Abstract

RAD52

αποτελεί σημαντικό αλλά όχι καλά χαρακτηρισμένο ομόλογο γονίδιο επισκευή ανασυνδυασμού που μπορεί να συνδεθεί με τα άκρα μονόκλωνου DNA και μεσολαβούν την αλληλεπίδραση DNA-DNA είναι αναγκαία για την ανόπτηση των συμπληρωματικών κλώνους του DNA. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του

RAD52

παραλλαγές στην απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε παράγοντες πλατίνας, διερευνήσαμε τις ενώσεις τους με αντίσταση από λευκόχρυσο και την πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Εμείς συμμετείχαν 154 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου πλακώδες καρκίνωμα, ο οποίος είχε ριζική χειρουργική επέμβαση μεταξύ 2008 και 2009, και ο γονότυπος τρεις δυνητικά λειτουργικά

RAD52

παραλλαγές από τη δοκιμασία στιγμιότυπο. Δοκιμάσαμε

in vitro

αντίστασης πλατίνας και έκφραση RAD52 χρησιμοποιώντας τις μεθόδους ΜΤΤ και ανοσοϊστοχημεία, αντίστοιχα. Σε 144 περιπτώσεις που είχαν τα δεδομένα του γονότυπου, βρήκαμε ότι τόσο η παραλλαγή rs1051669 και η έκφραση της πρωτεΐνης RAD52 σχετίζονταν σημαντικά με καρβοπλατίνη αντίσταση (

P

= 0,024 και 0,028, αντίστοιχα) και rs10774474 με νεδαπλατίνη αντίσταση (

P

= 0,018). Η παραλλαγή rs1051669 συσχετίστηκε σημαντικά με την έκφραση της πρωτεΐνης RAD52 (προσαρμογή OR = 4,7, 95% CI = 1,4 – 16,1,

P

= 0,013). Όταν αυτά τα τρία

RAD52

παραλλαγές συνδυάστηκαν, επιβίωση χωρίς εξέλιξη ήταν χαμηλότερη σε ασθενείς που πραγματοποιείται τουλάχιστον ένα (≥1) αλληλόμορφο παραλλαγής σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν κανένα από τα αλληλόμορφα παραλλαγή (

P

= 0,047). Ως εκ τούτου, τόσο

RAD52

παραλλαγές και την έκφραση της πρωτεΐνης μπορεί να προβλέψει με αντίσταση από λευκόχρυσο, και

RAD52

παραλλαγές φάνηκε να προβλέψουμε την πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Οι μεγάλες μελέτες δικαιολογείται να επικυρώσει αυτά τα ευρήματα

Παράθεση:. Shi Τ-Υ, Γιανγκ G, Tu Χ-Υ, Γιανγκ J-M, Qian J, Wu X-H, et al. (2012)

RAD52

Παραλλαγές Προβλέψτε Platinum Αντίσταση και την πρόγνωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 7 (11): e50461. doi: 10.1371 /journal.pone.0050461

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Ιουλίου 2012? Αποδεκτές: 22η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Επιστημών για νέους επιστήμονες του Πανεπιστημίου Fudan. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι ο τρίτος πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες, αντιπροσωπεύοντας το 9% (529.800) όλων των νέων περιπτώσεων καρκίνου και 8% (275.100) όλων των θανάτων από καρκίνο μεταξύ των γυναικών το 2008 στον κόσμο [1]. Πάνω από το 85% αυτών των περιπτώσεων και θανάτων συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες, συμπεριλαμβανομένης της Κίνας [1]. Ταυτόχρονη θεραπεία chemoradiation είναι η τυπική θεραπεία χρησιμοποιούνται συχνότερα για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου πλακώδες καρκίνωμα (CSCC), οι οποίοι έχουν τοπικά προχωρημένο [2], [3] και υποτροπιάζοντα ή /και μεταστατικό [4] ασθένειες. Ωστόσο, οι πρωτογενείς ή επίκτητη χημειοαντίσταση είναι ένα σοβαρό κλινικό πρόβλημα που συμβάλλει στην υποτροπή της νόσου, την εξέλιξη και την ασθένεια-ειδικές θνησιμότητα [5] – [7]. Ο μηχανισμός υποκείμενη ετερογενές απόκριση των ασθενών είναι πολυπαραγοντική και μπορεί να περιλαμβάνει πολλαπλούς γενετικούς παράγοντες. Μερικοί από αυτούς τους γενετικούς παράγοντες μπορεί αξιόπιστα και προοπτικά να αξιολογηθούν για το ρόλο τους στον προσδιορισμό απόκριση σε αντικαρκινικούς παράγοντες.

επιδιόρθωση του DNA είναι κυρίως υπεύθυνη για την επισκευή ή /και την απομάκρυνση προϊόντων προσθήκης λευκόχρυσου-DNA. Αυτή η επιδιόρθωση του DNA περιλαμβάνει τις συντονισμένες δραστηριότητες των περισσότερων από 20 ένζυμα που απομακρύνουν και να αποκαταστήσει ένα τμήμα του DNA που περιέχει ένα ογκώδες προϊόν προσθήκης [8]. επισκευή ομόλογος ανασυνδυασμός (HRR) είναι ένας κύριος μηχανισμός επιδιόρθωσης του DNA για την επισκευή δίκλωνα σπασίματα (DSBs) κατά τη διάρκεια της S και G2 φάσεων [9], το οποίο είναι ένα κυτταρικό μηχανισμό άμυνας ενάντια κυτταροτοξικά αποτελέσματα με βάση την πλατίνα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [10] – [13].

RAD52

, ως ένα σχετικά λιγότερο καλά χαρακτηρισμένο γονίδιο HRR, εκτείνεται 37.6 kb στο χρωμόσωμα 12p12.2-13 και κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη με 417 αμινοξέα, τα οποία μπορεί να συνδεθεί με τα άκρα μονόκλωνου DNA και μεσολαβούν ο αλληλεπίδραση DNA-DNA είναι αναγκαία για την ανόπτηση των συμπληρωματικών ελίκων του DNA [14]. Πρόσφατα, Tassone et al. ανέφεραν ότι ένα υπερέκφραση του

RAD52

mRNAs σε κύτταρα HCC1937 BRCA1 ελαττωματικός συνδέθηκε με υψηλή ευαισθησία σε ενώσεις λευκοχρύσου προερχόμενο [15]. Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι

RAD52

μπορεί να εμπλέκεται στην αντίσταση λευκόχρυσου σε καρκινικά κύτταρα.

πολυμορφισμών μονού νουκλεοτιδίου (SNPs) σε γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA μπορεί να επηρεάσει θέσεις σύνδεσης πρωτεΐνης ή συγγένεια ή να προκαλέσει αλλαγές στη δομή της πρωτεΐνης και ως εκ τούτου μπορεί να τροποποιήσει τις λειτουργίες των γονιδίων και να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα πιο ευαίσθητα σε θεραπεία λευκοχρύσου [16], [17]. Μέχρι σήμερα, λίγες δημοσιευμένες μελέτες έχουν διερευνήσει τις ενώσεις του

RAD52

SNPs με τον κίνδυνο κακοήθειας [18], [19], και κανένας δεν έχει αξιολογηθεί αυτό με χημειοαντίσταση. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε τη σύνδεση των τριών δυνητικά λειτουργικών

RAD52

SNPs με

in vitro

αντίσταση από λευκόχρυσο και την πρόγνωση σε ασθενείς με CSCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

το έργο εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Fudan Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου (FUSCC). Μια γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους προσλαμβάνονται άτομα, και κάθε κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη της συναίνεσης του Ελσίνκι.

Ασθενείς

Στην παρούσα μελέτη, που προσλαμβάνονται 154 ασθενείς CSCC που είχαν ριζική υστερεκτομή και πυελική λεμφαδενεκτομή μεταξύ του Μαρτίου 2008 και του Μαρτίου 2009 στο Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου Fudan (FUSCC). Όλες οι περιπτώσεις είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη να είναι πλακώδες καρκίνωμα από δύο γυναικολογικών παθολόγους (XYT και GY). Η λεπτομερής κλινική πληροφορίες που προέρχονται από ηλεκτρονική βάση δεδομένων των ασθενών σε FUSCC και περιλάμβαναν την ηλικία, το στάδιο του όγκου (ΦΥΓΩ, Διεθνής Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής, 2009), το μέγεθος του όγκου (δηλαδή, η μεγαλύτερη διάμετρος του όγκου αναφέρθηκε από τον παθολόγο μετά από χειρουργική εκτομή) , πυελικό λεμφαδένα (LN) μεταστάσεις, λεμφο-αγγειακό χώρο εισβολής (Lvsi) και το βάθος του τραχήλου της μήτρας στρώματος εισβολής. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν κάθε τρεις μήνες για τα δύο πρώτα χρόνια, κάθε έξι μήνες για τα επόμενα δύο χρόνια, και σε ετήσια βάση για την εν συνεχεία τα επόμενα χρόνια. Η ανάλυση όλων των δειγμάτων αίματος και των ιστών πραγματοποιήθηκε με τυφλό τρόπο σε σχέση με χημειοαντίσταση και την επιβίωση κατάσταση των ασθενών.

SNP επιλογής

Τα SNPs επιλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων NCBI dbSNP (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP), η βάση δεδομένων Διεθνές HapMap Έργου (https://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/) και η πρόβλεψη λειτουργίας SNP (FuncPred) λογισμικό (http : //snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm) με βάση τέσσερα κριτήρια: 1) που βρίσκονται στα δύο άκρα του

RAD52

γονίδιο [δηλ, 5′-πλευρικές, 5′-αμετάφραστη περιοχή (UTR), 3′-UTR, 3′-πλευρικές], 2) είχε ένα μικρό συχνότητα αλληλόμορφου τουλάχιστον 5% στην κινεζική πληθυσμούς, 3) σε χαμηλή ανισορροπία σύνδεσης χρησιμοποιώντας ένα

r

2 κατώφλι του 0,8 για τον άλλον, και 4) προβλέπεται ως δυνητικά λειτουργικά SNPs στο microRNA (miRNA) τοποθεσίες ή παράγοντα μεταγραφής θέσεις πρόσδεσης πρόσδεσης. Ως αποτέλεσμα, τρία

επιλέχθηκαν RAD52

SNPs, και είναι rs1051669G & gt? Α (3′-UTR), rs10774474A & gt? Τ (5′-πλευρικές) και rs11571378T & gt? Α. (5′-πλευρική)

DNA Εκχύλιση και γονοτυπικός

Γονιδιωματικό DNA λήφθηκε από δείγματα ολικού αίματος χρησιμοποιώντας ένα QuickGene DNA Kit Ολικό αίμα (Fujifilm Co., Tokyo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. καθαρότητα του DNA και η συγκέντρωση προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρική μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm με Synergy ™ 4 Multi-Λειτουργία Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT).

Τα επιλεγμένα SNPs γονότυπος χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πολλαπλής στιγμιότυπο. Οι εκκινητές για την επέκταση και ενίσχυση στιγμιότυπο PCR σχεδιάστηκαν για να έχουν μια θερμοκρασία αναδιάταξης περίπου 60 ° C με τη χρήση του λογισμικού Primer5. Για να δοκιμαστεί για πιθανές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, αστάρια ευθυγραμμίστηκαν με τη βάση δεδομένων GeneBank χρησιμοποιώντας το BLAST online εργαλείο. AutoDimer λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των πιθανών δομών φουρκέτας και πιθανούς συνδυασμούς διμερούς αρχικού τεμαχίου. Όλοι οι εκκινητές συντέθηκαν από Sangon Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Μετά την ενίσχυση και τον καθαρισμό, τα προϊόντα της PCR αναμίχθηκαν και χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο στην αντίδραση επέκτασης στιγμιότυπο. Στη συνέχεια, διεξήχθη ηλεκτροφόρηση για το ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) για να ελέγχουν την ποιότητα των προϊόντων της PCR. Τα δεδομένα του γονότυπου τελικά αναλύονται από την Peak Scanner Λογισμικό έκδοση 1.0 (Applied Biosystems). Δέκα τοις εκατό των δειγμάτων επιλέχθηκαν τυχαία να αλληλουχηθεί. Ως αποτέλεσμα, η μέση του γονότυπου ποσοστό ήταν 93,5% με τη χρήση της δοκιμασίας πολλαπλής στιγμιότυπο. Το ποσοστό διαφορά σε όλους τους θετικούς ελέγχους (δηλ αντιγραφεί δείγματα, επικαλυπτόμενα δείγματα από προηγούμενες μελέτες και τα δείγματα που επιλέγονται τυχαία για να προσδιοριστεί η αλληλουχία) ήταν μικρότερη από 0,1%.

Η Δοκιμασία ΜΤΤ [20]

Κατά την εκτέλεση της δοκιμασίας ΜΤΤ, θεωρήσαμε ήδη αναφερθεί μέγιστες συγκεντρώσεις στο πλάσμα (PPC,) για τις τέσσερις επιλεγμένες παράγοντες πλατίνας: σισπλατίνη 10 μg /ml (Qilu Pharmaceutical Co, Κίνα? κλινική δόση 100 mg /m

2) [21] , καρβοπλατίνη 20 μg /ml (Qilu Pharmaceutical Co, Κίνα? κλινική δόση 450 mg /m

2) [22], νεδαπλατίνη 10 μg /ml (Nanjing Dongjie Pharmaceutical Co., Κίνα? κλινική δόση 100 mg /m

2) [23] και οξαλιπλατίνη 12 μg /ml (Nanjing Φαρμακευτική Factory Co, Κίνα? κλινική δόση 130 mg /m

2) [24]. Στην πραγματική δοκιμασία, χρησιμοποιήσαμε 10 × ΔΕΗ ως την τελική συγκέντρωση εργασίας για κάθε ένα από αυτούς τους παράγοντες πλατίνας, όπως συνιστάται προηγουμένως [25], [26].

Ιστοπαθολογικά επιβεβαίωσε φρέσκο ​​ιστούς όγκων που λαμβάνονται κατά τη χειρουργική επέμβαση κόπηκαν σε κομμάτια μικρότερων των 5 × 5 mm και εναιωρήθηκε στο μέσο RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ΜΟ) που παρέχεται με 15% βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Langley, ΟΚ) σε θερμοκρασία δωματίου. Αιωρούμενα καρκινικά κύτταρα χύνεται πάνω από ένα 150 μm mesh αποστειρωμένα χάλυβα τοποθετείται στο πιάτο. Percoll ασυνεχή φυγοκέντρηση βαθμίδωσης με 400 g χρησιμοποιήθηκε για να διαχωριστούν και να καθαριστούν τα καρκινικά κύτταρα, όπως συνιστάται προηγουμένως [20]. Τα καρκινικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση του Η &? Ε βάφονται μορφολογική εξέταση και κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε μία συγκέντρωση 1 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα /ml και καλλιεργήθηκαν σε 96-φρεατίων μικροπλάκες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Την ημέρα δύο, 90 μΐ μέσου RPMI 1640 που παρέχεται με 15% εμβρυϊκό βόειο ορό και 10 μΐ των διαλυμάτων με 100 × ΔΕΗ για καθένα από τα επιλεγμένα παράγοντες αναμίχθηκαν για 48 ώρες. Για κάθε ασθενή, 100 μΙ κυτταρικού εναιωρήματος του καρκίνου χωρίς παράγοντες πλατίνας καλλιεργήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι δοκιμασίας. Την τέταρτη ημέρα, 20 μΙ ΜΤΤ (5 mg /mL, Σαγκάη Lanji Co., Κίνα) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο στους 37 ° C για 4 ώρες, και στη συνέχεια 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος (10% SDS, 5% ισοβουτανόλη και 0.012 mol /L HCl) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για όλη τη νύχτα για να διαλυθεί κρύσταλλοι φορμαζάνης. Οπτικές πυκνότητες (OD

570 nm) μετρήθηκαν με Microplate Reader (ΒΙΟ-RAD550, Hercules, CA). Ο ρυθμός αναστολής λήφθηκε με τη χρήση του τύπου του (1-OD

πλατίνα /OD

έλεγχος) × 100%.

Ιστός μικροσυστοιχιών, ανοσοϊστοχημεία (IHC) Δοκιμασία και η εκτίμηση του ανοσοποιητικού χρώσης

Τα τμήματα του όγκου /φυσιολογικό ιστό που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για την μικροσυστοιχία ιστού που επιλέγεται από έναν εκπρόσωπο όγκου /φυσιολογικό περιοχή στο αντίστοιχο H & amp? Ε χρώση τμήμα του κάθε μπλοκ από δύο γυναικολογικών παθολόγους (XYT και GY). A 10 × 12 (120 πυρήνες) συστοιχία έγινε από την Τράπεζα Ιστών του FUSCC, η οποία περιελάμβανε επίσης 17 ελέγχους από φυσιολογικό τραχηλικό ιστών. Για κάθε ασθενή, δύο πυρήνες έγιναν από ξεχωριστές πηγές. IHC διεξήχθη επί 5 τομές μm πάχους του ιστού που παρασκευάζεται από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό από την κατασκευασμένη μπλοκ microarray ιστού χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι RAD52 [sc-8350, πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, Santa Cruz Biotechnology (Inc., Santa Cruz, CA ), αραίωση 1:50] και κιτ ανίχνευσης ChemMate ™ EnVision ™ (DAKO, Glostrup, Δανία). Ένα γνωστό θετικό δείγμα συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος. Για τον αρνητικό μάρτυρα, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε με μη άνοσο ορό κουνελιού.

IHC αποτελέσματα χρώσης ήταν ανεξάρτητα σκόραρε από δύο παθολόγους γυναικολογικών (XYT και GY), οι οποίοι δεν γνώριζαν την πληροφόρηση των ασθενών, χρησιμοποιώντας BX51 μικροσκόπιο και κάμερες DP25 (Όλυμπος Co., Tokyo, Japan). Το σύστημα βαθμολόγησης βασίζεται τόσο το ποσοστό των θετικών κυττάρων και χρώση ένταση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Η αξιολόγηση της κατάστασης έκφρασης πρωτεΐνης ορίσθηκε ως αρνητικός (≤2 +) και θετικά (& gt? 2+). Για πυρήνες που ήταν μη ερμηνεύσιμο λόγω της απώλειας του ιστού ή η έλλειψη των κυττάρων, με αποτέλεσμα να μην ισχύει (Ν /Α) δόθηκε.

Στατιστικές Μέθοδοι

Επειδή οι τιμές της πλατίνας-αναστολή δεν ακολουθούν κανονικές κατανομές, πραγματοποιήσαμε την μη παραμετρική

Wilcoxon

δοκιμής και

Kruskal-Wallis

δοκιμή για να συγκρίνετε τιμές της πλατίνας-αναστολής για κάθε παράγοντα τόσο μεταξύ των πρακτόρων και μεταξύ των διαφορετικών ομάδων. χ Pearson ‘s

2-τεστ και λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ

RAD52

γονότυπους και την έκφραση της πρωτεΐνης. Για την ανάλυση επιβίωσης, η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) φορές υπολογίστηκαν από την ημερομηνία της πρώτης χειρουργική επέμβαση για την ημερομηνία της υποτροπής της νόσου και του θανάτου, αντίστοιχα. Ασθενείς χωρίς εξέλιξη, έχασε από την παρακολούθηση ή πέθαναν από άλλες αιτίες περικόπηκαν την τελευταία τους ημερομηνία καταγραφής.

Kaplan-Meier

εκτίμηση επιβίωσης και τεστ log-rank υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση PFS και OS. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα των

RAD52

γονότυπους για την αθροιστική πιθανότητα επιβίωσης σε ασθενείς CSCC. Κάθε αναφερθεί

P

αξία ήταν διπλής όψης, και

P

& lt? 0,05 χρησιμοποιήθηκε για να συναχθεί η στατιστική σημαντικότητα. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SAS (έκδοση 9.1? SAS Institute, Cary, NC).

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά ασθενών και in vitro τιμές Platinum-αναστολή από την Δοκιμασία ΜΤΤ

Γονοτυπικές ήταν ανεπιτυχής σε 10 περιπτώσεις, μετά από επανειλημμένες αναλύσεις. Ως εκ τούτου, η τελική ανάλυση περιλάμβανε 144 ασθενείς CSCC, των οποίων η κλινική και παθολογική χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 1. διάμεση ηλικία των ασθενών κατά τη διάγνωση ήταν 46,5 έτη (εύρος, 20-70 ετών). ΦΥΓΩ διανομή στάδιο ήταν 68 (47,6%) το στάδιο ΙΒ, 67 (46,9%) ΙΙΑ στάδιο και οκτώ (5,6%) το στάδιο IIB. Ασθενείς με το μέγεθος του όγκου μεγαλύτερο των 4cm αντιπροσώπευαν 43,8% (63/144) των περιπτώσεων. Σαράντα εννέα (34,0%) και 50 (34,7%) ασθενείς είχαν θετικό μεταστάσεις πυελική LN και θετική Lvsi, αντίστοιχα. Υπήρχαν 109 (75,7%) περιπτώσεις των οποίων τα κύτταρα του καρκίνου εισέβαλε περισσότερο από το 1/2 στρώμα στρώμα του τραχήλου της μήτρας. Η διάμεση παρακολούθηση ήταν 37,6 μήνες (εύρος, 32,1 έως 41,6 μήνες), ενώ υπήρχαν και 20 (13,9%) υποτροπές και 10 (6.9%) θάνατοι κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης.

Η

Η διάμεσος

in vitro

ρυθμός αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης καρκίνου με σισπλατίνη, καρβοπλατίνη, νεδαπλατίνη και οξαλιπλατίνης ήταν 80,8%, 34,3%, 76,4% και 52,0%, αντίστοιχα (Σχήμα 1). Με τη χρήση του

Kruskal-Wallis

δοκιμή, βρήκαμε ότι οι τέσσερις παράγοντες πλατίνας έδειξαν σημαντική διαφορά στην αναστολή καρκινικών κυττάρων (

Kruskal-Wallis test

,

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1). Σισπλατίνη και νεδαπλατίνη δύο είχαν μεγαλύτερη επίδραση στην παρεμπόδιση των καρκινικών κυττάρων από καρβοπλατίνη έκανε (

Kruskal-Wallis test

,

P

& lt? 0.001? Σχήμα 1). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα ποσοστά αναστολής μεταξύ cisplatin και νεδαπλατίνη ομάδες (

Wilcoxon

δοκιμή,

P

= 0.269? Σχήμα 1). Για κάθε μέσο πλατίνας, συγκρίναμε τα ποσοστά αναστολής της σε διάφορες ομάδες ανάλογα με διάφορες κλινικές και παθολογικές χαρακτηριστικά, αλλά δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το μεσαίο

in vitro αναστολή

ρυθμός ανάπτυξης των κυττάρων του καρκίνου με σισπλατίνη, καρβοπλατίνη, νεδαπλατίνη και οξαλιπλατίνη ήταν 80,8%, 34,3%, 76,4% και 52,0%, αντίστοιχα, και επισημαίνονται με «-«. Τέσσερις ομάδες έδειξαν σημαντική διαφορά στην αναστολή καρκινικών κυττάρων (

Kruskal-Wallis test

,

P

& lt? 0.001). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα ποσοστά αναστολή παρατηρήθηκε μεταξύ σισπλατίνη και νεδαπλατίνη ομάδες (

Wilcoxon

δοκιμής,

P

= 0,269).

Η

Σύνδεσης μεταξύ RAD52 SNPs και in vitro Τιμές Platinum αναστολής

Όλες οι παρατηρούμενες κατανομές γονότυπου μεταξύ των ασθενών που συμφωνήθηκαν με την ισορροπία Hardy-Weinberg (HWE,

P

= 0,533 και 0,115 για rs1051669 και rs10774474, αντίστοιχα), με εξαίρεση τις rs11571378 (

P

= 0,0004). Συνολικά, οι παραλλαγή αλληλόμορφα rs1051669A και rs10774474T συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με την αντίσταση λευκόχρυσου. Τα καρκινικά κύτταρα με rs1051669AA και rs10774474TT παραλλαγή ομοζυγώτες είχαν χαμηλότερα απαντήσεις σε καρβοπλατίνη και νεδαπλατίνη, αντίστοιχα (

Kruskal-Wallis test

,

P

= 0,024 και 0,018, αντίστοιχα? Πίνακας 2). Συγκεκριμένα, υποθέτοντας ένα υπολειπόμενο γενετικό μοντέλο, βρήκαμε ότι οι ασθενείς οι οποίοι έφεραν το γονότυπο rs10774474 ΤΤ είχε μια σημαντικά αυξημένη αντίσταση στην νεδαπλατίνη, σε σύγκριση με εκείνους που διεξάγεται AA /AT γονότυπους (

Wilcoxon

δοκιμής,

P

= 0,027). Οι φορείς γονότυπο ΑΑ rs1051669 φάνηκε να έχουν αυξημένη αντοχή σε σύγκριση με το καρβοπλατίνη GG /αυτά γονότυπο AG, αλλά αυτό δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (

Wilcoxon

δοκιμή,

P

= 0,074). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ των

in vitro

ποσοστά αναστολής και το SNP rs11571378.

Η

Σύνδεσης μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά, RAD52 SNPs και Επιβίωση

Μετά την προσαρμογή για τους ασθενείς «ηλικία, ΦΥΓΩ στάδιο, το μέγεθος του όγκου, της πυέλου μεταστάσεις LN, Lvsi και το βάθος των στρωματικών εισβολής, δεν βρήκαμε μια ανεξάρτητη ένωση ενός ενιαίου παραλλαγή, μόνος, με τους ασθενείς« επιβίωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, όταν αυτά τα τρία επιλεγμένα RAD52 SNPs συνδυάστηκαν, οι ασθενείς που φέρουν τουλάχιστον ένα (≥1) αλληλόμορφο παραλλαγής (δηλαδή, rs10774474T, rs11571378A και rs1051669A) είχαν φτωχότερες PFS και OS σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν κανένα από τα αλληλόμορφα παραλλαγή (δοκιμασία log-rank ,

P

= 0,047 και 0,162, αντίστοιχα?. Σχήμα 2Α και 2Β)

Οι ασθενείς που φέρουν τουλάχιστον ένα (≥1) αλληλόμορφο παραλλαγής (δηλαδή, rs10774474T, rs11571378A και rs1051669A) είχε φτωχότερες επιβίωση χωρίς εξέλιξη και τη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν κανένα από τα αλληλόμορφα παραλλαγή (log-rank test,

P

= 0,047 και 0,162, αντίστοιχα). RAD52 (C) αρνητικά και (Δ) θετική έκφραση με χαμηλή κυτταροπλασματική φόντο ανιχνεύθηκε από το αντίσωμα sc-8350 (400 ×).

Η

RAD52 SNPs σχετιζόμενων με την έκφραση RAD52 Πρωτεΐνη

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω βιολογική αξιοπιστία βασίζεται η παρατηρούμενη συσχέτιση, εκτελέσαμε την ανάλυση IHC των ιστών στόχων και διαπίστωσε ότι RAD52 εντοπίστηκε στον πυρήνα (Σχήμα 2C και 2D). Οι μέσες βαθμολογίες των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης RAD52 ήταν 1,6 ± 1,8 και 4,2 ± 1,8 για καρκίνο του τραχήλου και των φυσιολογικών ιστών, αντίστοιχα. Από τις 144 περιπτώσεις που αναλύθηκαν, 109 (75,7%) ήταν αρνητικά RAD52, 30 (20,8%) ήταν θετικά και RAD52 πέντε (3,5%) ήταν RAD52 N /A. Ο θετικός ρυθμός έκφρασης (& gt? 2+) της RAD52 πρωτεϊνών σε τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς ήταν 22% (30/139) σε σύγκριση με 88% στους φυσιολογικούς ιστούς (15/17) (χ

2-test,

P

& lt? 0.001). Οι κατανομές γονότυπος του gt rs1051669G &? A, rs10774474A & gt? Τ και rs11571378T & gt? Αποτελούν SNPs στις RAD52-αρνητικών και θετικών ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 3. Στις κυρίαρχη γενετική μοντέλα, η παραλλαγή rs1051669 φορείς AG /AA έδειξε μια σημαντικά μειωμένη επίπεδο έκφρασης της RAD52 πρωτεϊνών σε ασθενείς CSCC, σε σύγκριση με τους μεταφορείς παραλλαγή GG γονότυπο [ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, προσαρμοσμένο ποσοστό πιθανοτήτων (OR) = 4,7, 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI) = 1,4 – 16,1,

P

= 0,013? Πίνακας 3]. Επιπλέον, ο ρυθμός RAD52-αρνητικών συσχετίστηκε σημαντικά με φτωχή απόκριση του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων στην καρβοπλατίνη (

Wilcoxon

δοκιμή,

P

= 0,028? Πίνακας 2). Ωστόσο, δεν βρήκαμε καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης RAD52 και την επιβίωση των ασθενών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Συζήτηση

Η αντίσταση στην χημειοθεραπεία με πλατίνα είναι ένα challege στην κλινική πρακτική [5] – [7]. Στην παρούσα μελέτη, για την αξιολόγηση αντίστασης πλατίνας, εκτελέσαμε τη δοκιμασία ΜΤΤ που χρησιμοποιήθηκε ευρέως για δοκιμή χημική ευαισθησία, και συνολική ακρίβεια της ήταν περίπου 81,3% για την πρόβλεψη της κλινικής αποτέλεσμα σε γυναικολογικό καρκίνο [28]. Βρήκαμε ότι ο ρυθμός αναστολής της νεδαπλατίνη και cisplatin να τραχήλου καρκινικά κύτταρα είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη των καρβοπλατίνη και οξαλιπλατίνη, ανεξάρτητα από κλινικά και παθολογικά μεταβλητές. Το εύρημα αυτό είναι σύμφωνο με τις τρέχουσες NCCN συστάσεις των κατευθυντήριων οδηγιών που σισπλατίνη είναι η πρώτη επιλογή για τη χημειοθεραπεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Τα ευρήματά μας αναφορικά νεδαπλατίνη είναι επίσης συνεπής με τα δημοσιευμένα κλινικά δεδομένα. Αύξηση δεδομένα έχουν προτείνει ότι είναι νεδαπλατίνη εξίσου αποτελεσματική με σισπλατίνη με λιγότερα πεπτικά και νεφρική τοξικότητα και μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική επιλογή για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [29]. Ωστόσο, οι μεγαλύτερες τυχαιοποιημένες κλινικές δοκιμές που απαιτούνται για την επικύρωση αυτή τη διαπίστωση.

Είναι γνωστό ότι η επισκευή του DNA παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αντίσταση λευκόχρυσου και οποιαδήποτε διατάραξη στην επιδιόρθωση του DNA μπορεί να οδηγήσει σε μία αλλοιωμένη ευαισθησίας στη θεραπεία [30 ], [31]. DSBs, η πιο θανατηφόρα μορφή της βλάβης του DNA που προκαλείται από ιονίζουσα ακτινοβολία παράγοντες και η πλατίνα, επισκευάζονται από δύο σημαντικές οδούς-HRR και μη-ομόλογο τέλος-που ενώνει την επισκευή [32]. Έχει προταθεί ότι μία αυξημένη συχνότητα των DSBs και χρωμοσωμικών ανωμαλιών παρατηρούνται 16-24 ώρες μετά την σισπλατίνη έκθεση [33] και την καταστολή των σχετικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην οδό HRR μπορεί να είναι υπεύθυνη για αντοχή στη σισπλατίνη [34]. Σε

Saccharomyces cerevisiae

, μαγιά

RAD52

διαδραματίζει καίριο ρόλο στην αντιγραφή-συνδέονται HRR [35]. Μαγιά RAD52 και RAD52 θηλαστικών εμφανίζουν παρόμοια αλληλουχία αμινοξέων και βιοχημικές δραστηριότητες, η οποία προτείνει διατηρούμενες λειτουργία του [36]. Προηγούμενη δεδομένα έχουν δείξει ότι RAD52 θηλαστικών μπορούσε να ανταποκριθεί στο DNA DSBs και αντιγραφή στασιμότητα ανεξάρτητα από BRCA2, που ενεργεί ως ανεξάρτητη και εναλλακτική οδό HRR [37]. Για παράδειγμα, η απουσία της πρωτεΐνης RAD52 είχε ως αποτέλεσμα εκτεταμένη χρωμοσωμικές εκτροπές, ειδικά εκτροπές χρωματιδικού τύπου [37], και παράγοντες πλατίνας μπορεί να δεσμεύονται άμεσα με το DNA, που οδηγεί σε διαφορετικούς τύπους αλλοιώσεων του DNA [38]. Επιπροσθέτως, η ρύθμιση προς τα κάτω του

RAD52

mRNAs συσχετίστηκε με κακή απόκριση των κυττάρων σε ενώσεις λευκόχρυσου προερχόμενα σε κύτταρα BRCA1 ελαττωματικός HCC1937 [15]. Με συνέπεια, στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η κατάσταση έκφρασης πρωτεΐνης RAD52 αρνητικά συσχετίστηκε με κακή απόκριση του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων στην καρβοπλατίνη. Ως εκ τούτου,

RAD52

μπορεί να ενέχεται στο σχηματισμό της αντίστασης πλατίνας. Ωστόσο, απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν τα παρατηρούμενα επίπεδα έκφρασης χαμηλά RAD52 που θα συμβάλει στην αυχενική χημειοθεραπεία του καρκίνου.

Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που επικεντρώθηκε στην προγνωστική αξία

RAD52

για τις διακυμάνσεις στην αντίσταση από λευκόχρυσο και πρόγνωση σε CSCC. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι η κατανομή rs11571378 γονότυπος μεταξύ των ασθενών αναχωρήσει από HWE αλλά δεν προέβλεψαν καμία από κλινικά αποτελέσματα. Αντίθετα, οι άλλοι δύο SNPs (δηλαδή, rs1051669 και rs10774474), του οποίου το γονότυπο κατανομές μεταξύ των ασθενών που ακολουθείται HWE, συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με το

in vitro

ποσοστά αναστολής της καρβοπλατίνη και νεδαπλατίνη σε κύτταρα CSCC, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ένα σημαντικό ρόλο των

RAD52

παραλλαγές στην αντίσταση λευκόχρυσου. Στην πραγματικότητα, αυτές οι δύο SNPs είναι και οι δύο προβλεπόμενες ως δυνητικά λειτουργικά. Για παράδειγμα, ο rs1051669 SNP βρίσκεται στο 3′-UTR του

RAD52

και μπορεί να είναι σε μια θέση πρόσδεσης miRNA διαταράσσουν την αλληλεπίδραση miRNA-mRNA και να επηρεάσουν την έκφραση του miRNA στοχευμένων γονιδίων [39]. Ομοίως, η rs10774474 SNP βρίσκεται στην ανάντη του

RAD52

, η οποία θα μπορούσε να είναι μια θέση σύνδεσης παράγοντα μεταγραφής να συμμετάσχουν στο γονίδιο ρυθμιστικά δίκτυα, όπως οδοί επιδιόρθωσης του DNA [40]. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RAD52 συνδέθηκαν με τα ποσοστά αναστολής της καρβοπλατίνη, ένα παρόμοιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για την

RAD52

-rs1051669 SNP. Είναι ενδιαφέρον, γονότυπου-φαινότυπου συσχέτιση μας αναλύει επίσης αποδειχθεί ότι η rs1051669 SNP ήταν σημαντικά σχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης RAD52. Ως εκ τούτου, φαίνεται βιολογικά εύλογο ότι η

RAD52

-rs1051669 SNP μπορεί να είναι λειτουργική με τη ρύθμιση της έκφρασης RAD52 και να συμβάλει έτσι στην αντίσταση πλατίνας σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Kaplan-Meier

εκτιμήσεις επιβίωσης έδειξαν επίσης ότι οι ασθενείς που πραγματοποιείται τουλάχιστον ένα (≥1) αλληλόμορφο παραλλαγής τριών

RAD52

SNPs είχαν σημαντικά φτωχότερη PFS από εκείνους που δεν φέρουν κανένα από τα αλληλόμορφα παραλλαγή, που δείχνει την επίδραση του

RAD52

SNPs για την πρόγνωση των ασθενών CSCC. Επειδή αυτοί οι γονότυποι παραλλαγή μπορεί να προβλέψει την έκφραση της πρωτεΐνης, υποθέσαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RAD52 μπορεί να προβλέψει την επιβίωση στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, στην παρούσα μελέτη, δεν παρατηρήσαμε καμία συσχέτιση μεταξύ ενιαίο SNPs ή τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης RAD52 και επιβίωση, η οποία μπορεί να οφείλεται σε σχετικά σύντομο χρόνο παρακολούθησης με περιορισμένη γεγονότα υποτροπών και των θανάτων. Ωστόσο, ορισμένα δημοσιευμένα στοιχεία για άλλους καρκίνους υποστηρίζουν την υπόθεσή μας, αν και δεν υπάρχουν μελέτες για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έχουν δημοσιευθεί μέχρι σήμερα. Πρόσφατα, Jewell et al. ανέφερε ότι η υπερέκφραση του

RAD52

mRNA θα μπορούσε να προβλέψει κακή PFS με αναλογία κινδύνου 4,49 σε μελάνωμα και ότι τα καρκινικά κύτταρα με απορυθμίζεται γονίδια των μονοπατιών επιδιόρθωσης του DNA ήταν πιθανό να είναι πιο επιθετική [41].

Εν ολίγοις,

RAD52

SNPs, είτε ατομικά είτε συλλογικά, μπορεί να τροποποιήσει τη λειτουργία του γονιδίου και να αλλάξει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης RAD52, καθιστώντας έτσι καρκινικό κύτταρο ανθεκτικό σε παράγοντες πλατίνας. Οι μεγαλύτερες προοπτικές μελέτες με μεγαλύτερο χρόνο παρακολούθησης που απαιτούνται για την επικύρωση ευρήματά μας.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Yunhua Ling, Guangqi Qin και Hongyu Gu των Fudan Πανεπιστήμιο της Σαγκάης Κέντρο Καρκίνου για την εκτέλεση

in vitro

δοκιμασία ΜΤΤ, μικροσυστοιχίες ιστών και ανοσοϊστοχημεία τεχνικές, αντίστοιχα, και να ευχαριστήσω τον καθηγητή Shaokang Zhan του Πανεπιστήμιο Fudan Σχολή Δημόσιας Υγείας για την υποστήριξη στατιστική ανάλυση. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον καθηγητή Mario Leitao από το Memorial Sloan-Kettering, για την αναθεώρηση του παρόντος εγγράφου.