒΝΑ) IgG, και πρώιμου αντιγόνου (ΕΑ) IgG μετρήθηκαν πριν και μετά TLD και θεραπείες ACT (Σχήμα 1D) [33]. EBV-ειδικών αντισωμάτων παρέμεινε σταθερή για αρκετούς μήνες μετά τη θεραπεία σε όλους τους ασθενείς. Αυτό είναι σύμφωνο με λανθάνουσα μόλυνση EBV χωρίς ιογενή επανενεργοποίηση, αν και το τελευταίο δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς. Το DNA EBV αντιγραφή αριθμοί ανά εκατομμύριο PBMCs ήταν κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης με PCR πραγματικού χρόνου αντίδρασης σε δείγματα αίματος πριν και μετά TLD (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η ex vivo EBV ειδικών για το αντιγόνο ρεπερτόριο CD8 Τ κυττάρων μετά από παροδική λεμφο-εξάντληση αποκαλύπτει κλωνοτυπική επιμονή παρά τις διακυμάνσεις της συχνότητας

Έχουμε ήδη αναπτύξει μια στρατηγική της παγκόσμιας ενίσχυσης cDNA στο επίπεδο του 5-κύτταρο κατάλληλο για την άμεση

ex vivo

αξιολόγηση των ατομικών TCR BV-CDR3beta (TRBV) χρήση τμήμα γονιδίου [14,34]. Εν συντομία, cDNA δεξαμενές EBV επίτοπο-ειδικά CD8 Τ κύτταρα αρχικά παράγονται και χρησιμοποιούνται ως μια οθόνη για την υποτροπιάζουσα οικογένειες TRBV. Στη συνέχεια, η κυριαρχία της κάθε οικογένειας TRBV προσδιορίστηκε με δοκιμή κάθε δείγμα 5-κυττάρων, η οποία περιλαμβάνει την πισίνα για τα θετικά οικογένειες TRBV, και αντιπροσωπεύει το ισοδύναμο των 300 έως 450 του ιού-ειδικών CD8 Τ κύτταρα ανά άτομο. Τα ενισχυμένα τμήματα γονιδίου TRBV-CDR3-JB τελικώς η αλληλουχία ή PCR-clonotyped να προσδιορίσει τη μοναδική TCR υπογραφή κάθε κλωνοτυπική Τ κυττάρων, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, αρχικά συνέκρινε την κλωνοτυπική ρεπερτόριο TCR του απευθείας

ex vivo

ταξινομημένο 5-κυττάρου ΕΒν-ειδικών Τ κυττάρων με εκείνη των μονά κύτταρα Τ που παράγονται από

in vitro

περιοριστική αραίωση καλλιέργειες . Συγκρίσιμες αναλογίες των υπογραφών κλωνοτυπική επιμέρους TCR βρέθηκαν κατά τη χρήση του

ex vivo

ταξινομημένο 5-κυττάρου και το

in vitro προσεγγίσεις

Τ κλωνοποίηση κυττάρων (Σχήμα S2A), σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [14 , 15,28]. Επιπλέον, ανεξάρτητα εκτελούνται

ex vivo

διαλογή πειράματα σε ενιαίο ιό αντιγόνου-ειδικά Τ κύτταρα, αποκάλυψε παρόμοια σχετικές συχνότητες των κυρίαρχων clonotypes Τ κυττάρων (Σχήμα S2B). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η άμεση

ex vivo

προσέγγιση μας επιτρέπει την υψηλής ανάλυσης μοριακός χαρακτηρισμός του ρεπερτορίου κλωνοτυπική

in vivo

σε σαφώς καθορισμένες αντιγόνο-ειδικών υποπληθυσμών.

επόμενο καθόρισαν την εμμονή του EBV BMFL1 ειδικών clonotypes Τ κυττάρων σε υγιή άτομα την πάροδο του χρόνου. Η πλειονότητα των clonotypes ήταν παρόντες τόσο νωρίς και αργά χρονικά σημεία (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, μια συσχέτιση έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των συχνοτήτων των clonotypes ανιχνευθεί σε μια περίοδο 4 ετών (Σχήμα 2Β? Rho = 0,739,

P

& lt? 0.001, συσχέτισης Spearman του). Θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε την εμφάνιση νέων clonotypes την πάροδο του χρόνου, όμως αυτές οι πρόσφατα ανιχνεύθηκε clonotypes ήταν χαμηλών συχνοτήτων (

& lt? 5%) (Σχήμα 2Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με εκείνα που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν από την ομάδα μας [14] και άλλοι [23], και δείχνουν ότι μετά την καθιέρωσή τους σε υγιείς ενήλικες, η κλωνική σύνθεση κατά τη διάρκεια της χρόνιας έρπητα ιούς λοίμωξη διατηρείται σταθερό για τουλάχιστον αρκετά χρόνια.

Α και C. TRBV σύνθεση κλωνοτυπική ΕΒν-ειδικών CD8 Τ κυττάρων σε PBMCs από δύο υγιείς δότες (Α) σε πρώιμα (2002) και αργά (2006) χρονικά σημεία, και σε ΜΚΠΑ από τέσσερις ασθενείς με μελάνωμα ( C) Λευκά χρονικό σημείο και μετά-ACT. Κάθε κλωνοτυπική αντιπροσωπεύεται από συγκεκριμένη οικογένεια TRBV του και τον κωδικό αριθμό της (clono). Οι συχνότητες κλωνοτυπική υπολογίζονται από την παρουσία του κάθε κλωνοτυπικό αλληλουχία μεταξύ των μεμονωμένων δειγμάτων 5-κυττάρων (υγιείς δότες, n = 142? μελάνωμα ασθενών, n = 344) ταξινομούνται άμεσα

ex

vivo

. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι συχνότητες μόνο είτε από νέο «αύξηση» ή «μειώνονται» οι clonotypes απεικονίζονται. Β και D. Η συσχέτιση των επιμέρους συχνοτήτων κλωνοτυπική λαμβάνεται από

ex

vivo

ταξινομημένο δειγμάτων 5-κυττάρου (Β) μεταξύ των δειγμάτων αίματος σε πρώιμα (2002) και αργά (2006) χρονικά σημεία από δύο υγιείς δότες και (Δ) μεταξύ Λευκών και μετα-ACT από πέντε ασθενείς με μελάνωμα (συσχέτισης Spearman του). Ένθετα δείχνουν τη συσχέτιση μεταξύ TCR clonotypes με συχνότητες κάτω από 10% για υγιείς δότες και 20% για τους ασθενείς.

Η

Εμείς αξιολογηθεί περαιτέρω η EBV αντιγόνου-ειδική ΤΟΚ ρεπερτορίου σε πέντε ασθενείς με μελάνωμα τον προσδιορισμό του δυναμικού ανάκαμψης της δεσπόζουσας clonotypes Τ κυττάρων μετά TLD και ACT (Σχήμα 2C). Ομοίως με τις υγιείς δότες, το συνολικό ρεπερτόριο TCR επέμενε ακόλουθα TLD και ACT με τη μεγάλη πλειοψηφία των clonotypes είναι ανιχνεύσιμη πριν και μετά τη θεραπεία (Σχήμα 2C). Εκτός από τον ασθενή LAU 936, οι clonotypes που είτε εξαφανίστηκαν ή εμφανίστηκε ήταν χαμηλής συχνότητας (& lt? 5%), η οποία μπορεί να σχετίζεται με την ευαισθησία της τεχνικής περισσότερο από την πραγματική εμφάνιση ή την εξαφάνιση ενός συγκεκριμένου κλωνοτυπική. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε πιο έντονη διακυμάνσεις στις συχνότητες των ανιχνεύσιμων clonotypes μεταξύ των ασθενών σε σύγκριση με υγιείς δότες, η οποία ήταν ιδιαίτερα εμφανής για τις clonotypes με συχνότητες & lt? 20% (Σχήμα 2D). Συλλογικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η κλωνική σύνθεση του EBV-ειδικά CD8 Τ κυττάρων σε παγκόσμιο επίπεδο διατηρήθηκε σε ασθενείς με μελάνωμα που υποβάλλονται σε TLD και ακολουθείται από ανοσοδιέγερσης, παρά τις διακυμάνσεις στις συχνότητες εντός συγκεκριμένων ασθενών και για clonotypes ανιχνεύσιμη σε χαμηλότερες συχνότητες.

ΕΒν αντιγόνο-ειδική clonotypes φέρουν αλληλουχίες κοινό TRBV συχνά μοιράζονται μεταξύ υγιείς δότες και ασθενείς με μελάνωμα

Μια σημαντική ομοιότητα του EBV επίτοπο-ειδικά CD8 Τ κύτταρα μεταξύ υγιών ενηλίκων και ασθενών ήταν το προτιμησιακό

in vivo

επιλογή της δεσπόζουσας clonotypes με αλυσίδες TRBV που ανήκουν στο

TRBV14

,

TRBV20

και

TRBV29

οικογένειες (Σχήμα 2). Έχουμε επίσης εντοπίσει τουλάχιστον δεκατέσσερις σειρές δημόσια TRBV, με δύο CDR3 μοτίβα RDxTGNGY και VGxGGTNEKL, οι οποίες αντιπροσώπευαν πάνω-και μοιράστηκε μέσα σε υγιή άτομα και ασθενείς με μελάνωμα (Εικόνα 3Α). Οι δημόσιες clonotypes ορίζεται από την παρουσία του ίδιου ίδια αλληλουχία TRBV-ΟϋΚ3-BJ βρέθηκαν σε τουλάχιστον δύο άσχετα άτομα. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [35], πολλές από τις δημόσιες clonotypes TRBV που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη ήταν κωδικοποιούνται από δύο ή τρεις διαφορετικές παραλλαγές αλληλουχίας νουκλεοτιδίων. Όταν συγκρίναμε τις συχνότητες των clonotypes δημόσια TRBV εντός των συνολικών EBV-ειδικές αποκρίσεις CD8 Τ κυττάρων, το ένα τρίτο από αυτούς εκπροσωπούνται κυρίαρχη clonotypes (με συχνότητες & gt? 5%) (Σχήμα 3Β). Μεταξύ 35 και 48% του ΕΒν αντιγόνο ειδικό clonotypes βρέθηκαν στις χαμηλές συχνότητες (μεταξύ 1 και 5%), ενώ περίπου το ένα τέταρτο βρέθηκαν μόνον μιά φορά σε υγιείς δότες ή ασθενείς. Μαζί, τα δεδομένα μας έδειξαν απόδειξη για το υψηλό επίπεδο της ομοιότητας των EBV BMFL1 ειδικών CD8 Τ κύτταρα μεταξύ των ασθενών με μελάνωμα και υγιή άτομα, όπως φαίνεται από (i) την κατανομή των συχνών ακολουθιών δημόσια TRBV και (ii) Η διατήρηση αυτών των δημόσιων TRBV clonotypes με το χρόνο και μετά από TLD.

Α. Συγκέντρωση των αλληλουχιών TCR βήτα-περιοχής 14 κοινό αμινοξύ ανιχνεύεται μεταξύ των τριών υγιών ατόμων και πέντε ασθενείς με μελάνωμα. Κάθε TCR βήτα αλυσίδων κλωνοτυπική περιγράφεται από το τμήμα TRBV, αλληλουχία CDR3-βήτα, τμήμα TRBJ, αριθμός ακολουθίας νουκλεοτιδίων των παραλλαγών προσδιορίζονται για κάθε αλληλουχία αμινοξέων, καθώς και η αναλογία υγιών δοτών και των ασθενών από τα οποία ταυτοποιήθηκε κάθε ακολουθία. Β Κατανομή των δημόσιων αλληλουχιών εντός των συνολικών EBV-ειδικά CD8 Τ κυττάρων σε υγιείς δότες και ασθενείς ανάλογα με τη σχετική συχνότητα τους? κυρίαρχο clonotypes (με συχνότητα & gt? 5%) εκπροσωπούνται σε μαύρο, χαμηλή κυρίαρχη (1-5%) σε γκρι και μοναδικές ακολουθίες στα λευκά.

Η

Ενισχυμένη γονίδιο polyfunctionality έκφραση από μεμονωμένες EBV αντιγόνου-ειδικά CD8 Τ κυττάρων μετά από παροδική λεμφο-εξάντληση και του ανοσοποιητικού ανασύσταση

Για την περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης των TLD και ACT, χαρακτηρίσαμε την εξέλιξη του EBV επίτοπο ειδική απόκριση CD8 Τ κυττάρων σε ασθενή LAU 1013 που υποβλήθηκαν σε δύο διαδοχικούς κύκλους TLD και ανοσοδιέγερσης (Σχήμα 4Α), χωρίς να δείχνει σημάδια EBV επανενεργοποίησης (Εικόνα 1D). Η συχνότητα των EBV-ειδικό πρώιμο διαχωριζόμενες «μνήμη-όπως το» EM28

POS και αργά διαχωριζόμενες EM28

αρν /Emra CD8 Τ κυττάρων ήταν συγκρίσιμα μεταξύ των δύο λευκαφαίρεση χρονικά σημεία (Λευκά Ι και Λευκά II) ( Σχήμα 4Β). Σύμφωνα με τα δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 1, παρατηρήσαμε αυξημένη διαφοροποίηση των κυττάρων τελεστή των EBV-ειδικών Τ κυττάρων πριν (σε Leuka Ι) και μετά από λεμφο-εξάντληση (Leuka II), σε σύγκριση με τον ιό-ειδικών Τ κυττάρων από υγιείς δότες .

Α. Πρόγραμμα του θεραπευτικού σχήματος για ΤΔΜ ασθενή 1013, που έλαβαν δύο γύρους TLD (απεικονίζεται ως γκρι κουτιά). Τα γκρίζα βέλη δείχνουν λευκαφαίρεση (Λευκά Ι και Λευκά II) και επανέγχυση των PBMCs, αντίστοιχα. Δείγματα αίματος ελήφθησαν κατά την ημέρα 45 (μετά-Leuka Ι) και την ημέρα 15/22 (μετα-Leuka II) μετά την επανέγχυση. Β Φαινότυπος του EBV BMFL1-ειδικά κύτταρα CD8 Τ (αριστερό πάνελ) και το σύνολο των CD8 Τ κύτταρα (δεξιά πλευρά) που δείχνει τις αναλογίες της έγκαιρης διαφοροποιούνται EM28

pos (? CCR7

negCD45RA

negCD28

pos) και αργά-διαφοροποιημένα (που αποτελείται από EM28

αρν? CCR7

negCD45RA

negCD28

αρνητικά και Emra? CCR7

negCD45RA

posCD28

αρν) υποσύνολα σε PBMCs που λαμβάνονται από LAU ασθενής 1013 στο Leuka Ι (n = 2) και Leuka II (n = 3) χρονικά σημεία. Οι ράβδοι σφάλματος (μέση τιμή +/- SD) αντιπροσωπεύουν ανεξάρτητα πειραματικών αντιγράφων. Γ Άμεση

ex

vivo

αθροιστική έκφραση της μνήμης /γονιδίων παλιννόστησης που σχετίζονται με (

CD62L /ΠΩΛΗΣΗ

,

CCR5

,

IL7R

,

CD27

και

EOMES

) και τα γονίδια τελεστές που σχετίζονται με (

PRF1

,

KLRD1 /CD94

,

IFNg

και

GZMB

). Ενιαία EBV-ειδικών CD8 Τ κύτταρα ταξινομήθηκαν από νωρίς διαχωριζόμενες EM28

POS και αργά διαχωριζόμενες Emra στα Λευκά Ι (n = 266) και Λευκά ΙΙ (n = 162) χρονικά σημεία και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την παγκόσμια ενίσχυση του cDNA, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

P

-τιμές διεξήχθησαν με μονόδρομη δοκιμή ANOVA? ns, δεν είναι σημαντική.