Αφηρημένο

ΡΒΧ1 είναι ένας παράγοντας ΠΑΡΑΜΥΘΙ ομοπεδίου μεταγραφής που εμπλέκονται στην οργανογένεση και την ογκογένεση. Αν και έχει δειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, του μαστού και μελάνωμα εξαρτώνται ΡΒΧ1 για την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση, ο μοριακός μηχανισμός του τρόπου με τον ΡΒΧ1 προωθεί την ογκογένεση παραμένουν ασαφείς. Εδώ, θα εφαρμοστεί μια ολοκληρωμένη προσέγγιση με επικάλυψη ΡΒΧ1 στόχους τσιπ τσιπ με το ΡΒΧ1-ρυθμίζεται μεταγραφικό στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών να εντοπίσει γονίδια των οποίων η μεταγραφή ήταν άμεσα ρυθμίζεται από ΡΒΧ1. Έχουμε περαιτέρω προσδιορίζεται εάν γονιδίων στόχων ΡΒΧ1 που προσδιορίζονται στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών συν-υπερεκφράζεται με ΡΒΧ1 σε ιστούς καρκινώματος. Με την ανάλυση του γονιδίου TCGA συνόλων δεδομένων μικροσυστοιχιών έκφραση από ωοθηκικό ορώδες καρκίνωμα, βρήκαμε συν-προς τα πάνω ρύθμιση του ΡΒΧ1 και ένα σημαντικό αριθμό άμεσων γονιδίων στόχων του. Μεταξύ των γονιδίων στόχων ΡΒΧ1, επιλέχθηκε MEOX1 πρωτεΐνη ομοπεδίου των οποίων το DNA μοτίβο σύνδεσης εμπλουτίστηκε σε αλληλουχίες DNA ΡΒΧ1-immunoprecipicated για λειτουργική ανάλυση. Έχουμε αποδείξει ότι MEOX1 πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με πρωτεΐνη ΡΒΧ1 και η αναστολή της MEOX1 αποδίδει ένα παρόμοιο φαινότυπο αναστολής αύξησης, όπως καταστολή ΡΒΧ1. Επιπλέον, εκτοπικά εξέφρασε MEOX1 λειτουργικά διασωθεί το ΡΒΧ1-ανακληθεί αποτέλεσμα, γεγονός που υποδηλώνει MEOX1 μεσολαβεί τον κυτταρικό σήμα ανάπτυξη της ΡΒΧ1. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι MEOX1 είναι ένα κρίσιμο γονίδιο στόχο και συμπαράγοντα του ΡΒΧ1 σε καρκίνους των ωοθηκών

Παράθεση:. Thiaville ΜΜ, Stoeck Α, Chen L, Wu R-C, Magnani L, Oidtman J, et al. (2012) ταυτοποίηση των γονιδίων ΡΒΧ1 στόχος στα καρκινικά κύτταρα από την Global Χαρτογράφηση του ΡΒΧ1 Δεσμευτική τοποθεσίες. PLoS ONE 7 (5): e36054. doi: 10.1371 /journal.pone.0036054

Επιμέλεια: Jindan Yu, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 του Δεκεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 26, Μαρτίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 2, Μάη του 2012

Copyright: © 2012 Thiaville et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση American Cancer Society ΕΓΓ-08-174-01-GMC και επιχορηγήσεις NIH /NCI: R01CA148826, R01CA103937, R01CA129080 και U24CA160036. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Pre-Β-κυττάρων λευχαιμίας ομοιοκυτίου-1

(

ΡΒΧ1

) ανήκει στην ΠΑΡΑΜΥΘΙ (επέκταση τριών αμινοξέων βρόχου) της οικογένειας των άτυπων πρωτεϊνών ομοπεδίου, του οποίου η τα μέλη χαρακτηρίζονται από εισαγωγή τριών κατάλοιπο στην πρώτη έλικα του ομοιοπεριοχή [1]. πρωτεΐνη ΡΒΧ1 αλληλεπιδρά με άλλα ομοπεδίου περιέχουν πυρηνικές πρωτεΐνες όπως ΗΟΧ και MEIS να σχηματίσουν σύμπλοκα ετεροδιμερών μεταγραφής. Βιοχημικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι ΡΒΧ1 και ΗΟΧ αλληλεπιδρούν μέσω επαφών μεταξύ της ομοιοπεριοχή ΡΒΧ1 και μία συντηρημένη αλληλουχία εξαπεπτιδίου στην πρωτεΐνη ΗΟΧ [2]. X-ray κρυσταλλογραφικές μελέτες έχουν δείξει επιπλέον ότι ΡΒΧ1-HOXB1 διμερισμός διαμεσολαβείται από πρόσδεση του εξαπεπτιδίου ΗΟΧ σε ένα θύλακα στο ΡΒΧ1 που βρίσκεται μεταξύ της εισαγωγής των τριών καταλοίπων και την τρίτη έλικα του ομοιοπεριοχή ΡΒΧ1 [3]. Ο ετεροδιμερισμός των ΡΒΧ1 και ΗΟΧ ρυθμίζει συνεργατικά συγγένεια και ειδικότητα της δέσμευσης τους να στοχεύουν αλληλουχίες DNA [4], [5].

Δεδομένου κρίσιμο ρόλο της στην μεταγραφική ρύθμιση, αυτό δεν αποτελεί έκπληξη ότι ΡΒΧ1 εμπλέκεται σε μια ποικιλία βιολογικών διεργασιών από προσδιορισμός κυτταρικής τύχης κατά την οργανογένεση στην ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκίνων [6], [7], [8]. Η έκφραση του ΡΒΧ1 είναι χρονικά και χωρικά ρυθμιζόμενη για τον έλεγχο της ανάπτυξης των οργάνων του σπλήνα, πάγκρεας, νεφρό, επινεφρίδια, και σκελετός [9], [10], [11], [12], και εμπλέκεται στην ανάπτυξη του πόρου του Muller ότι αργότερα αναπτύσσεται στο γυναικείο γεννητικό σύστημα [13].

οι αναδυόμενες αποτελέσματα έχουν δείξει έναν ρόλο των ΡΒΧ1 στον ανθρώπινο καρκίνο. Το συγκρότημα ετεροδιμερές ΡΒΧ1-ΗΟΧ βρέθηκε να συμβάλει στην ογκογόνο δράση στον καρκίνο του μαστού και μελάνωμα. Ένα κυρίαρχο αρνητικό πρωτεΐνη ΡΒΧ1 ή ΗΟΧ εξαπεπτίδιο μοτίβο που διαταράσσεται η αλληλεπίδραση μεταξύ ΡΒΧ1 και ΗΟΧ βρέθηκε ότι μειώνει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό αυτών των καρκινικών κυττάρων [14], [15], [16], [17]. Επιπλέον, ΡΒΧ1 δρα ως παράγοντας πρωτοπόρος στον καρκίνο του μαστού, την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης να ευνοούν την πρόσληψη των άλφα υποδοχέων οιστρογόνων (ΕΧΕ) [18]. ΡΒΧ1 έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι ένας καθοδικός τελεστής του μονοπατιού σηματοδότησης Notch, η οποία συχνά ενεργοποιείται σε ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας, και ορισμένους τύπους καρκινωμάτων του μαστού [8], [19], [20]. Υπό το φως του δυνητικού ρόλου του ΡΒΧ1 σε διάφορους τύπους καρκίνου, ταυτοποίηση των γονιδίων-στόχων μεταγραφή ΡΒΧ1 σε καρκινικά κύτταρα είναι κρίσιμη για την αποσαφήνιση ογκογόνο μηχανισμούς του. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση για τον εντοπισμό γονιδίων των οποίων υποστηρικτές καταλήφθηκαν από πρωτεΐνη ΡΒΧ1 και των οποίων τα επίπεδα έκφρασης ρυθμίζονται από ΡΒΧ1. Έχουμε επικεντρωθεί στην γονιδιακή άμεσο στόχο ένα ΡΒΧ1,

MEOX1

, και απέδειξε τη συμμετοχή της σε ΡΒΧ1 μεσολάβηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων, καθώς και την άμεση αλληλεπίδραση της με ΡΒΧ1.

Αποτελέσματα

Παγκόσμια χαρτογράφηση των ΡΒΧ1 τοποθεσίες σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Δεδομένου ότι ΡΒΧ1 είναι ένας παράγοντας πυρηνικής μεταγραφής που συνδέεται προς ειδικούς προαγωγούς, επιδιώξαμε να εντοπίσει θέσεις πρόσδεσης ΡΒΧ1 στο γονιδίωμα ανθρώπινου καρκίνου χρησιμοποιώντας ανάλυση τσιπ τσιπ δεσμευτική. Μια κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, OVCAR3, επιλέχθηκε επειδή αυτή η κυτταρική γραμμή προηγουμένως αναφέρθηκε για να υπερεκφράζουν ΡΒΧ1, και ήταν εξαρτημένη από την έκφραση ΡΒΧ1 για την κυτταρική επιβίωση [8]. θραύσματα DNA ΡΒΧ1-δεσμεύεται εμπλουτίζεται από ChIP υβριδίστηκαν σε μια σειρά ανθρώπινο υποκινητή που περιέχει 18.028 υποστηρικτές γονίδιο, που αντιπροσωπεύουν συνολικά 24.659 μεταγραφές. IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε ένα παράλληλο ανοσοκαθίζησης. Τυχόν θετική κορυφές επικαλυπτόμενες εκείνων που προέρχονται από τον έλεγχο IgG αποκλείστηκαν από τη λίστα κορυφή ΡΒΧ1. Χρησιμοποιώντας μια ψευδή αναλογία ανακάλυψη (FDR) ≤0.2, εντοπίσαμε 2.299 μοναδική υποστηρικτές που έδειξαν σημαντική σήματα δεσμευτική ΡΒΧ1 (Πίνακας S1). Τα δεδομένα τσιπ τσιπ στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της κατανομής δεσμευτικός κορυφή ΡΒΧ1 μήκος των ολόκληρων περιοχών προαγωγού, και βρήκαμε ότι θέσεις δέσμευσης ΡΒΧ1 συνέβη σε όλες τις περιοχές προαγωγού (Εικ. 1). Πραγματοποιήσαμε επίσης τσιπ τσιπ για τον προσδιορισμό της κατανομής της RNA πολυμεράσης ΙΙ, H3K4me3, και H3K27me3 σε περιοχές υποκινητή (Εικ. 1), και δοκιμάζονται υποστηρικτής συνύπαρξη τους με τους στόχους ΡΒΧ1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υποκινητής ΡΒΧ1 δέσμευσης συν-συνέβη και με τους τρεις δοκιμάστηκε δείκτες, με ΡΒΧ1-RNA πολυμεράση II να είναι η πιο σημαντική ζεύγος συνύπαρξη (Πίνακας S2). Δεν υπήρχε σημαντική συνύπαρξη μεταξύ H3K4me3 και H3K27me3, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα δύο σήματα ιστονών συνδέεται με τους υποστηρικτές του μια ξεχωριστή σειρά από γονίδια.

Τα ιστογράμματα δείχνουν την κατανομή της συχνότητας δεσμευτική κορυφή σε σχέση με τη θέση τους στο προωθητές (άξονας x). συχνότητα Binding όπως φαίνεται στον άξονα γ προσδιορίστηκε από τον αριθμό των κορυφών δεσμευτικών γεγονότων σε συγκεκριμένες θέσεις υποκινητή. TSS:. Θέση έναρξης της μεταγραφής

Η

Πιθανές συμπαράγοντες που συνεργάζονται με ΡΒΧ1

Με την ανάλυση των αλληλουχιών DNA που εμπλουτίζεται από ΡΒΧ1 ChIP, cis-ρυθμιστικών συμπαράγοντες των ΡΒΧ1 μπορούσε να εντοπιστεί από τη σάρωση σύνδεσης DNA μοτίβα οι προηγουμένως χαρακτηριζόμενη παράγοντες μεταγραφής. Το web-based εφαρμογή Cistrome χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση αυτή (https://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/). Η κανονική μοτίβο δέσμευσης ΡΒΧ1 βρέθηκε να είναι μεταξύ των σημαντικά εμπλουτισμένη μοτίβα αλληλουχία (σχήμα 2 & amp?. Πίνακας S3). Ένα διάγραμμα των αποστάσεων μεταξύ των δεσμευτικών ΡΒΧ1 και η προβλεπόμενη μοτίβο του απεκάλυψε μια κανονική (σχήμα καμπάνας) κατανομή (Εικ. S1). Εκτός από το μοτίβο ΡΒΧ1, GATA1, FOSL1, και JunB μοτίβα παράγοντα μεταγραφής ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη, υποδηλώνοντας πιθανή εμπλοκή τους με ΡΒΧ1 στην ρύθμιση της μεταγραφής. Επιπλέον, το μοτίβο της MEIS1 το οποίο είναι ένα πολύ γνωστό συμπαράγοντα του ΡΒΧ1 και το μοτίβο «TAATTA» τόσο για MEOX1 και ΗΟΧ επίσης εμπλουτισμένο στο ΡΒΧ1 ChIPed αλληλουχίες.

Επιλεγμένα παραδείγματα δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής μοτίβα που είναι στατιστικά εμπλουτισμένο σε ΡΒΧ1 ανοσοκαταβυθίζονται ακολουθίες DNA

η

ΡΒΧ1 άμεσα ρυθμιζόμενη μεταγραφικό

οι μεταγραφικοί παράγοντες μπορούν να λειτουργήσουν άμεσα, καθώς και από μεγάλες αποστάσεις ή έμμεσους μηχανισμούς.? ως εκ τούτου, να εντοπίσει τα γονίδια των οποίων η μεταγραφή ήταν άμεσα ρυθμίζεται από ΡΒΧ1, θα επικαλύπτονται την ΡΒΧ1 ρυθμίζεται μεταγραφικό με τα γονίδια-στόχους τσιπ τσιπ ΡΒΧ1. Το μεταγραφικό ΡΒΧ1 ταυτίστηκε με τη σύγκριση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών έκφρασης μεταξύ ΡΒΧ1 siRNA-θεραπεία και τον έλεγχο των siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα OVCAR3. Το νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα της ΡΒΧ1 siRNA ελέγχθηκε με κηλίδα Western (Εικ. S2). Εμείς εντοπίστηκαν 2.094 μοναδικά γονίδια των οποίων τα επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά ρυθμίζονται από ΡΒΧ1 (FDR & lt? 0,01). Τα κανονικά μονοπάτια σηματοδότησης εμπλουτισμένο στο μεταγραφικό ΡΒΧ1 περιλαμβάνουν σηματοδότηση Wnt, σηματοδότησης των υποδοχέων της ινσουλίνης, και caveolar ενδοκυττάρωση σηματοδότησης (Πίνακας S4).

Επικάλυψη ΡΒΧ1 γονιδίων στόχων τσιπ τσιπ και το μεταγραφικό ΡΒΧ1 εντοπίστηκαν 195 γονίδια που ήταν δυναμικό ΡΒΧ1 άμεση γονιδίων-στόχων (Εικ. 3Α και S5). Αναλύσαμε περαιτέρω τη διανομή των γονιδίων στόχων ΡΒΧ1 ChIP σε σχέση με τις μεταβολές στην μεταγραφικό σε κύτταρα OVCAR3 σε επεξεργασία με siRNA ΡΒΧ1. Ήμασταν σε θέση να δείξει ένα σημαντικό εμπλουτισμό των στόχων ChIP ΡΒΧ1 μόνο μεταξύ των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από θεραπεία ΡΒΧ1 siRNA (Σχ. 3Β). Σε αντίθεση, οι στόχοι ΡΒΧ1 τσιπ δεν ήταν εμπλουτισμένο σε up-ρυθμιζόμενα γονίδια ή γονίδια των οποίων η έκφραση παρέμεινε αμετάβλητη (FDR & gt? 0,01). Για τον προσδιορισμό των πιθανών μεταγραφή από κοινού ρύθμιση για τα γονίδια-στόχους ΡΒΧ1, οι 195 εντοπίστηκαν γονίδια επικαλύπτονται με τα σύνολα δεδομένων ChIP περιέχει τροποποιημένα σήματα των ιστονών (βλέπε παραπάνω). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η πλειοψηφία (~ 70%) των υποκινητών γονιδίου στόχου ΡΒΧ1 περιείχε επίσης H3K4me3 αλλά μόνο ~ 2% των υποκινητών γονιδίου στόχου ΡΒΧ1 περιέχονται H3K27me3 (Εικ. S3 και Στήλη Q στον Πίνακα S5). Στατιστικά τεστ έδειξαν ότι οι 195 τεκμαρτή γονιδίων στόχων ΡΒΧ1 σημαντικά συν-συνέβη με H3K4me3 και RNA πολυμεράση ΙΙ, αλλά όχι με H3K7me3 (Πίνακας S2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΡΒΧ1 απαιτείτο για την ενεργό έκφραση των γονιδίων στόχων και των υποκινητών των γονιδίων στόχων του συχνά καταλαμβάνεται με H3K4me3, σήμα ιστόνης σχετίζεται με ενεργά γονίδια μεταγράφονται

Α:. Venn διάγραμμα ΡΒΧ1 τσιπ τσιπ γονιδίων στόχων και ΡΒΧ1 μεταγραφικό αποκαλύπτουν μια σειρά από επικαλυπτόμενα γονίδια που είναι άμεσα γονιδίων στόχων του ΡΒΧ1. Ο πλήρης κατάλογος των επικαλυπτόμενων γονιδίων φαίνεται στον Πίνακα S5. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα OVCAR3. Β: Ανάλυση σύνολο εμπλουτισμός Gene διεξήχθη για να καθοριστεί εάν οι στόχοι ΡΒΧ1 ChIP εμπλουτισμένο στο μεταγραφικό ΡΒΧ1. Τα γονίδια κάτω-ρυθμίζονται από ΡΒΧ1 siRNA εμπλουτίζεται σημαντικά στο στόχο που έχει τεθεί ΡΒΧ1 chip.

Η

Επτά εκπρόσωπος των υποψηφίων, με βάση τις γνωστές λειτουργίες τους στη βιολογία του καρκίνου, επιλέχθηκαν από τους στόχους 195 υποψήφια ΡΒΧ1 για την επικύρωση χρησιμοποιώντας qPCR. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ειδική δέσμευση του ΡΒΧ1 να αναλυθούν οι προαγωγοί (Σχ. 4Α), και επιβεβαιώθηκε μεταγραφής κάτω ρύθμιση σε απόκριση σε ΡΒΧ1 knockdown για καθένα από αυτά τα γονίδια που αναλύθηκαν (Σχ. 4Β).

A. Επτά γονίδια επελέγησαν από τον κατάλογο του γονιδίου-στόχου ΡΒΧ1 ChIP και πληρότητα του κάθε δικαιούχου από ΡΒΧ1 ελέγχθηκε με ανάλυση τσιπ qPCR. ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας είτε IgG ή αντίσωμα αντι-ΡΒΧ1, και το ανοσοκαταβυθισμένο DNA υποβλήθηκε σε ανάλυση qPCR χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που πλευρίζουν την κορυφή της περιοχής δεσμεύονται ΡΒΧ1. ρύθμιση Β Μεταγραφική αυτών των γονιδίων στόχου με ΡΒΧ1 ή MEOX1 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας siRNA και ανάλυση RT-qPCR. Έκφραση των επτά γονιδίων στόχων είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται από ΡΒΧ1 siRNA σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA (Μαθητή

t-test

,

σ

& lt? 0,01). Εκτός από την ZHX2, MEOX1 siRNA μειωτικά σημαντικά την έκφραση των γονιδίων δοκιμάστηκαν (Μαθητή

t-test

,

σ

& lt? 0,01). Γ τσιπ qPCR επικύρωση GATA1 και MEOX1 δεσμευτική κοντά στις ακολουθίες ΡΒΧ1-δεσμεύεται. ChIP πραγματοποιήθηκε με τη χρήση IgG, αντι-GATA1, ή αντίσωμα αντι-MEOX1 και το ανοσοκαταβυθισμένο DNA υποβλήθηκε σε qPCR χρησιμοποιώντας ίδιους εκκινητές όπως στο Α, εκτός ως προς τη δέσμευση του MEOX1 στο

ZHX2

υποκινητή, σύνδεση του GATA1 ή MEOX1 στους υποψηφίους του γονιδίου είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι δέσμευση της IgG στους ίδιους φορείς προώθησης (Μαθητή

t-test

,

σ

& lt? 0,01).

Η

Για να προσδιορίσετε αν το δυναμικό συμπαράγοντες ΡΒΧ1 που προσδιορίζονται από την ανάλυση μοτίβο που περιγράφεται παραπάνω συν-συμβαίνουν με δεσμευτικές ΡΒΧ1 σε περιοχές προαγωγού, εκτελέσαμε τσιπ qPCR για GATA1 και MEOX1 χρησιμοποιώντας PCR εναρκτήρες που πλευρίζουν τις αλληλουχίες του ΡΒΧ1 δέσμευσης αιχμής. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι και οι δύο παράγοντες μεταγραφής εκφράστηκαν σε κύτταρα OVCAR3 (Εικ. S4A). Τσιπ qPCR απέδειξε ότι GATA1 δεσμεύεται σε όλες τις δοκιμαζόμενες υποστηρικτές και MEOX1 ήταν παρούσα σε 6 από 7 δοκιμαστεί υποκινητές (

t

Φοιτητών – test,

σ

& lt? 0,01? Σχήμα 4C.).

Συσχέτιση ΡΒΧ1 και γονιδίου-στόχου έκφρασης σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών

για να προεκτείνουν τη βιολογική σημασία των γονιδίων στόχων ΡΒΧ1 που εντοπίζονται στην κυτταρική σειρά OVCAR3 σε σχέση με τους ανθρώπινους ιστούς καρκίνου, πραγματοποιήσαμε

in silico

ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα δημόσια προσβάσιμο μικροσυστοιχίες έκφρασης σύνολο δεδομένων [21], για να καθοριστεί εάν η έκφραση ΡΒΧ1 συσχετίστηκε με γονίδια-στόχους της σε 9 διαφορετικούς τύπους ιστών καρκινώματος. Ένα σύνολο των 86 υποψηφίων γονιδίων στόχων ΡΒΧ1 εντοπίστηκαν στο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών [21], και αυτά τα γονίδια Διερωτήθηκε Oncomine. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το καρκίνωμα των ωοθηκών έχει ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης ΡΒΧ1 σε σύγκριση με τους άλλους 8 τύπους καρκίνων (Εικ. 5). Επιπλέον, 28 από τα 86 γονίδια ερωτηθούν ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα στους καρκίνους των ωοθηκών, σε σύγκριση με άλλα καρκινώματα (

ρ

& lt? 0,05).

Oncomine μετα-ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ένα προηγουμένως δημοσιεύθηκε γονίδιο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχιών έκφρασης που περιέχει εννέα διαφορετικά είδη όγκων. Γονίδια κατατάχθηκαν σύμφωνα με την υπερέκφραση τους στον καρκίνο των ωοθηκών και τα κορυφαία 18 γονίδια χαράχθηκαν.

Η

Το πρόσφατα διαθέσιμα TCGA ωοθηκών σύνολο δεδομένων ορώδες καρκίνο μας επιτρέπεται να εκτελούν στατιστική ανάλυση για να προσδιοριστεί η συν-ρύθμιση προς τα πάνω ΡΒΧ1 και τα γονίδια-στόχους της σε καρκινώματα ωοθηκών. Μεταξύ 195 πιθανά γονίδια-στόχους ΡΒΧ1, περαιτέρω ανάλυση διεξήχθη σε ένα σύνολο 137 για τους οποίους ήταν παρόντες σε όλες τις τρεις διαφορετικές πλατφόρμες μικροσυστοιχιών διαθέσιμα από την cBio Cancer Genomics Πύλη δεδομένα γονιδιακής έκφρασης (https://www.cbioportal.org/public-portal /). Μεταξύ αυτών των γονιδίων στόχων 137 ΡΒΧ1, 53 γονίδια έδειξε μια τάση προς συν-ρύθμιση προς τα πάνω με ΡΒΧ1 (λόγος πιθανοτήτων & gt? 1.5), εκ των οποίων 18 (13,1%) ήταν σημαντικά (

σ

& lt? 0,05). Αυτό είναι υψηλότερο από ό, τι θα αναμενόταν από την τύχη (

σ

= 0.013, Chi-square test), επειδή εφαρμόζοντας την ίδια ανάλυση με το σύνολο των 11.201 γονιδίων που διατίθενται για ανάλυση αποκάλυψε ότι μόνο 873 γονίδια (7,8%) έδειξε τόσο ο λόγος πιθανοτήτων μεγαλύτερος από 1,5 και

σ

& lt? 0,05. Η αναλογία πιθανοτήτων και η σημασία (

σ

-τιμή) συν-ρύθμιση προς τα άνω του ΡΒΧ1 και γονιδίων-στόχων του φαίνονται στον Πίνακα στήλες S5 Η και Ι, αντιστοίχως.

MEOX1 αλληλεπιδρά άμεσα με ΡΒΧ1 και διασώζει τις ΡΒΧ1-ανακληθεί

επίδραση

Στη συνέχεια, επιλέγονται

MEOX1

, ένας από τους άμεσους στόχους του ΡΒΧ1, για περαιτέρω λειτουργικές μελέτες. Όπως ΡΒΧ1, MEOX1 είναι μια πρωτεΐνη ομοπεδίου και μπορεί να αλληλεπιδράσουν με ΡΒΧ1 να σχηματίσουν σύμπλοκα ετεροδιμερών μεταγραφής. Έτσι, ρωτήσαμε αν MEOX1 και ΡΒΧ1 φυσικά αλληλεπιδρούν στα κύτταρα. Ένα πείραμα συν-ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη σε κύτταρα ΗΕΚ293 επιμολυσμένα με ΡΒΧ1-V5 και φορείς έκφρασης cDNA MEOX1-FLAG. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΡΒΧ1 pull-down χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα V5 σημαντικά εμπλουτισμένη πρωτεΐνη MEOX1 ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western με ένα αντίσωμα FLAG (Σχ. 6Α). Αμοιβαίες συνανοσοκαθίζησης επιβεβαίωσε ότι MEOX1 συν-ανοσοκαταβυθίζονται με ΡΒΧ1 (Σχ. 6Α).

Α. ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΡΒΧ1-V5 ή /και φορείς έκφρασης MEOX1-FLAG. Ανοσοκαθίζηση και στύπωμα Western πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αντισωμάτων tag-ειδικό επιτόπιο. Β Αριστερός πίνακας: κύτταρα OVCAR3 επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης MEOX1 ή φορέα ελέγχου. κηλίδα Western Διεξήχθη να δοκιμαστεί η έκφραση MEOX1 (κορυφή). Τα ίδια κύτταρα διαμολύνθηκαν με ΡΒΧ1 siRNA ή ελέγχου siRNA και στύπωμα Western διεξήχθη για να ελεγχθεί η προς τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνης ΡΒΧ1 (μέση). Ανίχνευση GAPDH πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω). Δεξιό πλαίσιο: Σχετική αριθμούς κυττάρων μετρήθηκαν σε κύτταρα επιμολυσμένα με OVCAR3 MEOX1 cDNA, ΡΒΧ1 siRNA, πλασμίδιο ελέγχου (pLPC), και τον έλεγχο siRNA (siLuc). Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία μεταξύ των MEOX1 ομάδα υπερ-εκφράζεται και της ομάδας ελέγχου.

Η

Δοκιμάσαμε επίσης μια ομάδα γονιδίων ΡΒΧ1-ρυθμίζονται για να προσδιοριστεί εάν MEOX1 είχε εμπλακεί στη ρύθμιση της μεταγραφής τους. Χρησιμοποιώντας MEOX1 siRNA, βρήκαμε ότι η έκφραση των έξι από τα επτά γονίδια ΡΒΧ1 ρυθμιζόμενων ήταν επίσης εξαρτάται από την MEOX1. Επιπλέον, βρήκαμε ότι

ΡΒΧ1

μεταγραφή εξαρτάται από MEOX1, όπως MEOX1 siRNA μείωσε το

ΡΒΧ1

επίπεδο του mRNA. Αντίστοιχα, η

MEOX1

επίπεδο mRNA έγινε κάτω-ρυθμίζονται από ΡΒΧ1 νοκ ντάουν. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ΡΒΧ1 ήταν απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών συμπεριλαμβανομένων OVCAR3? εδώ, εκτελέσαμε siRNA knockdown για να προσδιοριστεί εάν MEOX1 knockdown παρήγαγε ένα φαινότυπο παρόμοιο με ΡΒΧ1 knockdown. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι MEOX1 knockdown μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3, ένα φαινότυπο που μοιάζει με το ΡΒΧ1-αποσύρονται επίδραση (Εικ. S5).

Για να δοκιμαστεί εάν MEOX1 μεσολάβηση της λειτουργίας της κυτταρικής ανάπτυξης του ΡΒΧ1, εκφράσαμε MEOX1 συστατικώς (οδηγείται από έναν προαγωγέα CMV) και κατέστειλαν έκφραση ΡΒΧ1 χρησιμοποιώντας siRNA. Βρήκαμε ότι συστατική έκφραση MEOX1 μερικώς προστατευμένο κύτταρα από ΡΒΧ1 απόσυρση επαγόμενη καταστολή της ανάπτυξης, αύξηση του αριθμού των κυττάρων ως σημαντικά παρατηρήθηκαν σε κύτταρα MEOX1 επιμολυσμένα σε σύγκριση με τον έλεγχο του πλασμιδίου-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 6Β). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι MEOX1 αποτελεί ουσιώδες μεσολαβητής του σήματος ανάπτυξης ΡΒΧ1 που σχετίζονται, αν και η έκφραση της ίδιας MEOX1 δεν είναι επαρκής για να διεγείρει κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. S6).

Συζήτηση

Η ομοιοακολουθίας οικογένεια γονιδίων, η οποία είναι κρίσιμη στην μεταγραφική ρύθμιση, κωδικοποιεί πυρηνικές πρωτεΐνες που περιέχουν εξαιρετικά διατηρημένη homeodomains δέσμευσης DNA [22]. Οι πρωτεΐνες ομοιοκυτίου εμπλέκονται σε κρίσιμες δραστηριότητες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ογκογένεσης. Στην έκθεση αυτή, εστιάσαμε σε ένα από τα γονίδια που ομοιοακολουθίας, ΡΒΧ1, το οποίο βρέθηκε να παίζει κρίσιμο ρόλο στον καρκίνο των ωοθηκών, με την πρόθεση της ταυτοποίησης και χαρακτηρισμού του δικτύου μεταγραφική του σε καρκινικά κύτταρα. Ενσωμάτωση ανάλυση των υποκινητών γονιδίων δεσμεύεται από ΡΒΧ1 και το μεταγραφικό ΡΒΧ1 μας επέτρεψε να εντοπιστούν γονίδια που ρυθμίζονται απευθείας από ΡΒΧ1.

Η ευρωστία της δοκιμασίας τσιπ τσιπ γονιδιώματος σε όλη μας αποδεικνύεται από την παρατήρηση ότι το μοτίβο κανονική ΡΒΧ1 είναι άκρως εμπλουτισμένο σε αλληλουχίες ΡΒΧ1 ChIPed. Έχουμε αποδείξει ότι οι στόχοι ChIP 195 ΡΒΧ1 επικαλύπτονται σημαντικά με πληρότητα υποκινητή της RNA πολυμεράσης II και H3K4me3, ενός σήματος ιστόνης συνδέονται με την ενεργό μεταγραφή, αλλά όχι με H3K27me3, σήμα ιστόνης συνδέονται με την καταστολή της μεταγραφής. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι στόχοι ChIP ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη μόνο μεταξύ γονίδια των οποίων η μεταγραφή από την υποστήριξη της ΡΒΧ1 (μειωτικά από ΡΒΧ1 siRNA) αλλά όχι μεταξύ γονίδια των οποίων η μεταγραφή καταστέλλεται ή δεν επηρεάζεται από ΡΒΧ1. Αυτά τα δεδομένα λαμβανόμενα μαζί υποστηρίζουν την άποψη ότι ΡΒΧ1 χρησιμεύει κυρίως ως μεταγραφικός ενεργοποιητής παρά ένα καταστολέα σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Η τρέχουσα μελέτη αποκάλυψε επίσης πιθανά cis-ρυθμιστικών συμπαράγοντες του ΡΒΧ1, οι οποίες περιλαμβάνουν GATA1, FOSL1, MEIS1 , JunB, και ένα μοτίβο «TAATTA» για MEOX1 [23] και ΗΟΧ [24]. Τα μοτίβα αυτών των συμπαραγόντων μεταγραφής ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη σε αλληλουχίες ΡΒΧ1 δεσμευμένα, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να εργάζονται από κοινού με ΡΒΧ1 να διευκολυνθεί μεταγραφική ρύθμιση. Είναι ενδιαφέρον, αρκετές από αυτές τις πιθανές συμπαράγοντες ΡΒΧ1, συμπεριλαμβανομένης της BCL6 και MEOX1, εντοπίστηκαν επίσης να ρυθμιστούν άμεσα από ΡΒΧ1, προτείνοντας μια αυτόματη ρυθμιστικό έλεγχο της μεταγραφής των γονιδίων αυτών. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε σε MEOX1 να αξιολογήσει συν-δεσμευτική και συν-κανονιστική δραστηριότητα της με ΡΒΧ1. Περαιτέρω πειράματα θα πρέπει να εκτελούνται για να καθοριστεί εάν οι άλλες συμπαράγοντες χρησιμεύσει ως συν-ρυθμιστικών παραγόντων με ΡΒΧ1 στα καρκινικά κύτταρα.

Ένα άλλο συναρπαστικό εύρημα σε αυτή τη μελέτη είναι η αναγνώριση ενός νέου ρόλου της MEOX1 στην παθογένεση του καρκίνου. Παρά το γεγονός ότι MEOX1 είναι καθιερωμένη ως ένας από τους βασικούς μεταγραφικούς ρυθμιστές κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι MEOX1 συμμετέχει επίσης στην ανάπτυξη του καρκίνου μέσω της συμμετοχής στο δίκτυο ΡΒΧ1 μεταγραφικό. Το γεγονός ότι η MEOX1 συν-απορυθμίζεται με ΡΒΧ1 σε ένα υποσύνολο ωοθηκικών καρκινωμάτων (Εικ. 5) δείχνει ότι μια ΡΒΧ1-MEOX1 μοριακό άξονας εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση των εν λόγω καρκινωμάτων. Με βάση αυτό το σκεπτικό, πραγματοποιήθηκε «διάσωσης» δοκιμασία με εκτοπικά εκφράζοντας MEOX1 σε καρκινικά κύτταρα με ΡΒΧ1 knockdown. Το αποτέλεσμά μας δείχνει ότι η έκφραση MEOX1 αντιστραφεί η ανασταλτική δράση αύξησης του ΡΒΧ1 knockdown υποδηλώνει ότι MEOX1 μεσολαβεί στην λειτουργία υποστήριξης ανάπτυξης του ΡΒΧ1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Τόσο ΡΒΧ1 και MEOX1 ανήκουν στην οικογένεια ομοιοπεριοχή, τα μέλη της οποίας συνήθως αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες ομοπεδίου να παράγει ετεροδιμερική σύμπλοκα πρωτεΐνης που είναι τα λειτουργικά μεσολαβητές της μεταγραφικής ρύθμισης. Πράγματι, πείραμα συνανοσοκαθίζηση μας απέδειξαν αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών ΡΒΧ1 και MEOX1, γεγονός που υποδηλώνει ότι MEOX1 μπορεί να είναι ένα κρίσιμο ομοπεδίου συμπαράγοντα του ΡΒΧ1. Έτσι, ΡΒΧ1 φαίνεται να δρα όχι μόνο ως προς τα ανάντη ρυθμιστής αλλά και ως δεσμευτικό συμπαράγοντα του MEOX1. Αυτό το εύρημα είναι θυμίζει μια προηγούμενη μελέτη που δείχνει ότι ΡΒΧ1 και HOXB1 συνεργάζονται στη ρύθμιση της δραστηριότητας της έκφρασης HOXB1 σε ιστούς ποντικών [25]. Μπορεί να προβλέπεται ότι αυτή η θετική αυτο-ρυθμιστικών βρόχου λειτουργεί ώστε να εξασφαλίζεται σταθερή μεταγραφική δραστηριότητα άλλων γονιδίων ΡΒΧ1 ρυθμίζονται.

Τα αποτελέσματα όπως αναφέρονται εδώ αποτελούν ένα πρώτο βήμα προς την κατανόηση των σύνθετων ρυθμιστικών δικτύων της ΡΒΧ1 σε καρκινώματα. Καθώς ο ρόλος των ΡΒΧ1 στην ανθρώπινη συμπαγείς όγκους αναδύεται, τα γονίδια-στόχους που ελέγχονται άμεσα από ΡΒΧ1 αναφέρονται εδώ θα χρησιμεύσει ως βήματα για την αποκρυπτογράφηση πώς ΡΒΧ1 συμβάλλει στην ανάπτυξη των όγκων. Αυτή η μελέτη εγείρει επίσης διάφορα σημαντικά ζητήματα πρέπει να αντιμετωπιστούν. Για παράδειγμα, θα ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί κατά πόσο οι ΡΒΧ1 ρυθμιζόμενα γονίδια που προσδιορίζονται στο καρκίνωμα των ωοθηκών από κοινού με τα μηχανήματα που λειτουργούν κατά την διάρκεια της ανάπτυξης οργάνων. Δεδομένου ότι η υπερέκφραση του ΡΒΧ1 και MEOX1 είναι σχετικά ειδικά για τον καρκίνο των ωοθηκών, σε σύγκριση με άλλους συμπαγείς όγκους (Εικ. 5), η βιολογική σημασία του ΡΒΧ1 και MEOX1 συν-έκφραση και τη συνεργασία τους στην μεταγραφική ρύθμιση είναι πιθανό να είναι στο πλαίσιο και του ιστού που εξαρτάται από . Από αυτή την άποψη, θα ήταν σημαντικό να καθοριστεί εάν MEOX1 διαμορφώνει την επιλεκτικότητα και αλληλουχίας στόχου συγγένεια δέσμευσης του συμπλέγματος μεταγραφής ΡΒΧ1 στον καρκίνο των ωοθηκών, και τελικά, θα ήταν ενδιαφέρον να καθορίσουν τον τρόπο ΡΒΧ1 /σχηματισμό πολύπλοκων MEOX1 προωθεί την ογκογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές

Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιελάμβανε κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών, OVCAR3, και σε εμβρυϊκό κύτταρο σειρά νεφρού επιθηλιακά, ΗΕΚ293. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia). Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου βοοειδούς και αντιβιοτικά. Δεν υπήρξε καμία ένδειξη μόλυνσης από μυκόπλασμα βασίζεται σε ανάλυση PCR.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Ανάλυση

Για κάθε ανοσοκατακρήμνιση, 12 × 10

6 OVCAR3 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν περίπου. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 150 mm και καλλιεργήθηκαν μέχρι 80% συρροή. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με την προσθήκη φορμαλδεΰδης (1% τελική συγκέντρωση) στα μέσα καλλιέργειας και επώαση για 10 λεπτά. Η αντίδραση σβήστηκε με 125 mM γλυκίνη για 5 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε DPBS, πυρήνες διογκώθηκε σε πυρήνες ρυθμιστικού διόγκωσης (5 mM PIPES ρΗ 8.0, 85 mM KCl, 0,5% ΝΡ 40), και λύθηκαν σε πυρήνες ρυθμιστικό λύσης (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI , ρΗ 8,0). Τα λυθέντα πυρήνες υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε ένα Fisher μοντέλο 100 συσκευή υπερήχων για 5 κύκλους των 40 sec σταθερή παλμό με επώαση σε πάγο 2 λεπτά σε μεταξύ των παλμών. Ήχο διασπώμενα προϊόντα λύσης αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης πλινθίου (0,01% SDS, 1,1% Triton Χ-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCI, ρΗ 8,0, 167 mM NaCl) και επωάστηκαν με Πρωτεΐνη G Sepharose (Invitrogen) για 1 ώρα. Τα σφαιρίδια απομακρύνθηκαν και χάντρα διαυγασμένα λύματα επωάζονται με αντισώματα εναντίον ΡΒΧ1, GATA1, ή MEOX1 (Santa Cruz SC-899, SC-265 ×, και Epitomics T2204, αντίστοιχα) όλη τη νύκτα με περιστροφή στους 4 ° C. Μια 1:01 πολτός BSA-αποκλεισμένη Protein G-Sepharose προστέθηκε σε προϊόντα λύσης αντίσωμα επωάζεται και περιστράφηκε σε 4 ° C για 2-3 ώρες. συμπλοκών αντισώματος-πρωτεΐνης συνδέεται προς σφαιρίδια πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό χαμηλού άλατος (0.1% SDS, 1% Triton Χ-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0, 150 mM NaCl), μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα LiCl (0,25 Μ LiCl, 1% ΝΡ 40, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0), και δύο φορές με ΤΕ, ρΗ 8,0. Συγκροτήματα εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με επώαση σε 1% SDS, 0,1 Μ NaHCO

3 (θερμαίνεται στους 65 ° C) για 30 λεπτά στους 37 ° C με ανακίνηση. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 200 mM NaCl και 1 μg RNase Α στους 65 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από 1 ώρα επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ στους 37 ° C, το DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Qiagen QIAquick PCR και εκλούεται σε 100 μΐ ΤΕ.

Για την ανάλυση qPCR, 2,5 μΙ δείγμα χρησιμοποιήθηκε ανά αντίδραση. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green χρωστική και μία iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι αριθμοί κύκλος κατωφλίου (Ct) ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό διεπαφής Οπτικό σύστημα iCycler. PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Primer 3 (Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα S6). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη, το οποίο παρασκευάστηκε από επεξεργασία με υπερήχους εισόδου (συνολικά) DNA.

τσιπ τσιπ Array Ανάλυση

Για ανάλυση συστοιχία τσιπ τσιπ, Chip πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω με τη διαφορά για το στάδιο καθαρισμού DNA. ΫΝΑ καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Qiagen MinElute PCR και εκλούεται με 10 μΙ Η2Ο. Ολόκληρο το άνοσο δείγμα DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ WGA2 (Sigma) και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού Qiagen QIAquick PCR με όγκο έκλουσης 40 μΙ σε Η2Ο. Για DNA εισόδου, 200 ng καθαρισμένου DNA χρησιμοποιήθηκε για WGA2 PCR. Μία μικρή ποσότητα από κάθε ενισχυμένο δείγμα αραιώθηκε σε 5 ng /μl και χρησιμοποιείται για qPCR. Εάν 4 μg του DNA δεν παρήχθησαν από το WGA2 PCR, 10 ng της αντίδρασης WGA2 ενισχύθηκαν και πάλι με τη χρήση του κιτ WGA3 (Sigma), και δοκιμάστηκαν με εκκινητές ελέγχου ξανά. Κλάσματα του κάθε δείγματος (4 μg) απεστάλησαν στην NimbleGen για την επισήμανση και υβριδισμό συστοιχίας. Η REFSEQ υποστηρικτής NimbleGen 385K 1-plex σειρά χρησιμοποιήθηκε για υβριδοποίηση του δείγματος.

Για την ανάλυση της σειράς, το πρόγραμμα NimbleGen Signal Χάρτης χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση κορυφές του σήματος για κάθε δείγμα και να χαρτογραφήσουν αυτές τις κορυφές στις αντίστοιχες περιοχές του γονιδιώματος τους. Χρησιμοποιώντας τα GenomicRanges πακέτο Bioconductor (διαθέσιμο σε bioconductor.org), θα προβληθεί τις περιοχές αιχμής από το στόχο τσιπ τσιπ με FDR≤0.2 για επικάλυψη με αιχμές από μη ειδικό IgG τσιπ τσιπ και απορρίπτονται εκείνες τις κορυφές με ένα τουλάχιστον bp επικάλυψη. Οι υπόλοιπες κορυφές από το στόχο τσιπ τσιπ θεωρήθηκαν θετικά για σύνδεση με τις πρωτεΐνες.

αναλύσεις αναζήτηση Motif πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του εργαλείου seqpos μοτίβο ανακάλυψη (Cistrome, https://cistrome.org/ap/root) και η TRANSFAC βάση δεδομένων μοτίβο με την ακόλουθη παράμετρο: πλάτος από την κορυφή προς σάρωση = 600 bp?

σ

& lt?. 0,05 ορίστηκε ως η αποκοπή για τη σημασία

γονιδιακής έκφρασης Array Ανάλυση

RNA απομονώθηκε από κύτταρα OVCAR3 που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία είτε με ΡΒΧ1 siRNA ή τον έλεγχο siRNA που στοχεύει γονίδιο λουσιφεράσης. επισήμανσης RNA, υβριδισμό με το HT-12 Έκφραση Array Illumina άνθρωπο, και η ανάλυση ομαλοποίηση διεξήχθησαν από την εγκατάσταση Lowe Family Genomics Πυρήνα, Johns Hopkins Bayview Ιατρικό Κέντρο. Το φορές μεταβολής επιπέδου έκφρασης του κάθε γονιδίου υπολογίσθηκε ως ο λόγος της θεραπείας ΡΒΧ1 siRNA για τον έλεγχο. Καθώς υπήρχε μόνο μια συστοιχία σε κάθε χρονικό σημείο, θα χρησιμοποιείται ο λογάριθμος της πτυχής αλλαγή ως το στατιστικό αποτέλεσμα της δοκιμής, και διεξήγαγε ανάλυση σημασία για τον υπολογισμό του

σ

-τιμή, η οποία ορίζεται ως η πιθανότητα απόκτησης ενός τεστ στατιστική τουλάχιστον τόσο ακραίο όσο εκείνο που πράγματι παρατηρούνται κάτω από τη μηδενική υπόθεση. Για μηδενική κατανομή υποθέτουμε το στατιστικό αποτέλεσμα της δοκιμής ακολούθησε μια κανονική κατανομή, όπου η μέση τιμή και την τυπική απόκλιση υπολογίστηκαν από τα δείγματα ελέγχου. Έχουμε επίσης εφαρμόσει Benjamini και Hochberg της διαδικασίας [26] για πολλαπλούς ελέγχους υποθέσεων, και εκτιμάται ότι το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) για σημαντικά εκφράζονται τα γονίδια. Σημαντικά επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια τελικά καθορίζεται από ένα προκαθορισμένο FDR αποκοπής & lt?. 0.01

Στατιστική δοκιμή γονιδιακής επικαλύψεις μεταξύ των συνόλων δεδομένων σειρά

Για να αξιολογηθεί η σημασία της επικάλυψης μεταξύ των συνόλων (π.χ. μεταξύ των τσιπ τσιπ και μεταξύ 195 γονίδια-στόχους και το chip-chip), προσδιορίσαμε την πιθανότητα απόκτησης του ίδιου αριθμού ή περισσότερες επικαλυπτόμενες γονίδια με τυχαία δειγματοληψία από το πλήρες σύνολο γονιδίων. Ο αριθμός των γονιδίων στο σύνολο ήταν 18.511 για το τσιπ τσιπ και 30.500 για την σειρά έκφρασης. Η

σ

-τιμή υπολογίστηκε με τον καθορισμό των άνω πιθανότητες ουρά του αντίστοιχου Υπεργεωμετρική κατανομή χρησιμοποιώντας phyper () συνάρτηση στο R έκδοση 2.14.1.

Στατιστική δοκιμή για συν-έκφραση μεταξύ ΡΒΧ1 και γονιδίων στόχων του

Τα Z-score των δεδομένων έκφρασης mRNA από τη μελέτη του καρκίνου των ωοθηκών TCGA ανακτήθηκαν από τον καρκίνο Genomics Data Server (CGDS) φιλοξενείται από Memorial-Sloan-Kettering, (http: //www. cbioportal.org/) χρησιμοποιώντας την 1.1.19 πακέτο CGDS-R (https://cran.r-project.org/web/packages/cgdsr/index.html). Τα Ζ-βαθμολογίες υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας διπλοειδή όγκους (διπλοειδή για κάθε γονίδιο) ως πληθυσμό αναφοράς, και μόνο τα γονίδια που αντιπροσωπεύεται από τις τρεις πλατφόρμες έκφρασης που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συμπεριελήφθησαν TCGA [27]. Ένα σύνολο 11.202 γονιδίων από 316 δείγματα όγκων με Ζ-βαθμολογίες ανακτήθηκαν για ανάλυση

Υπερ-έκφραση για κάθε γονίδιο ορίστηκε από Z-score & gt?. 1,65 (δηλαδή την κορυφή του 5% στην έκφραση του mRNA). Η τάση της συν-υπερέκφραση ΡΒΧ1 και γονιδίων-στόχων της, στο ίδιο δείγμα αξιολογήθηκε στο σύνολο του δείγματος 316 όγκου και υπολογίστηκαν λόγοι πιθανοτήτων (OR).