Αφηρημένο

Η χρήση μικρών αντιμικροβιακά πεπτίδια ή βακτηριοσινών, όπως νισίνη, για τη θεραπεία του καρκίνου είναι μια νέα προσέγγιση ότι υπόσχεται πολλά. Η νισίνη αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτής της νέας προσέγγισης, επειδή έχει χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια σε ανθρώπους για πολλά χρόνια ως συντηρητικό τροφίμων, και οι πρόσφατες εργαστηριακές μελέτες υποστηρίζουν το δυναμικό κατά του όγκου του σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Προηγουμένως, δείξαμε ότι η νισίνη (2,5%, χαμηλή περιεκτικότητα) έχει αντικαρκινική δυναμικό στον κεφαλής και λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC)

in vitro

και

in vivo

. Οι τρέχουσες μελέτες ερεύνησαν μια φυσικά απαντώμενη παραλλαγή της νισίνης (νισίνης ZP? 95%, υψηλή περιεκτικότητα) για αντικαρκινική δράση του

in vitro

και

in vivo

. Η νισίνη ZP προκάλεσε τη μεγαλύτερη επίπεδο απόπτωσης σε κύτταρα HNSCC σε σύγκριση με χαμηλή περιεκτικότητα nisin. HNSCC κύτταρα επεξεργασμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις νισίνης ZP παρουσίασαν αύξηση των επιπέδων της απόπτωσης και μειώνοντας τα επίπεδα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, κλωνογονική ικανότητα, και το σχηματισμό σφαίρας. Η νισίνη ZP επαγόμενη απόπτωση μέσω ενός καλπαΐνης οδού που εξαρτάται σε κύτταρα HNSCC αλλά όχι σε ανθρώπινη στοματική κερατινοκυττάρων. Η νισίνη ZP επάγεται επίσης απόπτωση δοσοεξαρτώμενο σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) με ταυτόχρονη μείωση στο σχηματισμό αγγειακών βλαστάρι

in vitro

και μειωμένη ενδοογκική πυκνότητα μικροαγγείων

in vivo

. Η νισίνη ZP μειωμένη ογκογένεση

in vivo

και μακροχρόνια θεραπεία με νισίνη ZP επεκταθεί επιβίωσης. Επιπλέον, ποντικοί που υπέστησαν αγωγή νισίνης παρουσίασαν φυσιολογική ιστολογία οργάνων χωρίς ενδείξεις φλεγμονής, ίνωσης ή νέκρωση. Εν ολίγοις, νισίνη ZP εκθέματα μεγαλύτερη αντικαρκινική δράση από τα χαμηλά νισίνη περιεχόμενο, και ως εκ τούτου έχει τη δυνατότητα να χρησιμεύσει ως μια νέα θεραπευτική για HNSCC

Παράθεση:. Kamarajan P, Hayami Τ, Ματ Β, Liu Υ, Danciu Τ , Ramamoorthy A, et al. (2015) Νισίνη ZP, μία βακτηριοσίνη και Τροφίμων Συντηρητικό, αναστέλλει καρκίνο κεφαλής και λαιμού Ογκογένεση και επιμηκύνει την επιβίωση. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10.1371 /journal.pone.0131008

Επιμέλεια: Hari Κ Κοαΐ, Πανεπιστήμιο Επιστημών Υγείας Κέντρο της Πολιτείας της Λουιζιάνα, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 10 Φεβ 2015? Αποδεκτές: 26 Μαΐου 2015? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούλη 2015

Copyright: © 2015 Kamarajan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμη εντός του χαρτιού και υποστήριξη αρχείο πληροφοριών της

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο του Michigan MCUBED Χρηματοδότηση # U036798 στο YK, FPW, και AR. BM υποστηρίχθηκε από τα ακρωτήρια της Βραζιλίας και CNPq χορηγία, Επιστήμη Χωρίς Σύνορα Προγράμματος. YL υποστηρίχθηκε από το Πρόγραμμα μελετητές από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Σχολή και το Νοσοκομείο της Στοματολογίας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κεφάλι και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα αυχένα (HNSCC) είναι η έκτη κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως. Οι ασθενείς με διάγνωση HNSCC αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Δεδομένης ανατομική του θέση, HNSCC χειρουργική εκτομή είναι συχνά καταστροφική και, συχνά, την πλήρη αφαίρεση της μάζας του όγκου δεν είναι μια βιώσιμη επιλογή, συχνά καθιστώντας αυτούς τους ασθενείς με ανίατη ασθένεια ακόλουθες επεξεργασίες με χημειοραδιοθεραπεία [1]. Υπάρχουν περιορισμένες χημειοθεραπευτικών επιλογές για τους ασθενείς μια φορά την ασθένειά τους δεν είναι πλέον δεκτικά να θεραπεύσει, και τα χαμηλά ποσοστά 5ετούς επιβίωσης για τους ασθενείς με μεταστατικό HNSCC δεν έχουν βελτιωθεί εδώ και δεκαετίες [2,3]. Τα γεγονότα αυτά υπογραμμίζουν την επείγουσα ανάγκη βελτίωσης θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς αυτούς.

Μερικές αναφορές έχουν δείξει ότι αντιμικροβιακά πεπτίδια ή βακτηριοσίνες έχουν κυτταροτοξική δράση έναντι των καρκινικών κυττάρων [4-8]. Δεδομένης αυτής ενδιαφέρουσα υπόθεση, διερευνήσαμε τις κυτταροτοξικές και αντικαρκινικές ιδιότητες του αντιμικροβιακού πεπτιδίου, νισίνη, και διαπίστωσε ότι αναστέλλει HNSCC ογκογένεση [9]. Η νισίνη είναι ένα 34-αμινοξέων πολυκυκλικών αντιβακτηριακό πεπτίδιο που παράγεται από τη ζύμωση του gram-θετικό βακτηρίδιο

Lactococcus lactis

. Πολλοί αντιβακτηριακοί παράγοντες είναι αποτελεσματικές ενάντια παρόμοια είδη βακτηρίων? Ωστόσο, η νισίνη έχει επιπτώσεις ευρέος φάσματος, καθώς αναστέλλει επίσης gram-αρνητικά βακτήρια [10]. Νισίνης δεν είναι τοξικά για τα ζώα και είναι ασφαλές για κατανάλωση από τον άνθρωπο [11]. Η νισίνη έχει εγκριθεί για ανθρώπινη χρήση ως συντηρητικό τροφίμων από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) το 1969 και από τη διοίκηση τροφίμων και φαρμάκων (FDA) το 1988, και έχει δοθεί μια ονομασία γενικά θεωρείται-και-ασφαλή (GRAS) από το FDA [12]. Εκτιμάται ότι 0,94 έως 2,24 mg της νισίνης που καταναλώνεται ανά άτομο ανά ημέρα στις ΗΠΑ [12]. Ενώ βακτηριοκίνες, όπως νισίνη, έχουν χρησιμοποιηθεί εδώ και δεκαετίες στην πρόληψη βακτηριακής ανάπτυξης σε τρόφιμα, έχουν μόλις πρόσφατα έχουν ελεγχθεί για την πρόληψη της ανάπτυξης ή διέγερσης απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων. Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μια φυσική διαδικασία που εξαλείφει τα ανεπιθύμητα ή μεγαλύτερα κύτταρα. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε απόπτωση. Έτσι, υπάρχει μεγάλη προσπάθεια για την κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα έτσι ώστε να μπορούν να αναπτυχθούν νέα μέσα για να επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Η νισίνη μπορεί να χρησιμεύσει σε αυτήν την ικανότητα και την ανάπτυξη της νισίνης ως θεραπευτικό του καρκίνου μπορεί να επιδιωχθεί άμεσα εξής προσδιορισμούς δοσολόγηση.

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι η νισίνη, μπορούν να χρησιμεύσουν ως νέου πιθανή θεραπευτική για την αγωγή HNSCC [9]. Η νισίνη μεσολαβεί αυτά τα αποτελέσματα με την επαγωγή απόπτωσης προτιμησιακή, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα HNSCC, σε σύγκριση με πρωτογενή κερατινοκύτταρα. Η νισίνη μειώνει επίσης HNSCC ογκογένεση in vivo. Μηχανιστικά, νισίνη ασκεί αυτές τις επιδράσεις στην HNSCC, εν μέρει, μέσω της μεταφοράς κατιόντων ρυθμιστή ομόλογο 1 (CHAC1), μια προ-αποπτωτικών ρυθμιστή μεταφοράς κατιόντων και μέσα από μια ταυτόχρονη CHAC1-ανεξάρτητο εισροή εξωκυττάριου ασβεστίου [9,13]. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τη χρήση της νισίνης ως δυνητικά νέα θεραπευτική για HNSCC, και δεδομένου ότι η νισίνη είναι ασφαλές για κατανάλωση από τον άνθρωπο ως συντηρητικό τροφίμων, μπορεί να διευκολυνθεί η μετάφρασή του σε ένα κλινικό περιβάλλον.

Η νισίνη δρα μεταβάλλοντας την ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης και σχηματίζει βραχύβια πόρους, αλλάζοντας έτσι το δυναμικό της μεμβράνης [14]. Η νισίνη βυθίζεται στην κυτταρική μεμβράνη μέσω των κατιονικών τμημάτων των αμινοξέων που εκτείνεται προς τη μία πλευρά του μορίου. Αυτά τα κατιονικά τμήματα αλληλεπιδρούν με τα αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια και τα κεφάλια, ενώ το υδρόφοβο τμήμα νισίνης αλληλεπιδρά με τον πυρήνα μεμβράνη [15]. εμπλοκή νισίνη με τη μεμβράνη, ως εκ τούτου, μεσολαβεί αναδιοργάνωση φωσφολιπίδιο και επιτρέπει την εισροή ιόντων [14,16]. Δεδομένου ότι τα κύτταρα HNSCC και πρωτογενή κερατινοκύτταρα διαφέρουν στη σύνθεση λιπιδική μεμβράνη τους και τη λειτουργία και απόκριση σε ροών ασβεστίου, ικανότητα νισίνη να μεταβάλλουν το διαμεμβρανικό δυναμικό και μεμβράνη σύνθεση των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά αποτελέσματα σε αυτά τα κύτταρα [17-22]. Πράγματι, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν αυτή υπόθεση ως βάση για την νισίνης μεσολάβηση απόκλιση θάνατο αποπτωτικών κυττάρων και μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με HNSCC πρωτογενή κερατινοκύτταρα [9].

Δεδομένου του ρόλου νισίνης ως ένα ασφαλές βακτηριοσιν για τη συντήρηση τροφίμων, και η γνώση ότι άλλοι βακτηριοσίνες έχουν προ-αποπτωτικών ιδιότητες ενάντια στα καρκινικά κύτταρα, τα ευρήματά μας σχετικά με τις επιπτώσεις της νισίνης σε HNSCC ογκογένεση βοήθεια παρέχει μια βάση για νισίνης ως πιθανή θεραπευτική μυθιστόρημα για HNSCC. Έτσι, η εστίασή μας στην παρούσα μελέτη ήταν να επεκταθεί αυτή η βασική γνώση. Προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε ένα 2.5% νισίνη (χαμηλή περιεκτικότητα) σκεύασμα. Στη μελέτη αυτή, στόχος μας ήταν να δοκιμαστεί η αποτελεσματικότητα ενός 95% nisin (υψηλή περιεκτικότητα) επί HNSCC απόπτωση των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό in vitro και σε ογκογένεση in vivo. Συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε στη μεταγραφική δυναμικό της από την εξέταση υψηλής καθαρότητας, ποιότητας τροφίμων μορφή νισίνης για τους in vivo και μακροπρόθεσμες επιπτώσεις. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε δύο φυσικά, υψηλή παραλλαγές νισίνη περιεχόμενο, νισίνη ZP και νισίνης AP. Λαμβάνοντας υπόψη την ασφάλεια νισίνης για κατανάλωση από τον άνθρωπο και δεδομένης της in vitro και in vivo αποτελεσματικότητα σε HNSCC, νισίνη θα μπορούσε να αναπτυχθεί ως ένα νέο θεραπευτικό του καρκίνου για HNSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Institutional Review Board Έγκριση

Αυτή η μελέτη έχει εγκριθεί από και διεξήχθη σύμφωνα με τους κανονισμούς που ορίζονται από το διοικητικό συμβούλιο θεσμική αναθεώρηση και την επιτροπή σχετικά με τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Michigan.

καλλιέργειας κυττάρων

Τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HNSCC χρησιμοποιήθηκαν για αυτές τις μελέτες. HNSCC ταυτότητας κυτταρική γραμμή και την προέλευση ήταν που παρέχονται από τις πηγές τους και δημοσιεύονται εκτενώς. Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HNSCC, UM-SCC-17B (γλωττίδας /μαλακών ιστών του λαιμού) και UM-SCC-14Α (δάπεδο του στόματος) παρασχέθηκαν από τον Dr. Thomas Carey (Καθηγητής, Πανεπιστήμιο του Michigan, MI) [23]. Η προφορική κυτταρική σειρά SCC HSC-3 (γλώσσα) παρασχέθηκε από τον Dr. Randall Kramer (Καθηγητής, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια, στο Σαν Φρανσίσκο, CA) [24]. Η προφορική κυτταρική σειρά SCC, OSCC-3 (γλώσσα) παρεσχέθη από το Δρ Mark Lingen (Καθηγητής, Πανεπιστήμιο του Σικάγο). κύτταρα HNSCC διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πενικιλλίνη και 1% στρεπτομυκίνη. Κανονικό-ανθρώπινης ομφάλιας φλέβας ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVECs), και τα συνοδευτικά μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και συμπληρώματα (Kits EGM-2 Bullet) ελήφθησαν από την Lonza (Allendale, NJ). Ανθρώπινη ανασυνδυασμένη VEGF165 ελήφθη από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και Matrigel Matrix ελήφθη από BD Biosciences (San Jose, CA). HUVECs καλλιεργήθηκαν σε EGM-2 βασικά μέσα στους 37 ° C σε 5% CO

2.

νισίνη

Νισίνη Α και νισίνη Ζ είναι δύο φυσικά απαντώμενες παραλλαγές της νισίνης που παράγονται με ζύμωση του

Lactococcus lactis

και διαφέρουν από ένα απλό υπόλειμμα αμινοξέος στη θέση 27? ιστιδίνη σε νισίνη Α και ασπαραγίνης σε νισίνης Ζ [25]. Υψηλή μορφές περιεχόμενο αυτών των δύο παραλλαγών, νισίνη ZP και νισίνης ΑΡ (% περιεκτικότητα 95 /υπερκαθαρό?% Βάρος /βάρος? Ένυδρο δραστικότητα ≥38,000 IU /mg) αγοράστηκαν από την Handary (Βρυξέλλες, Βέλγιο) και χαμηλή περιεκτικότητα νισίνη Α (2.5% περιεκτικότητα σε χλωριούχο νάτριο ισορροπία και το μετουσιωμένο στερεά γάλακτος? δραστικότητα ≥1,000,000 ανά IU /g) αγοράσθηκε από την Sigma-Aldrich (N5764). Η νισίνη ZP και ΑΡ και χαμηλή περιεκτικότητα νισίνης ανασυστάθηκαν σε νερό και χρησιμοποιήθηκαν για όλα τα πειράματα.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού και Αποικίας Δοκιμασίες Σχηματισμού

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της νισίνης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο CyQUANT NF Κυττάρων ο πολλαπλασιασμός Assay Kit χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ). Για δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, 2000 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις νισίνης ZP για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία, φρέσκα μέσα προστέθηκε κάθε 2 ημέρες για μια περίοδο 10 ημερών. Οι αποικίες στη συνέχεια βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και οι αποικίες που περιείχαν & gt? 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν.

Orasphere Δοκιμασία

δοκιμασίες Σφαίρα χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη, ένα ακίνητο θεωρείται ότι συμβάλλουν στην μεταστατικό δυναμικό. oraspheres HNSCC (UM-SCC-17Β) παρασκευάστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [26-29]. Εν συντομία, τα κύτταρα που επιβιώνουν αγκυροβόλιο έντυπο υπαναχώρησης πολυκύτταρων συσσωματώματα ή oraspheres. Oraspheres αναπτύχθηκαν διατηρώντας τα κύτταρα υπό συνθήκες εναιώρημα σε πολυ (μεθακρυλικό 2-υδροξυαιθύλιο) (πολυ-ΗΕΜΑ) επικαλυμμένες πλάκες (7.5 mg /mL σε αιθανόλη 95%, Sigma-Aldrich) για 36 ώρες. Μια orasphere ορίζεται ως ένα συσσωμάτωμα κυττάρων που είναι τουλάχιστον 50 μm σε διάμετρο. Η συνολική έκταση που καταλαμβάνεται από oraspheres σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε ποσοτικά για κάθε συνθήκη θεραπείας με τη χρήση λογισμικού απεικόνισης ΝΑΚ-Στοιχεία BR4.13.04. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η νισίνη προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο κατά τον χρόνο της κυτταρικής επιμετάλλωσης.

Η απόπτωση Δοκιμασίες

Για να καθοριστούν τα αποτελέσματα τριών διαφορετικών μορφών της νισίνης επί HNSCC κυτταρικής απόπτωσης τρεις διαφορετικές δοκιμασίες διεξήχθησαν. Η απόπτωση εκτιμήθηκε σε κύτταρα κατεργασμένα νισίνη χρησιμοποιώντας μια άμεση μέθοδο χρώσης, μια δοκιμασία κυτταρομετρία ροής με βάση, και western αποτύπωση προσέγγιση για την αξιολόγηση γνωστές αποπτωτικών πρωτεϊνών σηματοδότησης

Απόπτωση:. Χρώση και Μικροσκοπία

αιθίδιο βρωμιούχο και ακριδίνη πορτοκαλί χρώση (ΕΒ /ΑΟ) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η απόπτωση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Για αυτούς τους προσδιορισμούς, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων στα 2 χ 10

4 κύτταρα /cm

2, και μετά από 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις νισίνης (0, 100, 200, 400 και 800 μg /mL) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα λεκέ ΕΒ /ΑΟ. ΕΒ λήφθηκε από την Bio-Rad (Berkeley, CA) και ΑΟ ελήφθη από την Acros Organics (Geel, Belgium). Το αντιδραστήριο βαφής ΕΒ /AO αποτελούνταν από 100 μg /ml βρωμιούχου αιθιδίου και 100 μg /ml του πορτοκαλί ακριδίνης σε PBS. Η χρωστική ΕΒ /AO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, απομακρύνεται, και στη συνέχεια τις εικόνες των χρωματισμένων κυττάρων συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο εφοδιασμένο με σύστημα ψηφιακής απεικόνισης (Eclipse 50i Nikon, Melville, ΝΥ). Τα κύτταρα μετρήθηκαν και, με βάση το χρώμα τους, είχαν ταξινομηθεί είτε ως ζωτικής σημασίας, αποπτωτικών ή νεκρωτικές. AO διαπερνά όλα τα κύτταρα και κάνει οι πυρήνες εμφανίζονται με πράσινο χρώμα. EB λαμβάνεται μόνο από τα κύτταρα όταν ακεραιότητα κυτταροπλασματική μεμβράνη έχει χαθεί, και βάφει τους πυρήνες, έτσι ώστε να φαίνεται κόκκινο. Έτσι, στις αρχές αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζονται πράσινο με καταπράσινα κουκκίδες στους πυρήνες εξαιτίας συμπύκνωση της χρωματίνης και πυρηνική κατακερματισμό. Αργά αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζονται πορτοκαλί (συνδυασμός πράσινου και κόκκινα χρώματα) με πιο σημαντική τη συμπύκνωση της χρωματίνης και πυρηνική κατακερματισμό. Νεκρωτικά κύτταρα εμφανίζονται πορτοκαλί αλλά πυρηνική μορφολογία τους μοιάζει με εκείνη των βιώσιμων κυττάρων, επομένως, υπάρχει απουσία συμπύκνωση χρωματίνης. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε κατηγορία προσδιορίστηκε με μέτρηση τουλάχιστον 100 κυττάρων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Απόπτωση:. Κυτταρομετρία ροής

Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από νισίνης αγωγή προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με επώαση με το ένζυμο χωρίς ρυθμιστικό διάστασης (Invitrogen), ιζηματοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V (BD Pharmingen) για ανάλυση με κυτταρομετρία ροής (FACSDiVa ταξινομητή κυττάρων, Becton Dickinson).

απόπτωση: Western Blotting

για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της νισίνης ZP επί της έκφρασης προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών σε κύτταρα HNSCC, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις Western blot κύτταρα UM-SCC-17B που υποβλήθηκαν σε αγωγή με νισίνη ZP επί 18 ώρες . Ένας αναστολέας καλπαΐνης εξετάστηκε επίσης σε αυτό το πλαίσιο για την ικανότητά του να αναστρέψει τα αποπτωτικά αποτελέσματα που προκαλούνται από νισίνη ZP? δηλαδή το κλείδωμα διάσπαση PARP. Ο αναστολέας καλπαΐνης αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (A6185, St. Louis, ΜΟ), που ανασυστάθηκε σε νερό, και χρησιμοποιούνται σε συγκέντρωση 500 ηΜ. Μετά από διάφορες θεραπείες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και λύθηκαν για 30 λεπτά, ενώ σε πάγο σε δοκιμασία radioimmunoprecipitatation (RIPA) ρυθμιστικό (R0278, Sigma-Aldrich) που περιείχε 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (P8340, Sigma- Aldrich). Τα κυτταρολύματα προσαρμόστηκαν για συγκέντρωση πρωτεΐνης με την BCA κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης (Bio-Rad, Berkeley, CA). προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με νάτριο δωδεκύλ θειικού ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P (Millipore, Billerica, ΜΑ). αναλύσεις κηλίδος Western πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός αντι-πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης-1 (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) πρωτογενές αντίσωμα, κασπάσης-3 πρωτογενές αντίσωμα (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), ένα καλπαΐνης πρωτογενές αντίσωμα (MAB3083, Millipore) που ακολουθείται από ένα αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας αντι-κουνελιού (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology) ή αντίσωμα αντι-ποντικού (A9044, Sigma-Aldrich). Οι κηλίδες στη συνέχεια αναπτύχθηκαν με το σύστημα ανίχνευσης ECL-plus (Pierce). Για την αξιολόγηση των δειγμάτων για ίση φόρτωση πρωτείνης, οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και ανιχνεύθηκαν και πάλι με ένα αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).

Δοκιμασία in vitro αγγειογένεση

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της νισίνης ZP την αγγειογένεση, εκτελέσαμε προσδιορισμούς in vitro βλαστάρι [31]. Για τις δοκιμασίες βλαστός, HUVECs θρυψινοποιήθηκαν και εναιωρήθηκαν σε ενδοθηλιακά μέσα αύξησης κυττάρων (EGM-2) που περιέχει 50 ng /ml ανασυνδυασμένης αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και διάφορες συγκεντρώσεις της νισίνης ZP (0, 100, 400 και 800 μg /mL ). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

4 κύτταρα /cm

2 σε Matrigel επικαλυμμένες πλάκες 96 φρεατίων και επωάζονται όλη τη νύκτα. Εικόνες από τα λαχανάκια συνελήφθησαν με τη χρήση του XL Πυρήνα Συστήματος EVOs Imaging (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη), τότε το συνολικό μήκος βλαστών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Image J (National Institutes of Health). Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Ανοσοϊστοχημική Αναλύσεις

Για την αξιολόγηση των επιδράσεων νισίνης επί της αγγειογένεσης in νίνο, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η έκφραση CD31, ένα ενδοθηλιακό μόριο κυτταρικής προσκόλλησης, σε τομές ιστού όγκου ποντικού. Εν συντομία, μετά την ανάκτηση αντιγόνου με προεπεξεργασία με μικροκύματα (κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα, 10 mM, ρΗ 6.0), οι πλάκες επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα CD31 (DIA-310, Dianova, Hamburg, Germany) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνου (DAB) αντίδραση, διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη ρουτίνας. Ανοσοϊστοχημική χρώση για CD31 βαθμολογήθηκε και σκόραρε από παθολογοανατόμο με τυφλό τρόπο.

καρκίνο του στόματος μοντέλο ποντικού

Για να εξετάσει τις in vivo αντικαρκινική δράση της νισίνης ZP, ένας καρκίνο του στόματος όροφο του κύκλου χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο στόμα του ποντικιού. κύτταρα UM-SCC-17B εγχύθηκαν υποβλεννογόνια στο δάπεδο του στόματος σε ποντικούς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9, 28, 29, 32]. Όλα τα πρωτόκολλα για τις in vivo μελέτες που εγκρίθηκαν από την Επιτροπή σχετικά με τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων στο Πανεπιστήμιο του Michigan. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή, αιωρήθηκε σε DMEM, αναμειγνύεται με ίσο όγκο ανάπτυξης Matrigel μήτρα βασικής μεμβράνης παράγοντας μειωμένες (BD Biosciences, San Jose, CA) σε τελική συγκέντρωση 1,25 χ 10

4 /0,05 mL. Έξι εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια (NCr-ηυ /ηυ στέλεχος, NCI, Frederick, MD) αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 100 mg /kg κεταμίνης και 10 mg /kg ξυλαζίνης. Ένα συνολικό όγκο 0,05 mL SCC εναιώρημα κυττάρων /Matrigel εγχύθηκε υποβλεννογόνια στο δάπεδο του στόματος. Τρεις εβδομάδες μετά τις ενέσεις των καρκινικών κυττάρων και μετά την επιβεβαίωση ότι καθορίστηκαν οι όγκοι, τα ζώα ισομερώς κατανεμημένα σε έξι ομάδες: μια ομάδα ελέγχου που δόθηκε νερό (ίσος όγκος /ελέγχου) από του στόματος καθετηριασμό για 3 εβδομάδες και πέντε διαφορετικές ομάδες θεραπείας που δόθηκαν νισίνη θεραπεία με από του στόματος καθετηριασμό για 3 εβδομάδες. Μετά τις ενέσεις των καρκινικών κυττάρων, οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν σε εναλλασσόμενες ημέρες. Οι ομάδες θεραπείας αποτελούνταν από ποντίκια που έλαβαν νισίνη ZP σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (400 και 800 mg /kg ανά ημέρα) και τα ποντίκια που έλαβαν νισίνη ΑΡ σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (400 και 800 mg /kg ανά ημέρα). Υπήρχε επίσης μια άλλη ομάδα ποντικιών που δόθηκε νισίνη ZP (800 mg /kg ανά ημέρα) για μία εκτεταμένη χρονική περίοδο (μήνες). Μετά την ολοκλήρωση της χορήγησης νισίνης, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 υπερδοσολογίας και αυχενική εξάρθρωση, τότε οι όγκοι συλλέχθηκαν, ξεπλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), απεικονίζεται, και σταθερό για όλη τη νύχτα σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη. Μια ψηφιακή δαγκάνα χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του όγκου του όγκου χρησιμοποιώντας τον τύπο

μια

x

μια

x

b

/2, όπου

μια

είναι το μικρότερο διάσταση. Σε γενικές γραμμές, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν τα ποντίκια εμφάνισαν φυσιολογική σημάδια στρες από την ανικανότητα να φάει ή ποτό, απώλεια βάρους, ή όταν οι όγκοι του όγκου φθάσει μια σειρά από 300-500mm

3, και ως εκ τούτου οι ποντικοί γενικά σε ευθανασία κατά προσέγγιση 3 εβδομάδες για η βραχυπρόθεσμη πρωτόκολλο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με μια CO

2 υπερδοσολογία.

Στατιστική Ανάλυση

Σε γενικές γραμμές, οι τιμές εκφράστηκαν ως μέσο ± SD. διαφορών μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν με την ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) και τεστ Tukey-Kramer HSD. Για τις in vivo μελέτες, χρησιμοποιήθηκαν ανεξάρτητα t-τεστ με άνιση διακύμανση.

Αποτελέσματα

Νισίνη ZP και νισίνης AP προκαλέσουν σημαντική HNSCC κυτταρική απόπτωση με δοσοεξαρτώμενο τρόπο και πέρα ​​από ότι σε χαμηλή νισίνη περιεχομένου

Η θεραπεία τόσο με νισίνη ZP (95%) και νισίνης ΑΡ (95%) που προκαλείται από σημαντικές αυξήσεις στην απόπτωση σε κύτταρα HNSCC (UM-SCC-17Β και HSC-3) σε σύγκριση με τη θεραπεία με χαμηλή νισίνη περιεχόμενο (2,5% ) (Εικ 1Α και 1Β). Η απόπτωση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας βρωμιούχο αιθίδιο και πορτοκαλί της ακριδίνης (ΕΒ /ΑΟ) χρώση και μικροσκοπία. Τα αποτελέσματα της νισίνης ZP και ΑΡ στην απόπτωση ήταν δοσοεξαρτώμενη και αυξημένη καθώς οι συγκεντρώσεις νισίνης ZP και ΑΡ αυξήθηκε από 200 σε 400 μg /ml. Αν και οι διαφορές στην απόπτωση μεταξύ νισίνη ZP και νισίνης AP δεν ήταν σημαντικές, νισίνη ZP παρουσίασαν καλύτερη διαλυτότητα, και έτσι τα περισσότερα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με νισίνη ZP.

Α και Β

, γραφήματα που δείχνουν τις αλλαγές σε ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων HNSCC (HSC-3 και UM-SCC-17Β) κατεργάζεται με μέσο ελέγχου ή μέσου που περιέχει 2.5% νισίνη, 95% νισίνη AP, ή 95% nisin ZP για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με χρήση βρωμιούχου αιθιδίου και πορτοκαλί της ακριδίνης (ΕΒ /ΑΟ) λεκέ και μετρήθηκαν. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05.

C

, Μικροσκοπικές εικόνες που δείχνουν morphologhy κυττάρων HNSCC κατεργασία με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν ZP νισίνη (100 έως 800 μg /mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια βάφονται με ΕΒ /ΑΟ (Κλίμακα bars, 100 μm).

DF

, γραφήματα που δείχνουν τις αλλαγές στο ποσοστό των ζωτικής σημασίας, αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων (UM-SCC-17Β, HSC-3 και κανονικά από το στόμα κερατινοκύτταρα) που έλαβαν θεραπεία με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν νισίνη ZP (400 ή 800 μg /mL) για 24 ώρες. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0,05 ζωτικά κύτταρα? # Ρ & lt?. 0.05 αποπτωτικά κύτταρα

Η

Επιπλέον, οι επιδράσεις της νισίνης ZP επί HNSCC κυτταρικής απόπτωσης ήταν σημαντικές σε μία ευρεία περιοχή δόσεων από 100, 200, 400 και 800 μg /mL (Σχ 1α- 1Ε) και σε αρκετές κυτταρικές σειρές HNSCC (UM-SCC-17Β και HSC-3). Συντονισμένα, κύτταρα κατεργασμένα με αυξανόμενες δόσεις νισίνης ZP εμφάνισαν σημαντική μείωση του αριθμού των ζωτικών κυττάρων και σημαντικά αύξηση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων, ενώ ο αριθμός των νεκρωτικών κυττάρων παρέμεινε σχετικά χαμηλή και σταθερή. Αντίθετα, οι πρωτογενείς κερατινοκύτταρα δεν εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα απόπτωσης όπως αυτή που παρατηρήθηκε σε HNSCC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1 F).

νισίνη ZP επάγει την απόπτωση μέσω της καλπαΐνης, κασπάσης 8 και PARP διάσπαση

Για την περαιτέρω εξετάσει το μηχανισμό της νισίνης μεσολάβηση απόπτωση, χρησιμοποιήσαμε επιπλέον δοκιμασίες αποπτωτικών και ρωτήθηκαν πρωτεΐνες σηματοδότησης γνωστό αποπτωτικά. Τέσσερις διαφορετικές HNSCC κυτταρικές γραμμές εξετάστηκαν για αποκρισιμότητα νισίνης τους. Η νισίνη αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές σειρές τέσσερις HNSCC όπως εκτιμάται με χρώση αννεξίνης V και κυτταρομετρία ροής (σχήμα 2Α).

Μια

, γραφήματα που δείχνουν τις αλλαγές στο ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων (UM-SCC -17B, HSC-3, UM-SCC-14Α και OSCC-3) που έλαβαν θεραπεία με μέσο ελέγχου ή μέσα που περιέχουν ZP νισίνη (400 μg /mL) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin V και απόπτωση εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05.

B

, ανοσοστυπώματα που δείχνει καλπαΐνη 1, κασπάσης-8, επίπεδα κασπάσης-3, και πρωτεΐνη ΡΑΚΡ σε HNSCC (UM-SCC-17Β) και

C

, κανονικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα κυτταρολύματα του στόματος μετά αγωγή με νισίνη ZP για 18 ώρες.

D

, ανοσοστυπώματα που δείχνει PARP και καλπαΐνη 1 ενεργοποίηση σε προϊόντα λύσης κυττάρου HNSCC μετά την αγωγή για 18 ώρες με μέσα ελέγχου, μέσα που περιέχουν νισίνη ZP (400 μg /mL), μέσα που περιέχουν έναν αναστολέα καλπαΐνης (ΑΙΧΝ, 500 ηΜ) , ή μέσα που περιέχουν τόσο ένα αναστολέα καλπαΐνης (ΑΙΧΝ, 500 ηΜ) και νισίνης (400 μg /mL).

D

, μια ανοσοκηλίδα για β-ακτίνη δείχνει τα στοιχεία ελέγχου φόρτωσης.

Η

Δεδομένου προηγούμενα ευρήματα μας ότι η νισίνη μεσολαβεί το ασβέστιο-εξαρτώμενη απόπτωση, διερευνήσαμε την πιθανή συμμετοχή της καλπαΐνης, ένα γνωστό εξαρτώμενο από το ασβέστιο μεσολαβητής της απόπτωσης [9]. Πράγματι, HNSCC κύτταρα επεξεργασμένα νισίνης παρουσίασαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του καλπαΐνης 1 μικρή υπομονάδα, ενδεικτικό της καλπαΐνης 1 ενεργοποίησης (Σχήμα 2Β). Η μείωση της έκφρασης της καλπάίνης 1 μικρή υπομονάδα αντικατοπτρίζεται στις αυξανόμενες δόσεις νισίνης ZP 100-400 μg /mL, και έτσι ήταν δοσοεξαρτώμενη.

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό της απόπτωσης που προκαλείται από νισίνη ZP, κασπάσης -8 και διάσπαση της κασπάσης-3 εξετάστηκαν στο πλαίσιο αυτό. Η νισίνη που επάγεται κασπάσης-8 ενεργοποίηση με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, η θεραπεία των κυττάρων με HNSCC νισίνη ZP επαγόμενη κασπάσης-3 ανεξάρτητες απόπτωση (Σχήμα 2Β). Western blotting για κασπάση-3 σε κύτταρα κατεργασμένα nisin ZP αποκάλυψε σταθερά επίπεδα της κασπάσης-3 έκφραση και την απουσία κασπάσης-3 διάσπαση ανεξάρτητα από τη δόση νισίνης δοκιμάστηκε (Σχήμα 2Β).

κύτταρα επεξεργασμένα νισίνη ZP παρουσίασαν επίσης πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση, ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης (Εικόνα 2Β). διάσπαση PARP αυξημένη δοσοεξαρτώμενο ως nisin ZP δόσεις αυξήθηκαν. Για να καθοριστεί εάν η νισίνη μεσολάβηση διάσπαση PARP ήταν ένα καλπαΐνης εξαρτώμενο από μηχανισμό, έναν αναστολέα καλπαΐνης (ΑΙΧΝ) εξετάσθηκε σε αυτό το πλαίσιο (Σχήμα 2C). Κατεργασία HNSCC κυττάρων τόσο με νισίνη ZP και αναστολέα καλπαΐνης, αποτελεσματικά μειωμένη διάσπαση PARP, σε σύγκριση με κύτταρα που κατεργάζονται μόνο με νισίνη. Τα φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του στόματος δεν εμφάνισαν ενεργοποίηση της καλπαΐνης, κασπάσης-8, κασπάσης-3 ή PARP σε απόκριση σε θεραπεία με νισίνη ZP (Εικ 2Δ). Έτσι, νισίνη ZP επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων HNSCC μέσω ενεργοποίησης /διάσπασης της καλπαΐνης, κασπάσης-8 και PARP, αλλά ανεξάρτητα από κασπάσης-3 διάσπασης.

Νισίνη ZP και νισίνης AP μειώσει σημαντικά HNSCC χρόνου κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη δόση -dependently

Τα αποτελέσματα της νισίνης ZP και AP στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HNSCC εξετάστηκαν επόμενο, και βρήκαμε ότι η θεραπεία τόσο με νισίνη ZP και τον πολλαπλασιασμό νισίνης AP σημαντικά μειωμένη κυτταρική HNSCC (UM-SCC-17B) (Εικ 3Α ). Τα αποτελέσματα της νισίνης ZP και ΑΡ επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων HNSCC ήταν δοσοεξαρτώμενη, δεδομένου ότι τα επίπεδα πολλαπλασιασμού μειώθηκαν ως η συγκέντρωση της νισίνης ZP και ΑΡ αυξήθηκε από 400 έως 800 μg /mL. Επιπλέον, οι διαφορές στον πολλαπλασιασμό HNSCC κυττάρων που προκαλείται από νισίνη ZP έναντι νισίνης θεραπεία AP ήταν σημαντικές, έτσι ώστε τα αποτελέσματα που προκαλούνται από νισίνη ZP ήταν πιο έντονες. Έτσι, δεδομένης της μεγαλύτερης επιπτώσεις της νισίνης ZP στη μείωση του πολλαπλασιασμού και με δεδομένη την βελτίωση της διαλυτότητας της νισίνης ZP πάνω νισίνη AP, επιλέχθηκε νισίνη ZP για περαιτέρω μελέτη. Οι επιδράσεις της νισίνης ZP επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων HNSCC ήταν σημαντικές σε μία ευρεία κλίμακα δόσεων από 100 έως 800 μg /ml και σε αρκετές HNSCC κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3Β). Επίσης, η νισίνη ZP μεσολάβηση μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν HNSCC εξαρτώμενη από το χρόνο, δείχνοντας σημαντικές επιδράσεις στις 6, 12, 24, και 48 ώρες (Σχήμα 3C). Η μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων πιθανόν αντανακλά εν μέρει την ανακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από νισίνη [9]? αποδεικνύεται περαιτέρω από μειωμένη φωσφορυλίωση του δείκτη σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, cdc2 (S1 Σχήμα).

Μια

. Γραφήματα που δείχνουν τις μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα UM-SCC-17Β κατεργάζεται με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν νισίνη AP ή ZP (400 ή 800 μg /mL) για 48 ώρες. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05. # Σύγκριση μεταξύ νισίνη AP και νισίνης ZP * p ≤ 0,05.

Β

. Γραφήματα που δείχνουν τις μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε HNSCC κύτταρα (UM-SCC-17Β, HSC-3 και UM-SCC-14Α) που έλαβαν θεραπεία με μέσο ελέγχου ή μέσα τα οποία περιέχουν αυξανόμενες δόσεις της νισίνης ZP (100 έως 800 μg /mL) για 48 ώρες. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05. ¶Comparison μεταξύ του 100 μg /ml ομάδα σε σχέση με τον έλεγχο για τα κύτταρα UM-SCC-17Β * pμ0.05.

C

. Γραφήματα που δείχνουν τις μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα UM-SCC-17Β κατεργάζεται με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν ZP νισίνη (400 μg /mL) για 6, 12, 24 και 48 ώρες. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05.

D

, Οι εικόνες είναι από τα κύτταρα UM-SCC-17B θεραπεία για 48h με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν νισίνη ZP (400 ή 800 μg /mL) στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και απεικονίζεται στο αξιολογήσει κλωνογόνο ικανότητα.

E

, Το γράφημα δείχνει το ποσοστό των αποικιών που υπάρχουν σε σχέση με τους ελέγχους για τις δοκιμασίες μέτρησης κλωνογόνο ικανότητα. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt? 0.05.

F

. Γραφήματα που δείχνουν τις μεταβολές στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε φυσιολογικό ανθρώπινο στόματος κερατινοκύτταρα κατεργασία με μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν ZP νισίνη (100, 200, 400 ή 800 μg /mL) για 48 ώρες. Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * p & lt?. 0.05

Η

νισίνη ZP μειώνει το σχηματισμό αποικιών HNSCC κυττάρων

διερευνηθούν περαιτέρω οι επιπτώσεις της νισίνης ZP στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μετρώντας τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Σε συμφωνία με τις βραχυπρόθεσμες δοκιμές πολλαπλασιασμού, η θεραπεία με νισίνη ZP ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα HNSCC (Σχήμα 3D και 3Ε). Οι ανασταλτικές επιδράσεις επί του σχηματισμού αποικίας ήταν δοσοεξαρτώμενη, δεδομένου ότι ο σχηματισμός αποικίας μειωθεί σημαντικά καθώς η νισίνη ZP δόση αυξήθηκε από 400 έως 800 μg /mL. HNSCC κύτταρα κατεργασμένα με αυτές τις δύο δόσεις παρουσίασαν μείωση 2 και 50 φορές σε κλωνογόνο ικανότητα. Νισίνης δεν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα του στόματος, όπως ότι στα κύτταρα HNSCC (Σχήμα 3F).

μπλοκ νισίνης ZP orasphere σχηματισμό

Βρήκαμε περαιτέρω ότι η θεραπεία με νισίνη ZP μπλοκαριστεί σημαντικά orasphere σχηματισμό ή αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη (Σχ 4Α και 4Β). σχηματισμό Orasphere ή αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ανάπτυξη είναι μια ιδιότητα που συμβάλλει στην ογκογόνο δυναμικό. επιδράσεις νισίνης ZP για orasphere σχηματισμό ήταν δοσοεξαρτώμενη, όπως ότι η συνολική orasphere εμβαδόν μειώθηκε σταθερά μετά από αγωγή με νισίνη δόσεις από 100, 200, 400 και 800 μg /mL.

Μια

, Φάση αντίθεση εικόνες και

Β

, ποσοστό γράφημα που δείχνει των orasphere αναστολής (συνολικής έκτασης) σε κύτταρα HNSCC (UM-SCC-17Β) καλλιεργήθηκαν κάτω από συνθήκες αναστολής και να αντιμετωπίζονται με τα μέσα ελέγχου ή μέσα που περιέχουν νισίνη ZP (100 έως 800 μg /ml) για 36 ώρες. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων σε σχέση με τους μάρτυρες αναλύθηκαν με ANOVA με το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο * ρ & lt?. 0.05

Η

νισίνη ZP επάγει απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και αναστέλλει την αγγειογενετική βλάστηση

προηγουμένως έδειξαν ότι η θεραπεία με χαμηλή περιεκτικότητα νισίνη ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και οδήγησε σε μικρές χλωμό όγκους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η νισίνη επηρέασε την παροχή αίματος του όγκου. Επίσης έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι οι επιδράσεις κατά του όγκου νισίνη είχαν διαμεσολαβείται από CHAC1, ένα προ-αποπτωτικών επαγωγέα σε ενδοθηλιακά κύτταρα [9]. Έτσι, για να διαπιστωθεί αν νισίνης ZP επηρεάζει την αγγειογένεση, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα της νισίνης ZP στην απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και βλάστησης.