Αφηρημένο

Η /όρχεων οικογένεια αντιγόνου (CT) του Καρκίνου από γονίδια μεταγραφικά καταστέλλονται στους περισσότερους ανθρώπινους ιστούς, αλλά ασυνήθιστα εκ νέου εκφράζονται σε πολλούς κακοήθεις τύπους όγκων. περιορίζεται προφίλ έκφρασης τους κάνει CT αντιγόνα ιδανικοί στόχοι για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Όπως ελάχιστα είναι γνωστά σχετικά με το εάν τα αντιγόνα CT μπορεί να ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστική επεξεργασία, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν την υποβάθμιση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 σε επιλεγμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι αναστολείς της αποδόμησης πρωτεασώματος μεσολάβηση επαγόμενη τη στεγανοποίηση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 σε ένα απορρυπαντικό αδιάλυτο κλάσμα. Επιπλέον, αυτή η θεραπεία είχε επίσης ως αποτέλεσμα αυξημένη εντοπισμός του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 στο κεντρόσωμα. Παρά την αλληλεπίδρασή τους, μετεγκατάσταση είτε ΝΥ-ESO-1 ή MAGE-C1 στο κεντρόσωμα θα μπορούσε να συμβεί ανεξάρτητα από την άλλη. Χρησιμοποιώντας μια σειρά από κολοβωμένη θραύσματα, οι περιοχές που αντιστοιχούν σε NY-ESO-1

91-150 και MAGE-C1

900-1116 καθιερώθηκαν ως σημαντικοί για τον έλεγχο τόσο της σταθερότητας και εντοπισμός αυτών των αντιγόνων CT. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι τα επίπεδα σταθερής κατάστασης των NY-ESO-1 και MAGE-C1 ρυθμίζεται από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος και ότι και οι δύο συμπεριφέρονται σαν συνάθροιση επιρρεπείς πρωτεΐνες κατά της συσσώρευσης. Με αναστολείς πρωτεασώματος που χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο ως θεραπεία πρώτης γραμμής για τον καρκίνο, τα στοιχεία αυτά εγείρουν ζητήματα σχετικά με την επεξεργασία του αντιγόνου CT για αντιγονικές παρουσίαση και, ως εκ τούτου ανοσογονικότητα σε ασθενείς με καρκίνο

Παράθεση:. Pagotto Α, Caballero ΕΓ, Volkmar Ν, Devalle S, Simpson AJG, Lu Χ, et al. (2013) Centrosomal Εντοπισμός του Καρκίνου /όρχεων (CT) Αντιγόνα NY-ESO-1 και MAGE-C1 ρυθμίζεται από Proteasome Δραστηριότητα στο Κύτταρα Όγκου. PLoS ONE 8 (12): e83212. doi: 10.1371 /journal.pone.0083212

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 8 Αύγ, 2013? Αποδεκτές: 31, Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 10 Δεκεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Pagotto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το Ludwig Cancer Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Εμπλοκή του ανοσοποιητικού συστήματος να αναγνωρίζει και να εξαλειφθούν οι όγκοι /καρκινικών κυττάρων παραμένει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Η προσέγγιση βασίζεται εγγενώς σχετικά με τον προσδιορισμό των μοριακών υπογραφών σε θέση να διαφοροποιήσει αποτελεσματικά και με συνέπεια την κακοήθη πληθυσμού. Ο Καρκίνος /όρχεων (CT) αντιγόνα είναι μια συλλογή από περισσότερα από 100 οικογένειες γονιδίων με πολλά μέλη και οι παραλλαγές ματίσματος [1-3] που έχουν προσδιοριστεί μέσα από ένα ευρύ φάσμα τεχνικών, συμπεριλαμβανομένων: κλωνοποίηση των Τ-κυττάρων επίτοπο [4-7] ? ορολογική ανάλυση των βιβλιοθηκών έκφρασης cDNA (SEREX) [1], διαφορική ανάλυση γονιδιακής έκφρασης [8,9]? και της βιοπληροφορικής μεθόδους [10,11]. έκφραση τους είναι συνήθως περιορίζεται στα γεννητικά κύτταρα των όρχεων [12-15] και περιστασιακά ωοθήκη [16] και τροφοβλαστών [17]. Ωστόσο, σε μια ποικιλία τύπων όγκου (π.χ. μελάνωμα, μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, το σάρκωμα, κλπ …) άτυπο έκφραση ενός ή περισσότερων αντιγόνων CT μπορεί να παρατηρηθεί [3,18,19]. Οι φυσιολογικές συνέπειες της έκφρασης αντιγόνου CT για την πρόοδο του καρκίνου δεν είναι πλήρως κατανοητοί, αλλά αρκετές CT αντιγόνα έχουν δειχθεί ότι είναι ρυθμιστές των ουβικιτινίωση μέσω συμπλοκών που σχηματίζονται με λιγάσες ουβικιτίνης τύπου δακτυλίου [20].

Η CT αντιγόνο NY-ESO-1 /CTAG1 /CT6 εντοπίστηκε για πρώτη φορά από SEREX στην οισοφαγική καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [1,21]. NY-ESO-1 παρουσιάζει μια σχετικά μοναδική αρχιτεκτονική, με έναν τομέα Pcc-1 στο Ο-άκρο (αα 89 έως 164) ομόλογος προς έναν παράγοντα μεταγραφής ζυμομύκητα που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και πολωμένο ανάπτυξη [22], που του μόνο συντηρημένη χαρακτηριστικό. Οριστικός βιολογικός ρόλος για ΝΥ-ΕδΟ-1 παραμένει απροσδιόριστος, αλλά έχει δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν ειδικά με ένα άλλο αντιγόνο CT, MAGE-C1 [23]. MAGE-C1 είναι μέρος της οικογένειας μεγαλύτερου

MAGE

(γονίδια Μελάνωμα αντιγόνο), το οποίο αποτελείται από περισσότερα από 50 γονίδια σε πολλαπλούς υποοικογένειες (

MAGE-A με το -Ι_

). Το κυρίαρχο χαρακτηριστικό αυτών των οικογενειών είναι η εύστοχα ονομάστηκε τομέα MAGE ομολογία (MHD), μια μεγάλη κεντρική περιοχή συντηρημένη μεταξύ των μελών του [24-26]. Η MHD είναι παρούσα στις περισσότερες μεταζώων πρωτεΐνες MAGE, αλλά κυρίως απουσιάζει στο

C. elegans

καθώς και μονοκύτταροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί. Που προσδιορίζονται από SEREX και παραστατική ανάλυση διαφορά (RDA) [8], MAGE-C1 /CT7 είναι σχεδόν τρεις φορές μεγαλύτερο από οποιοδήποτε άλλο μέλος της οικογένειας MAGE (1142 αα). επεκταθεί Ν-άκρο της έχει μικρή έως καμία αξιόλογη προβλεπόμενη αρχιτεκτονική του τομέα, εκτός από πολλαπλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες των 14, 16 και 21 aa [8]. MAGE-C1 συνήθως εκφράζεται σε πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ) [27], καθώς και σάρκωμα, μελάνωμα και τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [3,18]. Μια λειτουργία για MAGE-C1 δεν έχει ακόμη καθοριστεί, αλλά αρκετές μελέτες έχουν συνδέσει με την απόπτωση στα ΜΜ [28,29].

Μεταξύ των οικογενειών γονιδίων αντιγόνου CT, έχουν τουλάχιστον 19 μέλη έχουν βρεθεί να προκαλούν χυμική και /ή κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων σε ασθενείς με καρκίνο [19,30]. πρωτεΐνες αντιγόνου CT επεξεργασία σε πεπτίδια από το πρωτεάσωμα και παρουσιάζονται στην κυτταρική επιφάνεια από μόρια MHC, αναγνωρίζονται από αυτόλογα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα. Όγκου-περιορισμένης έκφρασης και υψηλή ανοσογονικότητα έχει κάνει CT αντιγόνα ελκυστικοί στόχοι για ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές για τη θεραπεία επιλεγμένων καρκίνων [19,31-36]. NY-ESO-1 θεωρείται ότι είναι ένα από τα πιο ανοσογόνα CT αντιγόνων και υπήρξε το επίκεντρο της έρευνας για τη διατύπωση των θεραπευτικών εμβολίων [37]. Σε αντίθεση με άλλα αντιγόνα, είναι σύνηθες να παρατηρήσουμε ταυτόχρονη αντισώματος και απόκριση Τ-κυττάρων προς NY-ESO-1, το οποίο είναι ικανό να εκμαιεύσει ισχυρή ολοκληρωμένη CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρου ανοσοαπόκριση [38-40] . Συστηματική ανάλυση εντόπισε ένα επιτόπιο «hot spot» για την απόκριση των Τ-κυττάρων στο κεντρικό τμήμα της πρωτεΐνης ΝΥ-ΕδΟ-1 ανάμεσα στα αμινοξέα 80-110 [41-44].

Ενώ η μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης του αντιγόνου CT έχει συγκεντρώσει ένα μεγάλο μέρος της προσοχής, την κατανόηση μετα-μεταφραστική ρύθμιση τους και η βιολογική λειτουργία πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπόψη για την οριοθέτηση των ρόλων τους στον καρκίνο. Όπως ελκυστικούς στόχους εμβόλιο, τον προσδιορισμό κυτταρικών μηχανισμών που ελέγχουν ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 επίπεδα σταθερής κατάστασης πρωτεΐνη είναι σημαντική, καθώς μπορεί να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τα μέσα που θα μπορούσαν να διαμορφώνουν την έκφραση ή την επεξεργασία τους για την παρουσίαση του αντιγόνου και κατά συνέπεια, η ανοσοαπόκριση έναντι των κυττάρων όγκου που εκφράζουν αυτά τα αντιγόνα CT. Εδώ, θα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι σε σταθερή κατάσταση επίπεδα, διαλυτότητα και τον εντοπισμό της CT αντιγόνα NY-ESO-1 και MAGE-C1 ρυθμίζονται από την υποβάθμιση μέσω του πρωτεασώματος. Οι συγκεκριμένες περιοχές της κάθε πρωτεΐνης που εμπλέκεται στη ρύθμιση αυτών των όψεων είναι επίσης εντοπιστεί και να συζητηθούν.

Αποτελέσματα

αναστολή πρωτεασώματος προκαλεί μη διαλυτότητα και centrosomal εμπλουτισμό των NY-ESO-1

Για να καθοριστεί εάν η υποβάθμιση μέσω της ουβικιτίνης-πρωτεασώματος συστήματος (UPS) μπορεί να εμπλέκεται σε μετα -translational ρύθμιση αντιγόνο CT, τα επίπεδα έκφρασης του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά σε ένα πάνελ καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Παρατηρήσαμε ότι η SK-MEL-37 μελανώματος και κυτταρικές σειρές H146 μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (SCLC) εκφράζουν υψηλά επίπεδα του ΝΥ-ΕδΟ-1 (Εικόνα 1Α και S1A, αντίστοιχα). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές στη συνέχεια κατεργάζεται με το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος. Κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν σε διαλυτά (SOL) και αδιάλυτα (INSOL) κλάσματα σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα, συλλέγεται και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE λύσης. Αν και δεν είναι ποσοτικές, κηλίδες Western ανιχνεύτηκαν για ΝΥ-ΕδΟ-1 ανιχνεύεται αυξημένα επίπεδα στα ΚΙΡΑ-αδιάλυτα κλάσματα των δύο κυτταρικές σειρές μετά από αγωγή MG132 σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα (Σχήμα 1Β, S1B), αντανακλώντας τη μειωμένη διαλυτότητα με την απώλεια της δραστικότητας πρωτεοσώματος . Με αυτή την αλλαγή στη διαλυτότητα, είχε υποψίες ότι NY-ESO-1 εντοπισμού μπορεί να έχουν επίσης μεταβληθεί. Σε αμφότερες κύτταρα SK-MEL-37 και H146, ΝΥ-ESO-1 παρατηρήθηκε με ανοσοφθορισμό να συσσωρεύεται σε εφάπαξ puncta μετά την αγωγή MG132, εκτός από το κυρίως κυτταροπλασματική εντόπιση δει σε μη επεξεργασμένα κύτταρα. Θυμίζει κεντροσώματος, παρουσία NY-ESO-1 είναι σε αυτό το σώμα επιβεβαιώθηκε από colocalisation των NY-ESO-1 με περικεντρίνη, καλώς χαρακτηρισμένης πρωτεΐνης που σηματοδοτεί αυτή τη δομή (Σχήμα 1C, S1c). Επιπλέον, ουβικιτίνη puncta, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του σχηματισμού aggresome, παρατηρήθηκαν επίσης να colocalise με ΝΥ-ESO-1 σε αυτή τη δομή (Σχήμα 1 D). Με κάποια συχνότητα, κεντροσωμάτων-εντοπισμένη NY-ESO-1 θα μπορούσαν ακόμη να ανιχνευθεί σε μη επεξεργασμένα κύτταρα H146 (Σχήμα S1c, κορυφή, 2D), αυξάνοντας την πιθανότητα μιας bona fide φυσιολογική λειτουργία τους σε αυτό το σώμα υπό κανονικές συνθήκες. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν NY-ESO-1 μπορεί εντοπίζεται στο κεντρόσωμα και ότι απαιτεί το UPS για την αποτελεσματική αποικοδόμηση.

Α) Ανίχνευση της ενδογενούς MAGE-C1 και NY-ESO-1 με κηλίδα western (CT7.33 και NY-41 αντισώματα, αντίστοιχα). Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από SK-MEL-37, U2OS και Η1299 κύτταρα και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. β-τουμπουλίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Β) Ανίχνευση των ΝΥ-ΕδΟ-1 από SK MEL-37-κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO (αρνητικός έλεγχος) και MG132 (40μΜ, 4 ώρες). Ίσες ποσότητες ΚΙΡΑ-διαλυτών (SOL) και αδιάλυτων (INSOL) υλικό (20μg) ανιχνεύθηκαν. Γ) μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού ενδογενούς ΝΥ-ΕδΟ-1 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο) σε SK-MEL-37 κύτταρα φαίνονται, μαζί με τις εικόνες συγχωνευθείσα τους. Τα D) ανοσοφθορισμού μικρογραφίες του ενδογενούς ΝΥ-ΕδΟ-1 (πράσινο) και ουβικουϊτίνης (κόκκινο) σε SK-MEL-37 κύτταρα δείχνεται, μαζί με συγχωνευμένη τις εικόνες τους. Λευκά βέλη δείχνουν κεντροσωμάτια και η κλίμακα μπαρ = 20μm.

Η

NY-ESO-1 και MAGE-C1 colocalise στο κεντρόσωμα κατόπιν αναστολή πρωτεασώματος

NY-ESO-1 είναι συχνά συν-εκφράζονται με MAGE-C1 σε καρκινικά κύτταρα όπου είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν. Για να προσδιοριστεί εάν οι αλλαγές στην NY-ESO-1 διαλυτότητα και υποκυτταρικός εντοπισμός επάγεται από την αγωγή MG132 επηρεάζεται επίσης MAGE-C1, SK-MEL-37 κύτταρα τα οποία ενδογενώς εκφράζουν τόσο MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 (Εικόνα 1Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132. Όπως NY-ESO-1, αναστέλλοντας τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος αξιοσημείωτα αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης MAGE-C1 στο RIPA-αδιάλυτο κλάσμα, με πολύ μικρή αλλαγή που παρατηρείται στην RIPA-διαλυτό κλάσμα (Εικόνα 2Α). Colocalisation με περικεντρίνη έδειξαν ότι, όπως και ΝΥ-ΕδΟ-1, MAGE-C1 συσσωρεύεται στο κεντροσωμάτια όταν δραστηριότητα πρωτεασώματος διακυβεύεται (Σχήμα 2Β) και colocalisation του MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 σε παρόμοιες puncta υποστηρίζει ταυτόχρονη παρουσία τους εκεί (Σχήμα 2C). Colocalisation με περικεντρίνη αυξήθηκε σημαντικά σε SK MEL–37 κύτταρα κατεργασμένα με MG132, φθάνοντας πάνω από 75% για το MAGE-C1 (ρ = 0,00222, 2-tailed t-test) και ΝΥ-ΕδΟ-1 (ρ = 0,00013) ( Εικόνα 2D) και υποδεικνύοντας μία ισχυρή απάντηση στην αναστολή του πρωτεασώματος. NY-ESO-1 colocalisation με ουβικιτίνη puncta έδειξε αξιοσημείωτη διαφορά στο SK-MEL-37 κύτταρα (ρ = 0,01139), αλλά όχι H146s, που επέδειξε λιγότερο συνεπής σχηματισμός (Σχήμα 2Ε). SK-MEL-37 κύτταρα κατεργασμένα με είτε epoxomicin, μια πιο εκλεκτικός αναστολέας πρωτεασώματος (σχήμα S2A), ή μειωμένες συγκεντρώσεις MG132 (Σχήμα S2B) έδωσε συγκρίσιμα αποτελέσματα. Συσσώρευση είτε MAGE-C1 ή NY-ESO-1 σε puncta και σε ΚΙΡΑ-αδιάλυτα κλάσματα ήταν αναστρέψιμη, η οποία αντικατοπτρίζεται από την επιστροφή σε διάσπαρτες εντοπισμό και τη διαλυτότητα των απορρυπαντικών παρακάτω MG132 έκπλυση (Σχήμα S2C, S2D). Μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι και οι δύο NY-ESO-1 και MAGE-C1 παροδικά συσσωρεύονται στο κεντροσωμάτια σε απόκριση ενός εξασθενημένη οδός αποδόμησης.

Α) Western στύπωμα της MAGE-C1 από προϊόντα λύσης SK-MEL-37 κύτταρα κατεργασμένα με DMSO (αρνητικός έλεγχος) και MG132 (40μΜ, 4 ώρες). ΚΙΡΑ-διαλυτό (SOL) και αδιάλυτων (INSOL) κλάσματα εμφανίζονται. Β) ανοσοφθορισμού μικρογραφίες του ενδογενούς MAGE-C1 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο) σε SK-MEL-37 κύτταρα. Συγχωνευθείσας εικόνες εμφανίζονται επίσης. Ράβδοι κλίμακας = 20 μm C) μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού ενδογενούς MAGE-C1 (πράσινο) και ΝΥ-ΕδΟ-1 (κόκκινο) σε SK-MEL-37 κύτταρα. Ράβδοι κλίμακας = 10 μm. Σε όλες τις εικόνες, λευκό βέλη δείχνουν κεντροσωμάτια. D) γραφήματα Bar παρουσιάζει το ποσοστό των ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 puncta συνεντοπίζεται με περικεντρίνη για SK-MEL-37 (MAGE-C1 /περικεντρίνη – DMSO: 0,42 ± 0,72 και MG132: 76,94 ± 6,61, ρ = 0,00222? NY-ESO-1 /περικεντρίνη – DMSO: 5,77 ± 3,74 και MG132: 75,77 ± 1,73, ρ = 0,00013), U2OS (MAGE-C1 /περικεντρίνη – DMSO: 2,75 ± 1,74 και MG132: 69,28 ± 6,79, ρ = 0,00212), HC33 (NY-ESO-1 /περικεντρίνη – DMSO: 21,32 ± 2,39 και MG132: 70.23 ± 6.86, p = 0,00312) και H146 (NY-ESO-1 /περικεντρίνη – DMSO: 57.86 ± 18.53 και MG132: 80,95 ± 1,80, p = 0,16289) κύτταρα. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα H146 εκφράζουν MAGE-C1, δεν περιλαμβάνονται στην παρούσα ανάλυση. Ε) Μπαρ γραφήματα που παρουσιάζουν το ποσοστό των συνεντοπίζεται NY-ESO-1 και ουβικουϊτίνης puncta για SK-MEL-37 (DMSO: 0.65 ± 1.12 και MG132: 30.81 ± 6.09, p = 0,01139), HC33 (DMSO: 4,09 ± 2,52 και MG132 : 23.06 ± 6.70, ρ = 0,02739), και H146 (DMSO: 2,14 ± 1,43 και MG132: 20,00 ± 18,03, ρ = 0,22733) κύτταρα. Η μέση, τυπική απόκλιση και τη σημασία δείχνονται.

Η

Ανεξάρτητα εντοπισμό του CT αντιγόνων στο κεντρόσωμα

Από ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 μπορούν να σχηματίσουν σύμπλοκα, Στη συνέχεια εξετάσαμε εάν η αλληλεπίδραση ήταν υποχρεωμένη να προσδώσει στεγανοποίηση σε ΚΙΡΑ-αδιάλυτο κλάσμα ή τον εντοπισμό στη κεντροσώματος κατά την αναστολή του πρωτεασώματος. κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS εκφράζουν MAGE-C1, αλλά όχι NY-ESO-1, ενώ τα κύτταρα HC33 SCLC εκφράζουν NY-ESO-1 αλλά όχι ΜΑΟΕ-C1 (Σχήμα 1Α, S1 Α). Κατά την επεξεργασία με MG132, κάθε αντιγόνο CT παρατηρήθηκε να συσσωρεύεται ανεξάρτητα σε ΚΙΡΑ-αδιάλυτα κλάσματα (Σχήμα 3Α, 3C) και εντοπίζονται σε κεντροσωμάτια (Σχήμα 3Β, 3D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζονται από siRNA μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση του είτε αντιγόνου σε SK-MEL-37 κύτταρα, τα οποία απέδειξαν ότι η εξάντληση του ΝΥ-ΕδΟ-1 δεν επηρέασε centrosomal εντοπισμός του MAGE-C1 (Σχήμα S3, αριστερά) και αντιστρόφως ( Εικόνα S3, δεξιά). Τόσο MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 που σχηματίζεται puncta που συνεντοπίζεται με περικεντρίνη σε (p = 0,00312) κύτταρα, U2OS (ρ = 0,00212) και HC33 αντίστοιχα, με επίπεδα κοντά 70% και σημαντικά μεγαλύτερο από τα κύτταρα DMSO-αγωγή (Εικόνα 2D ). Όπως και οι H146s, υψηλότερα βασικά επίπεδα της ΝΥ-ΕδΟ-1 puncta παρατηρήθηκαν επίσης στην κυτταρική γραμμή HC33. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι NY-ESO-1 και MAGE-C1 μπορεί να συσσωρεύονται και να εντοπίσουν την κεντρόσωμα ανεξάρτητα μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της περιόδους διαταραγμένη δραστηριότητα πρωτεασώματος.

Α) Ανίχνευση της ενδογενούς NY-ESO-1 με western blot από τα κύτταρα HC33 SCLC που έλαβαν θεραπεία με DMSO και MG132 (40μΜ, 4 ώρες). ΚΙΡΑ-διαλυτό (SOL) και αδιάλυτων (INSOL) κλάσματα εμφανίζονται. Β) μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού ενδογενούς ΝΥ-ΕδΟ-1 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο) σε κύτταρα HC33 σε επεξεργασία με DMSO και MG132, όπως στο Σχήμα 1C C) Ανίχνευση του ενδογενούς MAGE-C1 από κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS κάτω από τις ίδιες συνθήκες όπως στο Σχήμα 2Α. μικροφωτογραφίες D) ανοσοφθορισμού ενδογενούς MAGE-C1 (πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο) σε κύτταρα U2OS σε επεξεργασία με DMSO και MG132, όπως στην Εικόνα 2Β. Λευκά βέλη δείχνουν κεντροσωμάτια. μπαρ κλίμακα = 20μm.

Η

NY-ESO-1

91-150 συμβάλλει στη συνολική σταθερότητα

Έχουμε αποδείξει ότι το NY-ESO-1 είναι ένα υπόστρωμα του πρωτεασώματος αλλά ποιες περιοχές επηρεάζουν την υποβάθμιση του δεν είναι γνωστή. Για τον εντοπισμό των τομέων υπεύθυνη για στεγανοποίηση σε ΚΙΡΑ-αδιάλυτα κλάσματα και κεντροσωμάτων εντοπισμού, κατασκευάσαμε θραύσματα NY-ESO-1 (NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91-180 και NY-ESO-1

50-150, Σχήμα 4Α) και εξέφρασε τα ατομικά μαζί με την μορφή πλήρους μήκους (NY-ESO-1

FL) σε ποντικό που προέρχονται ΝΙΗ3Τ3 κυττάρων, τα οποία εκφράζουν ούτε MAGE-C1 ούτε NY-ESO-1. Μετά τη θεραπεία και διαλυτοποίηση αγωγή MG132 που περιγράφεται παραπάνω, σε σχέση έκφρασης και υποκυτταρικού εντοπισμού αναλύθηκαν με κηλίδα western και ανοσοφθορισμό, αντίστοιχα. Και οι δύο ΚΙΡΑ-διαλυτά και αδιάλυτων κλασμάτων NY-ESO-1

FL, NY-ESO-1

91-180 και NY-ESO-1 σταθεροποιήθηκαν

50-150 από MG132, ενώ NY- ESO-1

1-90 συσσωρευτεί μόνο στο RIPA-διαλυτό κλάσμα (σχήμα 4Β). Σημαντική συσσώρευση του NY-ESO-1

91-180 κομμάτι με MG132 εμπλέκει το UPS σε ταχεία κύκλου εργασιών του θραύσματος και προτείνει NY-ESO-1 σταθερότητας προέρχεται από μια περιοχή εκτός του τομέα PCC1. Η NY-ESO-1

1-90 θραύσμα εμφανίστηκε συγκεντρώνεται στον πυρήνα, ενώ NY-ESO-1

91-180 και ΝΥ-ΕδΟ-1

50-150 εντοπισμένο τόσο στο πυρηνικό και κυτταροπλασματική περιοχές ανεξάρτητα από το αν ενδογενούς ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 υπήρχαν (SK-MEL-37, Σχήμα 4C) ή όχι (ΝΙΗ3Τ3, Εικόνα S4). Υποκυτταρικός εντοπισμός της είτε ΝΥ-ΕδΟ-1 που εκφράζεται σε αποκοπές NIH3T3s (σχήμα S4) ή NY-ESO-1

1-90 σε SK-MEL-37S (Σχήμα 4C) δεν ήταν αισθητά μεταβληθεί από MG132. Ωστόσο, όπως και η ενδογενής NY-ESO-1, τόσο NY-ESO-1

91-180 και NY-ESO-1

50-150 συσσωρευτεί σε κεντροσωμάτια σε SK-MEL-37 κύτταρα (Σχήμα 4C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα τονίζουν την περιοχή μεταξύ αα 91-150 ως επιρροή στη NY-ESO-1 σταθερότητας και τον εντοπισμό στη κεντρόσωμα.

Α) Σχηματική αναπαράσταση της V5 /His6 επισύναψη επιτόπου σε όλο το μήκος και περικοπή κατασκευάσματα της NY-ESO-1. NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91 – 180 και ΝΥ-ΕδΟ-1

50-150 φαίνονται, μαζί με την διατηρημένη περιοχή PCC1. Β) Ανίχνευση των ΝΥ-ΕδΟ-1 κατασκευάσματα εκφράστηκε παροδικά σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 με western blot με αντι-V5 και αντι-β-τουμπουλίνης (έλεγχος φόρτωσης). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 και τα κλάσματα συλλέγονται όπως στο σχήμα 1Β. Γ) μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού SK-MEL-37 κύτταρα (± MG132) εκφράζουν παροδικά NY-ESO-1 θραύσματα (anti-V5, πράσινο) και περικεντρίνη (κόκκινο), με πυρήνες που προσδιορίζονται από χρώση ϋΑΡΙ (μπλε). Λευκά βέλη δείχνουν κεντροσωμάτια. Ράβδοι κλίμακας = 20 μm.

Η

Η MHD συμβάλλει στη σταθερότητα MAGE-C1

Όπως NY-ESO-1, οι πτυχές που επηρεάζουν MAGE-C1 επίπεδα σταθερής κατάστασης δεν έχουν καλά χαρακτηριστεί. Για να προσδιορισθεί η περιοχή /s του MAGE-C1 επηρεάζουν τη σταθερότητά της, δημιουργήσαμε μία σειρά θραυσμάτων που περιλαμβάνουν: MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600 – 901, MAGE-C1

902- 1029 και MAGE-C1

1030-1142 (Σχήμα 5Α). Δεν μπορέσαμε να κατασκευάσει θραύσματα που εκτείνονται σε ολόκληρο το μήκος του MAGE-C1, καθώς ο μεγάλος αριθμός πλούσια σε GC επαναλήψεις μεταξύ των αμινοξέων 139 και 600 απέκλειαν την ενίσχυση αυτής της περιοχής. Όταν παροδικά επιμολυσμένα σε τόσο ΝΙΗ3Τ3 (Εικόνα 5Β) και Η1299 κύτταρα (Σχήμα S5), MAGE-C1

1-138 και MAGE-C1

600-901 εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα σταθερής κατάστασης των κατά κύριο λόγο μόνο μπάντες, σε σύγκριση με άλλες αποκοπές. Επιπλέον, κάθε εμφανίστηκε να μεταναστεύει σε ένα μοριακό βάρος που ήταν υψηλότερη από την αναμενόμενη. Αυτό θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει το σχηματισμό MAGE-C1 ολιγομερή ή θα μπορούσε να αντικατοπτρίζει καθυστερημένος μετανάστευση λόγω σύνθεση πολυπεπτιδίου. Αντίθετα, και τα δύο Ο-τερματικά θραύσματα (MAGE-C1

902-1029 και MAGE-C1

1030-1142) επέδειξαν μειωμένη RIPA-διαλυτό σταθερής κατάστασης επίπεδα στα οποία ανιχνεύτηκαν δύο διακριτές ζώνες. Οι υψηλότερες από τις αναμενόμενες ζώνες μπορεί να αντικατοπτρίζει μία μετα-μεταφραστική τροποποίηση (π.χ. ουβικιτινίωση) ή δυνητικά ένα ολιγομερές είδος. Τα θραύσματα που περιέχουν τμήματα του MHD (MAGE-C1

902 έως 1029, MAGE-C1

1030-1142) συσσωρευτεί σε αμφότερες τις ΚΙΡΑ-διαλυτά και αδιάλυτων κλασμάτων με προσθήκη MG132. Αντιστρόφως, MAGE-C1

600-901 ήταν μόνο μέτρια σταθεροποιηθεί με MG132 ενώ το Ν-τερματικό θραύσμα (MAGE-C1

1-138) φαίνεται να είναι σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστη (Σχήμα 5Β). Σε κύτταρα ΝΙΗ3Τ3, MAGE-C1

1-138 και MAGE-C1 εμφανίστηκε

600-901 τόσο στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, ενώ τα θραύσματα MHD-που περιέχει (MAGE-C 1

902-1029 και MAGE- C1

1030-1142) είχαν αποκλειστεί εντελώς από τον πυρήνα (Σχήμα 5C). Εντοπισμός των θραυσμάτων MAGE-C1 στα κύτταρα ΝΙΗ3Τ3 δεν ήταν σημαντικά μεταβληθεί μετά τη θεραπεία MG132. Για να καθοριστεί αν η MHD μόνο ήταν αρκετή για MAGE-C1 διαχωρισμού και εντοπισμού, η απομονωμένη περιοχή (MAGE-C1

900 έως 1.116) εκφράστηκε σε Η1299 κύτταρα, μία ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκινώματος πνεύμονα που εκφράζει το ΝΥ-ΕδΟ-1 αλλά δεν MAGE-C1. Όπως τα θραύσματα που περιείχαν τμήματα του MHD, MAGE-C1

900-1116 συσσωρευτεί στις δύο ΚΙΡΑ-διαλυτό και αδιάλυτο κλάσματα με MG132 ως δύο ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western (Εικόνα 5D). Συνάδουν με τις σχετικές θραύσματα, MAGE-C1

900 – 1116 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική σε Η1299 κύτταρα και MG132 δεν ιδίως μεταβάλλει την εντόπιση (Σχήμα 5Ε). Αυτά τα δεδομένα εμπλέκουν τον τομέα εξαιρετικά διατηρημένη MAGE ομολογία στην πρωτεασώματος εξαρτώμενη από την επεξεργασία και την κυτταροπλασματική εντόπιση της ΜΑΟΕ-C1.

Α) Σχηματική αναπαραστάσεις V5 /His6 επισύναψη επιτόπου σε όλο το μήκος και περικοπή κατασκευάσματα της MAGE-C1. MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600-901, MAGE-C1

902 έως 1.029, MAGE-C1

1030-1142 και MAGE-C1

900 με 1116 είναι παρουσιάζεται και η περιοχή MAGE ομολογία (MHD) υποδεικνύεται. Β) Παροδική έκφραση του MAGE-C1 θραύσματα σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες ποντικού ανιχνεύθηκαν με στύπωμα western με αντι-V5 και αντι-β-τουμπουλίνης (έλεγχος φόρτωσης). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και λύθηκαν όπως στο σχήμα 1Β. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν πιθανή ολιγομερικές μορφές. μικροφωτογραφίες C) ανοσοφθορισμού ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες ποντικού που εκφράζουν MAGE-C1 θραύσματα (αντι-V5, πράσινο) όπου TOPRO συμπεριλήφθηκε για τη χρώση των πυρήνων (κόκκινο). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132 (40μΜ, 4 ώρες) ή DMSO (αρνητικός έλεγχος). Δ) Παροδική έκφραση του MAGE-C1

900 με 1116 σε κύτταρα Η1299 NSCLC και ανιχνεύονται κάτω από τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν στο σχήμα 5Β. Αστερίσκος υποδηλώνει πιθανή ολιγομερή μορφή. Ε) μικρογραφήματα ανοσοφθορισμού των Η1299 κυττάρων που εκφράζουν MAGE-C1

900 – 1116, όπως στο σχήμα 5C. Για όλες τις εικόνες, τα μπαρ κλίμακα = 20μm.

Η

Συζήτηση

Ανοσοθεραπευτικός στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου βασίζονται σε αποτελεσματικά διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και κακοηθών κυττάρων βασίζεται σε διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας ή παρουσιάζονται αντιγόνα. Ο /όρχεων (CT) της οικογένειας αντιγόνου Ο καρκίνος των γονιδίων έχει πάνω από 100 διαφορετικά μέλη, των οποίων συνήθως περιορισμένη έκφραση σε βλαστικής κύτταρα των όρχεων γίνεται απορυθμίζεται σε πολλούς καρκίνους, ουσιαστικά διαφοροποιεί τους από την κανονική, περιβάλλοντα ιστό. Τα γονίδια αντιγόνου CT σιγήσει κανονικά με μεθυλίωση στην πλούσια CpG υποκινητές τους και έτσι απομεθυλίωση των περιοχών αυτών, καθώς και ακετυλίωση ιστονών, είναι εν μέρει υπεύθυνη για παρεκκλίνουσα επανέκφραση τους στον καρκίνο (ανασκόπηση στο 19). Ωστόσο, οι μηχανισμοί αυτοί δεν είναι σε θέση να εξηγήσει πλήρως την έλλειψη έκφρασης των αντιγόνων CT σε ορισμένους τύπους όγκων που χαρακτηρίζονται από την παγκόσμια υπομεθυλίωσης (π.χ. καρκίνος του παχέος εντέρου) [45,46], ούτε την ετερογένεια που συχνά παρατηρείται σε δείγματα όγκων [47]. Τέτοια πολύπλοκα σχήματα έκφρασης απαιτούν πολλαπλά επίπεδα ρύθμισης που είναι απίθανο να οφείλεται αποκλειστικά στην μεταγραφική μηχανισμούς. Για το λόγο αυτό, διερευνήσαμε την μελετημένο μετα-μεταφραστική ρύθμιση του CT αντιγόνων. Εδώ σας παρουσιάζουμε τα στοιχεία που εμπλέκουν την υποβάθμιση, μέσω του πρωτεασώματος 26S, ως σημαντικός ρυθμιστής της CT αντιγόνου επίπεδα σταθερής κατάστασης και να αποδείξει ότι, όταν είναι σε κίνδυνο, διαλυτότητα και υποκυτταρικός εντοπισμός των δύο NY-ESO-1 και MAGE-C1 έχουν μεταβληθεί δραματικά.

Το σύστημα ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος (UPS) είναι ένας κύριος μηχανισμός για την οργανωμένη υποβάθμιση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα (αναθεωρηθούν 48). Για να εξακριβωθεί το πώς αποδόμηση μέσω του UPS επηρέασε σταθερής κατάστασης επίπεδα του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα με αναστολείς πρωτεασώματος, ενώ παρακολουθεί τις αλλαγές διαλυτότητα και εντοπισμός του κάθε πρωτεΐνη. αναστολέων πρωτεασώματος που προκαλείται ενδογενώς εκφράζονται ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 να συσσωρεύονται, είτε μόνα (HC33, U2OS), όταν και οι δύο CT αντιγόνα ήταν παρούσες (SK-MEL-37) ή όταν κάθε εκφράστηκε παροδικά σε κυτταρικές γραμμές που στερούνται είτε ( ΝΙΗ3Τ3). Αξίζει να σημειωθεί ότι η συσσώρευση ήταν κυρίως ανιχνεύθηκε ως αύξηση στην απορρυπαντική αδιάλυτο κλάσμα του κυτταρικού λύματος. Ενώ ούτε NY-ESO-1 ούτε MAGE-C1 έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι είναι συνάθροιση επιρρεπείς, η τάση για CT αντιγόνα για να γίνει αδιάλυτο υποδηλώνει ότι οι ικανότητες του συνοδού (και την υποβάθμιση) δικτύου /s έχουν ξεπεραστεί. Τόσο MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 παρατηρήθηκαν να συσσωρεύονται στο κεντρόσωμα υπό τις ίδιες συνθήκες. Αυτό το μοτίβο θυμίζει άλλες επιρρεπείς πρωτεϊνών συνάθροισης όπως CFTRΔF508 [49] και huntingtin [50] του οποίου η συσσώρευση σε κεντροσωμάτια επιδεινώνεται με την αναστολή πρωτεασώματος (αναθεωρηθούν 51,52). Κεντροσωμάτια χρησιμεύσει ως κέντρο οργάνωσης πρωτογενή μικροσωληνίσκων (MTOC) και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο ως ρυθμιστής της προόδου του κυτταρικού κύκλου [53]. Η MTOC γίνεται επίσης ένα κομβικό σημείο για τα κατασκευαστικά στοιχεία και των δύο του κυτταροπλάσματος συνοδούς (π.χ. Hsp40, Hsp70) και το UPS (π.χ. ουβικιτίνης, 19S και 20S υπομονάδες) [49,54,55], τα οποία συσσωρεύονται σε απάντηση misfolded πρωτεΐνες παραδοθεί εκεί με απευθείας μεταφορά επί των μικροσωληνίσκων για να σχηματίσουν το ενδοκυτταρικό σώμα αναφέρεται ως aggresome [49,56,57]. Σε αυτό το ρόλο, κεντροσωμάτια λειτουργούν ως πλατφόρμες διαλογή για αποφάσεις ελέγχου ποιότητας πρωτεΐνες. Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι κεντροσωμάτων-εντοπισμένη εξαρτήματα UPS είναι σε θέση να συμμετάσχουν σε ενεργό υποβάθμιση [54,58,59]. Το αδιάλυτο διαχωρισμού και συσσώρευση στο κεντροσωμάτια τόσο ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 υποδηλώνουν μια ροπή αυτών των αντιγόνων CT να συσσωματώνονται, ένα χαρακτηριστικό επιδεινώνεται όταν δραστηριότητα πρωτεασώματος είναι σε κίνδυνο.

Η συσσώρευση τόσο της ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 στο κεντροσωμάτια απουσία δραστηριότητας πρωτεασώματος αντικατοπτρίζει πιθανόν το διαχωρισμό των misfolded πρωτεϊνών (πιθανώς ως αδιάλυτα συσσωματώματα) σε μια κεντρική τοποθεσία όπου περιμένουν αποκατάστασης. Η ανίχνευση του συμπυκνωμένου ουβικιτίνης θύλακες σε κεντροσωμάτια (Σχήμα 1 D) και η συσσώρευση των υλικών polyubiquitinated στο κλάσμα INSOL (Σχήμα S2D) υποστηρίζουν αυτό το μοντέλο. Τα υψηλότερα επίπεδα των NY-ESO-1 puncta σε κεντροσωμάτια στα μη επεξεργασμένα κύτταρα H146 (και σε μικρότερο βαθμό HC33s) έναντι SK-MEL-37s μπορεί επίσης να αντανακλούν τις διαφορές μεταξύ συνοδό τους και τα δίκτυα της υποβάθμισης, καθιστώντας συνάθροιση πιο διαδεδομένη σε κύτταρα με μειωμένη ικανότητα. Μια εναλλακτική εξήγηση για αυτό θα μπορούσε να είναι ότι είτε NY-ESO-1 ή MAGE-C1 (ή και τα δύο) έχει ένα bona fide λειτουργικό ρόλο στο κεντρόσωμα (δηλ NY-ESO-1 σε κύτταρα H146, Εικόνα S1c, 2D). Για παράδειγμα, οι αναστολείς πρωτεασώματος επηρεάσει τον κύκλο εργασιών της centrosomal πρωτεϊνών, που επηρεάζουν τόσο μικροσωληνίσκων πυρήνων και η οργάνωση [60,61]. Η παρουσία είτε MAGE-C1 ή NY-ESO-1 (ή και τα δύο) σε κεντροσωμάτια μπορούν να τροποποιήσουν τα ποσοστά και /ή τη σταθερότητα των βασικών παραγόντων εκεί αποικοδόμηση. Τα MHDs των μελών της οικογένειας αρκετές MAGE αλληλεπιδρούν με δαχτυλίδι τύπου λιγάσες Ε3 ουμπικουιτίνης (π.χ. TRIM28) και διαμορφώνουν ουμπικουιτίνωση [20]. Σε ΜΜ, όπου MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 συχνά υπερεκφράζονται, κεντροσωμάτων ενίσχυση βρίσκεται σε ~ 30% των περιπτώσεων και έχει συσχετιστεί με υπερέκφραση του CT γονιδίων της οικογένειας MAGE [62]. Έτσι, ένα κέρδος της λειτουργίας επίδραση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και /ή MAGE-C1 στο κεντρόσωμα δεν μπορεί να αποκλειστεί.

τεκμηριωμένο σύμπλοκο μεταξύ NY-ESO-1 και MAGE-C1 σήμαινε ότι εντοπισμός του κάθε αντιγόνου CT να κεντροσωμάτια ή αδιαλυτότητα τους θα μπορούσε να ήταν εξαρτάται από την αλληλεπίδραση. Ωστόσο, δεδομένου ότι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ενιαία CT αντιγόνα ακόμα συσσωρευτεί σε κεντροσωμάτια μετά τη θεραπεία MG132, μια αλληλεπίδραση δεν φαίνεται να είναι προαπαιτούμενο. Αυτό επιβεβαιώθηκε με τη χρήση SK-MEL-37 κυττάρων και CT αντιγόνο στοχευμένη RNAi μεμονωμένα (Σχήμα S3) και υποστηρίζει ένα μοντέλο όπου και οι δύο NY-ESO-1 και MAGE-C1 είναι εγγενώς ικανά ανεξάρτητων centrosomal εντοπισμού. Επιπλέον, οι περιφέρειες που διέπουν αυτό το εντοπισμού θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί σε αα 91-150 της NY-ESO-1 και αα 900 έως 1116 της MAGE-C1. Αυτή η περιοχή του ΝΥ-ΕδΟ-1 είναι μέρος ενός «hot spot», τα οποία προσδιορίζονται κατά προσέγγιση μεταξύ των αμινοξέων 80-110, για την κυτταρική ανοσολογική απόκριση εναντίον NY-ESO-1 σε καρκίνο [37,63]. Από αυτά τα MHC Τάξης Ι παρουσιάζονται επιτόπων είναι τα υποπροϊόντα της υποβάθμισης του πρωτεασώματος, προσδιορίζοντας την περιοχή αυτή ως σημαντικό για τον κύκλο εργασιών και τον εντοπισμό κατά την αγωγή MG132 είναι συνεπής. Η MHD (αα 908-1106) του MAGE-C1 διατηρείται εντός της οικογένειας MAGE αλλά εμφανίζει μικρή ομολογία με άλλες γνωστές περιοχές. Ακόμη και αν η λειτουργία του δεν είναι ακόμα καλά κατανοητή, η MHD για μερικές MAGEs αντιπροσωπεύει μία θέση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης αλληλεπίδραση [20,23]. Στην πραγματικότητα, MAGE-C1 φαίνεται να δεσμεύει NY-ESO-1 έως MHD της [19,23,30]. Δύο επίτοποι MAGE-C1 παρουσιάζεται από μόρια MHC-I επί κυττάρων ΜΜ είναι σε θέση να επάγουν CD8 + Τ-κυτταρική απόκριση [64] και τα εν λόγω πεπτίδια που προέρχονται από την MHD (αα 959-968 και 1083-1091). Η κοινή παρουσία του MHD σε όλα τα μέλη της οικογένειας MAGE υποδηλώνει ότι αυτό το χαρακτηριστικό της MAGE-C1 μπορεί να έχουν σημασία για την κατανόηση της ανοσολογικής απόκρισης σε άλλη οικογένεια MAGE πρωτεΐνες.

Συνολικά, τα ευρήματά μας αναδεικνύουν μία μετα-μεταφραστικό επίπεδο της ρύθμιση του ΝΥ-ΕδΟ-1 και MAGE-C1 που μπορεί να επηρεάσουν την ανοσολογική αντίδραση ενάντια στα κύτταρα όγκου που εκφράζουν αντιγόνο CT. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι ιδιαίτερα σημαντικές για το MM. Η χρήση των εκλεκτικών αναστολέων πρωτεασώματος (π.χ. Velcade /bortezomib) υπήρξε σημαντική εξέλιξη στη θεραπεία της ΜΜ. Έχουμε δείξει ότι οι αναστολείς πρωτεασώματος είναι πιθανόν να διεγείρουν centrosomal εντοπισμό και τη συσσώρευση αδιάλυτων MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 σαν μέρος του aggresomes σε κύτταρα ΜΜ. Τι φυσιολογικό επακόλουθο τη συσσώρευση αντιγόνο CT μπορεί να έχουν σε ΜΜ δεν είναι ακόμη σαφές. Τόσο MAGE-C1 και ΝΥ-ΕδΟ-1 εκφράζονται συχνά σε mm (66% και 22% των περιπτώσεων, αντιστοίχως), με 93% των MAGE-C1-θετικά μυελώματα προκαλεί ένα ανιχνεύσιμο χυμική και κυτταρική ανοσολογική απόκριση έναντι αυτού του αντιγόνου [65, 66]. Συσσώρευση είτε CT αντιγόνου (ή και τα δύο) θα μπορούσε να είναι κυτταροτοξικά και να οξύνει την προκύπτουσα αποπτωτικό πρόγραμμα που επάγεται από αναστολείς πρωτεασώματος [67]. Κάναμε παρατηρούμε μειωμένη χρώση MAGE-C1 στον πυρήνα όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MG132. Τα μυελώματα με πυρηνικά κυτταροπλασματική ή πυρηνικά μόνο MAGE-C1 έχουν χειρότερη πρόγνωση, σε σύγκριση με εκείνους με MAGE-C1 μόνο στο κυτταρόπλασμα [27]. Αν και παρουσίαση αντιγόνου θα διακυβευόταν, η περιορισμένη εντοπισμό αντιγόνο CT που προκύπτει από την αναστολή του πρωτεασώματος μπορεί στην πραγματικότητα να συμβάλει θετικά σε μια βελτιωμένη πρόγνωση. Αυτό το ενδεχόμενο όφελος πρέπει ωστόσο να σταθμίζεται σε σχέση με τις καλά τεκμηριωμένες πλειοτροπικές επιδράσεις σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες που προκύπτουν με την αναστολή του πρωτεασώματος. Το κεντρικό ρόλο που διαδραματίζει η UPS σε όλα τα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων του όγκου, καθιστά τον ορισμό θεραπευτικό παράθυρο κλειδί για την χρησιμότητα αυτών των ενώσεων. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για τον προσδιορισμό των φυσιολογικών ρόλων των CT αντιγόνων και τις πιθανές συνέπειες για την αποτελεσματικότητα της ανοσοθεραπείας ενάντια στους όγκους που τους εκφράζουν συχνά, όπως το μελάνωμα, το καρκίνωμα του πνεύμονα και πολλαπλό μυέλωμα.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, τα αντισώματα και τα αντιδραστήρια

Ανθρώπινο μελάνωμα (SK-MEL-37) [1] και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) κυτταρικές σειρές (H146, HC33, Η69, Η209, H524, H889, και