Αφηρημένο

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο, είναι ομάδα υψηλού κινδύνου ο HPV μολυνθεί, ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας. Η ανασταλτική πρωτεΐνη της RAF κινάσης (RKIP) έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση σε διάφορους ανθρώπινων νεοπλασμάτων, ωστόσο ο ρόλος του για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας δεν είναι σαφής. Στην παρούσα μελέτη, 259 ιστούς τραχήλου της μήτρας, συμπεριλαμβανομένων των τραχηλίτιδα, τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής βλάβες και καρκινώματα, αναλύθηκαν για RKIP έκφραση με ανοσοϊστοχημεία. Βρήκαμε ότι η έκφραση RKIP μειώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια κακοήθη πρόοδο, όντας εντόνως εκφρασμένο σε μη νεοπλασματικά ιστούς (54% των δειγμάτων? 73/135), και εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στον τράχηλο διηθητικά καρκινώματα (-15% (19/124 ). Μετά από

in vitro

μειορύθμιση του RKIP, παρατηρήσαμε μια βιωσιμότητα και πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα του RKIP-ανέστειλε κύτταρα πάροδο του χρόνου, η οποία συνδέεται με μια αλλαγμένη κατανομή του κυτταρικού κύκλου και μεγαλύτερο αριθμό αποικιών σε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Ένας

in vitro

πληγών δοκιμασία επούλωσης έδειξε ότι RKIP κατάργηση σχετίζεται με αυξημένο μεταναστευτικές ικανότητα. RKIP μειορρύθμιση συσχετίστηκε επίσης με αυξημένη αγγείωση των όγκων

in vivo

χρησιμοποιώντας δοκιμασία CAM. Επιπλέον, RKIP αναστολή που προκαλείται από του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα αποπτωτικών αντίσταση στη θεραπεία με σισπλατίνη. Συμπερασματικά, περιγράψαμε ότι RKIP πρωτεΐνη μειωθεί σημαντικά κατά τη διάρκεια της κακοήθη εξέλιξη του τραχήλου της μήτρας όγκους. Παρά την έλλειψη σύνδεσης με τον ασθενή κλινική έκβαση, έχουμε αποδείξει,

in vitro

και

in vivo

, ότι η απώλεια της έκφρασης RKIP μπορεί να είναι ένας από τους παράγοντες που βρίσκονται πίσω από την επιθετικότητα, κακοήθη εξέλιξη και την αντίσταση χημειοθεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Martinho O, Pinto F , Granja S, Miranda-Gonçalves V, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP Αναστολή στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας συνδέεται με υψηλότερα όγκου επιθετική συμπεριφορά και η αντίσταση στη Cisplatin θεραπεία. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10.1371 /journal.pone.0059104

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Ιταλία

Ελήφθη: 23 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 11 Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Martinho et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από την πορτογαλική Fundação para a Επιστημών e Tecnologia (χορηγήσουν PTDC /SAU-TOX /114549/2009). Όλγα Martinho και η Σάρα Granja ήταν αποδέκτες των υποτροφιών PhD (SFRH /BD /36463/2007 και SFRH /BD /51062/2010, αντίστοιχα), και Filipe Pinto και η Βέρα Miranda-Gonçalves ήταν αποδέκτες των ερευνητικών υποτροφιών (UMINHO /BI /016 /2011 και SFRH /BI /33503/2008, αντίστοιχα), τόσο από FCT, Πορτογαλία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συχνά διαγιγνώσκονται με καρκίνο. και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας το 9% (529.800) του συνόλου των νέων περιπτώσεων καρκίνου και 8% (275.100) του συνόλου των θανάτων από καρκίνο μεταξύ των γυναικών το 2008 [1]. Επίμονη λοίμωξη με υψηλού κινδύνου τύπους του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) είναι ένας

sine-qua-non

προϋπόθεση για την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. HPVs μολύνουν τα επιθηλιακά κύτταρα και να προκαλέσει μια ποικιλία των βλαβών που κυμαίνονται από κοινές κρεατοελιές να τραχήλου νεοπλασίας και του καρκίνου [2] – [4]. Οι όγκοι του τραχήλου της μήτρας χωρίζεται σε τρεις διαφορετικές ιστολογική υποτύπους: Μήτρας των πλακωδών κυττάρων καρκινώματα (SCC) είναι η πιο συχνή, ακολουθούμενη από αδενοκαρκίνωμα (AC) και αδενοχοληδωτό καρκίνωμα (ASC), η οποία είναι μια ασυνήθιστη υπότυπος [5]. HPV λοίμωξη από μόνη της δεν είναι αρκετή για την ενεργοποίηση καρκίνο του τραχήλου και HPV-διαμεσολαβούμενη ογκογένεση απαιτεί επίσης την συσσώρευση επιπρόσθετων γενετικών αλλαγών που επέρχονται με τον χρόνο μετά την αρχική μόλυνση [6]. Μπορεί να χρειαστούν αρκετά χρόνια για ένα

in situ

νεόπλασμα να προχωρήσουν σε διηθητικό καρκίνωμα. Ο μηχανισμός της κλωνικής εξέλιξης, η οποία περιλαμβάνει την επιλογή κυττάρων με επεμβατικές ή μεταστατικό δυναμικό, παραμένει επίσης άλυτο

κινάσης ανασταλτική πρωτεΐνη

Raf (RKIP? Επίσης γνωστή ως PEBP1, για φωσφατιδυλαιθανολαμίνη δέσμευσης protein1)., Όπως υποδεικνύεται από το όνομα, εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως ο ενδογενής αναστολέας του μονοπατιού RAF /MEK /ERK, αναστέλλοντας την ενεργοποίηση Raf-1 [7] – [9]. Στην πραγματικότητα, RKIP έχει εμπλακεί σε διάφορες οδούς ενδοκυτταρικής σηματοδότησης που ελέγχουν την κυτταρική ανάπτυξη [10], [11], την κινητικότητα [12], [13], επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) [14] και της διαφοροποίησης [15]. RKIP εκφράζεται ευρέως σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς, τονίζοντας το ρόλο της σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες [16], αλλά θεωρείται ότι είναι ένας καταστολέας μετάσταση στον καρκίνο [17], που είναι η απώλεια του ή μειωμένη έκφραση που σχετίζεται με κακοήθεια και την πρόγνωση σε πολλούς τύπους μεταστατικού και επιθετικών καρκίνων [10], [11], [18] – [34]

μια προηγούμενη μελέτη, που έγινε σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών, που βρέθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση που RKIP είναι ένα από τα γονίδια που. εκφράζεται διαφορικά μεταξύ δείγματα όγκων από ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας με ή χωρίς μετάσταση λεμφαδένα [35]. Πιο πρόσφατα, βρέθηκε σε μια μεγάλη σειρά ασθενών που RKIP πρωτεΐνη είναι σημαντικά προς τα κάτω σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και μετάσταση λεμφαδένα [36]. Επιπλέον, μια άλλη μελέτη με HeLa τραχηλικό καρκίνο κύτταρα έδειξαν ότι RKIP, μέσω της ρύθμισης του μονοπατιού ERK, έχει ένα σημαντικό ρόλο στη μιτωτική ρύθμιση σημείου ελέγχου [37]. Ως εκ τούτου, τα προηγούμενα ευρήματα, μας ώθησε να διαλευκανθεί ο βιολογικός ρόλος του RKIP σε καρκίνο του τραχήλου κακοήθη πρόοδο και την απόκριση σε χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, αξιολογούνται πρώτα τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης RKIP σε αμφότερες τις μη-κακοήθη και όγκων του τραχήλου της μήτρας δείγματα και αξιολογήθηκαν το ρόλο της στην κλινική έκβαση των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Δεύτερον, αξιολογήθηκε

in vitro

και

in vivo

η βιολογική λειτουργία του RKIP αρνητική ρύθμιση στην τραχηλική κακοήθειας του καρκίνου και την ανταπόκριση σε χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Για την παρούσα εργασία, 259 τραχήλου ιστοί αναλύθηκαν, η οποία περιελάμβανε 45 τραχηλίτιδα, 47 χαμηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες (LSIL), 43 υψηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες (HSIL), 70 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC), 41 αδενοκαρκινώματα (AC) και 13 αδενοχοληδωτό καρκινώματα (ASC) (Πίνακας 1). Τα δείγματα παραφίνης που περιέχουν τα τραχήλου της μήτρας μη-κακοήθεις αλλοιώσεις ανακτήθηκαν από τα αρχεία του τμήματος Παθολογίας του Adolfo Lutz Ινστιτούτου Σάο Πάολο της Βραζιλίας, και τις επεμβατικές δείγματα του τραχήλου της μήτρας όγκου ανακτήθηκαν από Araújo Jorge Νοσοκομείο και Ιατρική Σχολή του Ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου της Γκοϊάς (Goiânia, Γκόιας μέλος, Βραζιλία). Όλες οι ιστοπαθολογικές διαγνώσεις εξετάστηκαν από τους συγγραφείς και κατηγοριοποιούνται σύμφωνα με την ταξινόμηση του ΠΟΥ. Όλοι οι ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν θηλυκά καταγωγής Βραζιλίας, με μέση ηλικία 49 έτη (εύρος 23-74 έτη). Παρακολούθηση δεδομένων ήταν διαθέσιμα για 72 ασθενείς, και συλλέγονται μέσω άμεσης συνέντευξης με τους ασθενείς ή τους συγγενείς τους, και με την εξέταση των φακέλων των ασθενών σε νοσοκομείο. Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης (συνολική επιβίωση) ήταν 35,5 ± 42,0 μήνες (εύρος, 2-144 μήνες).

Η

Όλα τα δείγματα που εγγράφονται στην παρούσα μελέτη ήταν ασύνδετες και αγνώστων από τους χορηγούς τους. Λόγω της αναδρομικής φύσης της μελέτης, λήφθηκε καμία γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς. Οι Τοπικές Ηθικά Αναθεώρηση Επιτροπών των εμπλεκόμενων φορέων (Επιτροπή Δεοντολογίας των Ανθρωπίνων Ερευνών του Adolfo Lutz Ινστιτούτου του Σάο Πάολο και της Araújo Jorge Νοσοκομείου από την Ιατρική Σχολή του Ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου της Goiás, Βραζιλία) ενέκρινε το έργο και παραιτήθηκε από την ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση .

τηλέφωνα γραμμές

Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τρεις κυτταρικές σειρές τραχηλικού καρκινώματος: HeLa κυτταρική γραμμή, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr

α Έλσα Logarinho (IBMC, Πορτογαλία) [38] , κυτταρικές σειρές SiHa και C-33Α που ευγενώς από τον Dr

α Luisa Βίλα (INCT-HPV, Βραζιλία) [39]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Μέσο Eagle (DMEM 1 ×, υψηλής γλυκόζης? Gibco, Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS? Gibco, Invitrogen ) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη διάλυμα (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).

Drugs

η σισπλατίνη (cis-διαμινολευκόχρυσος (II) διχλωρίδιο) ελήφθη από την Sigma-Aldrich και αραιώνεται σε 0,9% NaCl για ένα απόθεμα διαλύματος 10 mM. Το φάρμακο στη συνέχεια παρασκευάστηκε όπως διαμεσολάβηση αραιώσεις για να ληφθεί μια ίση ποσότητα του φορέα του φαρμάκου (1% τελική συγκέντρωση) σε κάθε μία από τις συνθήκες που μελετήθηκαν. Σε όλες τις πειραματικές συνθήκες τα φάρμακα αραιώνονται σε 0,5% FBS μέσο καλλιέργειας (DMEM-0.5).

Η ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία Ανάλυση RKIP

Οι ιστολογικές πλάκες με τομές ιστού μm πάχους 4 υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική ανάλυση σύμφωνα με την υπεροξειδάση περίπλοκο σύστημα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης (UltraVision Μεγάλες τόμος Detection System Anti-Πολυδύναμα, HRP? LabVision Corporation), χρησιμοποιώντας το πρωτογενές αντίσωμα που εγείρεται έναντι RKIP (Millipore, αναφορά 07-137) αραιωμένο 1:600, 1Η επώαση στους RT, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18], [25], [40], [41]

τα τμήματα βαθμολογήθηκαν διπλή-τυφλή για κυτταροπλασματική έκφραση μετά από μια ημι-ποσοτικό κριτήριο:. (

–

), 0% των ανοσοδραστικών κυττάρων? (+),

& lt?

5% των ανοσοαντιδραστικών κυττάρων? (++), 5-50% των ανοσοδραστικών κυττάρων? και (+++),

& gt?

50% των ανοσοαντιδραστικών κυττάρων. Δείγματα με βαθμολογίες (

–

) και (+) θεωρήθηκαν αρνητικά και τα άτομα με βαθμολογίες (++) και (+++) θεωρήθηκαν θετικά

Για RKIP ανοσοκυτταροχημική ανάλυση του τραχήλου της μήτρας. κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων, και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Η διαδικασία ανοσοκυτταροχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41].

Δημιουργία shRKIP σταθερά κυτταρικές σειρές που εκφράζουν

Για την παραγωγή των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν σταθερά shRKIP, χρησιμοποιήσαμε τον φορέα PQY15, που περιέχει ένα 19 bp shRNA για RKIP, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37], [41], [42]. Η διαμόλυνση έγινε με τη χρήση του αντιδραστηρίου Fugene HD (Roche), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή, με 2 μα πλασμιδίου σε αναλογία 6:02 (Αντιδραστήριο: Το πλασμίδιο). Τα κύτταρα (2 χ 10

5) τοποθετήθηκαν πάνω σε μία πλάκα 12-φρεατίων μέχρι 80% συρροή και επιμολύνθηκαν σε μέσο DMEM, χωρίς FBS ή αντιβιοτικά Επιπλέον, κατά την διάρκεια 24 ωρών [41]. Μετά από αυτό, τα σταθερά διαμολυνθέντα επιλέχθηκαν με 0,5 μg /ml (HeLa) ή 2 μg /ml (C-33Α και SiHa) πουρομυκίνης σε ϋΜΕΜ-10. Ο κενός φορέας επίσης επιμολυσμένα ως μάρτυρας.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα πλάκα σε πλάκα 6 φρεατίων σε πυκνότητα 8 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να τηρούν τουλάχιστον 24 ώρες. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 6 ώρες πριν από την απομόνωση της πρωτεΐνης. Όταν είναι απαραίτητο, τα κύτταρα διεγείρονται επίσης με 10 ng /ml EGF από 10 λεπτά πριν από το τέλος των 6 ωρών ασιτία. Επίσης, για τα πειράματα σισπλατίνη, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για επιπλέον περίοδο 24 ωρών σε ϋΜΕΜ-0,5. Τα κύτταρα αποξέστηκαν σε ψυχρό PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris ρΗ 7,6 – 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM NaPyrophosphate, 1% ΝΡ-40 και 1/7 του κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Roche). Κηλίδωση Western έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπες 12% γέλη SDS-PAGE, φόρτωση 20 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα, με ανίχνευση με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (SuperSignal West Femto μέγιστη ευαισθησία Substrate, Pierce). έκφραση RKIP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα έναντι RKIP (αραίωση 1:2000, Upstate Biotechnology). Η ενεργοποιημένη ERK και EGFR αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το αντίσωμα φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Thr202 /Tyr204) και φωσφο-EGFR (Y1068) (αραίωση 1:1000, Cell Signaling Technology). Η συνολική μορφή της ERK και EGFR αξιολογήθηκαν επίσης με τα αντισώματα ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (κλώνος 137F5, αραίωση 1:1000, Cell Signaling Technology) και EGFR (αραίωση 1:500, κλώνο 31G7, Zymed Laboratories). Για την αξιολόγηση της απόπτωσης που χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα κατά του διασπασμένου PARP (κλωνοποιήσουν Asp214, αραίωση 1:1000, Cell Signaling Technology), διασπασμένη κασπάση-9 (κλωνοποιήσουν Asp330, αραίωση 1:1000, Cell Signaling Technology) και PARP (αραίωση 1:1000, Cell Τεχνολογία σηματοδότησης). Για τον έλεγχο φόρτωσης χρησιμοποιήσαμε β-τουμπουλίνης (κλώνος ΑΑ2, αραίωση 1:5000, Upstate Millipore). Όλα τα πρωτογενή αντισώματα επωάστηκαν για μία ώρα σε RT.

Οι κηλίδες ανίχνευση έγινε με χημειοφωταύγεια (ECL Western Blotting Αντιδραστηρίων Ανίχνευσης, RPN2109, GE Healthcare) σε ImageQuant ™ LAS 4000 mini (GE Healthcare) ή χρησιμοποιώντας Hyperfilm X100 ECL (Amersham, GE Healthcare).

κυττάρων Η βιωσιμότητα και Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων εις τριπλούν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ-10. Μετά από 6 ώρες ασιτία ορού τα βιώσιμα ή πολλαπλασιαστικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Titer96 Υδατικό δοκιμασία κυττάρων τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Promega) ή με ELISA Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού, BrdU (χρωματομετρική, Roche Applied Science) και χρησιμοποιείται για την τιμή χρόνου μηδέν. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ χωρίς ορό κατά τη διάρκεια της 24, 48 και 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και πάλι αξιολογήθηκε με Κυττάρων Titer96 Υδατικό δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων και κυτταρικού πολλαπλασιασμού ELISA, BrdU (χρωματομετρική), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα βαθμονομηθεί με την τιμή εκκίνησης (χρόνος 0 ώρες, θεωρήθηκε ως 100% της βιωσιμότητας /πολλαπλασιασμού) και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Η δοκιμασία έγινε εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.

Για να προσδιορισθεί η συγκέντρωση στην οποία το 50% της κυτταρικής ανάπτυξης αναστέλλεται από τη θεραπεία cisplatin (IC

50 συγκέντρωση), τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96- φρεατίων σε πυκνότητα 3 × 10

3-5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ-10. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του φαρμάκου αραιωμένο σε ϋΜΕΜ-0,5. Μετά από 48 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας Κυττάρου Titer96 Υδατικό δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων (MTS) (Promega). Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD βιώσιμα κύτταρα σε σχέση με όχημα φάρμακο μόνο (που θεωρείται ως 100% βιωσιμότητα). Το IC

50 συγκέντρωση υπολογίστηκε με ανάλυση μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism.

Επούλωση Δοκιμασία Μετανάστευσης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για τουλάχιστον 95% της συμβολής. κύτταρα μονόφυλλο πλύθηκαν με PBS και αποξέστηκαν με ένα πλαστικό ρύγχος πιπέτας 200 μL και στη συνέχεια επωάζονται με φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ χωρίς ορό. Οι «πληγωμένο» περιοχές φωτογραφήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης σε χρονικά σημεία 12, 24 ή 48 ωρών. Η σχετική απόσταση μετανάστευσης υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: ποσοστό κλεισίματος τραύματος (%) = 100 (Α-Β) /Α, όπου το Α είναι το πλάτος των πληγών των κυττάρων πριν από την επώαση, και το Β είναι το πλάτος των πληγών κυττάρων μετά από επώαση [ ,,,0],41]. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η δοκιμασία έγινε εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα πλακίδιο 6 φρεάτων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά από 6 ώρες ασιτία ορού, τα κύτταρα επωάστηκαν με φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ χωρίς ορό κατά τη διάρκεια 24 ωρών. Τα κύτταρα tripsinized και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για τουλάχιστον 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται κατά την διάρκεια 1 ώρα στους 50 ° C με ένα ιωδιούχο προπίδιο διάλυμα (ΡΙ) (20 μg /mL των ΡΙ και 250 μg /mL από RNAse σε ένα διάλυμα από 0,1 % Triton Χ-100 σε PBS). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των ΡΙ χρώση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής (LSRII, BD Biosciences). Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με το λογισμικό FlowJo έκδοση 7.6.3. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος ± SD του ποσοστού των κυττάρων σε φάση G1 ή G2 /M συν φάσης S [41]. Η δοκιμασία έγινε εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.

αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

Η δοκιμασία μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους, όπως περιγράφεται προηγουμένως από εμάς [43]. Εν συντομία, 1 υποστρώματα mL (βάση άγαρ στρώματα) που αποτελείται από μέσο άγαρ 0,6% παρασκευάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων με συνδυασμό ίσων όγκων 1,2% άγαρ Noble είτε με 2 × μέσου ϋΜΕΜ με 20% FBS. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, και ressuspended εντός μέσου 0,35% άγαρ (στρώμα άγαρ κορυφής? Ίσους όγκους 0.7% άγαρ Noble και 2 × ϋΜΕΜ με 20% FBS)? 2 × 10

3 κύτταρα στη συνέχεια επιστρώθηκαν επί της προηγουμένως προετοιμασμένης στρώματα βάσης άγαρ. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα για 15 ημέρες και οι αποικίες που σχηματίζονται χρωματίζονται με 0,05% ιώδες κρύσταλλο για 15 λεπτά. Βιτρώ αποικίες φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα στερεοσκοπικό μικροσκόπιο (Olympus S2 × 16) και μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Olympus DP71) και μετρήθηκαν με εικόνας J λογισμικού. Μόνο αποικίες με μέγεθος μεγαλύτερο από 775 μm

2 (περίπου 31,4 μm διαμέτρου) μετρήθηκαν [43]. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Η δοκιμασία έγινε εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.

χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη όρνιθας (CAM) Δοκιμασία

Για να αξιολογηθεί

in vivo

πολλαπλασιασμό και αγγειογένεση όγκου χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία CAM όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41], [43]. Γονιμοποιημένα αυγά κότας επωάστηκαν στους 37 ° C και 70% υγρασία, και την ημέρα 3 της ανάπτυξης, ένα παράθυρο έγινε μέσα στο περίβλημα, το οποίο σφραγίστηκε με ταινία και τα αυγά επέστρεψαν στον επωαστήρα. Την ημέρα 9 της ανάπτυξης, μικρά πλαστικά δαχτυλίδια τοποθετήθηκαν επί της CAM και την ημέρα 10 της ανάπτυξης 3 × 10

6 κύτταρα, επαναιωρήθηκαν σε 20 μΐ μέσου DMEM, εγχύθηκαν στους δακτυλίους πάνω από το CAM. Την ημέρα 17 της ανάπτυξης, ο όγκος που σχηματίζεται φωτογραφήθηκε

in ονο

χρησιμοποιώντας στερεομικροσκόπιο (Olympus S2 × 16), και η περίμετρος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Κυττάρων Β (Olympus). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD.

Τέλος, τα αυγά κότας θυσιάστηκαν στους -80 ° C για 10 λεπτά, και CAM και οι όγκοι σταθεροποιήθηκαν με παραφορμαλδεΰδη 4% και φωτογραφήθηκαν

ex ονο

για μέτρηση αιμοφόρων αγγείων. Οι όγκοι εγκλείστηκαν σε παραφίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ιστολογική ανάλυση.

Στατιστική Ανάλυση

Οι συσχετισμοί μεταξύ της έκφρασης RKIP και κλινικά δεδομένα από ασθενείς εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square (χ2-test). Αθροιστικές πιθανότητες επιβίωσης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Οι διαφορές μεταξύ των ποσοστών επιβίωσης ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS για Windows, έκδοση 17.0. Για

in vitro

και

in vivo

προσδιορισμούς, και μόνο οι συγκρίσεις μεταξύ των διαφόρων συνθηκών που μελετήθηκαν έγιναν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student, και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας αμφίδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) . Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism έκδοση 5. Το επίπεδο σημαντικότητας σε όλες τις στατιστικές αναλύσεις ορίστηκε στο p & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Έκφραση RKIP σε τραχήλου της μήτρας ιστοί

μια προσέγγιση ανοσοϊστοχημεία έγινε για να ανιχνεύσει έκφραση της πρωτεΐνης RKIP και διανομή σε τραχηλικών βλαβών (Εικ. 1).

Α) Θετική έκφραση σε ένα τραχηλίτιδα. Β) Υψηλής ποιότητας πλακώδη ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση με αρνητική έκφραση. Γ) ιστού αδενοκαρκίνωμα απεικονίζει θετική έκφραση. D) Αρνητική αδενοκαρκίνωμα (*) με τα παρακείμενα φυσιολογικά κύτταρα (βέλος) που απεικονίζει θετική χρώση. Όλες οι φωτογραφίες τραβήχτηκαν με 200 × μεγέθυνση.

Η

κυτταροδιάλυμα θετική έκφραση της RKIP παρατηρήθηκε στο 64,5% (29/45) των δειγμάτων τραχηλίτιδα, στο 44,7% (21/47) των LSIL και 53,5% (23/43) των HSIL (Πίνακας 1) (Σχ. 1Α και Β). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης των RKIP μεταξύ LSIL και HSIL (

σ

= 0.404), καθώς επίσης και μεταξύ τραχηλίτιδα και πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες (SIL) γενικά (

σ

= 0,087 ), Τραπέζι 1). Σχετικά με κακοήθεις αλλοιώσεις, RKIP ήταν παρούσα σε χαμηλά επίπεδα, με μόνο 19,5% (8/41) των AC, 12,9% (9/70) των SCC και 15,4% (2/13) του ASC απεικονίζει θετική χρώση (Πίνακας 1) ( Το Σχ. 1C και D). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της έκφρασης RKIP στις διάφορες κακοήθεις αλλοιώσεις που μελετήθηκαν (

σ

= 0,643, Πίνακας 1). Ωστόσο, κατά την ομαδοποίηση των καλοηθών βλαβών (τραχηλίτιδα και SIL) και τις κακοήθεις αλλοιώσεις (AC, SCC και ASC), μια στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης RKIP παρατηρήθηκε σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου (

σ

& lt? 0.001), όταν σε σύγκριση με τις καλοήθεις αλλοιώσεις (Πίνακας 1)

Δεν συσχετίσεις βρέθηκαν μεταξύ έκφρασης RKIP και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως η ηλικία, η παρουσία της μετάστασης και δεδομένα παρακολούθησης, ανεξάρτητα από τον ιστολογικό τύπο (p & gt.? 0.05, Πίνακας 2).

η

RKIP έκφραση και Ρύθμιση της ERK Διαδρομή στον καρκίνο του τραχήλου της Μήτρας Γραμμές κυττάρων

για να μελετήσει το ρόλο της RKIP στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, πρέπει πρώτα να ελέγχονται για την έκφραση RKIP στην ανθρώπινου κολπικού καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa, SiHa και C-33Α) με ανοσοκυτταροχημεία και κηλίδα western (Σχ. 2). Βρήκαμε ότι RKIP εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε όλες τις κυτταρικές σειρές, και είναι παρούσα τόσο σε κυτόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων (Σχ. 2Α), όπως ήδη περιγράφηκε πριν από [37]. Όλες οι κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για να knockdown την έκφραση RKIP με σταθερή επιμόλυνση με φορέα που περιέχει PQY15 μια σύντομη φουρκέτα-RNA για RKIP (shRKIP). Ο κενός φορέας επίσης επιμολυσμένα ως έλεγχος. Τα επίπεδα πρωτεΐνης RKIP σε αυτά τα σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. επίπεδα πρωτεΐνης 2Β, RKIP ήταν αναστέλλεται αποτελεσματικά στα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα επιμολυσμένα κύτταρα με κενό φορέα.

ανάλυση Α) Η ανοσοκυτταροχημεία για RKIP σε HeLa, SiHa και κύτταρα C-33Α που δείχνει τόσο πυρηνικά και κυτταροπλασματικά έκφρασης. Β) Για την αναστολή RKIP, οι κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν σταθερώς με ένα shRNA για RKIP και με το αντίστοιχο κενό φορέα για τον έλεγχο. RKIP επίπεδα έκφρασης αξιολογήθηκαν από western blot. Περαιτέρω, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 10 ng /ml EGF από 10 λεπτά και EGFR και ενεργοποίηση ERK (φωσφορυλίωση) εκτιμήθηκε με Western Blot για φωσφο-ERK1 /2 και η έκφραση φωσφο-EGFR, αλλά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές. Ε: Κενό φορέα? Sh:. ShRKIP

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της RKIP στη διαμόρφωση της EGF διεγείρονται σηματοδότησης ERK στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, τα επιμολυσμένα κύτταρα διεγείρονται με EGF, και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του EGFR και ERK αξιολογήθηκαν από western blot . Όπως μπορεί να παρατηρηθεί στο Σχ. 2Β, EGF διέγερση δεν είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές επιπτώσεις στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης ERK σε αυτά τα κύτταρα, ανεξάρτητα από το καθεστώς RKIP.

Ο ρόλος της Έκφρασης RKIP στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας Γραμμές κυττάρων βιολογική συμπεριφορά

Για την εκτίμηση αν η διαμόρφωση της έκφρασης RKIP επηρέασε τις ογκογόνων ιδιοτήτων των κυττάρων, εμείς επιλέξαμε την κυτταρική σειρά με το υψηλότερο επίπεδο της αναστολής RKIP από shRKIP, HeLa και μετρήθηκαν

in vitro

βιωσιμότητα, τον πολλαπλασιασμό, αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη και τη μετανάστευση των δυνατοτήτων της (Εικ. 3). Παρατηρήσαμε ότι shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα έχουν ένα σημαντικό πλεονέκτημα βιωσιμότητα πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3Α)., Σε σύγκριση με τον κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (ρ & lt? 0,05). Αυτή η διαφορά μπορεί να είναι μια αντανάκλαση του αυξημένου αριθμού των κυττάρων ή μπορεί να αντανακλά την αυξημένη κυτταρικό μεταβολισμό. Για να δείτε αν αυτό το πλεονέκτημα βιωσιμότητας οφειλόταν σε υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού, μελετήθηκε η επίδραση της RKIP για την ενσωμάτωση BrdU, τη διανομή του κυτταρικού κύκλου και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη. Η δοκιμασία BrdU, επιβεβαίωσε ότι shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα έχουν σημαντική πολλαπλασιαστική πλεονέκτημα έναντι του χρόνου (Σχ. 3Β). Το προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ επέδειξαν σημαντική (ρ & lt? 0,05) αύξηση του αριθμού των αποικιών που σχηματίζονται στα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3C).. Με ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, παρατηρήσαμε ότι shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα είχαν μειωμένη φάση G0 /G1 με ταυτόχρονη και σημαντική (ρ & lt? 0,05) αύξηση της G2 /Μ φάσης + S (Σχήμα 3D.). Αυτά τα αποτελέσματα περαιτέρω επικυρώθηκαν στις άλλες δύο διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές, SiHa και C-33Α (Σχ. S1A-D).

Α) Κυτταρική βιωσιμότητα και Β) πολλαπλασιασμός μετρήθηκε στις 24, 48 και 72 ώρες με MTS και BrdU δοκιμασίες, αντίστοιχα. RKIP ανέστειλε κύτταρα είχαν μια στατιστικά σημαντική βιωσιμότητα και πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα την πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία για την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 0.35% άγαρ και το σχηματισμό πολυκύτταρων αποικιών φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση x16 μετά από 14 ημέρες. αναστολή RKIP προκαλεί μια στατιστικά σημαντική ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων HeLa σε μαλακό άγαρ. Δ) Η ελαττωμένη RKIP σε κύτταρα HeLa προκάλεσε μία μετατόπιση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου με στατιστικά σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων στη φάση S G2M + σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έγινε στη χρονική στιγμή 24 ώρες με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ιωδιούχου propridium βαμμένων κυττάρων. Ε) Ένα τυποποιημένο γρατσουνιά (τραύμα) εφαρμόστηκε σε μονοστοιβάδες και ψηφιακές εικόνες λήφθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία (0? 12? 24 και 48 ώρες). Παρατηρήθηκε ότι shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα είχαν στατιστικά σημαντικό πλεονέκτημα μετανάστευση πάροδο του χρόνου, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (δεξί πάνελ). Αντιπροσωπευτικές εικόνες σε 0 και 48 ώρες, παρουσιάζονται στον αριστερό πίνακα. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και οι διαφορές με ένα

ρ

& lt?. 0.05 για την αμφίδρομη ANOVA ή t δοκιμή Student θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντική (*)

Η

Τέλος , για την αντιμετώπιση της επίδρασης των RKIP σε HeLa κύτταρα μετανάστευση, εκτελέσαμε επούλωσης τραύματος δοκιμασία μετανάστευσης και παρατήρησε ότι shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα είχαν ένα πλεονέκτημα μετανάστευση πάροδο του χρόνου, με μια σημαντική (ρ & lt? 0,05) υψηλότερο ρυθμό κλεισίματος τραύματος σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 3Ε). Το ίδιο παρατηρήθηκε και στις άλλες δύο διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές, SiHa και C-33Α (Σχ. S1E-F).

In vivo

ρόλος της έκφρασης RKIP στην τραχηλική ανάπτυξη του καρκίνου και αγγειογένεση

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα της αύξησης του όγκου RKIP μεσολάβηση και την αγγειογένεση

in vivo

, εκτελέσαμε την δοκιμασία CAM (Εικ. 4). Τα επιμολυσμένα κύτταρα εμφυτεύονται εντός του CAM του εμβρύου νεοσσού (άδειο φορέα κύτταρα, η = 10? Κύτταρα shRKIP, n = 10), και επτά ημέρες μετά την εμφύτευση των κυττάρων, τα έμβρυα κοτόπουλου θυσιάστηκαν για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση, όπως περιγράφεται στα υλικά και τις μεθόδους τμήμα. Η μέση περίμετρο των όγκων που σχηματίζονται από τον έλεγχο και τα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα ήταν 4335 ± 823 μm και 4,913 ± 1,568 μm, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, το μέγεθος των όγκων που σχηματίζονται από κύτταρα shRKIP δεν ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τους όγκους που σχηματίζονται από τα κενά κελιά φορέα.

Α) Αντιπροσωπευτική εικόνες (16 × μεγέθυνση) του προσδιορισμού CAM μετά από 7 ημέρες όγκου ανάπτυξη

στο ονο

και

ex ovo

. Β) Η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε

in vivo

με δοκιμασία CAM όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Παρατηρήθηκε μια υψηλότερη περίμετρο (μΜ) των όγκων (

in ονο

) που σχηματίζονται από κύτταρα shRKIP, ωστόσο, η διαφορά μεταξύ των κυττάρων ελέγχου δεν ήταν σημαντική. Γ) χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης των τομές παραφίνης όγκους που δείχνει το υψηλότερο αγγείωση που επάγεται από την αναστολή RKIP. Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες με 10 × 20 × μεγέθυνση εκπροσωπούνται στον αριστερό πίνακα. Δ) καταμέτρηση των αιμοφόρων αγγείων

ex ονο

, παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση σε σχέση με τον αριθμό των σκαφών που προσλαμβάνονται στους όγκους που σχηματίζονται από κύτταρα shRKIP σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Συνολικά αναλύθηκε 20 αυγά (10 ενέθηκαν με κενό φορέα και 10 με κύτταρα shRKIP). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD και διαφορές με ένα

σ

& lt? 0,05 σε δοκιμασία t του Student θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές (*)

Η

Για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της. RKIP στη διαμόρφωση της αγγειογένεσης, μετρήσαμε

ex ovo

του αριθμού των σκαφών γύρω από τους όγκους. Μετρήσαμε μία μέση 54 ± 16 και 83 ± 10 σκάφη στους όγκους που σχηματίζεται από τον κενό φορέα και τα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα. RKIP ανέστειλε κύτταρα αποκάλυψε μια στατιστικά σημαντική (

ρ

& lt? 0,05) αύξηση στα αιμοφόρα αγγεία προσλήψεις σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4D).. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, η χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη των ενσωματωμένων παραφίνη όγκους και CAM επιβεβαίωσε την πλούσια αγγείωση των όγκων με τριχοειδή γύρω από τον όγκο και τα τριχοειδή αγγεία βλάστησης έξω από το CAM σε όγκους. Τα υψηλότερα ποσοστά της αγγείωσης παρατηρήθηκαν στους όγκους σχηματίζονται από shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ. 4C).

Ο ρόλος της RKIP σε κύτταρα καρκίνου του τραχήλου ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία

Για να προσδιοριστεί αν θα μπορούσαν να συμμετέχουν πρωτεΐνη RKIP στη ρύθμιση της απόκρισης του τραχήλου της μήτρας ασθενούς με καρκίνο στην συμβατική χημειοθεραπεία, προσδιορίσαμε την ευαισθησία του τραχήλου της μήτρας καρκινικές κυτταρικές γραμμές που μορφομετατρέπονται με shRKIP να σισπλατίνη θεραπεία. Όπως μπορεί να παρατηρηθεί στα κυτταροτοξικά δοκιμασίες (Εικ. 5Α), όλα τα shRKIP επιμολυσμένες κυτταρικές γραμμές ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε θεραπεία σισπλατίνη, σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές ελέγχου επιμολυσμένα με τον κενό φορέα, όντας αυτή η διαφορά λιγότερο εμφανές για το C-33Α κυτταρική σειρά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με τον shRKIP εμφανίζεται μία μέση IC

50 του 18,55 ± 2,06 μΜ έναντι των 5,91 ± 0,30 μΜ που επιτεύχθηκε από τα κενά κελιά φορέα. Για κυτταρική γραμμή C-33Α οι τιμές ήταν περισσότερο παρόμοια μεταξύ των δύο διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές, 10.37 ± 2.69 μΜ και 13,25 ± 1,98 μΜ για τον κενό φορέα και τα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα, αντίστοιχα (Εικ. 5Β). Η κυτταρική σειρά SiHa ήταν η λιγότερο ευαίσθητη σε σισπλατίνη με τον κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα φθάνοντας 25,99 ± 0,51 μΜ της μέσης IC

50, ενώ τα shRKIP επιμολυσμένα κύτταρα έφθασαν 40,69 ± 2,37 μΜ της μέσης IC

50 για σισπλατίνη (Εικ . 5Β).

Α) Αντιπροσωπευτική εικόνες της ανάλυσης μη γραμμικής παλινδρόμησης των κυτταρικών σειρών καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη για τον προσδιορισμό της μέγιστης ανασταλτικές συγκεντρώσεις ήμισυ (IC

50). Β) Γραφική αναπαράσταση της μέσης IC

50 τιμές για τη σισπλατίνη στην αυχενική καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα επιμολυσμένα κύτταρα με shRKIP ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε θεραπεία cisplatin στις τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Γ) HeLa επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης από 24 ώρες. θεραπεία Cisplatin επαγόμενη ενεργοποίηση ERK (ρ-ERK1 /2) και την απόπτωση των κυττάρων, όπως αξιολογήθηκε από PARP (συνολική και cleaded ειδικά αντισώματα) και κασπάσης-9 διάσπασης, κυρίως στις κενός φορέας επιμολυσμένα κύτταρα. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν τουλάχιστον τρεις φορές.