Αφηρημένο

κοντακτίνης-1 έχει αποδειχθεί ότι για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Αναφέρουμε εδώ ότι knockdown του κοντακτίνης-1 σε Α549 κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα μειώνεται εισβολή των κυττάρων Α549 και την ικανότητα του κυττάρου να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Μείωση του κοντακτίνης-1 είχε σαν αποτέλεσμα προς τα πάνω ρύθμιση της Ε-καδερίνης, συνεπής με Ε-καδερίνης είναι ανασταλτικές του καρκινικού κυττάρου εισβολής. Σε μια προσπάθεια για τη διερεύνηση των μηχανισμών σύμφωνα με την οποία κοντακτίνης-1 μειώνει την έκφραση Ε-καδερίνης, παρατηρήσαμε ότι κοντακτίνης-1 παίζει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση ΑΚΤ, καθώς knockdown του κοντακτίνης-1 εξασθενημένα ενεργοποίηση ΑΚΤ. Επιπροσθέτως, η αναστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ ενίσχυσε σημαντικά την έκφραση Ε-καδερίνης, μια παρατήρηση που μιμείται την κατάσταση που παρατηρείται σε κοντακτίνης-1 knockdown, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του ΑΚΤ παίζει ρόλο στην κοντακτίνης-1-μεσολαβούμενη ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης. Επιπλέον, μπορέσαμε να δείξουμε ότι knockdown του κοντακτίνης-1 δεν μείωσε περαιτέρω την ικανότητά εισβολή Α549 κυττάρου, όταν η ενεργοποίηση ΑΚΤ ανεστάλη με έναν αναστολέα ΑΚΤ. Για να υποστηρίξει περαιτέρω τα ευρήματά μας, έχουμε υπερεκφράζεται CNTN-1 σε δύο καρκινικών κυττάρων CNTN-1 null μαστού γραμμές που εκφράζουν E-cadherin. Μετά την υπερέκφραση, CNTN-1 μείωσε τα επίπεδα Ε-καδερίνης σε μία κυτταρική σειρά και αυξημένη ενεργοποίηση ΑΚΤ στην άλλη. Επιπλέον, στη μελέτη μας 63 πρωτογενείς καρκίνους του πνεύμονα, παρατηρήσαμε το 65% των πρωτογενών καρκίνων του πνεύμονα είναι κοντακτίνης-1 θετικά και σε αυτά τα καρκινώματα, 61% ήταν Ε-καδερίνης αρνητική. Συλλογικά, παρέχουμε αποδείξεις ότι κοντακτίνης-1 παίζει ένα ρόλο στην ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης στον καρκίνο του πνεύμονα και ότι η ενεργοποίηση ΑΚΤ συμβάλλει σε αυτή τη διαδικασία. Σε μια μελέτη των μηχανισμών που ευθύνονται για κοντακτίνης-1 για να ενεργοποιήσετε την ΑΚΤ, αποδείξαμε ότι νοκ ντάουν της CNTN-1 σε κύτταρα Α549 δεν ενισχύουν την έκφραση ΡΤΕΝ αλλά απορυθμίζεται PHLPP2, μια φωσφατάση που αποφωσφορυλιώνει ΑΚΤ. έτσι Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι κοντακτίνης-1 ενισχύει την ενεργοποίηση ΑΚΤ εν μέρει με την πρόληψη PHLPP2 μεσολάβηση ΑΚΤ dephosphrorylation

Παράθεση:. Yan J, Wong Ν, Hung C, Chen WX-Υ, Tang D (2013) Contactin- 1 Μειώνει E-καδχερίνη Έκφραση Μέσω Ενεργοποίηση ΑΚΤ στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (5): e65463. doi: 10.1371 /journal.pone.0065463

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 29 Οκτ 2012? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 28, 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τον καρκίνο του προστάτη Καναδά για την Δ Τανγκ. Οι συγγραφείς ήθελα επίσης να αναγνωρίσουμε την οικονομική στήριξη από την υγειονομική περίθαλψη του Αγίου Ιωσήφ στο Hamilton, Ontario, Canada στο Χάμιλτον Κέντρο Νεφρού Ερευνών (HCKR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η νευρική πρωτεΐνη κυτταρικής πρόσφυσης κοντακτίνης-1 (CNTN-1) αποτελείται από έξι περιοχές Ig, τέσσερα μοτίβα φιμπρονεκτίνης-όπως, και ένα γλυκοσυλοφωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (GPI) -moiety [1]. Το τμήμα GPI άγκυρες CNTN-1 προς την εξωτερική μεμβρανική επιφάνεια των κεντρικών και περιφερικών νευρώνων [2], [3]. CNTN-1 παίζει ένα ρόλο στην επέκταση άξονα και το σχηματισμό του διαφραγματικά-όπως ενώσεις μεταξύ νευραξόνων και μυελινωτικά νευρογλοιακά κύτταρα [4] – [6], Επιπλέον, CNTN-1 δρα σαν ένας συνδετήρας για τον υποδοχέα Notch στον εγκέφαλο με αποτέλεσμα ολιγοδενδροκυττάρων ωρίμανση [7]. Σύμφωνα με αυτές τις in vitro παρατηρήσεις, in vivo μελέτες αποκαλύπτουν έναν κρίσιμο ρόλο των CNTN-1 στο σχηματισμό καθοδήγηση νευράξονα και συνάψεων [8] – [10]. Νοκ ντάουν της CNTN-1 στο

Xenopus

embroys οδήγησε στην παραπλάνηση και την άρση σχηματισμού δεματίων του τριδύμου νεύρου άξονες [11]. Ότι, τα ποντίκια με ανεπάρκεια σε CNTN-1 πεθαίνουν μέσα σε λίγες εβδομάδες, λόγω των σοβαρών αταξία [4], [8].

Αν και η απώλεια της CNTN-1 λειτουργία, ως αποτέλεσμα της γονιδιακής knockout ή αυθόρμητες μεταλλάξεις σε

CNTN-1

, επηρεάζει το κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, αλλά όχι τις νευρομυϊκές συνάψεις (NMJs) σε ποντικούς [8], [12], οι μεταλλάξεις στο

CNTN-1

γονίδιο έχει εμπλακεί σε κίνδυνο NMJs λειτουργία στον άνθρωπο [13]. Μια μετάλλαξη με αποτέλεσμα την εισαγωγή ενός πρόωρου κωδικονίου στοπ εντός του τρίτου τομέως Ig σχετίστηκε με οικογενή μορφή της θανατηφόρου συγγενή μυοπάθεια σε ανθρώπους [13]. Παρά τη συσσώρευση έρευνα για CNTN-1 λειτουργία, λίγα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία του εκτός του νευρικού συστήματος. Παρά το γεγονός ότι, Αναλύσεις αποτύπωσης Northern του παγκρέατος, των πνευμόνων, των νεφρών και των σκελετικών μυών αποκάλυψαν μόνο τα χαμηλά επίπεδα της CNTN-1 μεταγραφημάτων [14], η λειτουργία του σε αυτούς τους ιστούς και έκφραση σε άλλους ιστούς έχει ακόμη προσδιοριστεί. Μόνο πρόσφατα έχουν εκεί αναφορές CNTN-1 έκφραση σε ασθένειες εκτός του νευρικού συστήματος, κυρίως με τη συμμετοχή του στον καρκίνο. CNTN-1 ανιχνεύθηκε σε πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα και του knockdown CNTN-1 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα αναστέλλεται ειδικά μετάσταση τους, αλλά όχι ο σχηματισμός των τοπικών όγκων ξενομοσχεύματος σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [15]. Αυτό οφείλεται εν μέρει στο ουσιαστικό ρόλο της CNTN-1 σε ακτίνη αναδιάταξη του κυτταροσκελετού και δομών εστιακής προσκόλλησης [15]. Επιπλέον, CNTN-1-μεσολαβούμενη μετάσταση ρυθμίζεται από VEGF-C και CNTN-1 ενισχύει GTP-δεσμευμένη RhoA η οποία αποδίδεται στο CNTN-1-προωθείται εισβολή καρκίνου του πνεύμονα και τη μετάσταση [15], [16]. ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα με υψηλά επίπεδα CNTN-1 έχουν φτωχή πρόγνωση [15]. Σε συμφωνία με τις εκθέσεις αυτές, παράγοντες που ενισχύει τη μετάσταση καρκίνου του πνεύμονα ρυθμίζει προς τα πάνω επίσης CNTN-1 [17]. Επιπλέον, CNTN-1 έχει αναφερθεί σε μελάνωμα [18] και σχετίζεται με μετάσταση σε καρκίνο του στομάχου, στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και καρκίνο του οισοφάγου [19] – [22].

Παρά συσσώρευση ενδείξεις που υποστηρίζουν ένα ρόλο της CNTN-1 στην μετάσταση του καρκίνου, οι υποκείμενοι μηχανισμοί υπεύθυνοι για αυτή τη διαδικασία παραμένει ασαφής. Για να διερευνήσουν περαιτέρω CNTN-1-μεσολάβηση ογκογένεση, έχουμε νοκ-κάτω CNTN-1 στο Α549 καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Αυτό οδήγησε σε μια προς τα πάνω ρύθμιση της Ε-καδερίνης. Στην πρωτοβάθμια καρκίνωμα του πνεύμονα, τα υψηλά επίπεδα του CNTN-1 συνυπήρχαν με χαμηλά επίπεδα Ε-καδερίνης. Μηχανιστικά, CNTN-1 παίζει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση ΑΚΤ, η οποία με τη σειρά της αναστέλλει την έκφραση Ε-καδερίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές γραμμές, τα πλασμίδια και οι αναστολείς

Καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές (Α549 και Η1299), ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές γραμμές (MCF7, ΒΤ549, ΒΤ474, MDA-MB-453, Τ47ϋ και ZR751), ο καρκίνος του νεφρού κυτταρικές γραμμές (Α498 και 786-0), ένα τραχηλικό καρκίνο κυτταρική σειρά (HeLa) , μια κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώματος (U87) και κύτταρα 293Τ (ανθρώπινα 293 νεφρού εμβρυϊκά επιθηλιακά κύτταρα) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Α549, ΒΤ549, Η1299, T47D, ΒΤ474, ZR751, MDA-MB-453 και 786-0 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640. MCF7, HeLa και 293Τ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ και Α498 και U87 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα ΜΕΜ. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% FBS (Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ) και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Burlington, ΟΝ). Η ταυτότητα του Α549 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση STR πραγματοποιείται από DDC Ιατρική (Fairfield, ΟΗ). CNTN-1 shRNA αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) και CNTN-1 ισομορφή 3 cDNA αγοράστηκε από την Open Biosystems (Huntsville, AL). Ο αναστολέας ΑΚΤ VIII αγοράστηκε από Calbiochem (EMD, Mississauga, ΟΝ). κατασκεύασμα οδηγείται λουσιφεράσης E-cadherin υποστηρικτής παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Antonio García de Herreros, Universitat Pompeu Fabra, Ισπανία [23].

Νοκ ντάουν της CNTN-1

φουρκέτα Τα siRNAs (έλεγχος /Ctrl και CNTN-1) εκφράστηκαν από έναν ρετροϊό που βασίζεται shRNA φορέα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Εξόντωση CNTN-1 διεξήχθη σύμφωνα με δημοσιευμένες συνθήκες μας [24] – [26]. Εν συντομία, ένα gag-pol που εκφράζουν φορέα, ένα rev φορέα έκφρασης και ένα περίβλημα φορέα έκφρασης (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ΟΝ) ήταν συν-επιμολύνθηκαν παροδικώς με ένα σχεδιασμένο ρετροϊικό πλασμίδιο σε κύτταρα 293Τ. Το μέσο που περιέχει ιό συλλέχθηκε 48 ώρες αργότερα, διηθείται μέσω φίλτρου 0,45 μΜ, και φυγοκεντρήθηκε στα 20.000 g για 120 λεπτά για να συμπυκνωθεί το ρετροϊό. Polybrene (10 μg /ml, Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ) προστέθηκε πριν επιλέχθηκαν μόλυνση και τα κύτταρα για σταθερή ενσωμάτωση με πουρομυκίνη (1 μg /mL, Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ).

ρετροϊικοί υπερέκφραση του CNTN-1

Ανθρώπινο CNTN-1 ισομορφή 3 cDNA αγοράστηκε (Open Biosystems, Huntsville, AL) και περαιτέρω τροποποιείται για να παράγει το πλήρες μήκος ισομορφή 1 του CNTN-1. PCR εκκινητές συντέθηκαν πλευρίζουν το θραύσμα άκρο C παρούσα σε ισομορφή 1 αλλά λείπουν από ισομορφή 3. RNA απομονώθηκε από κύτταρα Α549 με TRIZOL (Life Technologies, Burlington, ΟΝ) και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για RT-PCR. Η προκύπτουσα C άκρο PCR θραύσμα συνδέθηκε εντός pBluescript KS + και στη συνέχεια αποκόπτεται στη θέση περιορισμού για MfeI? μια μοναδική θέση που υπάρχει στο ισομορφή 1 και 3 ισομορφή, λίγα ζεύγη βάσεων ανοδικά πριν οι δύο αλληλουχίες διαφέρουν. Το θραύσμα C άκρο στη συνέχεια συνδέθηκε με το εμπορικά αγοράστηκαν ισομορφή 3. Η πλήρους μήκους ισομορφή 1 cDNA για CNTN-1 στην συνέχεια κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα ρετροϊού, pBabe. Επιβεβαίωση των θετικών κλώνων προσδιορίστηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Η υπερέκφραση του CNTN-1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα gag-pol φορέα έκφρασης και ένα φάκελο φορέα έκφρασης (VSV-G) (Stratagene, Mississauga, ΟΝ). Όλα τα στάδια διεξήχθησαν με τον ίδιο τρόπο που περιγράφεται παραπάνω για την knockdown του CNTN-1. Ο φορέας pBabe χωρίς CNTN-1 χρησιμοποιήθηκε ως ένα άδειο φορέα ελέγχου.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Δοκιμασία

Ένα σύνολο 1.000 κυττάρων Α549 shCTRL και shCNTN-1 κύτταρα εμβολιάζονται σε πλάκα 96 φρεατίων και επωάστηκαν στους 37 ° C για 5 ημέρες. Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας WST-1 κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Millipore, Mississauga, ΟΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. αναγνώσεις απορρόφησης μετρήθηκαν με μια συσκευή ανάγνωσης πλακών στα 420mn.

Εισβολή δοκιμασία

Τροποποιημένο θάλαμοι Boyden εμπορικώς αγοράστηκαν αποτελείται από ένθετα με μια μεμβράνη πόρου 8 μm επικαλυμμένα με Matrigel (BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ ) τοποθετήθηκαν σε μια πλάκα 24 φρεατίων. δοκιμασίες Εισβολή διεξήχθησαν σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα ένθετα matrigel δόθηκαν 2 ώρα για να επανυδατώνονται στους 37 ° C πριν από τη χρήση με την παρουσία 0,5 ml μέσου. Πλήρες μέσο (0.5 ml) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) τοποθετήθηκε στον κάτω θάλαμο. Ένα σύνολο 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν στην κορυφή θάλαμο του ενθέτου σε 0.5 ml μέσου χωρίς ορό για 22 ώρες. Κύτταρα που πέρασαν μέσα από τις μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.5%, Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ). Ποσοστό μεταστατικών κυττάρων υπολογίστηκε διαιρώντας τον αριθμό των κυττάρων που διέρχεται μέσω της μεμβράνης Matrigel μέγεθος πόρου 8 μm από τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν διαμέσου της μεμβράνης ελέγχου και πολλαπλασιάζοντας με το 100.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη Δοκιμασία

Α549 shCTRL και τα κύτταρα Α549 shCNTN σπάρθηκαν σε ατομικά φρεάτια πλακών έξι-φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 2 κ.εκ. μέσου 2Χ περιέχει 0.25% αγαρόζης. Μετά από 3 εβδομάδες, 5 τυχαία πεδία ανά φρεάτιο εξετάστηκαν για αποικίες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Κατά μέσο όρο περιοχή αποικία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Image Pro 5.0 λογισμικό. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Western ανάλυση κηλίδος

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει 20 mM Tris (ρΗ 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 25 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM NaF, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 0,1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM PMSF, 2 μg /ml λευπεπτίνη και 10 μg /ml απρωτινίνη (Sigma Aldrich, Oakville, ON). Ένα σύνολο 50 μα κυτταρολύματος, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά διαχωρίστηκε σε SDS-PAGE γέλη και μεταφέρθηκαν σε Hybond ECL Amersham μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham, Baie d’Urfe, QC). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Κατάλληλα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα επωάστηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ECL Western Blotting Kit (Amersham, Baie d’Urfe, QC). Τα πρωτεύοντα και δευτερεύοντα αντισώματα και οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: (amp 1:200, Ε &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ) αντι-CNTN-1? αντι-ΑΚΤ (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Ser473 φωσφορυλίωση αντι-ΑΚΤ (1:1000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), ΟδΚ3β-αντι Ser9 φωσφορυλίωση (1? 1000, κυτταρική σηματοδότηση, Danvers , ΜΑ), αντι-ΟδΚ3β (1:1000, Upstate Biotechnology, Billerica, ΜΑ), αντι-Ε-cadherin (1:2500, BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ), αντι-σαλιγκάρι (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-PHLPP2 (1:5000, Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ), αντι-GAPDH (1:5000, Cell Signaling, Danvers, ΜΑ), αντι-ακτίνης (1:1000, Santa Cruz), αντι-κατσίκα (1:3000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-ποντικού (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ΟΝ) και αντι-κουνελιού (1:3000, GE Healthcare, Mississauga, ΟΝ)

χρώση ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία, όπως ορίζεται στις θρύλους σχήμα. χρώση ανοσοφθορισμού διεξήχθη με τον καθορισμό κυττάρων με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0.05% σαπωνίνη (Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ) για 15 λεπτά. Αντι-CNTN-1 (1:20, R &? Συστήματα D, Minneapolis, ΜΝ) και αντι-Ε-καδερίνης (1:200, Βϋ Biosciences, Mississauga, ΟΝ) στη συνέχεια προστέθηκαν στα πλακίδια στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά το πλύσιμο, δευτερογενή αντισώματα, FITC- ή ροδαμίνη (TRITC) Donkey IgG (1:200, Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, ΡΑ), εφαρμόστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το slide στην συνέχεια καλύπτεται με μέσο στερέωσης Vectashield με DAPI (Vector Laboratories, Burlingam, CA). Εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Carl Zeiss, Axiovert 200).

Λουσιφεράσης δοκιμασία

Α549 Ctrl shRNA και Α549 CNTN-1 κύτταρα shRNA συν-επιμολύνθηκαν με pGL3 Ε-καδερίνης προαγωγέα κατασκεύασμα λουσιφεράσης (ευγενική προσφορά από τον Dr. Garcia de Herreros) και το πλασμίδιο pCH110-lacZ με Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Burlington, ΟΝ). Μετά από 48 ώρες, λουσιφεράση (Promega, Madison, WI) και δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης προσδιορίστηκε. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με β-γαλακτοσιδάση με διαίρεση του σήματος δραστικότητα λουσιφεράσης με το σήμα δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Tissue μικροσυστοιχία (TMA) διαφάνειες (LC723, LC10013) που περιέχει 63 αδενοκαρκινώματα πνεύμονα αγοράστηκαν από την US Biomax (Rockville, MD). TMA πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, καθαρίστηκαν σε σειρά αιθανόλης, και το θερμικά επεξεργασμένο για 30 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου (ρΗ = 6,0) σε ένα ατμόπλοιο τροφίμων. Πρωτογενή αντισώματα ειδικά για CNTN-1 (1:50, R &? D Systems, Minneapolis, ΝΜ) και Ε-καδερίνης (1:400, BD Biosciences, Mississauga, ΟΝ) επωάστηκαν με τα τμήματα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Οι αρνητικοί έλεγχοι επωάστηκαν με ένα μη ειδικό ποντίκι, κατσίκα ή IgG κουνελιού. Βιοτινυλιωμένο δευτερεύον IgG και αντιδραστήριο Vector ABC (Vector Laboratories, Burlingam, CA) προστέθηκαν στη συνέχεια σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πλύσεις έγιναν με PBS. αντίδραση χρωμογόνου διεξήχθη με διαμινοβενζιδίνη (Vector Laboratories, Burlingam, CA), και με αιματοξυλίνη (Sigma Aldrich, Oakville, ΟΝ). TMA διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ScanScope και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageScope (Aperio, Vista, CA). Εξετάστηκαν επίσης με το χέρι όλα τα σημεία (βάφονται πυρήνες). . Οι βαθμολογίες που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας το λογισμικό Imagescope μετατράπηκαν σε ένα Η-βαθμολογία με χρήση του τύπου [(Η-βαθμολογία =% θετικά X (ένταση + 1)] [27], [28] Σκορ αποδόθηκαν σε μία κλίμακα από 0 έως 3 (0 – αρνητικά ή χρώση φόντο, 1 – ασθενή χρώση, 2 – μέτρια χρώση, 3 -. ισχυρή χρώση)

πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΡΙΖΟΙ (Life Technologies, Burlington, ΟΝ). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκθέτη III (Life Technologies, Burlington, ΟΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 μα του RNA μετατράπηκε σε cDNA στους 65 ° C για 6 λεπτά ακολουθούμενη από 2 λεπτή επώαση σε πάγο, 25 ° C για 11 λεπτά, 50 ° C για 60 λεπτά και 70 ° C για 15 λεπτά. Real time PCR εναρκτήρες που χρησιμοποιούνται για ακτίνη, PHLPP2, SIP1, Slug, Twist, Ε47 και Ε-καδερίνης παρατίθενται στον πίνακα 1. Η αποδοτικότητα της PCR για κάθε σετ εκκινητών είναι η εξής: 93% ακτίνης, SIP1 86%, 97% Slug, E47 96%, Twist 92%, PHLPP2 92% και Ε-καδερίνης 85% σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του ΑΒΙ 7500 Fast Σε πραγματικό. Σύστημα PCR Ώρα (Applied Biosystems, Burlington, ΟΝ) με την παρουσία SYBR πράσινο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Burlington, ΟΝ). Εν συντομία, η κάθε αντίδραση αποτελείτο από 1 μι cDNA, 0.25 μL εμπρός εναρκτήρα (10 μΜ), 0,25 μι αντίστροφου εκκινητή (10 μΜ), 4,75 μι H

2O και 6.25 μι SYBR πράσινο κύριο μίγμα. Η αντίδραση PCR διεξήχθη σε πλάκα 96 φρεατίων στους 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 1 λεπτό. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές

Η

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση Student t-test και ρ & lt?.. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

CNTN-1 μειώνει την έκφραση Ε-καδερίνης

CNTN-1 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση των καρκινικών κυττάρων Α549 του πνεύμονα [15]. Για να διερευνήσουν περαιτέρω CNTN-1-μεσολάβηση μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα, έχουμε νοκ-κάτω CNTN-1 σε κύτταρα Α549. Ενώ knockdown του CNTN-1 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1Α), την ικανότητα του κυττάρου να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ και να εισβάλουν matrigel ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 1Β, C). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με την έκθεση ότι νοκ ντάουν της CNTN-1 δεν επηρεάζει το σχηματισμό των όγκων ξενομοσχεύματος, αλλά μειωμένη ικανότητα μετάστασης του κυττάρου [15].

(Α) κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν σταθερά με έλεγχο (CTRL) ή CNTN-1 shRNA. Νοκ ντάουν της CNTN-1 επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western (ένθετο). 1000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 κυττάρων. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας καθημερινά WST-1 κιτ δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων επί πέντε ημέρες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα τυπικά αποτελέσματα από ένα μόνο επανάληψη απεικονίζεται. (Β) Για να εξεταστεί η ικανότητα του κυττάρου να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ, 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο που περιέχει άγαρ για 3 εβδομάδες. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τυπικές εικόνες από ένα πείραμα που φαίνεται (αριστερό πάνελ). Τα μεγέθη των μαλακών αποικίες άγαρ υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ImagePro πρόγραμμα 5,0 λογισμικού και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. *:

ρ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με Α549 κύτταρα shCNTN-1 (2 tailed Student t-test). (Γ) Α549 shCTRL και shCNTN εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να περνούν μέσω μιας μεμβράνης ελέγχου και matrigel. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. Τυπικές εικόνες από ένα πείραμα που φαίνεται (αριστερό πάνελ). Εισβολή ποσοτικοποιήθηκε (δεξί πάνελ).

Η

Η ικανότητα εισβολής επιθηλιακών καρκίνων κυτταρικής προέλευσης οφείλεται στην απώλεια του επιθηλιακού πρωτεΐνη κυτταρικής πρόσφυσης, E-cadherin [29], [30]. Για να εξεταστεί κατά πόσον Ε-καδερίνης συμβάλλει στην CNTN-1-medaited κύτταρο εισβολή, ήμασταν σε θέση να δείξουμε ότι knockdown του CNTN-1 σημαντικά αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης (Εικόνα 2Α). Αυτό αυξητική ρύθμιση ήταν εν μέρει λόγω της ανύψωσης σε μεταγραφή Ε-καδερίνης, αποδεικνύεται από την αύξηση της Ε-καδερίνης mRNA (Σχήμα 2Β) και δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης (Εικόνα 2C). Επιπλέον, σύμφωνα με CNTN-1 να αγκυρώνεται στην κυτταρική επιφάνεια [3] και της θέσης λειτουργίας για Ε-καδερίνης είναι επίσης στην επιφάνεια του κυττάρου, knockdown του CNTN-1 όχι μόνο μείωσε σημαντικά το περιεχόμενο κυτταρικής επιφάνειας του CNTN-1 ( Εικόνα 2D), αλλά και αυξημένη κυτταρική επιφάνεια E-cadherin (Σχήμα 2Ε). Στο σύνολό τους, οι παραπάνω παρατηρήσεις δείχνουν ότι CNTN-1 μειώνει την έκφραση Ε-καδερίνης τουλάχιστον in vitro.

(Α) Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές, που ακολουθείται από την ανίχνευση της Ε-καδερίνης, CNTN -1 και ακτίνης με κηλίδα western (αριστερό πάνελ). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα επίπεδα του Ε-καδερίνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά και απεικονίζονται γραφικά (μέσα ± SD). *:

σ

& lt? 0.05 με δίπλευρη Student t-test. (Β) ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης Ε-καδερίνης σε υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. E-cadherin mRNA σε κύτταρα Α549 shCNTN δείχθηκε ως φορές μεταβολής με εκείνη των κυττάρων Α549 shCTRL. *:

σ

& lt? 0.05 με δίπλευρη Student t-test. (Γ) Α549 shCTRL και Α549 shCNTN κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με λουσιφεράση Ε-καδερίνης υποκινητή οδηγείται και ένα CMV οδηγείται LacZ κατασκεύασμα για 48 ώρες, ακολουθούμενη από την εκτίμηση για λουσιφεράση και β-gal δραστηριότητες. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. (D) χρώση ανοσοφθορισμού των Α549 shCTRL και Α549 shCNTN για CNTN-1. (Ε) χρώση ανοσοφθορισμού για E-cadherin στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. Πυρήνες αντίθετα με DAPI.

Η

Για να καθοριστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ CNTN-1 και Ε-cadherin, έχουμε εξετάσει 63 πρωτογενή καρκινώματα του πνεύμονα (Πίνακας 2). Περίπου το 65% (41/63) και 35% (22/63) των πρωτογενών καρκινωμάτων του πνεύμονα εκφράζεται εύκολα ανιχνεύσιμη (CNTN-1

+) και μη ανιχνεύσιμη CNTN-1 (CNTN-1

-), αντιστοίχως, από την IHC (Σχήμα 3Α). Αυτό είναι σύμφωνο με τη δημοσιευμένη επίπτωση για CNTN-1

+ έναντι CNTN-1

– πρωτογενή καρκινώματα του πνεύμονα [15]. Επιπλέον, στην ανάλυσή μας των 46 σταδίων Ι /ΙΙ και 17 στάδια III /IV καρκινώματα πρωτογενή πνεύμονα (Πίνακας 2), περίπου 61% των σταδίων Ι /ΙΙ και 76% των σταδίων III /IV καρκινώματα είναι CNTN-1-θετικά (Εικόνα 3Β), υποδεικνύοντας ένα ρόλο του CNTN-1 σε εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα.

Εξήντα τρία πρωτογενή καρκινώματα του πνεύμονα από μικροσυστοιχίες ιστού IHC χρωματίστηκαν για CNTN-1 και Ε-καδερίνης. (Α) χαρακτηριστικές εικόνες των καρκίνων του πνεύμονα με υψηλά και χαμηλά επίπεδα του CNTN-1. Το ποσοστό των καρκινωμάτων πνεύμονος με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα CNTN-1 υποδεικνύεται. (Β) μικροσυστοιχίες ιστών σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με ImageScope. CNTN-1 έκφρασης μετά την πρόοδο του καρκίνου του πνεύμονα αναλύθηκε. (C) Οι τυπικές εικόνες των καρκίνων του πνεύμονα με υψηλά και χαμηλά επίπεδα της Ε-καδερίνης. Το ποσοστό των καρκινωμάτων πνεύμονος με υψηλά ή χαμηλά επίπεδα της Ε-καδερίνης υποδεικνύεται. (D) Με βάση χρώση IHC, η αναλογία των CNTN-1-θετικά καρκινώματα που εξέφρασαν υψηλά ή χαμηλά επίπεδα Ε-καδερίνης υπολογίστηκε. (Ε) πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα ήταν IHC χρώση για CNTN-1 και Ε-καδερίνης. Περιφέρειες θετικό για CNTN-1 και αρνητικό για το E-cadherin (μπλε κουτί, μπλε κύκλο), θετική για CNTN-1 και θετική Ε-καδερίνης (πράσινο κουτί), αρνητικό για CNTN-1 και θετική για το E-cadherin (κόκκινο κουτί ) και μπορεί να παρατηρηθεί τόσο CNTN-1 και Ε-cadherin αρνητικό (μαύρο κουτί).

Η

Αναλύσαμε επίσης την έκφραση Ε-καδερίνης σε πρωτογενή καρκίνωμα του πνεύμονα. E-cadherin

+ και Ε-καδερίνης

– καρκινώματα παρατηρήθηκαν (Εικόνα 3C) με την πλειονότητα των περιπτώσεων να είναι Ε-καδερίνης αρνητικά (63% ή 40/63). Αυτό συμβαδίζει με έναν αριθμό δημοσιεύσεων που αποδεικνύουν το 60% -70% του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα που εκφράζουν έκφραση μειωμένη Ε-καδερίνης [31], [32]. Ωστόσο, άλλοι έχουν αναφέρει επίσης χαμηλότερα ποσοστά, λιγότερο από το 50% των καρκίνων του πνεύμονα εκφράζουν ελαττωμένη Ε-καδερίνης [33], [34]. Σημαντικά, περίπου το 61% των CNTN-1 θετικά καρκινώματα είναι επίσης Ε-καδερίνης-αρνητικό (Σχήμα 3D). Ωστόσο, κάναμε παρατηρούμε καρκινώματα τα οποία ήταν αρνητικά για αμφότερα CNTN-1 και Ε-καδερίνης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι CNTN-1 δεν είναι το μόνο την αναστολή της έκφρασης Ε-καδερίνης παράγοντας. Στο πλαίσιο της υποστήριξης αυτής της πρότασης, ενώ οι περιοχές CNTN-1 αρνητικό καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να είναι E-cadherin θετική, από τον ίδιο τον ασθενή η θετική πνεύμονα έκφραση καρκινώματα CNTN-1 μείωσε τα επίπεδα της E-cadherin (Σχήμα 3Ε). Στο σύνολό τους, η έρευνά μας υποστηρίζει την ιδέα ότι CNTN-1 διευκολύνει τον καρκίνο του πνεύμονα εξέλιξης /μετάσταση στο μέρος μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης.

CNTN-1 μειώνει την έκφραση Ε-καδερίνης μέσω ενίσχυσης της ενεργοποίησης ΑΚΤ

για την εξέταση των μηχανισμών που ευθύνονται για CNTN-1-μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης, πρέπει πρώτα να καθοριστεί αν CNTN-1 επηρεάζει σαλιγκάρι έκφρασης. Σαλιγκάρι είναι το πιο ευρέως μελετηθεί αναστολέας της Ε-καδερίνης μεταγραφής [23]. Σε κύτταρα Α549, knockdown του CNTN-1 δεν αλλάζει σαλιγκάρι έκφρασης (Σχήμα 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι σαλιγκάρι μπορεί να μην είναι ο κύριος παράγοντας που εμπλέκεται στην CNTN-1-μεσολαβούμενη αναστολή της έκφρασης Ε-καδερίνης σε κύτταρα Α549. Κατά την εξέταση των άλλων παραγόντων μεταγραφής Ε-καδερίνης, SIP1 και έκφραση Slug μειώθηκαν μετά CNTN-1 knockdown σε Α549 κύτταρα (Σχήμα 4Β, C). Ωστόσο, καμία μεταβολή παρατηρήθηκε για Ε47 και Twist (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Κυτταρολύματα για τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές εξετάστηκε για σαλιγκάρι έκφραση με κηλίδα western. Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. Τυπικές εικόνες (ένθετο) και ποσοτικοποίηση της έκφρασης σαλιγκάρι εμφανίζεται. Ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου του (Β) SIP1 και (C) Slug έκφραση στις κυτταρικές σειρές υποδεικνύονται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Το mRNA σε κύτταρα Α549 shCNTN δείχθηκε ως φορές μεταβολής με εκείνη των κυττάρων Α549 shCTRL. *:

σ

& lt? 0.05 με δίπλευρη Student t-test

Η

κ.λπ. και έχουμε δείξει πρόσφατα ότι η δραστηριότητα ΑΚΤ μειώνει την έκφραση Ε-καδερίνης [35] – [39. ] και δραστηριότητα ΑΚΤ παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση [40] – [42]. Εξετάσαμε ως εκ τούτου αν ΑΚΤ συμβάλλει στην CNTN-1-μεσολαβούμενη ρύθμιση προς τα κάτω της Ε-καδερίνης. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, προσδιορίσαμε την κατάσταση της ενεργοποίησης ΑΚΤ στα κύτταρα ελέγχου Α549 και Α549 σε κύτταρα στα οποία CNTN-1 νοκ-κάτω. Σε σύγκριση με τα κύτταρα shCTRL, knockdown του CNTN-1 μείωσε σημαντικά την ενεργοποίηση ΑΚΤ (Σχήμα 5Α). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αλλαγές στην ενεργοποίηση ΑΚΤ, αποδείξαμε ότι σε σύγκριση με τα κύτταρα shCTRL φωσφορυλίωση σερίνης 9 της ΟδΚ3β, μια καθιερωμένη στόχος ΑΚΤ [41], ήταν σημαντικά μειωμένη σε CNTN-1 κύτταρα knockdown (Σχήμα 5Β). Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις αποκαλύπτουν ότι CNTN-1 παίζει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση ΑΚΤ.

(Α) Κυτταρολύματα για Α549 shCTRL και Α549 shCNTN εξετάστηκε για την p-ΑΚΤ και η συνολική ΑΚΤ με κηλίδα western (αριστερό πάνελ) . ενεργοποίησης ΑΚΤ προσδιορίστηκε ποσοτικά (δεξιά πλευρά). (Β) Η φωσφορυλίωση σε Ser9 της ΟδΚ3β (pGSK3β), ΟδΚ3β και έκφραση GAPDH στο Α549 shCTRL και Α549 shCNTN κύτταρα προσδιορίστηκαν επίσης.

Η

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται κατά πόσον η ρύθμιση της δράσης ΑΚΤ συμβάλλει στην CNTN-1 επαγόμενη ελάττωση της έκφρασης Ε-καδερίνης. Η αναστολή της ενεργοποίησης ΑΚΤ με έναν αναστολέα της ΑΚΤ αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 6Α), υποδεικνύοντας ότι η μείωση της ενεργοποίησης ΑΚΤ κατά knockdown του CNTN-1 μπορεί να συμβάλει στην παρατηρούμενη αναστολή του Α549 κυττάρων εισβολής (Σχήμα 1). Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι, ενώ νοκ ντάουν της CNTN-1 μειώνεται εισβολή των κυττάρων Α549 κατά την αγωγή DMSO (έλεγχος κύστη), νοκ ντάουν της CNTN-1 δεν αναστέλλει την περαιτέρω Α549 κυττάρων εισβολής, όταν η ενεργοποίηση ΑΚΤ ανεστάλη (Εικόνα 6Β) . Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι CNTN-1 αναστέλλει την έκφραση Ε-καδερίνης μέσω ενίσχυσης της ενεργοποίησης ΑΚΤ. Όπως μείωση Ε-καδερίνης παίζει ζωτικό ρόλο στην μετάσταση καρκίνου [29], [30], η απώλεια της Ε-καδερίνης επομένως συμβάλλει στην μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα.

(Α) κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με έναν αναστολέα της ΑΚΤ (αναστολέας της ΑΚΤ VIII) σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις και στη συνέχεια εξετάζονται για το E-cadherin, η ενεργοποίηση ΑΚΤ (ρΑΚΤ), έκφραση ΑΚΤ, και ακτίνη. (Β) Α549 shCTRL και Α549 κύτταρα shCNTN-1 ήταν ψευδο-κατεργασμένα (DMSO, κορυφή δύο πίνακες) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με έναν αναστολέα της ΑΚΤ (κάτω δύο πίνακες), που ακολουθείται από προσδιορισμό εισβολή ένθετα Matrigel τους ικανότητα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Και οι δύο χαρακτηριστικές εικόνες και ποσοτικοποίηση της ικανότητας εισβολής κυττάρου δείχνεται. *:.

σ

& lt? 0.05 με δίπλευρη Student t-test

Η

CNTN-1 αυξάνει την ενεργοποίηση ΑΚΤ με τη μείωση της έκφρασης PHLPP2

δραστηριότητα ΑΚΤ ρυθμίζεται και από τις δύο ανάντη και κατάντη φωσφατάσες, PTEN και PHLPP (περιοχή ΡΗ πλούσιες σε λευκίνη επανάληψης πρωτεΐνη φωσφατάση). Ως εκ τούτου, καθορίζεται αν ένα ή και τα δύο φωσφατάσες εμπλέκονται σε CNTN-1 νοκ ντάουν που προκαλείται από τη μείωση της ενεργοποίησης ΑΚΤ. Σε σύγκριση με τα κύτταρα shCTRL, knockdown του CNTN-1 δεν επηρέασε σημαντικά ΡΤΕΝ έκφρασης (Σχήμα 7Α). Ωστόσο, η μείωση της CNTN-1 αύξησε σημαντικά την έκφραση PHLPP2 σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 7Β). Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του PHLPP2 σε CNTN-1 κύτταρα knockdown Α549 ήταν εν μέρει να αποδοθεί στην αύξηση των PHLPP2 mRNA (Σχήμα 7C), το οποίο μπορεί να είναι το αποτέλεσμα είτε προς τα πάνω ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου PHLPP2 ή σταθεροποίηση του PHLPP2 mRNA.

(Α) Α549 shCTRL και λύματα κυττάρων shCNTN-1 Α549 εξετάστηκαν για την έκφραση ΡΤΕΝ με κηλίδα western (κορυφή). Τα πειράματα διεξήχθησαν τρεις φορές. Τυπικές εικόνες από ένα μόνο πείραμα δείχθηκε (αριστερό πάνελ). έκφρασης ΡΤΕΝ επίσης ποσοτικά (δεξιά πλευρά). (Β) έκφραση PHLPP2 στο Α549 shCTRL και κυτταρικές σειρές Α549 shCNTN εξετάστηκαν με κηλίδα western (κορυφή). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τυπικές εικόνες από ένα μόνο πείραμα δείχθηκε (αριστερό πάνελ). έκφραση PHLPP2 προσδιορίστηκε ποσοτικά (δεξιά πλευρά). *:

σ

& lt? 0.05 με δίπλευρη Student t-test. (Γ) Real Time PCR ανάλυση της έκφρασης PHLPP2 στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

CNTN-1 ρύθμιση της E-cadherin και την ενεργοποίηση ΑΚΤ δεν είναι μοναδική στο Α549

Για να καθοριστεί εάν CNTN-1 ρυθμίζει Ε- καδερίνης και ΑΚΤ σε άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές, εξετάσαμε μια σειρά μαστού, του νεφρού, του πνεύμονα και του τραχήλου της μήτρας για CNTN-1 και Ε-καδερίνης έκφρασης. Παρά τη μεγάλη ποικιλία των καρκίνων που εξετάστηκαν, CNTN-1 δεν είναι ένα καθολικά εκφραζόμενη πρωτεΐνη στον καρκίνο (Σχήμα S1). Επιπλέον, δεδομένου ότι ο καρκίνος του μαστού κυτταρικές δύο σειρές που εξετάστηκαν εκφράζονται E-cadherin, προχωρήσαμε για να εξετάσει εάν CNTN-1 μπορεί ρυθμιζόμενη Ε-καδερίνης και ΑΚΤ δραστικότητα σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Μετά την έκτοπη υπερέκφραση της CNTN-1 σε ΒΤ549, παρατηρήσαμε μια μείωση στην έκφραση Ε-καντερίνης σε σύγκριση με άδειο φορέα ελέγχου με καμία αλλαγή στην ενεργοποίηση ΑΚΤ (Εικόνα S2). Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του CNTN-1 σε κύτταρα MCF7 οδήγησε σε αύξηση της ενεργοποίησης ΑΚΤ σύγκριση με κενό φορέα ελέγχου (Σχήμα 8Α, Β), ωστόσο, δεν υπήρξε καμία αλλαγή που παρατηρείται σε Ε-καδερίνης (Εικόνα 8C, D). Με βάση αυτές τις αποδείξεις, CNTN-1 μεσολαβούμενων ρύθμιση της Ε-καδερίνης και ΑΚΤ δεν περιορίζεται στον καρκίνο του πνεύμονα και μπορεί να παίζει ρόλο σε άλλους καρκίνους που εκφράζουν CNTN-1.

(Α) CNTN-1 υπερεκφράζεται σε κύτταρα MCF7 και τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και τρέχουν σε στύπωμα western για CNTN-1, π-ΑΚΤ, ΑΚΤ και έκφραση ακτίνης. (Β) χρώση ανοσοφθορισμού για CNTN-1 στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. (Γ) Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν από τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. Μόνο 10 μg κυτταρικά λύματα διεξήχθη σε κηλίδα western για Ε-καδερίνη και έκφραση ακτίνης. (D) χρώση ανοσοφθορισμού για E-cadherin στις υποδεικνυόμενες κυτταρικές σειρές. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με DAPI

Η

Συζήτηση

CNTN-1 είναι ένα νευρωνικό πρωτεΐνη πρόσφυση με λειτουργίες σε σχηματισμό καθοδήγηση νευράξονα και συνάψεων [8] -. [10].