Αφηρημένο

Εξαγορά της αντίστασης πλατίνας μετά την πρώτη γραμμή της πλατίνας /θεραπεία με ταξάνη παρατηρείται συνήθως σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και αποτρέπει την κλινική αποτελεσματικότητα. Υπάρχουν μερικές επιλογές για την πρόληψη της αντίστασης λευκόχρυσου? ωστόσο, έχουν απομεθυλίωση παράγοντες έχουν δειχθεί ότι επαναευαισθητοποιήσουν ασθενείς σε θεραπεία με πλατίνα καταδεικνύοντας έτσι ότι το DNA μεθυλίωση είναι ένα κρίσιμο συνεισφέρει στην ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας. Αναφέραμε προηγουμένως το υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα νέο ρυθμιστής της μεθυλτρανσφεράσης DNA (DNMT) δραστηριότητα και μεθυλίωσης DNA. Άλλοι έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του EGFR σχετίζεται με σισπλατίνη θεραπεία και αντίστασης πλατίνας. Υποθέσαμε ότι επάγεται σισπλατίνη ενεργοποίηση του EGFR διαμεσολαβεί αλλαγές στο DNA μεθυλίωση που συνδέονται με την ανάπτυξη ανθεκτικότητας πλατίνας. Για να διερευνήσουν αυτή, αξιολογήσαμε σηματοδότηση EGFR και δραστηριότητα DNMT μετά από οξεία έκθεση σισπλατίνη. Έχουμε αναπτύξει επίσης ένα

in vitro

μοντέλο της αντίστασης πλατίνας για να εξετάσει τα αποτελέσματα της αναστολής EGFR την εξαγορά της αντίστασης σισπλατίνη. Οξεία θεραπεία με σισπλατίνη ενεργοποιεί τον EGFR και οδών κατάντη σηματοδότησης, και προκαλεί τη μεσολάβηση αύξηση EGFR σε δραστηριότητα DNMT. ανθεκτικά σισπλατίνη κύτταρα παρουσίασαν επίσης αυξημένη δραστηριότητα DNMT και την παγκόσμια μεθυλίωσης. η αναστολή του EGFR διάρκεια επαναλαμβανόμενες θεραπείες σισπλατίνη δημιουργούνται κύτταρα τα οποία ήταν πιο ευαίσθητα στη σισπλατίνη και δεν ανέπτυξαν αυξήσεις στη μεθυλίωση του DNA ή δραστηριότητα DNMT σύγκριση με τους ελέγχους. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση του EGFR τη διάρκεια της θεραπείας πλατίνα συμβάλλει στην ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας. Επιπλέον, η αναστολή του EGFR μπορεί να είναι μια αποτελεσματική στρατηγική σε εξασθένηση της ανάπτυξης της αντίστασης πλατίνας ενισχύοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Granados ML, Hudson LG, Samudio-Ruiz SL (2015) Συνεισφορές των ο υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα από την απόκτηση του Platinum Αντίστασης ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 10 (9): e0136893. doi: 10.1371 /journal.pone.0136893

Εκδότης: J. Christopher Πολιτείες, το Πανεπιστήμιο του Louisville, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 10 Απρ 2015? Αποδεκτές: 9 Αυγούστου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 9η Σεπτεμβρίου 2015

Copyright: © 2015 Granados et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η έρευνα που αναφέρθηκαν σε αυτή τη δημοσίευση υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας στο πλαίσιο Βραβείο Αριθμός K01CA172591. Το περιεχόμενο είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες [1]. Προχωρημένη νόσο, στάδιο διάγνωση αργά, περιτοναϊκή μετάσταση και συχνή ανάπτυξη χημειοαντίσταση εμποδίζουν βελτιώσεις στο συνολικό ποσοστό επιβίωσης το οποίο παραμένει χαμηλό σε περίπου 44% [1]. Θεραπεία πρώτης γραμμής για τον καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνει χειρουργική debulking και πλατίνα (σισπλατίνη ή η καρβοπλατίνη) -taxane (paclitaxel) χημειοθεραπεία [2]. Όπως πολλοί ως το 70-80% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών θα αναπτύξει αντίσταση από λευκόχρυσο μετά από θεραπεία πρώτης γραμμής και οι περισσότεροι από αυτούς τους ασθενείς τελικά υποκύπτουν σε χημειοθεραπεία νόσο [3-5]. Έτσι, με αντίσταση από λευκόχρυσο συνεχίζει να είναι ένα σημαντικό κλινικό πρόκληση. Μέχρι σήμερα, υπάρχουν περιορισμένες παρεμβάσεις για την αποτροπή ή την αντιστροφή αντίστασης λευκόχρυσου? Ωστόσο, υπήρξαν κάποιες πρόοδοι στη χρήση των παραγόντων απομεθυλίωσης στο επαναευαισθητοποίηση των ασθενών σε θεραπεία με βάση πλατίνα [6-10]. Συγκεκριμένα, Matei και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι οι ανθεκτικές πλατίνα ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με απομεθυλιωτικής παράγοντα χαμηλή δόση που προκαλείται απομεθυλίωση των γονιδίων εντός των κυττάρων του όγκου και συσχετίζεται θετικά με την επιβίωση χωρίς εξέλιξη [7]. Αυτό τονίζει μεθυλίωσης του DNA ως μια κρίσιμη συμβολή για την απόκτηση ανθεκτικότητας στα φάρμακα για τον καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν μεθυλίωση του DNA και την απόκτηση της αντίστασης πλατίνας μετά από σισπλατίνη θεραπεία δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Αναφέραμε προηγουμένως ότι ο υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ρυθμίζει του μεθυλτρανσφερασών DNA (DNMT) και μεθυλίωσης του DNA [11]. Ως εκ τούτου, ο EGFR μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας.

Ο EGFR είναι μία κινάση τυροσίνης υποδοχέα που υπερεκφράζεται σε 30-98% του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών [4,5] και υπερέκφραση του EGFR (και του συνδέτες) σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών συσχετίζονται με φτωχή πρόγνωση [12]. Η ενεργοποίηση του EGFR σε όγκους των ωοθηκών συνδέεται με αυξημένη κακοήθεια και την κακή έκβαση των ασθενών [13,14]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του EGFR έχει δειχθεί σε ~ 30% των όγκων των ωοθηκών [15]. Ο EGFR είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση πολλών ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων των Ras /Raf /MAPK, Jak /Stat και AKT /PI3K και ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διαδικασίες όπως η κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση (βλέπε [14] για ανασκόπηση). Επιπλέον, η ενεργοποίηση του EGFR συμβαίνει σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη [16-19] και υπερενεργοποίηση του υποδοχέα, και κατάντη μονοπατιών σηματοδότησης του, εμπλέκεται στην αντίσταση λευκοχρύσου [20,21]. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του EGFR σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών αυξάνει τη δραστικότητα DNMT και πάνω από μακροχρόνια ενεργοποίηση EGFR μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη μεθυλίωση του DNA [11], καθώς και μειωμένη ευαισθησία στη σισπλατίνη [22].

Platinum ή σισπλατίνη αντίσταση συσχετίζεται με αυξημένη μεθυλίωση του DNA και επακόλουθη αποσιώπηση γονιδίων που εμπλέκονται στην κατάλληλη απόκριση του φαρμάκου [23-28]. Ανάλυση έκφρασης γονιδίων του πλατίνα ευαίσθητων έναντι ανθεκτικών πλατίνα δείγματα ασθενών έδειξε ότι τα διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια είναι πιο πιθανό να υποεκφράζεται σε ανθεκτικά σε σύγκριση με τα ευαίσθητα όγκους [29]. Στο σύνολό τους, υποθέσαμε ότι η επαγόμενη σισπλατίνης ενεργοποίηση του EGFR συμβάλλει στην ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω της ρύθμισης της δραστικότητας DNMT και μεθυλίωσης DNA. Επιπλέον, προτείνουμε ότι μικρού μορίου αναστολείς στο EGFR μπορεί να είναι χρήσιμη στην πρόληψη ή μείωση της απόκτησης της αντίστασης σισπλατίνη. Για να ελεγχθεί η υπόθεση μας, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση του EGFR, μονοπάτια κατάντη σηματοδότησης και δραστικότητα μεθυλοτρανσφεράσης DNA σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών σε απόκριση προς φυσιολογικώς σχετικές δόσεις σισπλατίνης. Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της μικρής αναστολέα μόριο erlotinib σε ένα

in vitro

μοντέλο της αντίστασης πλατίνας. Βρήκαμε ότι η αναστολή του EGFR εξασθενίζει σισπλατίνη που προκαλείται από αυξήσεις στη δραστικότητα DNMT, αποτρέπει αυξημένη μεθυλίωση DNA και μειώνει επίσης την αντίσταση λευκόχρυσου σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Το έργο αυτό αναδεικνύει ένα πιθανό μηχανισμό και προσιτό στόχο να μειωθεί η ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας βασίζονται σε επιγενετικών μηχανισμών.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και επεξεργασίας των ναρκωτικών

Η ωοθηκών κυτταρική γραμμή καρκινώματος OVCA 433 χορηγήθηκε από τον Dr. Robert Bast Jr., MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston ΤΧ [30] και αναπτύχθηκαν σε Ελάχιστο Ουσιώδες Μέσο (MEME) (Gibco, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ( ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Sigma, St. Louis, ΜΟ), 0,5 μονάδες /mL πενικιλίνη-0,5 μg /mL στρεπτομυκίνη (Gibco, Life Technologies) , αναφέρεται αργότερα ως μέσο ανάπτυξης MEME. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό 5% CO2 /95% αέρα. Οξεία 10 μΜ cisplatin (Sigma-Aldrich) θεραπείες έγιναν σε μέσο ανάπτυξης MEME για 0-6 ώρες. η αναστολή του EGFR πραγματοποιήθηκε μέσω προ-επώαση των κυττάρων με 2 μΜ AG1478 (LC Laboratories, Woburn, ΜΑ) για 24 ώρες πριν από τη θεραπεία cisplatin. 10 ηΜ EGF (Biomedical Technologies, Stoughton, ΜΑ) θεραπείες για 15 λεπτά διεξήχθησαν ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση του EGFR.

Cisplatin αντίσταση παράδειγμα

Όπως αρχικά καταδεικνύεται στο [20], αντίσταση σε σισπλατίνη μπορεί να αυξηθεί στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με επαναλαμβανόμενες διαδοχικές κατεργασίες με σισπλατίνη ακολουθούμενη από φάρμακο δωρεάν χρόνους αποκατάστασης. σισπλατίνη παράδειγμα αντίστασή μας διαμορφώθηκε από το [20]. Εν συντομία, OVCA 433 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη για 48 ώρες και στη συνέχεια αφέθηκαν να συνέλθουν για τουλάχιστον 48 ώρες μετά τη θεραπεία φαρμάκου. Κύτταρα ολοκληρώσει τρεις κύκλους κάθε συγκέντρωση σισπλατίνης ακολουθούμενα από τα ναρκωτικά δωρεάν χρόνους αποκατάστασης πριν εκτεθούν στην επόμενη υψηλότερη δόση. Οι δόσεις σισπλατίνης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 3, 6 και 9 μΜ. Κύτταρα ολοκλήρωση αυτού του παραδείγματος ονομάστηκαν Cisplatin ανθεκτικά κύτταρα (CPR). κύτταρα ελέγχου διέλευσης (που δεν υποβάλλονται σε σισπλατίνη θεραπείες) διεξήχθησαν παράλληλα. EGFR ανεστάλη με κατεργασία κυττάρων με 1 μΜ Η erlotinib (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ) για τουλάχιστον 1 ώρα πριν από την φαρμακευτικές αγωγές με σισπλατίνη. Η erlotinib διατηρήθηκε στο μέσο καλλιέργειας για 48 ώρες με θεραπείες σισπλατίνη και στη συνέχεια τα κύτταρα αφέθηκαν να ανακάμψουν από όλες τις θεραπείες φαρμάκου σε μέσο ανάπτυξης MEME διάρκεια χωρίς φάρμακο χρονικά διαστήματα.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής λύσης που περιέχει 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Na

3νο

4, λευπεπτίνη 10 mg /ml, πεπστατίνη Α 10 mg /ml, 1 mM PMSF εντός PBS και 1% SDS . Σύνολο συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με τη χρήση του BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Ίσες ποσότητες των συνολικών κυτταρικών κυτταρολυμάτων (30 μg) ηλεκτροφορήθηκαν μέσω 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε 0,45 μm νιτροκυτταρίνη (Thermo Fisher Scientific) και αποκλείστηκαν με 3% BSA. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-φωσφο-ΕΟΡΚ (Tyr1068) (Cell Signaling) σε 1: 1000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ολική EGFR (Santa Cruz, Dallas, ΤΧ) σε 1: 500, μονοκλωνικά αντι-φωσφο-JAK2 ( Abcam, Cambridge, ΜΑ) σε 1: 1000, μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-σύνολο JAK2 (Cell Signaling) σε 1: 1000, μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-φωσφο ΑΚΤ (Cell Signaling) σε 1: 1000, ποντίκι μονοκλωνικά αντι- σύνολο ΑΚΤ (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) σε 1: 500, μονοκλωνικό ποντικού αντι-φωσφο-STAT3 (ser727) (Cell Signaling) σε 1: 1000, μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού αντι-σύνολο STAT3 (κυτταρική σηματοδότηση) 1: 1000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-φωσφο -ERK1 /2 (Cell Signaling) σε 1: 2000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ολική ERK1 /2 (Cell Signaling) σε 1: 2000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-DNMT1 (New England Bio Labs, Ipswich, ΜΑ) σε 1: 750, πολυκλωνικό κουνελιού αντι-Dnmt3a (Cell Signaling) σε 1: 1000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-DNMT3B (Abcam) στα 1: 1000, πολυκλωνικά κουνελιού αντι-DNMT3L (Abcam) στα 1: 1000, κουνελιού πολυκλωνικό pDNMT1 (Ser714) (Millipore, Billerica , ΜΑ) σε 1: 250 και ένα αντι-GAPDH μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (Millipore) σε 1: 1000, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν στο κατάλληλο δευτερεύον αντίσωμα (Promega, Madison, WI) και οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico ή Femto Χημειοφωταύγειας (Thermo Fisher Scientific). Απεικόνιση των κηλίδων και πυκνομετρία επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας το σταθμό του Kodak Image 440 και το σχετικό λογισμικό (ΝΕΝ Life Science Products, Boston, MA).

μονόφυλλο και Πολυκύτταροι Aggregate (MCA) καλλιέργεια κυττάρων

Cells απλώθηκαν σε 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας (καλλιέργεια μονοστιβάδας) και 96 πηγαδιών πλάκες Lipidure U πυθμένα (NOF America Corporation, White Plains, ΝΥ) (MCA καλλιέργεια). Κύτταρα αυξήθηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C υπό 5% CO2 /95% αέρα. λήφθηκαν χρησιμοποιώντας Ολύμπου IX70 εξοπλισμένη με ψηφιακή κάμερα και απεικόνισης λογισμικού DP72 εικόνες.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μονοστρωματική καλλιέργεια και ως ΝΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις σισπλατίνης [0-300 μΜ] για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας PrestoBlue (Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μΐ αντιδραστηρίου PrestoBlue προστέθηκαν ανά 100 μΙ μέσου και επωάστηκαν για 1 ώρα (μονοστρωματική) ή 24 ώρες (ΝΕΠ). Μετά τους αντίστοιχους χρόνους επώασης, κορυφή ανάγνωση φθορισμού (RFUs? Διέγερση 555 nm & amp? Εκπομπή 585 nm) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός SpectraMax Μ2 και SoftMax λογισμικό Pro έκδοση V5.4 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Υπολογισμοί του IC

50 τιμές για δοκιμασίες βιωσιμότητας κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA).

δοκιμασία δραστικότητας DNMT

Πυρηνικά εκχυλίσματα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το EpiQuik Nuclear Extraction Kit (Epigentek, Farmingdale, ΝΥ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης για πυρηνικά εκχυλίσματα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την BCA κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (Thermo Fisher Scientific). Η συνολική δραστικότητα DNMT προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας 20 μg ολικής πρωτεΐνης και ο EpiQuik DNA μεθυλοτρανσφεράσης (DNMT) Δραστηριότητα /Δοκιμασία Αναστολής Kit (Epigentek), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Κάθε πλάκα αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας στα 450 nm. Η ποσότητα του μεθυλιωμένου DNA υποστρώματος ανιχνεύεται από το κιτ είναι ανάλογη με την ενζυματική δραστηριότητα DNMT σε δείγματα μας. δραστηριότητα DNMT υπολογίζεται από την ακόλουθη εξίσωση: Δείγμα τιμές ομαλοποιήθηκαν σε τιμές που λαμβάνονται για τον έλεγχο, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα 433 OVCA εντός του ιδίου πειράματος και εκφράζεται σε σχέση με ένα

Παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA ποσοτικοποίηση

DNA. απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας την DNeasy αίματος και Kit ιστών σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Qiagen, Valencia, CA). Παγκόσμια μεθυλίωσης DNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας 250 ng του DNA και του MethylFlash μεθυλιωμένο ϋΝΑ Ποσοτικοποίηση Kit (Epigentek) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ποσότητα της 5-μεθυλοκυτοσίνη μέσα σε κάθε δείγμα προσδιορίζεται από μία χρωματομετρική ανίχνευση η οποία ανιχνεύεται με αναγνώστη μικροπλάκας σε 450 nm. Η ποσοτικοποίηση της μεθυλίωσης του DNA υπολογίζεται με την ακόλουθη εξίσωση:. Δείγμα τιμές ομαλοποιήθηκαν σε τιμές που λαμβάνονται για τον έλεγχο, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα 433 OVCA εντός του ιδίου πειράματος και εκφράζεται ως ποσοστιαία αύξηση από 100% (έλεγχος)

Graphing και στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα αξιολογήθηκαν εις διπλούν έναντι μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου διόδου και συλλέγονται από τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράματα, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA) με τη χρήση μονόδρομης ANOVA ή αμφίδρομη ΑΝΟνΑ και κατά Tukey, post hoc ανάλυση Dunnet ή διόρθωση Bonferroni όπου ενδείκνυται. Πρότυπο αταίριαστα t-test χρησιμοποιήθηκε επίσης κατά περίπτωση.

Αποτελέσματα

Η οξεία θεραπεία με σισπλατίνη ξεκινά EGFR σηματοδότησης

Πολλά

in vitro

μελέτες μέχρι σήμερα έχουν χρησιμοποιηθεί υψηλής δόσεις σισπλατίνης (50-100 μΜ) για να αποδείξει αυξημένη ενεργοποίηση του EGFR επί σύντομους χρόνους θεραπείας [16-19]. Ωστόσο, μελέτες που εξετάζουν τη φαρμακοκινητική σε ασθενείς που λαμβάνουν 75-120 mg /m

2 σισπλατίνης έδειξε μέγιστα επίπεδα στο πλάσμα μεταξύ 0,2 έως 14 μΜ [31,32], υποδηλώνοντας έτσι ότι

in vitro

μελέτες 50-100 μΜ δεν μπορεί να είναι κλινικά σημαντική. Εδώ, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία cisplatin σε ένα πιο φυσιολογικώς σχετικό δόσης (10 μΜ) ενεργοποιεί τον EGFR. Σημαντικές αυξήσεις στη φωσφορυλίωση του EGFR (pEGFR) παρατηρήθηκαν στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (OVCA 433) μετά από 30 λεπτά (0,5 ώρες), 1 ώρα και 2 ώρες θεραπεία με 10 μΜ cisplatin χωρίς αλλαγές στο σύνολο EGFR (Εικόνα 1Α και 1Β). Τα δεδομένα εκφράστηκαν επίσης ως μία αναλογία του ενεργοποιημένου EGFR σε σύνολο EGFR (Εικόνα 1 C) και βρέθηκε να αυξηθεί σημαντικά στις 2 ώρες μετά τη θεραπεία cisplatin. Ειδική αναστολή της δραστηριότητας της κινάσης τυροσίνης του EGFR επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας AG1478 να καθοριστεί ο ρόλος του EGFR σε επαγόμενη σισπλατίνη ενεργοποίηση μονοπατιών κατάντη σηματοδότησης. Όπως ήταν αναμενόμενο, AG1478 ανέστειλε τόσο τη βασική όσο και η σισπλατίνη που προκαλείται από επίπεδα pEFGR χωρίς σημαντικές αλλαγές στην συνολική έκφραση EGFR (Εικόνα 2Α). Λειτουργική ενεργοποίηση του EGFR μετά σισπλατίνης θεραπείας εκτιμήθηκε μέσω αξιολόγησης των κατάντη στόχοι υποδοχέα μετά από θεραπεία με σισπλατίνη και AG1478 (Σχήμα 2Β). JAK2 και ενεργοποίηση ΑΚΤ αυξήθηκαν σημαντικά στην 4 h χρονικό σημείο θεραπεία σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους. Σημαντικές αυξήσεις στα ERK1 /2 ή την ενεργοποίηση STAT3 δεν παρατηρήθηκαν κάτω από αυτές τις συνθήκες (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντιστρόφως, η ενεργοποίηση των JAK2 και ΑΚΤ ελαττώθηκε σημαντικά από AG1478 ενώ επίπεδα ολικής πρωτεΐνης παρέμεινε σχετικά αμετάβλητη ανεξάρτητα από τη θεραπεία (Σχήμα 2Β-2D). Έτσι, οξεία, φυσιολογικά σχετικές δόσεις σισπλατίνης ξεκινά σηματοδότησης EGFR και ενεργοποίηση των JAK2 και AKT.

Α) Εκπρόσωπος δυτική κηλίδες ενεργοποιηθεί ή φωσφορυλιωμένη EGFR (pEGFR, tyr1068) σε OVCA 433 κύτταρα χορηγήθηκαν 10 μΜ cisplatin για 0,5 , 1, 2, 4 και 6 ώρες σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. 10 ηΜ EGF δίνεται σε κύτταρα για 15 λεπτά ως θετικός έλεγχος δείχνει την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Σύνολο κηλίδα EGFR και αντιπροσωπευτικές κηλίδες GAPDH επίσης δείξει. Β) Διάγραμμα της ενεργοποίησης EGFR ακόλουθα 10 μΜ θεραπεία σισπλατίνης για 0,5, 1, 2, 4 και 6 ώρες, η = 6. EGF δεδομένων εμφανίζεται ως θετικός έλεγχος. C) Διάγραμμα που δείχνει αναλογία pEGFR προς το σύνολο των EGFR (pEGFR συνολικό δείκτη /EGFR) μετά 10 μΜ θεραπεία σισπλατίνης για 0,5, 1, 2, 4 και 6 ώρες, η = 6. Η μονόδρομη ANOVA των δεδομένων αποκάλυψε μια σημαντική δράση της σισπλατίνης θεραπείας και σημαντικές διαφορές από τον έλεγχο, όπως καθορίζεται από post hoc ανάλυση Dunnet που υποδεικνύονται από * p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

η

Α) Εκπρόσωπος δυτική κηλίδες pEGFR, Σύνολο EGFR και GAPDH του OVCA 433 κυττάρων – /+ 10 μΜ σισπλατίνης για 1 ώρα παρουσία και απουσία του ειδικού αναστολέα EGFR AG1478 (2 μΜ, γιά 24 ώρες προ-επώασης). Β) Εκπρόσωπος δυτική κηλίδες για pJAK2 (tyr1007 /1008), συνολικής JAK2, ρΑΚΤ (Ser473), η συνολική ΑΚΤ και GAPDH. OVCA 433 κύτταρα – /+ 10 μΜ cisplatin για 1-4 ώρες και σε παρουσία AG1478. Τα δεδομένα που δημιουργούνται για τα ακόλουθα γραφήματα αντιπροσωπεύουν τουλάχιστον 4 ανεξάρτητα πειράματα δηλαδή ~ 4 διαφορετική μεταχείριση /ομάδες συλλογής και ~ 4 διαφορετικές ανοσοστυπώματα. C) Λόγος ενεργοποίησης JAK2 (pJAK2 /σύνολο JAK2) δεδομένα που ελήφθησαν μετά από 10 μΜ θεραπεία cisplatin για 1-4 ώρες και υπό την παρουσία AG1478, η = 4-6. Σημαντικές αυξήσεις από δείγματα ελέγχου παρατηρήθηκε σε 4 ώρες θεραπείας σισπλατίνη. AG1478 προ-επώαση για 24 ώρες αμβλύνθηκαν τα βασικά επίπεδα των ενεργοποιημένων JAK2 καθώς και σισπλατίνη που προκαλείται από αυξήσεις στην ενεργοποίηση JAK2 στις 4 ώρες (AG + 4). Δ) Λόγος ενεργοποίησης ΑΚΤ (/συνολικός ΑΚΤ) δεδομένα ρΑΚΤ ελήφθησαν μετά τη θεραπεία cisplatin 10 μΜ για 1-4 ώρες και υπό την παρουσία AG1478, η = 4-7. Σημαντικές αυξήσεις από δείγματα ελέγχου παρατηρήθηκε σε 4 ώρες θεραπείας σισπλατίνη. AG1478 προ-επώαση για 24 ώρες αμβλύνθηκε επάγεται σισπλατίνη αυξήσεις στην ενεργοποίηση ΑΚΤ στις 4 ώρες (AG + 4). Μονόδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική επίδραση της φαρμακευτικής αγωγής και μετά από δοκιμασία post hoc σημαντικές διαφορές Dunnet από τους ελέγχους που υποδεικνύονται με * p & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

In vitro

εξαγορά της αντίστασης σισπλατίνη

για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ενεργοποίησης EGFR στην ανάπτυξη της αντίστασης λευκόχρυσου, σχεδιάσαμε ένα

in vitro

παράδειγμα της αντίστασης πλατίνας βασίζονται σε παλαιότερα δημοσιευμένη εργασία [20] ( Σχήμα 3Α). ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη (CPR) αναπτύχθηκαν υπό προσκολλημένα (μονοστρωματική) συνθήκες παρουσίασαν μορφολογικές αλλαγές σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3Β). Η βιβλιογραφία δείχνει ότι η 3D μοντέλα, όπως πολυκύτταροι αδρανών υλικών (ΝΕΠ), αντανακλούν με μεγαλύτερη ακρίβεια καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vivo

απαντήσεις [33] και μπορεί να είναι σημαντική για την κατανόηση της αντίστασης στα φάρμακα [34]. CPR ΝΕΠ ήταν εμφανώς πιο συμπαγής σε σύγκριση με τον έλεγχο πέρασμα ΝΕΠ (Σχήμα 3Β). Αυτό είναι συνεπές με προηγούμενα ευρήματα μας δείχνουν ότι συμπαγής ΝΕΠ είναι πιο ανθεκτικά σε σισπλατίνη [22]. αναλύσεις βιωσιμότητας μονόφυλλο σισπλατίνη εμφανίζεται ένα & gt? αύξηση 5 φορές σε IC

50 (έλεγχος IC

50 = 12,7 μΜ έναντι CPR IC

50 = 72,9 μΜ) (Σχήμα 3C). Αμφίδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική δράση της σισπλατίνης, σημαντική επίδραση της κυτταρικό τύπο (έλεγχος έναντι CPR) και σημαντική αλληλεπίδραση. αναλύσεις βιωσιμότητας ΝΕΠ έδειξε ότι CPR ΝΕΠ είχε αυξηθεί σε IC

50, σε σύγκριση με ΝΕΠ ελέγχου διέλευσης (ελέγχει MCA IC

50 = 44,0 μΜ έναντι CPR MCA IC

50 = 79,5 μΜ) (Σχήμα 3D) . Και πάλι, αμφίδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική δράση της σισπλατίνης, κυτταρικό τύπο και την αλληλεπίδραση. Έτσι, μας

in vitro

μοντέλο της αντίστασης πλατίνας αποδείχθηκε ότι είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την εξέταση των μοριακών αλλαγών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της αντίστασης σισπλατίνη.

Α) Σχηματική σισπλατίνης αντίστασης παράδειγμα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και μέθοδοι. Β) Εκπρόσωπος 10Χ εικόνες OVCA 433 ελέγχου και ανθεκτικό σισπλατίνη (CPR) κύτταρα ως μονοστιβάδα και ως πολυκύτταρων αδρανών υλικών (MCA). Κλίμακα bar = 100 μm. Γ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου μονοστρωματική (μαύρη γραμμή), IC

50 = 12,7 μΜ, και CPR (γκρι γραμμή) IC

50 = 72,9 μΜ, σε ανταπόκριση στη θεραπεία με σισπλατίνη με δόσεις [5, 10, 20, 50, 100 μΜ] για 48 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, η = 8. Η αμφίδρομη ANOVA έδειξε μια σημαντική συνολική κύριο αποτέλεσμα του κυτταρικού τύπου (έλεγχος vs CPR) [F (1,84) = 88.10, ρ & lt? 0.001], ένα σημαντικό αποτέλεσμα σισπλατίνης έκθεσης [F (5,84) = 61.87, p & lt? 0.001], καθώς και σημαντικής αλληλεπίδρασης [F (5,84) = 4.353, p & lt? 0.01]. Σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα παρατηρήθηκε σε 5, 10, 20, 50, 100 μΜ σισπλατίνης σε κύτταρα ελέγχου, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001. Δ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχου ΝΕΠ (μαύρη γραμμή), IC

50 = 44,0 μΜ, και CPR (γκρι γραμμή), IC

50 = 79,5 μΜ, σε ανταπόκριση στη θεραπεία με σισπλατίνη με δόσεις [5, 10, 20 , 50, 100 μΜ] για 48 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, η = 7. Αμφίδρομη ANOVA έδειξε μια σημαντική συνολική κύριο αποτέλεσμα του κυτταρικού τύπου (έλεγχος vs CPR) [F (1,72) = 30.41, ρ & lt? 0.001], ένα σημαντικό αποτέλεσμα σισπλατίνης έκθεσης [F (5,72) = 128,3, p & lt? 0.001], καθώς και σημαντικής αλληλεπίδρασης [F (5,72) = 3.946, p & lt? 0.01]. Σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα παρατηρήθηκε σε 50, 100 μΜ σισπλατίνης σε κύτταρα ελέγχου, *** p & lt?. 0.001

Η

Χαρακτηρισμός των οδών σε κύτταρα CPR

Τα κύτταρα CPR παρέμειναν ανθεκτικά στην σηματοδότηση περαιτέρω σισπλατίνη θεραπεία, ακόμη και εν απουσία πρόσθετη έκθεση στη σισπλατίνη επιδεικνύοντας μια επίμονη μεταβολή στα κύτταρα CPR σύγκριση με τους ελέγχους πέρασμά τους. Ενώ άλλοι ανέφεραν ότι υπερδραστηριότητα του EGFR σχετίζεται με αντίσταση από λευκόχρυσο [20], παρατηρήσαμε καμία διαφορά σε βασικά επίπεδα σε κύτταρα pEGFR CPR σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 4Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα κύτταρα CPR δεν εμφανίζει σημαντικές αυξήσεις στα βασικά επίπεδα των οδών κατάντη σηματοδότησης EGFR όπως JAK2, ΑΚΤ, STAT3, ERK1 /2 (S1 Εικ). Ωστόσο, τα κύτταρα παρέμειναν CPR ευαίσθητα στην επαγόμενη σισπλατίνης ενεργοποίηση του EGFR με την επαναχορήγηση έκθεση στο φάρμακο για 1 ώρα, χωρίς ταυτόχρονη αλλαγές στα συνολικά επίπεδα EGFR (Εικόνα 4Α). κύτταρα CPR παρουσίασαν σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση EGFR (αναλογία pEGFR /σύνολο EGFR) όταν τα κύτταρα επανα-εκτίθενται σε σισπλατίνη (Εικόνα 4Β). Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας στο σχήμα 1, έχουμε δείχνουν μια σημαντική αύξηση στην ενεργοποίηση EGFR όταν τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη, αλλά δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και CPR απουσία της σισπλατίνης.

Α) Αντιπροσωπευτικά κηλίδες Western του pEGFR, Total EGFR και GAPDH για τα κύτταρα ελέγχου και CPR – /+ 10 μΜ cisplatin (επανέκθεση) για 1 ώρα. Β) σε γράφημα δεδομένα για την αναλογία της ενεργοποίησης EGFR (pEGFR /σύνολο EGFR) σε κύτταρα ελέγχου και CPR μετά σισπλατίνη επανέκθεση. Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post hoc Tukey αποκάλυψε σημαντικές αυξήσεις στην ενεργοποίηση EGFR σε κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη και σε κύτταρα CPR θεραπεία με σισπλατίνη, συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα αντίστοιχά τους, αλλά τα κύτταρα CPR δεν ήταν σημαντικά διαφορετικό από τα κύτταρα ελέγχου απουσία της σισπλατίνης. * Ρ & lt?. 0.05, ** ρ, 0,01

Η

Οξεία θεραπεία cisplatin αυξάνει τη δραστικότητα DNMT και αυτή η επίδραση εξαρτάται από την EGFR

ενεργοποίηση

Επειδή η ενεργοποίηση του EGFR αυξάνει τη δραστικότητα DNMT και μεθυλίωσης DNA και υπάρχει μια καθιερωμένη σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και της αντίστασης λευκόχρυσου (27-32), αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της οξείας έκθεσης σισπλατίνη για τη δραστηριότητα DNMT. OVCA 433 κύτταρα κατεργασμένα με σισπλατίνη έδειξαν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα DNMT στη 1 ώρα, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 5Α). αγωγή EGF χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος σε αυτές τις μελέτες, όπως δείξαμε προηγουμένως αυξημένη δραστηριότητα DNMT υπό αυτές τις συνθήκες [11]. Επιπρόσθετα, η αναστολή του EGFR με AG1478 απέτρεψε την επαγόμενη αύξηση σισπλατίνης σε δραστικότητα DNMT στη 1 ώρα (Σχήμα 5Β) που δείχνει ότι αυτή η αύξηση της δραστηριότητας DNMT εξαρτάται από την ενεργοποίηση του σισπλατίνης του EGFR. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των δειγμάτων ελέγχου και AG1478 μόνος επεξεργασμένα δείγματα, ούτε ήταν μια σημαντική διαφορά μεταξύ AG1478 μόνο και AG1478 + σισπλατίνη ομάδες εκεί.

Α) Κανονικοποιημένη δραστηριότητα DNMT μετά από θεραπεία με 10 μΜ cisplatin για 0- 4 ώρες, η = 4. 10 αγωγή με EGF ηΜ για 15 λεπτά χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Μονόδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική επίδραση της θεραπείας με σισπλατίνη και σημαντικές διαφορές από τον έλεγχο, όπως καθορίζεται από post hoc ανάλυση Dunnet που υποδεικνύονται από * p & lt? 0,05. Β) δραστηριότητα Κανονικοποιημένη DNMT μετά από θεραπεία με 10 μΜ σισπλατίνης για 1 ώρα παρουσία και απουσία 2 μΜ AG1478 (24 ώρες πριν από τη επώασης), n = 5. Η μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από post hoc ανάλυση Tukey αποκάλυψε ότι το ειδικό EGFR αναστολέας AG1478 εξασθενεί σημαντικά προκαλείται από τη σισπλατίνη επιπτώσεις στη δραστηριότητα DNMT. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001

Η

δραστηριότητας DNMT και παγκόσμια μεθυλίωση του DNA είναι αυξημένα στα κύτταρα CPR, αλλά η αναστολή του EGFR μειώνει την αλλοίωση αυτή

κύτταρα CPR έδειξαν σημαντική αύξηση της δραστηριότητας DNMT σύγκριση με κύτταρα ελέγχου διέλευσης (Σχήμα 6Α). Έτσι, χρησιμοποιήσαμε τον αναστολέα EGFR, Η erlotinib, να ερευνήσει εάν δραστηριότητα DNMT θα μπορούσαν να αποφευχθούν κατά τη διάρκεια της σισπλατίνης θεραπείας. θεραπείες erlotinib μόνη της δεν επηρέασε DNMT δραστηριότητα, ωστόσο, erotinib συν-θεραπεία με σισπλατίνη κατά την παραδειγματική αντίσταση από λευκόχρυσο (erlotinib CPR) εξασθένισε την προκαλούμενη αύξηση σισπλατίνη σε δραστηριότητα DNMT. Για την αξιολόγηση των συνεπειών της αυξημένης δραστηριότητας DNMT, μπορούμε στη συνέχεια μετρήθηκε παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA (σύνολο 5-μεθυλο-κυτοσίνης περιεχομένου) στις πειραματικές ομάδες (Σχ 6Β). Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε τιμές που λαμβάνονται για τα κύτταρα μάρτυρες και γραφικά ως ποσοστό του ελέγχου. Σύνολο 5-μεθυλο-κυτοσίνης περιεχόμενο αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα CPR, αλλά αυτή η αύξηση ήταν εξασθενημένος σε κύτταρα υπό αναστολή του EGFR κατά τη διάρκεια του παραδείγματος αντίστασης πλατίνας. Αυτές οι μελέτες επιβεβαιώνουν ότι επάγεται σισπλατίνη μεταβολές DNMT δραστηριότητα και μεθυλίωσης του DNA είναι εξαρτάται από την ενεργοποίηση του EGFR. Αυτή η αύξηση της δραστηριότητας DNMT και μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα CPR δεν θα μπορούσε να εξηγηθεί από τα αυξημένα επίπεδα της DNMTs υπάρχουν σε αυτά τα κύτταρα. Στην πραγματικότητα, η ανάλυση των επιπέδων DNMT στο κύτταρα ελέγχου και CPR έδειξε ότι DNMT1 και φωσφορυλιωμένη μορφή της DNMT1 στη σερίνη 714 (pDNMT1) προηγουμένως συνδέονται με την ενεργοποίηση του EGFR [35] είναι τόσο σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα CPR (S2 σχήμα). Dnmt3a, DNMT3B και DNMT3L όλα δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στην CPR κύτταρα σε σύγκριση με τους μάρτυρες.

Α) Κανονικοποιημένη δραστηριότητα DNMT στον έλεγχο, κύτταρα CPR καθώς και κύτταρα που έλαβαν τον αναστολέα EGFR Η erlotinib μόνο ή Η erlotinib + σισπλατίνη κατά τη διάρκεια της σισπλατίνη αντίσταση παράδειγμα, n = 4. One-way ANOVA που ακολουθείται από post hoc Dunnet έδειξε ότι η erlotinib συν-θεραπεία με σισπλατίνη στο πρότυπο αντίστασης σισπλατίνη εξασθενεί την αύξηση της δραστηριότητας DNMT παρατηρηθεί σε κύτταρα CPR. Β) τυποποιημένος τοις εκατό 5-μεθυλοκυτοσίνη (5mC) ή DNA παγκόσμια μεθυλίωσης για τον έλεγχο, κύτταρα CPR καθώς και κύτταρα που έλαβαν τον αναστολέα EGFR Η erlotinib μόνο ή Erlotinib + σισπλατίνη κατά τη διάρκεια του παραδείγματος αντίσταση σισπλατίνη, η = 4-6. Ένας τρόπος ANOVA που ακολουθήθηκε από Tukey post hoc αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση στην παγκόσμια μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα CPR, αλλά όχι σε κύτταρα που έλαβαν erlotinib * ρ & lt?. 0.05

Η

αναστολής EGFR μειώνει την έκταση της αντίστασης που παρατηρείται σε η in vitro μοντέλο της αντίστασης πλατίνας

Λαμβάνοντας υπόψη τα στοιχεία ότι η χρήση αναστολέων DNMT αντιστρέφει την αντίσταση λευκόχρυσου [6-10], καθώς και τις παρατηρήσεις μας ότι η αναστολή του EGFR εξασθενημένα δραστηριότητα DNMT και μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα CPR, ελέγξαμε εάν αυτό είχε ως αποτέλεσμα μια μεταβολή στην ευαισθησία πλατίνα. Όπως αποδεικνύεται αρχικά στο σχήμα 3, βρήκαμε σε ένα ξεχωριστό σύνολο πειραμάτων ότι τα κύτταρα CPR είναι σημαντικά πιο ανθεκτικές από τους ομολόγους του ελέγχου πέρασμά τους καλλιεργούνται ως μονοστιβάδα (έλεγχος IC

50 = 15,8 μΜ έναντι CPR IC

50 μεγαλύτερες από 100 μΜ) (Σχ 7Β) και ΝΕΠ (έλεγχος IC

50 = 28 μΜ έναντι CPR IC

50 μεγαλύτερο από 100 μm) (Εικ 7C). Αναστολή από μόνη της Η erlotinib δεν επηρεάζει την ευαισθησία στην cisplatin? μονοστρωματική (Η erlotinib IC

50 = 12 μΜ) και ΝΕΠ (Η erlotinib IC

50 = 32 μΜ). αναστολή του EGFR με erlotinib κατά την παραδειγματική αντίσταση από λευκόχρυσο μειώνει το βαθμό της αντίστασης που παρατηρείται σε κύτταρα CPR τόσο για μονοστρωματική (CPR IC

50 μεγαλύτερες των 100 μΜ έναντι Η erlotinib CPR IC

50 = 59 μΜ) και ΝΕΠ (CPR IC

50 μεγαλύτερες των 100 μΜ έναντι Η erlotinib CPR IC

50 = 86 μΜ). Αμφίδρομη ANOVA αποκάλυψε μια σημαντική επίδραση της κυτταρικό τύπο (έλεγχος vs. Η erlotinib εναντίον CPR vs Η erlotinib CPR), μια σημαντική επίδραση της θεραπείας με σισπλατίνη και σημαντικής αλληλεπίδρασης. Post hoc ανάλυση έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ CPR και Η erlotinib σε 50 μΜ και 100 μΜ. Στο σύνολό τους, αυτό υποδηλώνει ότι ο EGFR παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη της αντίστασης πλατίνας ως αναστολή EGFR ελάττωσε την ποσότητα της αντίστασης, που επιτεύχθηκε με το μοντέλο μας της αντίστασης πλατίνας.

Α) Αντιπροσωπευτική 10Χ εικόνες OVCA 433 ελέγχου , η erlotinib υποβάλλεται σε θεραπεία, ανθεκτικά στη σισπλατίνη (CPR) και τα κύτταρα που δόθηκαν η erlotinib και σισπλατίνη στο ανθεκτικά πλατίνα παράδειγμα (η erlotinib CPR) ως μονοστιβάδα και ως πολυκύτταρων αδρανών υλικών (MCA). Κλίμακα bar = 100 μm. Β) Κυτταρική βιωσιμότητα του ελέγχου μονοστρωματική (μαύρη γραμμή), IC

50 = 15,8 μΜ, CPR (γκρι γραμμή) IC

50 & gt? 100 μΜ, Η erlotinib μόνο (διακεκομμένη μαύρη γραμμή), IC

50 = 12 μΜ, και Η erlotinib CPR (διακεκομμένη γραμμή γκρι) IC

50 = 59 μΜ, σε απόκριση σε θεραπεία με σισπλατίνη δόσεις [5, 10, 20, 50, 100 μΜ] για 48 ώρες. Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, η = 4. Η αμφίδρομη ANOVA έδειξε μια σημαντική συνολική κύριο αποτέλεσμα του κυτταρικού τύπου (έλεγχος vs. Η erlotinib vs. CPR vs Η erlotinib CPR) [F (3,72) = 65.88, ρ & lt ? 0.001], μια σημαντική επίδραση της σισπλατίνης έκθεσης [F (5,72) = 94.46, p & lt? 0.001], καθώς και σημαντικής αλληλεπίδρασης [F (15,72) = 3.468, p & lt? 0.001]. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των CPR και Erlotinib CPR παρατηρήθηκαν σε 50 & amp? 100 μΜ σισπλατίνη, * ρ & lt? 0.05.