Αφηρημένο

Ιστορικό

Κάτω ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν για νουκλεοσιδικά μεταφορείς και το μεταβολισμό του φαρμάκου υπεύθυνη για την πρόσληψη και την μεταβολική ενεργοποίηση του νουκλεοσιδίου γεμσιταβίνης σχετίζεται με επίκτητη αντίσταση όγκου κατά αυτόν τον παράγοντα. Hydralazine έχει αποδειχθεί να αναστρέψει δοξορουβικίνη αντίσταση σε ένα μοντέλο καρκίνου του μαστού. Εδώ θα θέλαμε να διερευνήσει κατά πόσον επιγενετικών μηχανισμών είναι υπεύθυνοι για την απόκτηση αντίσταση σε γεμσιταβίνη και αν υδραλαζίνη θα μπορούσε να αποκαταστήσει την ευαισθησία γεμσιταβίνη σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ο καρκίνος του τραχήλου κυτταρική σειρά Calo κυττάρων γραμμή καλλιεργήθηκε με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της γεμσιταβίνης. Κάτω ρύθμιση του

hENT1

& amp?

dCK

γονίδια παρατηρήθηκε στα ανθεκτικά κύτταρα (CaLoGR), η οποία δεν συνδέθηκε με μεθυλίωση προαγωγού. Η θεραπεία με υδραλαζίνη αντιστραφεί αντίσταση γεμσιταβίνη και οδήγησε σε

hENT1

και

dCK

γονίδιο επανενεργοποίησης σε έναν προαγωγό μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητο τρόπο. Δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στη συνολική δραστικότητα HDAC ούτε σε Η3 και Η4 ακετυλίωση σε αυτούς τους προαγωγείς. Ανάλυση ChIP έδειξε H3K9m2 σε

hENT1

και

dCK

γονίδιο υποκινητές που συσχετίζεται με υπερ-έκφραση G9A ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση σε RNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης στα ανθεκτικά κύτταρα. Hydralazine ανέστειλε μεθυλοτρανσφεράσης G9A in vitro και η εξάντληση του γονιδίου G9A από iRNA αποκατασταθεί ευαισθησία γεμσιταβίνης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επίκτητη αντοχή γεμσιταμπίνη συνδέεται με τον ανάδοχο μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητο

hENT1

και

dCK

γονιδίου ρύθμιση προς τα κάτω και υπερ-έκφραση G9A μεθυλοτρανσφεράση. Hydralazine επανέρχεται αντίσταση γεμσιταβίνη σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα μέσω της αναστολής της G9A ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση

Παράθεση:. Candelaria Μ, de la Cruz-Hernandez E, Taja-Chayeb L, Perez-Cardenas E, Trejo-Becerril C, Gonzalez- Fierro A, et al. (2012) Η μεθυλίωση του DNA-Ανεξάρτητη Επαναφορά των γεμσιταβίνη Αντίστασης από Hydralazine σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10.1371 /journal.pone.0029181

Συντάκτης: Vladimir Ν Uversky, Πανεπιστήμιο της Νότιας Φλόριντα College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Φεβ, 2011? Αποδεκτές: 22 Νοέμβρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Μάρτη του 2012

Copyright: © 2012 Μίρνα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο εν μέρει υποστηρίζεται από Psicofarma SA de CV Οι χρηματοδότες είχαν ένα ρόλο στη συλλογή δεδομένων, αλλά όχι στο σχεδιασμό της μελέτης, η ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. ADG έχει λάβει καταβληθεί συμβουλών από Psicofarma S.A. de C.V. για θέματα άλλα από εκείνα που σχετίζονται με την έρευνα αυτή. Το ίδρυμα του συγγραφέα (Εθνικό Αυτόνομο Πανεπιστήμιο του Μεξικού) έχει αιτήσεων για διπλώματα ευρεσιτεχνίας που αφορούν υδραλαζίνη. Αυτό δεν αλλάζει »τήρηση όλων των PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Γεμσιταβίνη (2 ‘των συγγραφέων, 2’-διφθορο 2’δεοξυκυτιδίνη, dFdC) είναι ένα ανάλογο της κυτοσίνης αραβινοσίδης που κατέχει χαρακτηριστική φαρμακολογικές ιδιότητες και ευρεία δραστικότητα κατά του όγκου-φάσματος. Η γεμσιταβίνη έχει σημαντική κλινική δραστικότητα έναντι ενός αριθμού κακοηθειών περιλαμβανομένων του παγκρέατος, των πνευμόνων, της ουροδόχου κύστης, του μαστού, των ωοθηκών και της κεφαλής και του αυχένα [1], [2]. Σε τραχήλου της μήτρας γεμσιταβίνη καρκίνο συν σισπλατίνη και η ακτινοβολία βελτιώνει τα αποτελέσματα της επιβίωσης σε σύγκριση με σισπλατίνη ακτινοβολίας σε προχωρημένο στάδιο της νόσου και όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με σισπλατίνη είναι τόσο αποτελεσματική όσο άλλες δυάδες σισπλατίνη έναντι του μεταστατικού καρκίνου του τραχήλου της μήτρας [3].

φαρμακολογικά χαρακτηριστικά Γεμσιταβίνη είναι μοναδική στην ότι δύο κύριες κατηγορίες γονιδίων είναι απαραίτητα για την αντικαρκινική δράση και την αντοχή του: γονίδια μεμβράνη μεταφορέα που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, τα προϊόντα των οποίων είναι υπεύθυνα για φάρμακο ενδοκυτταρική πρόσληψη, και τα γονίδια που κωδικοποιούν το μεταβολισμό του φαρμάκου, τα οποία καταλύουν την ενεργοποίηση και απενεργοποίηση του [4]. Έτσι, η έκφραση αυτών των γονιδίων είναι βασική για την απόκριση του όγκου και αντίσταση στην gemcitabine. Οι περισσότεροι ενδοκυτταρική πρόσληψη της γεμσιταβίνης διαμεσολαβείται από hENT1 (ανθρώπινη εξισορροπητικού νουκλεοτιδικού μεταφορέα 1). Ευαισθησία σε ανάλογα νουκλεοζιτών, συμπεριλαμβανομένων γεμσιταβίνη

in vitro

και στο κλινικό περιβάλλον έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με την έκφραση αυτού του μεταφορέα, ενώ hENT1 ελλειμματικά κύτταρα είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στην παρούσα νουκλεοζίτη [5] – [8]. Οι ασθενείς με παγκρεατικό καρκίνο του πνεύμονα και εκφράζουν hENT1 έχουν υψηλότερα ποσοστά ανταπόκρισης και μεγαλύτερη μέση επιβίωση μετά γεμσιταβίνη συγκριτικά με άτομα με χαμηλή ή μηδενική hENT1 [9], [10]. Αναφορικά με τα γονίδια του μεταβολισμού γεμσιταβίνη,

dCK

έκφρασης έχει συσχετισθεί με γεμσιταβίνη ευαισθησία. Οι κυτταρικές σειρές που επιλέγονται για την αντοχή σε νουκλεοσιδικά ανάλογα έδειξαν μεταλλακτική αδρανοποίηση του

dCK

και

dCK

διαμόλυνση αποτελέσματα σε επαναευαισθητοποίηση κυττάρων σε Ara-C και γεμσιταβίνη [11] – [12]. Σε ασθενείς με καρκίνο μια χαμηλότερη έκφραση του dCK συνδέεται με μικρότερη συνολική επιβίωση [13], [14]. Από την άλλη πλευρά, διφωσφωρυλυώνονται γεμσιταμπίνη είναι ένας αναστολέας της ριβονουκλεοτιδικής ρεδουκτάσης, ένα ένζυμο ετεροτετραμερείς αποτελείται από δύο ομοδιμερών (RRM1 και RMM2) η οποία είναι το κλειδί στη σύνθεση της ενδοκυτταρικής τριφωσφορικής δεοξυνουκλεοτιδίου [15]. Πάνω από έκφραση του RRM1 και RRM2 έχει συσχετιστεί με γεμσιταβίνη αντίσταση σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές και NSCLC [16], [17]. Απαμινάσης κυτιδίνης (CDA) καταλύει την απαμίνωση της κυτιδίνης, dexoycytidine, και τα ανάλογά τους όπως είναι η γεμσιταβίνη ωστόσο, ο ρόλος του μεσολαβώντας αντίσταση γεμσιταμπίνη είναι αμφιλεγόμενη [18]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν σαφώς ότι ένα μειωμένη ή έλλειψη έκφρασης του dCK και hENT1 είναι ζωτικής σημασίας για την αντοχή γεμσιταβίνη, ωστόσο, οι μηχανισμοί που οδηγούν στην μεταγραφική σίγηση τους δεν έχουν ακόμη οριστεί. Προγενέστερες μελέτες έχουν δείξει ότι η μεθυλίωση σε

dCK

γονίδιο είναι υπεύθυνο για την αποσιώπηση του [19], ωστόσο? Αυτό μένει να αποδειχθεί για το

hENT1

Η

Hydralazine είναι ένα μικρό μόριο παράγοντα απομεθυλίωσης DNA [20] είναι γνωστό ότι απομεθυλίωση υποκινητές των γονιδίων και να προκαλέσει γονίδιο επανενεργοποίηση in vitro [21] -. [ ,,,0],24] και in vivo [25]. Χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης βαλπροϊκό οξύ επανενεργοποιεί την έκφραση των γονιδίων σε ασθενείς με καρκίνο [26] – [28]. Επιπλέον, η υδραλαζίνη έχει δειχθεί ότι αναστρέφουν την αντίσταση δοξορουβικίνη σε ένα μοντέλο καρκίνου του μαστού [29]. Δεδομένου ότι οι περισσότεροι των εργασιών σχετικά με γεμσιταμπίνη αντίσταση έχει γίνει σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές και, αυτό το φάρμακο έχει εκτεταμένα αξιολογηθεί σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [30] θέλαμε να διερευνήσει κατά πόσον επιγενετικών μηχανισμών είναι υπεύθυνοι για την απόκτηση αντίσταση σε αυτό το μέσο και αν υδραλαζίνη θα μπορούσε να αποκαταστήσει ευαισθησία gemcitabine σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι σε αυτό το μοντέλο, υδραλαζίνη αντιστρέφει την αντίσταση γεμσιταβίνη σε μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητο τρόπο.

Αποτελέσματα

κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας εξετάστηκαν για τη βασική έκφραση του

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

γονιδίων και, στη συνέχεια, την ευαισθησία τους σε gemcitabine αξιολογήθηκε. Το IC

50 στην κυτταρική σειρά SiHa ήταν & gt? 1000 μΜ, και ήταν αυθαίρετα θεωρείται ως κύρια ανθεκτική. Το IC

50 για τις άλλες κυτταρικές γραμμές ήταν: 3,3 μΜ, 0,3 μΜ και 0,1 μΜ για Calo, HeLa και κύτταρα C33A, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο σχήμα 1 Β, η βασική έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για τις μεταφορές gemcitabine και το μεταβολισμό που ρυθμίστηκαν σε ακτίνη και σε σχέση με την κανονική τράχηλο, ποικίλει μεταξύ των κυτταρικών σειρών και μια σχέση μεταξύ των επιπέδων αυτών των γονιδίων με την κατάσταση εγγενή ευαισθησία /αντοχή σε gemcitabine σε αυτές τις κυτταρικές σειρές δεν βρέθηκε.

Α. Το IC

50 της γεμσιταβίνης για HeLa, Calo, SiHa και C33A κύτταρα 3.3 μΜ, 0.3 μΜ, & gt? 1.000 μΜ και 0,1 μΜ αντιστοίχως, όπως αξιολογήθηκε με την δοκιμασία κρυσταλλικό ιώδες. B. Η βασική έκφραση του

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

γονίδια όπως αξιολογούνται από RT- PCR. Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ IC

50 και την κατάσταση εγγενούς ευαισθησίας /ανθεκτικότητας. Έκφραση προσαρμόστηκε με την έκφραση σε φυσιολογικό τράχηλο.

Η

Για να διερευνηθεί αν η επαγωγή της γεμσιταβίνης αντίστασης σχετίζεται με αλλαγές στην έκφραση του

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

γονίδια, κύτταρα Calo εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης και αφού τα κύτταρα έγιναν ανθεκτικά που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υδραλαζίνη σε διαφορετικούς χρόνους και συγκεντρώσεις . Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι μετά από πέντε εβδομάδες κύτταρα Calo επίκτητη αντίσταση σε αυτή αντιμεταβολίτη και ήταν σε θέση να αναπτυχθούν σε 927 μΜ της γεμσιταβίνης (συγκέντρωση 280 φορές). Το κράτος αντίσταση συνοδεύτηκε από ρύθμιση προς τα κάτω κατά το ήμισυ του

hENT1

και

dCK

.

RRM1

και

RRM2

γονίδια είχαν μικρές αλλαγές, ενώ

CDA

μειώθηκε επίσης (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, το σχήμα 2C δείχνει ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των

hENT1

και

dCK

γονίδια συνέβη σταδιακά καθώς αναπτύξει αντίσταση. Η επεξεργασία των κυττάρων με CaLoGR υδραλαζίνη σε 2 μΜ για 10 ημέρες, 10 μΜ και 30 μΜ για 5 ημέρες ήταν σε θέση να επανέλθει αντίσταση gemcitabine όπως φαίνεται στο σχήμα 2D. Το αντίστοιχο IC

’50 για αυτές τις θεραπείες ήταν 1,7 μΜ, 2.7 μΜ και 6,6 μΜ, αντίστοιχα.

Α. Μετά την απόκτηση αντίσταση γεμσιταμπίνη, το IC

50 στα κύτταρα CaLoGR ήταν 927 μΜ (συγκέντρωση 280 φορές). Β Έκφραση

hENT1

,

dCK

και

CDA

μειώθηκαν σχεδόν κατά το ήμισυ, RRM1 και RRM2 είχε μικρές αλλαγές. C. Η μείωση του

hENT1

και

dCK

γονίδια συνέβη σταδιακά καθώς αναπτύξει αντίσταση. D. Η επεξεργασία των κυττάρων με CaLoGR υδραλαζίνη σε 2 μΜ για 10 ημέρες, 10 μΜ και 30 μΜ για 5 ημέρες επανήλθε αντίσταση γεμσιταβίνη. Οι αντίστοιχες IC

’50 για αυτές τις θεραπείες ήταν 1,7 μΜ, 2.7 μΜ και 6,6 μΜ, αντίστοιχα.

Η

Για να καθοριστεί αν η αναστροφή της αντίστασης από υδραλαζίνη το οποίο είναι ένα αδύναμο παράγοντα απομεθυλίωσης DNA συνοδεύεται από μεταβολές στην έκφραση του

hENT1

και

dCK

γονίδια, μια RT-PCR αυτών των δύο γονιδίων διεξήχθη. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3Α δείχνει ότι όπως αναμένεται υδραλαζίνη οδήγησε στην εκ νέου έκφραση αυτών των γονιδίων στις τρεις συνθήκες θεραπείας αξιολογούνται. υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA έχει δειχθεί να σιγήσει γονιδίων σε μοντέλα χημειοθεραπεία αντίσταση ως εκ τούτου η κατάσταση μεθυλίωσης σε αυτούς τους προαγωγούς αξιολογήθηκε με MSP. Είναι ενδιαφέρον,

hENT1

και

dCK

υποστηρικτές μερικώς μεθυλιωμένη ακόμα και στην βασική κατάσταση και δεν έδειξε υπερμεθυλίωση στην ανθεκτική κυτταρική γραμμή CaLoGR. Hydralazine στα 2 μΜ, 10 μΜ ή 30 μΜ απέτυχε να απομεθυλίωση Αυτοί οι υποκινητές, όπως φαίνεται από MSP στο σχήμα 3Β. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το εύρημα, έξι ανεξάρτητους κλώνους (βασική, ανθεκτικό και ανθεκτικό σε επεξεργασία με υδραλαζίνη) ήταν όξινο θειώδες αλληλουχία αλλά όχι απομεθυλίωση παρατηρήθηκε στο CpG αξιολογήθηκαν (Σχ. 3C). Ως εκ τούτου, το γονίδιο επανενεργοποίηση ήταν ανεξάρτητη από απομεθυλιωτικής αποτέλεσμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι άλλες επιγενετικών μηχανισμών θα μπορούσε να εξηγήσει προς τα κάτω ρύθμιση και την επανενεργοποίηση αυτών των γονιδίων σε αυτό το μοντέλο. Για να επιβεβαιώσετε ότι η έλλειψη απομεθυλιωτικής επίδραση της υδραλαζίνης κατόπιν

dCK

και

hENT1

δεν ήταν λόγω της χαμηλής ικανότητας απομεθυλιωτικής του, το σχήμα 3D δείχνει ότι στην ίδια γραμμή κυττάρων και των συνθηκών, το γονίδιο

DAPK

διμεθυλιοποιήθηκε με υδραλαζίνη σε 2 μΜ 10 μΜ και 30 μΜ.

Α. Hydralazine στις τρεις συνθήκες που δοκιμάστηκαν (2 μΜ για 10 ημέρες, 10 μΜ και 30 μΜ για 5 ημέρες) αποκατέστησε την έκφραση αυτών των γονιδίων. Β

hENT1

,

dCK

γονίδια, εν μέρει μετουσιωμένο basally και μεθυλίωση υποστηρικτής δεν άλλαξε στα ανθεκτικά κύτταρα ούτε μετά υδραλαζίνη θεραπεία όπως αξιολογήθηκε από MSP. Γ Χάρτες των υποκινητών σε αυτά τα γονίδια που δείχνει το νησίδες CpG πυκνότητα και διανομής, καθώς και τις θέσεις των εκκινητών για ΘΧΣ, chip και αλληλουχίας. Είναι, επίσης, εμφανίζεται με αλληλούχιση ότι η μεθυλίωση CpG δεν άλλαξε στο

dCK

και

hENT1

γονίδια ούτε στα ανθεκτικά κύτταρα ούτε όταν λαμβάνουν θεραπεία με υδραλαζίνη. Άδειο και γεμάτο κύκλοι αντιπροσωπεύουν απομεθυλιωθεί και μεθυλιωμένα CpGs σε πέντε ανεξάρτητες sequencences. Δ Hydralazine ήταν σε θέση να απομεθυλίωση το

DAPK

υποστηρικτής στην κυτταρική σειρά Calo.

Η

Μια αύξηση της δραστηριότητας της αποακετυλάσης ιστόνης έχει αποδειχθεί ότι επάγει γονιδιακή σίγηση σε ορισμένα μοντέλα. Για να καθοριστεί εάν αυτό το φαινόμενο συμμετέχει στην αντίσταση gemcitabine σε καρκίνο του τραχήλου, η δραστικότητα αποακετυλάσης μετρήθηκε σε κύτταρα Calo χρησιμοποιώντας ένα κιτ το οποίο περιέχει το πρωτότυπο HDAC αναστολέα τριχοστατίνη Α ως θετικός έλεγχος. Το Σχήμα 4Α δείχνει ότι δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στη δραστηριότητα HDAC? πράγματι μια μικρή μείωση στην δραστικότητα αποακετυλάσης παρατηρήθηκε στα ανθεκτικά κύτταρα. Η αξιολόγηση της συνολικής ακετυλίωση σε Η3 και Η4 στο

hENT1

και

dCK

γονίδιο υποστηρικτές από δοκιμασίες ChIP ενώ παρουσίασαν μείωση της Η3 και Η4 ακετυλίωση στο

hENT1

υποστηρικτής , μια ήπια αύξηση στην ακετυλίωση των Η3 παρατηρήθηκε στο

dCK

υποκινητή και καμία αλλαγή για Η4 ακετυλίωση (Εικόνα 4Β). Αυτά τα φαινομενικά αντίθετα αποτελέσματα υποστηρίζουν κατά ένα σημαντικό ρόλο των Η3 και Η4 ακετυλίωση για να εξηγήσει την αποσιώπηση αυτών των γονιδίων από αυτή την τροποποίηση των ιστονών. Περαιτέρω, η θεραπεία βαλπροϊκό οξύ σε 1 mM για 5 ημέρες απέτυχε να επανενεργοποιήσει την έκφραση αυτών των γονιδίων και για την αντιστροφή αντίστασης γεμσιταβίνη (δεν φαίνεται).

A. Η συνολική δραστικότητα αποακετυλάσης ιστόνης δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές μεταξύ βασικών και ανθεκτικά κύτταρα, στην πραγματικότητα μια μικρή μείωση παρατηρήθηκε στα ανθεκτικά κύτταρα όπως εκτιμήθηκε με ένα κιτ HDAC δραστικότητα. B. Σύνολο ακετυλίωση των Η3 και Η4, όπως αξιολογήθηκε από ChIP έδειξαν μείωση του Η3 και Η4 ακετυλίωση κατά τη

hENT1

υποκινητή, μια ήπια αύξηση στην ακετυλίωση των Η3 και δεν αλλάζουν σε Η4 σε

dCK

υποκινητή.

η

Για να αποκτήσει περαιτέρω γνώση των επιγενετικών μηχανισμών του

hENT1

και

dCK

αποσιώπηση σε αυτό το μοντέλο της αντίστασης γεμσιταμπίνη, ιστόνης μεθυλίωση αναλύθηκε. Η μεθυλίωση του H3K9 είναι μία γνωστή κατασταλτική σήμα ενώ μεθυλίωσης σε H3K4 δραστηριοποιείται, ως εκ τούτου, η μεθυλίωση σε αυτές τις λυσίνες αξιολογήθηκε με ανάλυση ChIP στην βασική κατάσταση, σε ανθεκτικά κύτταρα και μετά υδραλαζίνη θεραπεία. Το Σχήμα 5 δείχνει ότι για το

hENT1

γονιδίου, δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στην H3K4me3 μεθυλίωση αλλά H3K9me2 ελαφρώς αυξημένες στα ανθεκτικά κύτταρα και μειώνεται μετά υδραλαζίνη θεραπεία. Όσον αφορά το

dCK

γονίδιο μια μικρή μείωση στην H3K4me3 παρατηρήθηκε στα κύτταρα ανθεκτικά στην οποία δεν έχει τροποποιηθεί από υδραλαζίνη. Παρ ‘όλα αυτά, η μεθυλίωση σε H3K9me2 ελαφρώς αυξημένη σε ανθεκτικά κύτταρα και μειώνεται μετά υδραλαζίνη. Οι αλλαγές στην ένταση της ζώνης ομαλοποιήθηκαν έναντι των αντίστοιχων ένταση εισόδου τους. Ως παράγοντα απομεθυλίωσης DNA 5-αζα-CdR έχει αποδειχθεί ότι μειώνει H3K9me2, χρησιμοποιήσαμε το πρόγραμμα MetaDrug ™ για να αποκαλύψει αν υδραλαζίνη μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της H3K9 μεθυλίωσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, υδραλαζίνη μπορεί να επηρεάσει όχι μόνο μεθυλίωσης του DNA σε κυτοσίνη, αλλά μπορεί επίσης να συμμετέχει στην αρνητική ρύθμιση του H3K9 μεθυλίωσης. Για να επιβεβαιώσετε αυτές τις προβλέψεις της έκφρασης του mRNA της

G9A

αξιολογήθηκε σε κύτταρα Calo με qPCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η έκφραση αυτού του γονιδίου αυξήθηκε στα ανθεκτικά κύτταρα ενώ υδραλαζίνη μειωμένο επίπεδο (σχήμα 7Α) της. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κηλίδα western, G9A πρωτεΐνη αυξήθηκε τα ανθεκτικά κύτταρα και μειώθηκαν μετά υδραλαζίνη αγωγή (Σχήμα 7Β). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η ανασταλτική ικανότητα G9A της υδραλαζίνη, μια μεθυλοτρανσφεράση H3K9

in vitro

δοκιμασία αναστολής έγινε χρησιμοποιώντας το

EpiQuik

™ ιστόνης μεθυλοτρανσφεράσης /Αναστολή Assay Kit (Η3-Κ9). Hydralazine σε 2 μΜ και 10 μΜ έντονα μειωμένη μεθυλίωση H3K9 (σχήμα 7C). Για να επιβεβαιωθεί η βιολογική σημασία αυτής της in vitro εύρημα, νοκ-άουτ του γονιδίου G9A μέσω μιας δοκιμασίας iRNA έδειξαν ότι επιμολυσμένα κύτταρα Calo επανέκτησε ευαισθησία στην υδραλαζίνη οποία δεν έχει τροποποιηθεί περαιτέρω όταν τα κύτταρα αυτά επίσης υποβλήθηκαν σε αγωγή με υδραλαζίνη (Εικ. 8).

Για

hENT1

γονιδίου, δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στην H3K4m3 μεθυλίωση αλλά H3K9me2 ελαφρώς αυξημένες στα ανθεκτικά κύτταρα και μειώνεται μετά υδραλαζίνη θεραπεία. Σε

dCK

γονίδιο υπήρξε μια μικρή μείωση H3K4me3 στα ανθεκτικά κύτταρα τα οποία δεν τροποποιήθηκε από υδραλαζίνη. Η μεθυλίωση σε H3K9me2 ελαφρώς αυξημένη σε ανθεκτικά κύτταρα και μειώνεται μετά υδραλαζίνη. Οι αλλαγές στην ένταση της ζώνης ομαλοποιήθηκαν ενάντια αντίστοιχες εισόδους τους.

Η

MetaDrug ™ πρόγραμμα προέβλεψε ότι υδραλαζίνη μπορεί να επηρεάσει όχι μόνο μεθυλίωσης του DNA σε κυτοσίνη, αλλά μπορούν επίσης να συμμετέχουν σε αρνητική ρύθμιση των H3K9 μεθυλίωσης.

Α. Ποσοτική RT-PCR του

G9A

δείχνει ότι κύτταρα ανθεκτικά CaLoGR είχαν μια αύξηση σε σχέση με τη βασική και ότι μειώνει την έκφραση υδραλαζίνη (βασική vs ανθεκτικά, ρ & lt? 0,05) του. B. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, υπήρξε μια αύξηση στην G9A στα ανθεκτικά κύτταρα που μειώθηκαν μετά υδραλαζίνη θεραπεία. Γ H3K9 μεθυλοτρανσφεράση

in vitro

δοκιμασία αναστολής. Hydralazine σε 2 μΜ και 10 μΜ έντονα μειωμένη μεθυλίωση H3K9 (χωρίς θεραπεία vs υδραλαζίνη, σ & lt? 0,05)

Η

Α.. Ανασταλτική συγκέντρωση της γεμσιταβίνης στα κύτταρα Calo δεν επιτεύχθηκε. B. Η εξάντληση των G9A αποκατασταθεί ευαισθησίας γεμσιταβίνη (IC

50 10,3 μΜ). Γ Καμία περαιτέρω αλλαγές στο IC

50 παρατηρήθηκαν όταν υδραλαζίνη προστέθηκε στα G9A εξαντληθεί κύτταρα. Δ qPCR της G9A επιβεβαιώνοντας τη μερική εξάντληση των

G9A

αγγελιοφόρος.

Η

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής της αντίστασης γεμσιταβίνης σε τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα και αναστροφή της με το ασθενές παράγοντα απομεθυλίωσης DNA υδραλαζίνη δείχνουν ότι η ανάπτυξη ανθεκτικότητας συνοδεύεται από τα κάτω ρύθμιση των βασικών γονιδίων για ενδοκυτταρική πρόσληψη gemcitabine και του μεταβολισμού,

hENT1

και

dCK

. Είναι ενδιαφέρον, αυτό ρύθμιση προς τα κάτω δεν οφειλόταν σε υπερμεθυλίωση υποκινητή του γονιδίου όπως αποδεικνύεται από MSP και όξινο θειώδες αλληλούχιση? Παρ ‘όλα αυτά, υδραλαζίνη ήταν σε θέση να ενεργοποιήσετε την έκφρασή τους και να επανέλθει η αντίσταση γεμσιταβίνη. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι άλλοι επιγενετικών μηχανισμών λειτουργούν στη σιωπή γονίδια αντίστασης σε χημειοθεραπεία και ότι υδραλαζίνη έχει μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητες επιδράσεις, πιθανότατα μέσω επηρεάζει αρνητικά τη ρύθμιση των H3K9 μεθυλίωσης όπως προβλέπεται από το πρόγραμμα METADRUG ™.

Αυτά τα ευρήματα είναι σημαντικό να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις πάνω στους μηχανισμούς αντίστασης φάρμακο χημειοθεραπείας. Απενεργοποίηση του γονιδίου με μεθυλίωση του DNA ήταν το πρώτο επιγενετικό μηχανισμό που φαίνεται να εμπλέκεται άμεσα στην απόκτηση αντίστασης σε χημειοθεραπεία στο

in vitro

μοντέλα [31], [32] Ωστόσο, η γνώση σχετικά με επιγενετικές διεργασίες έχει εξελιχθεί, η συμμετοχή άλλων επιγενετικών παραγόντων, όπως αποακετυλασών ιστόνης τόσο ψευδάργυρο και εξαρτώμενη από NAD, καθώς και μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης, demethylases ιστόνης και microRNAs στη διαδικασία αδρανοποίησης των γονιδίων που εμπλέκονται στην ευαισθησία σε χημειοθεραπεία και αντίσταση έχει αποκαλυφθεί [33] – [38]. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι σε αυτό το μοντέλο της αντίστασης γκεμσιταμπίνης στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, η μεθυλίωση σε H3K9 θα μπορούσε να είναι ο κύριος μηχανισμός για την αποσιώπηση της έκφρασης του

hENT1

και

dCK

γονίδια που ανοίγει το δρόμο για περαιτέρω δοκιμή της συμμετοχής της εν λόγω τροποποίησης των ιστονών σε άλλα μοντέλα της αντίστασης χημειοθεραπείας. Η σημασία αυτού του ευρήματος αυξήσεις ως αναστολείς της μεθυλτρανσφερασών G9A ιστονών είναι να είναι διαθέσιμα για μελέτη [39].

Οι πρώτες μελέτες έχουν δείξει ότι οι αναστολείς της μεθυλίωσης του DNA που προκαλείται

dCK

εκ νέου έκφραση στο CEM /κυττάρων dCK- [19] και ότι η έλλειψη έκφρασης του γονιδίου αυτού του κλειδιού για την ενεργοποίηση πολλών αναλόγων νουκλεοσιδίου συμπεριλαμβανομένων γεμσιταβίνη συμβαίνει με μεθυλίωση προαγωγού [40] – [43]. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχει άλλο επιγενετικές μηχανισμός για φίμωση αυτό το γονίδιο έχει περιγραφεί σε μοντέλα χημειοθεραπεία αντίσταση. Ομοίως, η έλλειψη έκφρασης ή χαμηλά επίπεδα hENT1 συσχετίζονται έντονα με την αντίσταση σε γεμσιταβίνη και άλλα ανάλογα νουκλεοσιδίου [6], [9], [10], [44]. Αν και αρκετές κωδικοποίησης γονιδίων μεταφορέα μεμβράνης όπως hOAT3 (SLC22A8), την οικογένεια φορέα διαλυμένης ουσίας 5 iodidetransporter (SLC5A8), του μεταφορέα ανηγμένου φολικού (RFC), η κυτταρική πρωτεΐνη ρετινόλη πρόσδεσης 1, και το ανθρώπινο Na + /I-συμμεταφορέα είναι γνωστές να ρυθμίζεται κάτω από μεθυλίωσης του DNA και επανενεργοποιηθεί από τους αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης DNA [45] – [49], εδώ δεν ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η μεθυλίωση προαγωγού σε

hENT1

αντιπροσωπεύει παρατηρήθηκε αρνητική ρύθμιση της, ακόμη επανενεργοποίηση του επιτεύχθηκε από υδραλαζίνη μέσω μεθυλίωσης του DNA-ανεξάρτητο μηχανισμό που υποδηλώνει ότι όντως

hENT1

ρυθμίζεται προς τα κάτω από μια επιγενετική επίδραση πιθανότατα μέσω G9A ιστονών μεθυλοτρανσφεράση μεσολάβηση H3K9 μεθυλίωσης.

Παρά το γεγονός ότι και τα δύο γονίδια που περιέχουν CpG νησιά σε υποστηρικτές τους [50], [51] και ότι τουλάχιστον για το

dCK

γονίδιο έχει επανειλημμένα αποδειχθεί ότι υποστηρικτής της μεθυλιώνεται στα ανθεκτικά κύτταρα [19], στο μοντέλο μας δεν υπάρχει καμία συσχέτιση μεταξύ του μεθυλίωση υποστηρικτής σε αυτούς τους προαγωγούς και της έκφρασης. Παρ ‘όλα αυτά, η επίδραση απομεθυλίωσης σε άλλα γονίδια (

DAPK

) αποδείχτηκε, αποκλείοντας ότι υδραλαζίνη έχει καμία επίδραση απομεθυλίωσης. Τα στοιχεία αυτά μας οδήγησαν να ψάξει για άλλα επιγενετικών μηχανισμών που θα μπορούσαν να ευθύνονται για γονιδιακή σίγηση. Δεν συνεπής αλλαγές στην αποακετυλάσης ιστόνης ούτε σε ακετυλίωση ιστονών σε αυτές τις υποκινητές γονίδιο παρατηρήθηκαν αποκλείοντας αυτήν την τροποποίηση ιστονών ως μηχανισμός σίγησης για αυτά τα γονίδια σε αυτό το μοντέλο. Όπως αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA 5-αζα-CdR δεκιταβίνη μπορεί να παρουσιάζουν εναλλακτικούς μηχανισμούς δράσης για μεθυλίωσης του DNA σε σχέση με μεταγραφική επανενεργοποίησης όπως ιστόνη H3K9 απομεθυλίωση στις ρυθμιστικές περιοχές του σιγήσει γονιδίων [52] εκτελέσαμε μια αναζήτηση στο πρόγραμμα METADRUG ™ για πάρετε ενδείξεις σε άλλες πιθανές επιπτώσεις της υδραλαζίνη. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι πράγματι υδραλαζίνη προβλέπεται ότι εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της H3K9 μεθυλίωσης. Αυτό το αποτέλεσμα μας οδήγησε να αναλύσει με ανάλυση ChIP για αλλαγές στο H3K9me2 τόσο σε

dCK

και

hENT1

υποστηρικτές στα κύτταρα CaLoGR. Τόσο οι φορείς υλοποίησης που περιέχονται H3K9me2 στα μη επεξεργασμένα κύτταρα, αυξήθηκε ελαφρώς στο ανθεκτικά κατάσταση, και αυτό το σήμα σίγηση εν μέρει απαλλαγεί από υδραλαζίνη. Πρέπει, ωστόσο, να τονίσω ότι αυτές οι αλλαγές αν και σε H3K9m2 αν και συνεπής σε τρεις διαφορετικές αναλύσεις, ήταν ήπιες οποία μπορεί να εξηγηθεί με βάση το ότι τουλάχιστον οκτώ μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης συμπεριλαμβανομένης G9A έχουν επίσης H3K9 ως στόχο μεθυλίωση τους [52].

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η διαπίστωση, μια ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι η έκφραση του G9A αυξήθηκε στα ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με τα ευαίσθητα κύτταρα και τα επίπεδα ελαττώθηκε μετά τη θεραπεία με υδραλαζίνη. Παρ ‘όλα αυτά, μια δραματική μείωση στο επίπεδο πρωτεΐνης αυτής της ιστόνης μεθυλτρανσφεράσης παρατηρήθηκε με κηλίδα western στα ανθεκτικά κύτταρα μετά την επεξεργασία υδραλαζίνη. Αξιοσημείωτη, αυτά τα αποτελέσματα είναι πολύ παρόμοια με εκείνα που βρέθηκαν με 5-αζα-CdR σε ένα μοντέλο καρκίνου του μαστού του MASPIN επανέκφραση όπου μειώσεις στα επίπεδα πρωτεΐνης μεθυλοτρανσφεράσης G9A ιστόνης δεν οφείλονται σε επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση G9A [53]. Πρόσθετη υποστήριξη για αυτή την επίδραση της υδραλαζίνης ελήφθη με έναν in vitro προσδιορισμό του H3K9 μεθυλίωσης που δείχνουν ότι η υδραλαζίνη αναστέλλει τη δράση αυτού του ιστόνης μεθυλτρανσφεράσης. Η βιολογική σημασία αυτών των παρατηρήσεων αποδείχθηκε δείχνοντας ότι καταστρέφουν G9A στα ανθεκτικά κύτταρα Calo οδήγησε να ανακτήσει την ευαισθησία σε gemcitabine από αυτά τα κύτταρα και ότι υψηλότερη ευαισθησία σε γεμσιταβίνη δεν επιτεύχθηκε προσθέτοντας υδραλαζίνη στα G9A εξαντλημένο κύτταρα υποστηρίζοντας κατά ένα

εκτός στόχου

επίδραση της υδραλαζίνης.

Αξίζει να σημειωθεί ότι το πρόγραμμα METADRUG ™ ανέφερε επίσης ότι υδραλαζίνη θα μπορούσε να δράσει θετικά στη ρύθμιση της H3K4 μεθυλίωσης που δεν παρατηρήθηκε στη μελέτη μας, όμως, πρόσφατα στοιχεία από μας ομάδα δείχνουν ότι σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές θεραπεία με υδραλαζίνη και βαλπροϊκό οξύ οδήγησε σε υπερ-έκφραση του MIC Α και MIC Β συνδετήρες που συνοδεύτηκε από αύξηση της H3K4 μεθυλίωσης σε αυτούς τους προαγωγούς γονιδίων που υποδηλώνει ότι η υδραλαζίνη θα μπορούσε να έχει αυτή την επίδραση πάνω σε αυτό το σήμα ιστόνης [54].

είτε εγγενή ή επίκτητη αντοχή φαρμάκου είναι ένα σύνθετο και πλειοτροπικές φαινόμενο και άλλους πιθανούς παράγοντες που συμμετέχουν στην αντίσταση gemcitabine σε αυτό το μοντέλο δεν διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Για τις περιπτώσεις, παρά

RRM1

και

RRM2

υπερέκφραση έχει σχέση με την αντίσταση φαρμάκου παρατηρήθηκε [55] δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές σε αυτά τα γονίδια σε αυτή τη μελέτη. Παραδόξως, το γονίδιο CD ήταν κάτω ρυθμίζονται στα ανθεκτικά κύτταρα, παρά την υπερέκφραση του έχει επανειλημμένα αποδειχθεί σχετίζονται με την αντίσταση στην γεμσιταμπίνη και άλλα ανάλογα νουκλεοσιδίου [56]. Η διαπίστωση αυτή υπογραμμίζει περαιτέρω την πολυπλοκότητα της ανθεκτικότητας στα φάρμακα που φαίνεται να είναι γονιδιακή και κυτταρική συγκεκριμένα μοντέλα.

Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης είναι πιθανή κλινική σημασία, τουλάχιστον για το συγκεκριμένο μοντέλο της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Γεμσιταβίνη χρησιμοποιείται συχνά για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, είτε ταυτόχρονη σε ακτινοβολία ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη για προχωρημένα στάδια [3]. Η επίκτητη αντίσταση σε αυτό το φάρμακο μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αποτυχία της θεραπείας? ως εκ τούτου, μπορεί να αποτρέψει υδραλαζίνη αντίσταση και ενδεχομένως να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της gemcitabine. Επιπλέον, η αποκάλυψη ότι H3K9 μεθυλίωση μπορεί να οδηγήσει σε αντίσταση χημειοθεραπεία αξίζει δοκιμή του σε άλλες πειραματικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι τραχήλου καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa , SiHa και C33A ελήφθησαν από την ATCC. Η κυτταρική σειρά Calo ήταν μια ευγενική δωρεά του Δρ Monroy-Γκαρσία [57]. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% C0

2 σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Grand Island, ΝΥ).

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες μικροτίτλου Falcon 6-πηγαδιών (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) σε 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 0.2 ml πλήρους μέσου και στη συνέχεια κατεργάζεται για 24 ώρες με γεμσιταβίνη σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1 × 10

-8 Μ έως 1 χ 10

-4 Μ Στη συνέχεια, το μέσο που περιείχε gemcitabine απομακρύνθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο. Μετά από 72 ώρες το μέσο αναρροφάται και αντικαθίσταται για 10 λεπτά με 50 μι 0,75% κρυσταλλικό ιώδες σε 50% αιθανόλη, 0,25% NaCl, και διάλυμα φορμαλδεΰδης 1,75%. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με νερό, ξηραίνονται στον αέρα, και η χρωστική εκλούεται με διάλυμα PBS + 1% θειικό duodecyl νάτριο (SDS). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από την απορρόφηση βαφής μετρήθηκε στα 570 nm σε αυτοματοποιημένο αναγνώστη ELISA. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η κυτταροτοξική δράση της κάθε θεραπείας εκφράστηκε ως ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (ποσοστό ελέγχου) και ορίζεται ως [Α

570 κατεργάζεται nm κύτταρα /A

570 nm μη-κατεργασμένα κύτταρα] χ 100.

επαγωγή αντίστασης γεμσιταβίνης και υδραλαζίνη θεραπεία

κυτταρική γραμμή Calo καλλιεργήθηκε στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% C0

2 σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Grand Island, Νέα Υόρκη). Αυξανόμενες δόσεις γεμσιταμπίνη (IC

30, IC

50, IC

80 και, τέλος, δύο βήματα σε IC

90 προστέθηκαν εβδομαδιαίες να προκαλέσει αντίσταση γεμσιταβίνη. Μετά την προσθήκη IC

90 φορές, η κυτταροτοξική δοκιμασία επαναλήφθηκε για να επιβεβαιωθεί αντίσταση γεμσιταβίνης.

γεμσιταβίνη επαγόμενη ανθεκτικών κυττάρων Calo (CaLoGR), καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% C0

2 σε DMEM συμπληρωμένο με εμβρυϊκό ορό 10% ορού (Gibco, Grand Island, ΝΥ). στη συνέχεια, η υδραλαζίνη προστέθηκε στα 10 μΜ και 30 μΜ για 5 ημέρες και 2 μΜ για 10 ημέρες. το μέσο που περιέχει το φάρμακο ανανεώνονται καθημερινά.

RT-PCR

RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές με πρότυπες μεθόδους. Εν συνεχεία 5 μα RNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DNAse. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNA PCR Πυρήνας Gene Amp

R (Applied Biosystems Roche) σύμφωνα με τις συστάσεις παροχέα .

GAPDH

,

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

γονίδια ήταν ενισχύθηκε με τη χρήση των ακόλουθων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών:

GAPDH

: S: 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 ‘, AS: 5′-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’

hENT1

: S: 5’GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 ‘ , AS: 5’CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 ‘

dCK

: S: 5′-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3′, AS: 5’GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 ‘,

RRM1

: S: 5′-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 ‘, AS: 5′-CAGGATCCACACATCAGACA-3′, RRM2: S: 5’-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 ‘, AS: 5′-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3’,

CDA

: S: 5 ‘GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 ‘, AS: 5′-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3’. Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 25 μΐ που περιέχει cDNA, 20 pmol εκκινητών, 200 μΜ dNTPs, 0.25 U Taq πολυμεράση, και 1 χ ρυθμιστικό που παρέχεται από τον κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCRs ξεκίνησαν με ένα στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους στους 94 ° C για 35 sec, 59 ° C για 35 sec, και 72 ° C για 45 δευτερόλεπτα? μια τελική επέκταση πραγματοποιήθηκε στους 72 ° C για 7 λεπτά. Τα προϊόντα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 2%.

G9A

έκφραση γονιδίων εκτιμήθηκε με ποσοτική RT-PCR (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA), χρησιμοποιώντας SYBR Green Ι βαφής (Bio-Rad, Hercules, CA), χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές:

G9A

? Sense 5′-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 ‘και ο αντινοηματικός 5′-GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3’.

GUSB

(ανθρώπινη βήτα γλυκουρονιδάση) ειδικούς εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν ως ενδογενή έλεγχο? νόημα 5′-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 ‘και 5′-αντινόημα AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3’. Το PCR μετά από επώαση στους 95 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από κύκλους PCR 35 δευτερόλεπτα, στους 94 ° C, 35 sec, στους 59 ° C, 50 sec, στους 72 ° C, με μία τελική επέκταση στους 72 ° C για 7 λεπτά. Ο αριθμός των κύκλων της PCR προσδιορίστηκε πειραματικά. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση της μεθόδου 2-ΔΔCT και αναφέρεται ως η πολλαπλή μεταβολή στην έκφραση γονιδίου κανονικοποιήθηκε προς το ενδογενές γονίδιο ελέγχου (

GUSB

) και σε σχέση με κύτταρα χωρίς θεραπεία.

προσδιορισμό επιμόλυνσης iRNA

γεμσιταβίνη αποκτήθηκαν ανθεκτικά κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) σε 1.5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε 0.2 ml OptiMEM και μετά από 24 ώρες διαμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη και

G9A

siRNA (Ambrion cat # 439242). Αρνητικός έλεγχος έγινε με λιποφεκταμίνη RANiMAX περιέχουν siRNA Scramble (Ambrion, cat # 4390844). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% C0

2.