Αφηρημένο

Ιστορικό

β-lapachone (β-γύρο), έχει γίνει γνωστό ότι προκαλούν NQO1-dependnet θανάτου σε καρκινικά κύτταρα και να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR). Ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν την ραδιοευαισθητοποίηση που προκαλείται από β-γύρο

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

β-γύρο ενίσχυσε την επίδραση των υπέρυθρων ακτίνων για να προκαλέσει κλωνογόνων κυττάρων σε NQO1

+ -. MDA- MB-231 κύτταρα αλλά όχι σε NQO1

– MDA-MB-231 κύτταρα. β-γύρο προκάλεσε απόπτωση μόνο σε NQO1

+ κύτταρα και όχι σε NQO1

– κύτταρα και σημαντικά αυξημένη IR απόπτωση μόνο σε NQO1

+ κύτταρα. Συνδυασμένη θεραπεία του NQO1

+ κυττάρων που προκαλείται από την παραγωγή ROS, προκάλεσε ER στρες και τόνωσε την ενεργοποίηση της ERK και JNK. Η αναστολή της παραγωγής ROS από την NAC εξασθενημένα αποτελεσματικά την ενεργοποίηση της ERK και JNK, η επαγωγή του ER στρες και μετέπειτα απόπτωση. Είναι σημαντικό ότι, η αναστολή της ERK καταργηθεί γενιάς ROS και ER στρες, ενώ η αναστολή των JNK δεν το έκανε, δείχνει ότι η θετική ρύθμιση ανάδρασης μεταξύ της ενεργοποίησης ERK και της παραγωγής ROS προκαλεί ER στρες ως απάντηση σε συνδυασμένη θεραπεία. Περαιτέρω, η πρόληψη του στρες ER μπλοκαριστεί εντελώς ενεργοποίηση JNK θεραπεία επαγόμενης συνδυασμός και η επακόλουθη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Επιπλέον, η συνδυασμένη θεραπεία που επάγεται αποδοτικά την μιτοχονδριακή μετατόπιση του διασπασμένου Βαχ, διαταράσσεται δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και την πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ, το σύνολο των οποίων αποτελεσματικά μπλοκαριστεί από έναν αναστολέα JNK. Κασπασών 3, 8 και 9 ενεργοποιήθηκαν με συνδυασμένη θεραπεία, αλλά η αναστολή αυτών των κασπασών δεν καταργεί την απόπτωση που δείχνει την ενεργοποίηση της κασπάσης έπαιξε ένα μικρό ρόλο στην επαγωγή της απόπτωσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

β- γύρο προκαλεί NQO1 εξαρτώμενη ραδιοευαισθητοποίηση καρκινικών κυττάρων. Όταν + κύτταρα NQO 1

αντιμετωπίζονται με συνδυασμό IR και β-γύρο, θετική ρύθμιση ανάδρασης μεταξύ της ERK και ROS οδηγεί στο ER στρες προκαλεί ενεργοποίηση της JNK και μιτοχονδριακή μετατόπιση του διασπασμένου Bax. Η προκύπτουσα μείωση στην μιτοχονδριακή μεμβράνη οδηγεί σε μετατόπιση του ΟΕΕ και της απόπτωσης

Παράθεση:. Πάρκο Μ-Τ, Τραγούδι Μ-J, Lee H, OH Ε-Τ, Choi Β-Η, Jeong S-Y, et al. (2011) β-Lapachone Αυξάνει σημαντικά την επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας Αιτία μιτοχονδριακού απόπτωση μέσω της JNK ενεργοποίησης σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10.1371 /journal.pone.0025976

Επιμέλεια: Ντχιάνι Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 14, Σεπ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 6η Οκτωβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Πάρκο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Κορέα Υγείας 21 R & amp? D Έργου (A062254), το πυρηνικό πρόγραμμα έρευνας και ανάπτυξης του Ιδρύματος Κορέας Επιστημών και Μηχανικής (2009 – 0.093.747), και από την επιχορήγηση του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από την κυβέρνηση της Κορέας (MEST) (2011 – 0018954). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

β-lapachone (β-γύρο) είναι ένας παράγοντας ο οποίος βιοαναγωγικά έχει δειχθεί ότι έχουν ισχυρή αντικαρκινική δράση τόσο

in vitro

και

in vivo

[1] – [3]. Η αντικαρκινική δράση των β-γύρου έχει δειχθεί ότι οφείλεται στην μείωση δύο ηλεκτρονίων των β-γύρο διαμεσολαβείται από ΝΑΟ (Ρ) Η: κινόνη οξειδορεδουκτάσης (NQO1, DT-διαφοράση) χρησιμοποιώντας NADH ή NAD (Ρ) Η ως πηγές ηλεκτρονίων [1] – [3]. Επειδή NQO1 εκφράζεται με μεγαλύτερη αφθονία σε μια ποικιλία ανθρώπινων στερεών καρκίνων σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς [1] – [3], β-γύρο μπορεί επιλεκτικά να σκοτώσει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. β-γύρο έχει επίσης δειχθεί ότι ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (IR) [4]. Ωστόσο, η ακριβής βάση αυτής ραδιοευαισθητοποίησης μηχανισμός δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί.

Futile ποδηλασία μεταξύ των οξειδωμένων και μειωμένη μορφές β-γύρου έχει δειχθεί ότι προκαλεί προοδευτική εξάντληση των NADH και NAD (Ρ) Η, της οποίας, με τη σειρά του επάγει την μαζική απελευθέρωση του Ca

2+ από το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) στο κυτοσόλιο, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της Ca

2 + -εξαρτώμενη πρωτεϊνάσης, καλπαϊνη και μετέπειτα το θάνατο αποπτωτικών κυττάρων [1], [2 ], [5]. Επιπλέον, η ποδηλασία οξειδοαναγωγής που προκαλείται από ένα ηλεκτρόνιο μειωμένο β-γύρο (δηλαδή, η μορφή ημικινόνες της β-γύρο), το ενδιάμεσο μεταξύ δύο ηλεκτρονίων β-γύρο και την οξειδωμένη μορφή της β-γύρου μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση των οδών κυτταρικού θανάτου [1]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) με ποικίλες ερεθίσματα κυτταρικού θανάτου δεν κινεί μόνο καταρράκτες των σημάτων κυτταρικού θανάτου, αλλά και να οδηγήσει άμεσα σε βλάβη του DNA [6] – [10]. Ωστόσο, οι οδοί σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από ROS σε κύτταρα επεξεργασμένα με β-γύρο δεν έχουν ακόμη σαφώς.

Αν και β-γύρο καταδείχθηκε για την ενεργοποίηση από μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινασών (MAPKs) σε καρκινικά κύτταρα, και με τον τρόπο αυτό επάγουν αποπτωτικό θάνατο [11], τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ που προκαλείται από β-γύρο, και ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης ΜΑΡΚ σε β-lap-επαγόμενη απόπτωση δεν έχουν διευκρινιστεί.

το μιτοχονδριακό κυττάρων μονοπάτι θάνατος ρυθμίζεται από την αναλογία των προ- σε αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των μελών της οικογένειας Bcl-2. Μεταξύ αυτών των μελών της οικογένειας, Bax ή Bak διαδραματίζει βασικό ρόλο στην απώλεια του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού [12]. Κατά την παράδοση του αποπτωτικού ερεθίσματος, κυτοσολική Bax μετατοπίζεται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, όπου oligomerizes να σχηματίσουν ομοδιμερή, δημιουργώντας πόρους που επισπεύσει την απελευθέρωση του κυτοχρώματος

γ

, επαγωγής απόπτωσης παράγοντα (ΟΕΕ) και ενδονουκλεάση G (Endo G) από το χώρο intermembrane του μιτοχονδρίου στο κυτοσόλιο [7].

σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την μηχανισμός με τον οποίο β-γύρο ρυθμίζει την απόκριση των καρκινικών κυττάρων του μαστού σε ακτινοβολία. Έχουμε αποδείξει εδώ ότι η συνδυασμένη θεραπεία IR και β-γύρο αυξάνει συνεργικά κλωνογονικού και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1-εξαρτώμενο τρόπο. Δείχνουμε επίσης ότι η παραγωγή ROS, η επαγωγή του ER στρες και ενεργοποίηση εξωκυτταρικής ρυθμιζόμενης κινάση (ERK) και c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) με συνδυασμένη θεραπεία είναι ζωτικής σημασίας για μιτοχονδριακό αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Συγκεκριμένα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ο σχηματισμός ενός θετικού βρόχου ανάδρασης μεταξύ της ενεργοποίησης ERK και παραγωγή ROS είναι απαραίτητη για συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από στρες ER, η οποία οδηγεί στην ενεργοποίηση JNK και την επακόλουθη μιτοχονδριακό αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Τα δεδομένα μας παρέχει ένα δυναμικό μηχανισμό για να αντιπροσωπεύουν την ραδιοευαισθητοποίησης επίδραση των β-γύρο, και γνώσεων που αποκτήθηκαν στην παρούσα μελέτη θα οδηγήσει σε προόδους στην κλινική εφαρμογή της συνδυασμένης θεραπείας με IR και β-γύρο σε θεραπείες που βασίζονται σε NQO1-κατευθυνόμενη στόχευση του όγκου .

Αποτελέσματα

η συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο αυξάνει κλωνογονικού και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1-εξαρτώμενο τρόπο

για να προσδιοριστεί η επίδραση των β-γύρο για κλωνογονικού κυτταρικής επιβίωσης, υποβάλλαμε σε αγωγή γονική NQO1

– MDA-MB-231 κύτταρα ανεπαρκή σε NQO 1, ή NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων που έχουν άφθονη έκφραση του NQO1, με διαφορετικές δόσεις του β-γύρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην κλωνογονική κυτταρικό θάνατο μετά από αγωγή β-γύρο ήταν εμφανής σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα, αλλά όχι σε γονικά NQO1

– MDA-MB-231 κύτταρα, υποδεικνύοντας NQO1 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο για την β-γύρο-κυτταρικό θάνατο που επάγεται

(Α) NQO1

-. ή NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διάφορες συγκεντρώσεις της β-γύρο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 έως 14 ημέρες και βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και βαθμολογούνται για το σχηματισμό αποικιών. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. * Σημαντική διαφορά μεταξύ NQO1

– και NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων μετά από θεραπεία β-γύρο σε ρ & lt? 0,05. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μΜ β-γύρο και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις IR 30 λεπτά μετά την αγωγή με β-γύρο. Μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα βαθμολογήθηκαν για σχηματισμό αποικιών. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή ο συνδυασμός IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs

Η

Αναλύσαμε την επίδραση του β-γύρο τη IR επαγόμενη κλωνογόνο θάνατο του NQO1

-. MDA-MB-231 και NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές δόσεις IR με την παρουσία ή απουσία 2 μΜ β-γύρο και την κλωνογόνο επιβίωση προσδιορίστηκε όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β. Οι καμπύλες επιβίωσης ακτινοβολίας για συνδυασμένη θεραπεία ομαλοποιήθηκαν για το θάνατο από μόνη της β-γύρο. Η καμπύλη επιβίωσης ακτινοβολίας για συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο ήταν ταυτόσημη σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, η καμπύλη επιβίωσης ακτινοβολίας για συνδυασμένη θεραπεία του NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα ήταν σημαντικά πιο απότομη ιδιαίτερα στις χαμηλότερες δόσεις ακτινοβολίας από εκείνη για την αγωγή IR μόνος αποτέλεσμα σημαντική μείωση στον ώμο της επιβίωσης καμπύλη. Η μείωση του ώμου έδειξε ότι η β-γύρο ανέστειλε την επισκευή σχεδόν θανατηφόρες βλάβες της ακτινοβολίας σε NQO1

+ κύτταρα, αλλά όχι σε NQO1

-. Κύτταρα

Ερευνήσαμε το συνδυασμένο αποτέλεσμα της IR και β-γύρο για αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1

– MDA-MB-231 και NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 Gy IR του και μόνο, αξιολογήθηκε 2 μΜ β-γύρο μόνο, ή συνδυασμό IR και β-γύρο για διάφορα χρονικά διαστήματα, και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Ενώ απόπτωση NQO1

+ – MDA ΜΒ-231 κυττάρων που επάγεται από IR και μόνο ήταν περίπου 13 και 14% στις 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα, β-γύρο μόνος-επαγόμενη απόπτωση σε περίπου 18 και 40% των κυττάρων στους 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα (Εικ. 1 C). Συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο αξιοσημείωτα αυξημένο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα? περίπου 58 και 87% των κυττάρων ήταν αποπτωτικά στις 24 και 48 ώρες, αντίστοιχα. Αντιθέτως, σε NQO1

– MDA-MB-231 κύτταρα, δεν παρατηρήθηκε σημαντική απόπτωση συνέβη μετά τη θεραπεία μόνη της ή ακόμα και με συνδυασμό IR και β-γύρο με IR ή β-γύρο, πιθανότατα λόγω ανεπάρκειας NQO 1 και ένα μεταλλαγμένη μορφή της ρ53 που εκφράζονται σε NQO1

-. MDA-MB-231 κύτταρα [13]

συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο επάγει σημαντικά την παραγωγή ROS σε NQO1

+ – MDA-ΜΒ -231 κύτταρα

Ερευνήσαμε τη συμμετοχή των ROS στη συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1

– MDA-MB-231 και NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα. Μετρήσαμε την πρώτη ROS με χρώση DCF. Σε σύγκριση με ατομική αγωγή με IR ή β-γύρο, συνδυασμένη θεραπεία προκάλεσε πολύ πιο αύξηση των επιπέδων ROS για 3 ώρες σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα αλλά όχι σε NQO1

– MDA-MB-231 (Εικ. 2Α). Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω την παραγωγή ROS από συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο χρησιμοποιώντας μια άλλη χρωστική ROS ανίχνευσης, dihydroethidium (DHE). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση στην παραγωγή ROS σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα αλλά όχι σε NQO1

– MDA-MB-231 κυττάρων μετά συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο . Για να καθοριστεί αν η αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS είχε άμεση σχέση με αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, εμείς προεπεξεργασία NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα με την αντιοξειδωτική NAC πριν από έκθεση των κυττάρων σε IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C, η προθεραπεία με NAC μείωσε σημαντικά το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο. Επιπλέον, η προθεραπεία με NAC εξασθενημένα αποτελεσματικά την κλωνογόνο κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο (Σχ. 2D). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η επαγωγή του ROS συμβάλλει κριτικά με την αποπτωτική και κλωνογονικού κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο σε NQO1

+ -. MDA-MB-231 κύτταρα

(Α) και (Β) τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Μετά από 3 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ H2DCF-DA και 4 μΜ DHE, αντίστοιχα, για 30 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (Γ) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες με την παρουσία ή απουσία του NAC (10 mM). Μετά από 24 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με συνδυασμό IR (2 Gy) και β-γύρου (2 μΜ) παρουσία ή απουσία του NAC (10 mM). Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 έως 14 ημέρες και βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και βαθμολογούνται για το σχηματισμό αποικιών. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM. * Σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων με την παρουσία ή απουσία της NAC μετά τη συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, σ & lt?. 0.05

Η

β-γύρο σε συνδυασμό με IR ενεργοποιεί γρήγορα ERK και JNK, οδηγώντας σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο

για να αποκαλυφθεί η πιθανή συμμετοχή των MAPKs στο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο, μελετήσαμε τα επίπεδα των ενεργοποιημένων μορφών των MAPKs σε NQO1

– MDA-MB-231 και NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα με ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-φωσφο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, σε NQO1

– MDA-MB-231 κύτταρα, IR μόνος ελαφρώς αυξημένη φωσφορυλίωση της ERK και JNK, ενώ β-γύρο μόνη προκάλεσε μικρή αλλαγή στα επίπεδα των φωσφορυλιωμένων ERK και JNK. Η επίδραση της συνδυασμένης θεραπείας ήταν παρόμοια με εκείνη του IR και μόνο. Η φωσφορυλίωση της p38 MAPK σε NQO1

– MDA-MB-231 κυττάρων ήταν αρνητικό μετά από εφάπαξ ή σε συνδυασμό θεραπειών με IR και β-γύρο. Ωστόσο, σε NQO

+ – MDA-MB-231 κύτταρα, η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε ταχεία ανιούσα ρύθμιση των φωσφορυλιωμένων ERK και JNK, σε σύγκριση με την αγωγή με IR μόνο του ή β-γύρο μόνο (Σχήμα 3Α).. ενεργοποίηση ERK ήταν εμφανής σε 0,5 ώρες, και παρέμειναν αυξημένα για 3 ώρες μετά τη συνδυασμένη αγωγή. Επιπλέον, η ενεργοποίηση JNK άρχισε να αυξάνεται εντός 0,5 ώρα αλλά μειώθηκε 2 ώρες μετά συνδυασμένη θεραπεία σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα. Τα συνολικά κυτταρικά επίπεδα της ERK και JNK παρέμεινε σταθερή. επεξεργασία IR αυξημένη φωσφορυλίωση της p38 MAPK, ενώ η θεραπεία β-γύρο δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στην φωσφορυλίωση της p38 MAPK. Το επίπεδο φωσφορυλίωσης της p38 ΜΑΡΚ μετά συνδυασμένη αγωγή ήταν μικρότερη από ότι μετά από θεραπεία με IR μόνο, υποδεικνύοντας β-γύρο κατέστειλε IR-επαγόμενη ενεργοποίηση των p38 ΜΑΡΚ σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα (Εικ. 3Α). Για να εξεταστεί η σχέση μεταξύ της ενεργοποίησης του MAPKs και αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, εμείς προεπεξεργασμένα NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων με SP600125, PD98059, ή SB203580, αναστολείς του JNK, MEK /ERK, και p38 ΜΑΡΚ, αντίστοιχα, πριν από τη θεραπεία με IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, PD98059 και SP600125 μειωθεί αποτελεσματικά το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή από 56% σε 24% και 13%, αντίστοιχα, ενώ SB203580 ήταν αναποτελεσματική. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η εμπλοκή της ERK και JNK2 στο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, έχουμε προεπεξεργασμένα NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων με siRNAs που στοχεύουν ERK και ΙΝΚ2. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με φαρμακολογική αναστολείς, ειδική αναστολή της ERK και JNK2 με siRNAs σχεδόν κατήργησε εντελώς το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι ERK και JNK δρουν ως σημαντικοί μεσολαβητές αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο σε NQO1

+ -. MDA-MB-231 κύτταρα

(Α) NQO1

– ή NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) και (Γ) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία PD98059 (30 μΜ ), SP600125 (30 μΜ), SB203580 (30 μΜ), ή siRNA που στοχεύει ERK1 /2 ή JNK2. Το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs.

Η

Θετική ρύθμιση ανάδρασης μεταξύ ROS και ERK που επάγεται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-επικάλυψης είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της JNK

για να καθοριστεί εάν γενιάς ROS εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της ERK και JNK με συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, έχουμε προεπεξεργασμένα NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων με το αντιοξειδωτικό NAC πριν από τη θεραπεία με IR και β -αγκαλιά. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, η ενεργοποίηση της ERK και JNK με συνδυασμένη θεραπεία ήταν εντελώς αποκλεισμένη από προεπεξεργασία με NAC. Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συμβολή των ERK και JNK σε γενιά ROS προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία. Εμείς αντιμετωπίζεται NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων με siRNAs που στοχεύουν ERK και JNK2 πριν από τη θεραπεία με IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, siRNA μεσολάβηση ERK knockdown μπλοκάρει αποτελεσματικά ROS παραγωγή, όπως προσδιορίζεται με DCF, που προκαλείται από β-γύρο μόνο και σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό από συνδυασμένη θεραπεία, ενώ siRNA που στοχεύει JNK2 δεν εξασθενούν παραγωγή ROS.

(Α) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 30 λεπτά με την παρουσία ή απουσία του NAC. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 3 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία του siRNA που στοχεύει ERK1 /2 ή JNK2. Μετά από 3 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ H2DCF-DA για 30 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (Γ) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 30 λεπτά παρουσία ή απουσία PD98059 ή SP600125. . Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η δυνατότητα cross-talk μεταξύ ERK και JNK, εμείς προεπεξεργασία NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα με PD98059 ή SP600125. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4C, η ενεργοποίηση της ERK και JNK με συνδυασμένη θεραπεία ήταν εντελώς καταργήθηκε δια προκατεργασίας με PD98059 και SP600125, αντίστοιχα. Επιπλέον, PD98059 αποτελεσματικά μπλοκάρει θεραπείας συνδυασμού επαγόμενη ενεργοποίηση της JNK, ενώ SP600125 δεν εξασθενούν την ενεργοποίηση της ERK, υποδεικνύοντας ότι ERK είναι ένα ανάντη ενεργοποιητής της JNK (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η β-γύρο σε συνδυασμό με IR οδηγεί σε θετική ρύθμιση ανάδρασης μεταξύ ROS και ενεργοποίηση της ERK που μπορεί να συμβάλει στην ενεργοποίηση JNK.

ROS γενιά που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο απαιτείται για την επαγωγή της ER στρες

επόμενο διερευνηθεί αν συνδυασμένης θεραπείας με IR και β-γύρο προκαλεί ER στρες σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα χρησιμοποιώντας φωσφορυλίωση eIF2α και ψιλοκόψτε έκφρασης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, IR μόνο του δεν μετέβαλε φωσφορυλιωμένη επίπεδα eIF2α (ρ-eIF2α) και CHOP έκφραση, και β-γύρο μόνος ελαφρώς αυξημένη ρ-eIF2α και CHOP έκφρασης. Ωστόσο, η συνδυασμένη θεραπεία αισθητά επάγεται ρ-eIF2α και αυξημένο επίπεδο έκφρασης CHOP (Εικ. 5Α). Για να εξεταστεί περαιτέρω η εμπλοκή των ER στρες σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που επάγεται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, έχουμε προεπεξεργασμένα NQO1

+ – MDA-MB-231 κυττάρων με Salubrinal (Sal), έναν αναστολέα ER στρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, Sal αποτελεσματικά καταστέλλεται θεραπείας συνδυασμού επαγόμενης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ER στρες είναι μια σημαντική συμβολή στην συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε NQO1

+ -. MDA-MB-231 κύτταρα

(Α) NQO1

+ – MDA-MB -231 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία Sal (10 μΜ). Μετά από 24 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων με το περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (Γ) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο και μόνο β-γύρο ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 3 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία Sal (10 μΜ). Μετά από 3 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ H2DCF-DA για 30 λεπτά και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 30 λεπτά με την παρουσία ή απουσία του NAC. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Ε) και (F) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 30 λεπτά παρουσία ή απουσία Sal, SP600125 ή PD98059. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα

Η

επόμενο διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ της παραγωγής ROS και ER στρες σε NQO1

+ -. MDA-MB-231 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με συνδυασμό IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, η προθεραπεία με Sal δεν εξασθενούν την παραγωγή ROS προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία, ενώ προκατεργασία με NAC παρεμπόδισε αποτελεσματικά την φωσφορυλίωση του eIF2α (Εικ. 5D), υποδεικνύοντας ότι ROS παραγωγή που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία απαιτείται για την επαγωγή της ER στρες.

ER στρες που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο απαιτείται για την ενεργοποίηση της JNK

για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ ER στρες και MAPKs (ERK και JNK), έχουμε εξέτασε πρώτα την επίδραση της Sal στην ενεργοποίηση της ERK και JNK. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Ε, η προθεραπεία με Sal κατέστειλε αποτελεσματικά την ενεργοποίηση της JNK που επάγεται από συνδυασμένη θεραπεία, αλλά δεν εξασθενούν την ενεργοποίηση της ERK. Για να καθοριστούν περαιτέρω τον κρίσιμο ρόλο των MAPKs στην επαγωγή της ER στρες, μπορούμε προεπεξεργασία NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα με PD98059 ή SP600125. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5F, συνδυασμένη θεραπεία επαγόμενη φωσφορυλίωση της eIF2α εντελώς αποκλεισμένη από PD98059, αλλά όχι από SP600125. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ERK είναι ένα ανάντη ενεργοποιητής της ER στρες υπεύθυνος για την ενεργοποίηση της JNK σε απόκριση σε συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρων.

Συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο επάγει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο μέσω της πυρηνικής μετατόπισης του ΟΕΕ

Επειδή η ενεργοποίηση της οδού κασπάσης είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την επαγωγή αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου [14], διερευνήσαμε την εμπλοκή κασπασών στην αποπτωτική απόκριση σε συνδυασμένη αγωγή του NQO1

+ – MDA-ΜΒ -231 κυττάρων με IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε σε ενεργοποιήσεις της κασπάσης-8, -9 και -3. Σημειώστε ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και 3 συνέβησαν πριν από την ενεργοποίηση της κασπάσης 8. IR ή β-γύρο και μόνο δεν προκάλεσε κανένα φανερό ενεργοποιήσεις αυτών των κασπασών. Το κυτόχρωμα c απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια έχει αναφερθεί ότι σχηματίζει ένα σύμπλοκο με procaspase-9 και αποπτωτικά πρωτεάση ενεργοποίησης παράγοντα-1 (Apaf-1), με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του procaspase-9 [14]. Επομένως, προσδιορίσαμε το εάν συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο επάγει την απελευθέρωση κυτοχρώματος c από τα μιτοχόνδρια στο κυτοσόλιο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Β, συνδυασμένη θεραπεία έθεσε αποτελεσματικά το επίπεδο του κυτοχρώματος c εντός κυτταροπλασματικό κλάσμα για 12 ώρες, ενώ IR ή β-γύρο από μόνη της δεν το έκανε. Στη συνέχεια μελετήθηκε η απαίτηση της κασπάσης για συνδυασμένη θεραπεία επαγόμενης απόπτωσης χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα κασπάσης ευρέως φάσματος, ζ-VAD-fmk. Σχήμα 6C δείχνει ότι το Ζ-VAD-fmk παρεμπόδισαν αποτελεσματικά την ενεργοποίηση των κασπασών που προκαλείται από συνδυασμένη θεραπεία. Παραδόξως, ωστόσο, z-VAD-fmk μειώνεται μόνον εν μέρει συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από περίπου 51% έως 42% (Εικ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο συμβαίνει, ακόμα και αν η ενεργοποίηση των κασπασών παρεμποδίζεται

(Α) NQO1

+ -. MDA-MB-231 κύτταρα ήταν κατεργάζεται με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Β) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 12 ώρες. Κυτοσολικά κλάσματα από NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (Γ) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με συνδυασμό IR και β-γύρο για 12 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία z-VAD-fmk. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα. (D) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία z-VAD-fmk (30 μΜ ). Μετά από 24 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων με περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (Ε) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες. Πυρηνική κλάσματα από NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές. (F) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία του siRNA που στοχεύει ΟΕΕ. Μετά από 24 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων με περιεχόμενο DNA υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα εκφράζονται ως μέσοι ± SEMs. (G) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα κατεργάστηκαν με συνδυασμό IR και β-γύρο για 24 ώρες υπό την παρουσία ή απουσία του NAC, PD98059, Sal ή SP600125. Πυρηνική κλάσματα παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές.

Η

Επειδή ΟΕΕ, ένα μιτοχόνδρια-εντοπισμένη φλαβοπρωτεϊνη, είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην επαγωγή της κασπάσης-ανεξάρτητων αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο [7], μπορούμε επόμενο διερευνηθεί αν ΟΕΕ παίζει ρόλο στην επαγωγή κυτταρικού θανάτου από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο. ΟΕΕ απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια σε απόκριση σε ερεθίσματα κυτταρικού θανάτου, ακολούθως μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου προκαλεί κατακερματισμό του DNA [7]. Υποκυτταρικής κλασματοποίησης έδειξε ότι η συνδυασμένη θεραπεία οδήγησε δραματικά την πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ, ενώ IR ή β-γύρο και μόνο προκάλεσε μικρή αύξηση του ΟΕΕ στον πυρήνα (Σχ. 6Ε). Επιπλέον, siRNA μεσολάβηση ΟΕΕ knockdown μειώνεται αποτελεσματικά θεραπείας συνδυασμού που προκαλείται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από 55% έως σχεδόν επίπεδα ελέγχου (Σχ. 6F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ απαιτείται για την επαγωγή της αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο από συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο.

Για να καθορίσει περαιτέρω τους ρόλους των ROS, ERK, ER στρες και JNK στην πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ μετά από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, έχουμε προεπεξεργασία NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα με τα αντίστοιχα αναστολείς, NAC, PD98059, Sal ή SP600125, και να εξετάσει την υποκυτταρική εντόπιση του ΟΕΕ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6G, η πυρηνική μετατόπιση του ΟΕΕ που επάγονται από συνδυασμένη θεραπεία ήταν εντελώς αποκλεισμένη από προκατεργασία με NAC, PD98059, Sal ή SP600125. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ROS, ERK, ER στρες και JNK είναι ανάντη ενεργοποιητές του ΟΕΕ μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο που επάγεται από συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρων.

Συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο επάγει μιτοχονδριακή μετατόπιση του διασπασμένα Bax και διατάραξη της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό

Για τον προσδιορισμό του ρόλου του μιτοχονδριακού μονοπατιού σε συνδυασμένη θεραπεία απόπτωση σε NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα, εξετάσαμε πρώτες αλλαγές στην Bcl-2 και Βαχ επίπεδα έκφρασης, και μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Α, τα επίπεδα Βαχ ήταν σημαντικά μειωμένη σε απόκριση σε συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο, αλλά όχι σε απόκριση σε ατομική αγωγή με IR ή β-γύρο. Τα επίπεδα έκφρασης του Bcl-2 ήταν αμετάβλητη από μεμονωμένα ή συνδυασμένη θεραπεία. Έχει αναφερθεί ότι Bax διασπάται από ένα 21 kDa φυσική μορφή σε ένα θραύσμα 18 kDa σε απόκριση προς ερεθίσματα θάνατο [15], [16]. Λόγω μετατόπιση του 18 kDa διασπάστηκε Bax από το κυτοσόλιο στο μιτοχόνδρια έχει αναφερθεί ότι επάγει μια μείωση της μιτοχονδριακής διαμεμβράνης δυναμικού και την επακόλουθη απελευθέρωση του proapoptogenic πρωτεϊνών από μιτοχόνδρια [15], [16], ερευνήσαμε αν η συνδυασμένη θεραπεία προκαλεί μιτοχονδριακή μετατόπιση του διασπασμένου Βαχ . Όπως φαίνεται στο σχήμα 7Β και C, συνδυασμένη θεραπεία με IR και β-γύρο πιο αποτελεσματικά αυξημένα τα επίπεδα του 18 kDa διασπάστηκε Bax εντός της μιτοχονδριακό κλάσμα από την ατομική αγωγή με IR ή β-γύρο. Ωστόσο, 18 kDa μορφή του Βαχ δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε λύματα ολόκληρων κυττάρων μετά συνδυασμένη αγωγή (Σχ. 7C). Επειδή ένα καθεψίνης-πρωτεάση έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην ταχεία αποδόμηση της 18ης μορφή kDa του Bax στο κυτταρόπλασμα [17], μπορούμε προκατεργασμένο κύτταρα με το MG132 αναστολέα πρωτεάσης να γνωρίζουμε γιατί διασπασμένο Bax απουσίαζε σε λύμα ολόκληρου κυττάρου μετά συνδυάστηκαν αγωγή με IR και β-γύρο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7D, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με συνδυασμό IR και β-γύρο υπό την παρουσία MG132, που διασπάται Bax ανιχνεύθηκε σε προϊόν λύσης ολικού κυττάρου, δεικνύοντας ότι διασπασμένο Bax εύκολα αποδομείται στο κυτοσόλιο μετά συνδυασμένη αγωγή με IR και β -αγκαλιά. Έτσι, η μορφή 18 kDa του Βαχ μπορεί να είναι ασταθής στο κυτταρόπλασμα αλλά σταθερό στο μιτοχονδριακό κλάσμα μετά συνδυασμένη αγωγή με IR και β-γύρο. Επιπλέον, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Ε, η συνδυασμένη θεραπεία διαταράσσεται σημαντικά μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, που συμπίπτει με τις παρατηρούμενες αλλαγές στα επίπεδα Βαχ. . Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η συνδυασμένη θεραπεία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο συνεπάγεται μια μεταβολή στο μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό διαμεσολαβείται από ενδοκυτταρική ανακατανομή της διασπασμένης Βαχ

(Α) NQO1

+ – MDA-MB-231 κύτταρα ήταν κατεργάζεται με IR και μόνο, β-γύρο μόνο του ή συνδυασμό IR και β-γύρο για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα τυπικό πείραμα διεξήχθη τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.