Abstract

Η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου 2 συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη ορισμένων μορφών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η δημοσίευση των εξαιρετικά αμφιλεγόμενο επιδημιολογικές μελέτες το 2009 αύξησε την πιθανότητα ότι η χρήση των αναλόγου ινσουλίνης glargine αυξάνεται ο κίνδυνος αυτός περαιτέρω. Ωστόσο, δεν είναι σαφές πώς μετράται μιτογονικά αποτελέσματα των αναλόγων ινσουλίνης και

in vitro

συσχετίζονται με όγκο αυξητικά αποτελέσματα

in vivo

. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει τις πιθανές επιπτώσεις που προάγουν την ανάπτυξη της φυσικής ανθρώπινης ινσουλίνης, η ινσουλίνη Χ10 και IGF-1, οι οποίες θεωρούνται θετικοί έλεγχοι

in vitro

, σε βραχυπρόθεσμη ζωικό μοντέλο της παχυσαρκίας και διαβήτη-σχετικές καρκίνου. Εμείς χαρακτηριζόμενη ινσουλίνης και την έκφραση του υποδοχέα IGF-1 και της ανταπόκρισης στη θεραπεία με ινσουλίνη, X10 και IGF-1 στο μυϊκό καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή (κύτταρα MC38)

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, εξετάσαμε φαρμακοκινητικές και φαρμακοδυναμικές και παρακολουθήθηκε ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων κυττάρων MC38 σε ποντικούς με παχυσαρκία λόγω δίαιτας που έλαβαν θεραπεία με ανθρώπινη ινσουλίνη, X10 και IGF-1. Η θεραπεία με X10 και IGF-1 αύξησε σημαντικά την ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων κυττάρων MC38 σε ποντικούς με παχυσαρκία λόγω δίαιτας και ως εκ τούτου μπορούμε να συμπεράνουμε ότι υπερ-φαρμακολογικές δόσεις του αναλόγου ινσουλίνης X10, η οποία είναι υπερ-μιτογόνος

in vitro

και αύξησε τη συχνότητα εμφάνισης όγκων του μαστού σε θηλυκούς αρουραίους σε μια μελέτη τοξικότητας 12 μηνών, επίσης, την αύξηση της ανάπτυξης των μοσχευμάτων όγκου σε βραχυπρόθεσμη ζωικό μοντέλο

Παράθεση:. Hvid η Blouin MJ, Birman Ε, Damgaard J, Poulsen F, Fels JJ, et al. (2013) Η θεραπεία με ινσουλίνη Αναλογικά X10 και IGF-1 αυξάνει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου αλλομοσχεύματα. PLoS ONE 8 (11): e79710. doi: 10.1371 /journal.pone.0079710

Επιμέλεια: Josep Bassaganya-Riera, Virginia Tech, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 24 του Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 18, Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Hvid et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη εν μέρει υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση (TFF-116128), από το καναδικό Ινστιτούτο Έρευνας Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις συμφερόντων να αναφέρουν: H Hvid, J Damgaard, JJ Fels, F Poulsen, C Fledelius και BF Hansen είναι υπάλληλοι της Novo Nordisk και κατέχουν μετοχές της εταιρίας. Μ Pollak είναι σύμβουλος για την Novo Nordisk. Για όλα τα υπόλοιπα οι συγγραφείς δεν υπάρχουν συγκρούσεις συμφερόντων να αναφέρουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η παχυσαρκία και ο διαβήτης τύπου 2 σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο για ορισμένες μορφές καρκίνου, όπως του μαστού, του παγκρέατος και του παχέος εντέρου [1] – [5]. Εξαιρετικά αμφιλεγόμενη επιδημιολογικές μελέτες πρότειναν ότι η θεραπευτική χρήση του αναλόγου ινσουλίνης glargine ινσουλίνης συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου [6], [7], αλλά η δίκη καταγωγής που προβλέπονται πρόσφατα ισχυρές ενδείξεις ότι αυτό δεν συμβαίνει [8]. Ωστόσο, οι επιδημιολογικές μελέτες που δημοσιεύθηκαν το 2009 και τα επόμενα συζητήσεις τονίστηκε η σημασία της αξιολόγησης προ-κλινική ασφάλεια των αναλόγων ινσουλίνης. Επιπλέον, τα καθησυχαστικά αποτελέσματα σχετικά με την ινσουλίνη glargine δεν μειώνουν την προηγούμενη στοιχεία για μια συσχέτιση μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και αυξημένο κίνδυνο ή χειρότερη πρόγνωση ορισμένων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και τους μηχανισμούς πίσω από αυτό σύνδεσης παραμένει ένα σημαντικό θέμα.

Σε αυτό το πλαίσιο, το ανάλογο ινσουλίνης X10 είναι μια ενδιαφέρουσα συνδετήρα. X10 αναπτύχθηκε ως ένα ταχείας δράσης ανάλογο ινσουλίνης με υποκατάσταση της ιστιδίνης στη θέση Β10 με ασπαρτικό οξύ [9]. Αυτή η απλή αντικατάσταση αμινοξέος αύξησε την συγγένεια δέσμευσης του X10 με τον υποδοχέα IGF-1 (IGF-1 R) και υποδοχέα ινσουλίνης (IR) 3- έως 5-πλάσια και 2 φορές, αντίστοιχα [10], [11]. Επιπλέον, X10 έχει μειωθεί off-ρυθμό από το IR σε σύγκριση με την φυσική ανθρώπινη ινσουλίνη (ΗΙ) που έχει σαν αποτέλεσμα παρατεταμένη σηματοδότηση από την IR [12]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι X10 οδηγεί σε αναλογικά ισχυρότερη ενεργοποίηση των θέσεων φωσφορυλίωσης στα πεδία παραμεμβρανική μεμβράνης και της κινάσης του IR από το C-τερματικό τομέα [13]. Αυτά τα χαρακτηριστικά σύνδεσης υποδοχέα και -ενεργοποίηση δίνει X10 μια 3-15 φορές υψηλότερη από ό, τι μιτογενετική HI

in vitro

[14] και σε ένα 12-μηνών χρόνιας τοξικότητας μελέτες υπερ-φαρμακολογικές δόσεις του X10 αύξησε την συχνότητα της αυθόρμητης μαστικών όγκων σε θηλυκούς αρουραίους Sprague Dawley [15]. Περαιτέρω ανάπτυξη των X10 για κλινική χρήση επομένως διακοπεί, αλλά οι μηχανισμοί πίσω από την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης όγκων δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί (βλέπε [16] για μια λεπτομερή επισκόπηση).

μελέτες Προηγούμενη ζώα χρησιμοποιώντας γενετικές ή δίαιτα που προκαλείται μοντέλα παχυσαρκίας ή διαβήτη έχουν συσχετίσει την υπερινσουλιναιμία με αυξημένο σχηματισμό χημικά προκαλούμενων προνεοπλαστικών βλαβών στο παχύ έντερο [17], [18], η ανάπτυξη των χημικά επαγόμενων όγκων του παχέος εντέρου [19], [20], καθώς και την ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων καρκίνου του κυττάρου ποντικού [21 ] – [25]. Σε μοντέλα αρουραίων με χημική επαγωγή του καρκίνου, η θεραπεία με ινσουλίνη αυξημένη ανάπτυξη των όγκων azyoxymethane επαγόμενης κόλον [26] και 7,12-διμεθυλοβενζ (α) ανθρακένιο επαγόμενη μαστικούς όγκους [27]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η συνεχής έγχυση της ινσουλίνης σε αρουραίους για 12 ώρες αυξημένο πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων του παχέος εντέρου [28], και υπερ-φαρμακολογικές δόσεις HI ή glargine για 18 εβδομάδες αυξημένο πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου και το σχηματισμό του προ-νεοπλασματικών βλαβών, αλλά δεν οδήγησε σε σχηματισμό όγκου [29]. Σε μελέτες ασφαλείας, που παραδοσιακά εκτελούνται όπως μελέτες καρκινογένεσης ή μελέτες χρόνιας τοξικότητας του 6-24 διάρκειας μηνών σε ποντικούς ή αρουραίους [30], δεν παρατηρήθηκε αυξημένη συχνότητα όγκων παρατηρήθηκε σε αρουραίους Sprague Dawley και NMRI-ποντικούς μετά την αγωγή με σχετικά χαμηλές δόσεις glargine και HI για έως και 24 μήνες [31]. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η θεραπεία με υψηλές δόσεις X10 για 12 μήνες αύξησε τη συχνότητα εμφάνισης όγκων του μαστού σε μαστικούς όγκους επιρρεπείς θηλυκούς αρουραίους Sprague Dawley [32]. Ενώ οι συστάσεις για τις μελέτες ασφάλειας των αναλόγων ινσουλίνης και βασίζεται σε έγκυρες επιστημονικές πρακτικές, που αναπτύχθηκε αρχικά για τη μελέτη των μεταλλαξιογόνων, τα υπάρχοντα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η αυξητική δράση των αναλόγων ινσουλίνης και του όγκου είναι πιο σχετική ανησυχία, από ό, τι ανησυχία για την αύξηση την έναρξη του όγκου, μέσω της αύξησης ρυθμός μετάλλαξης που προκαλείται από έναν αυξημένο πολλαπλασιασμό, όπως πρότεινε επίσης προηγουμένως [33]. Η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας των προγραμμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου για διάφορες μορφές καρκίνου τονίζει ότι δεν είναι ασυνήθιστο για τους ενήλικες, συμπεριλαμβανομένων των διαβητικών, να έχουν απαρατήρητα προκαρκινικές πρώιμους καρκίνους [34], [35]. Συνεπώς, είναι σχετικό να διερευνηθεί πώς η θεραπεία με ινσουλίνη και ανάλογα ινσουλίνης επηρεάζουν τη συμπεριφορά των υφιστάμενων καρκίνων, και για να γίνει αυτό σε ζωικά μοντέλα του διαβήτη ή της παχυσαρκίας σε συνδυασμό με την αντίσταση στην ινσουλίνη, αφού αυτοί οι παράγοντες που είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου.

Ο σκοπός της μελέτης ήταν να εξετάσει την πιθανότητα προώθησης της ανάπτυξης επίδραση της θεραπείας με HI, X10 και IGF-1 σε ένα μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου ποντικών αλλομοσχεύματα (MC38 κύτταρα) όγκου ιδρύθηκε σε ποντίκια με διατροφή που προκαλείται από την παχυσαρκία (DIO) και αντίσταση στην ινσουλίνη. Ως εκ τούτου, χαρακτήρισε την κυτταρική σειρά MC38 χρησιμοποιείται για τις μελέτες μοσχεύματος εκτενώς και εκτέλεσε μια σειρά πειραμάτων σε ζώα για να αποκτήσουν μια αξιόπιστη εκτίμηση της πιθανής όγκου αυξητική δράση της ΗΙ, X10 και IGF-1

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

πειράματα σε ζώα

για να εξεταστεί η επίδραση της θεραπείας με HI, X10 και IGF-1 στην ανάπτυξη των μοσχευμάτων όγκου MC38 πραγματοποιήσαμε πέντε πανομοιότυπα πειράματα σε ζώα. Εμείς επικεντρώθηκε σε διαφορετικά τελικά σημεία σε αυτά τα πειράματα σε ζώα και να παρακολουθείται η ανάπτυξη του όγκου σε όλα τα πειράματα, βλέπε Πίνακα 1. Τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε πρόσφατα [36]. Εν συντομία, αρσενικοί ποντικοί C57BL /6 αγοράστηκαν από τα Jackson Laboratories στην ηλικία των 18 εβδομάδων, όπου τα ποντίκια είχαν διατηρηθεί σε μια δίαιτα υψηλή σε λιπαρά (τρωκτικό δίαιτα με 60 kcal% λίπος, D12492, Έρευνας Δίαιτες, Inc., New Brunswick, NJ, USA) από την ηλικία των 6 εβδομάδων. Για τον χαρακτηρισμό της μεταβολικής φαινότυπο σε DIO-ποντικούς (βλέπε Πίνακα 2), μεταβολικές παραμέτρους μετρήθηκαν επίσης σε ίδιας ηλικίας άπαχο ποντίκια που τρέφονταν με δίαιτα ελέγχου, (Rodent δίαιτα με 10 kcal% λίπος, D12450B, Research δίαιτες) περιλαμβάνονται σε τρεις από τα πειράματα. φροντίδα των ζώων και θεραπείες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις καθιερωμένες κατευθυντήριες γραμμές και πρωτόκολλα εγκεκριμένα από το Davis Ινστιτούτο Lady (πρωτόκολλο # 5951) και την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων του Πανεπιστημίου McGill. Τα ποντίκια στεγάστηκαν ένα ποντίκι ανά κλουβί με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό της βρύσης και υψηλής ή χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά διατροφή, αντίστοιχα, σε όλες τις μελέτες. Η θερμοκρασία στα δωμάτια των ζώων διατηρήθηκε στους 20-25 ° C με κύκλο φωτός /σκότους των 14/10 ωρών. Οι ποντικοί εγκλιματίστηκαν για 7-10 ημέρες πριν κινήθηκαν πειραματικές διαδικασίες. Σε πειραματική ημέρα 0, 2.0 × 10

5 (πείραμα Α) ή 5,0 χ 10

5 (όλες οι άλλες πειράματα) κύτταρα MC38, αιωρήθηκε σε 100 μΙ ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), ενέθηκαν υποδορίως (sc) στο δεξί πλευρό των ποντικών. Στη συνέχεια, κάθε ποντικός εγχύθηκε υποδορίως δύο φορές την ημέρα με (διάλυμα aqueos που περιέχει 7 mM φωσφορικό, 150 mM γλυκερίνη, 22 mM NaCl και 30 mM φαινόλη, ρΗ 7.4) είτε όχημα, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ινσουλίνη 600 nmol /kg, ανάλογο ινσουλίνης X10 (ανάλογο ινσουλίνης B10Asp) (Νονο Nordisk A /S, Copenhagen, Denmark) 600 nmol /kg ή ανασυνδυασμένου ανθρώπινου IGF-1 (Increlex, IPSEN Pharma GmbH, Ettlingen, Γερμανία) 600 nmol /kg. Το μέγεθος των αλλομοσχευμάτων όγκου μετρήθηκε τρεις φορές την εβδομάδα και ο όγκος που υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: μήκος Χ πλάτος

2 × 0,52. Με βάση τα στοιχεία όγκου του όγκου για κάθε ποντικό, υπολογίσαμε το εμβαδόν κάτω από τις καμπύλες ανάπτυξης όγκου (όγκων ανάπτυξη AUC). Κατά τον τερματισμό των πειραμάτων, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο. Αίμα συλλέχθηκε με καρδιακή παρακέντηση και αμέσως μετά την ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση, τα δείγματα του ήπατος, του παχέος εντέρου, γαστροκνήμιο μυ και τα αλλομοσχεύματα κυττάρων του όγκου MC38 αποκόπηκαν και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο για μετέπειτα παρασκευή λύματος ιστού.

γλυκόζης του αίματος και της HbA1c

Για την παρακολούθηση της φαρμακοδυναμική επίδραση της θεραπείας με HI, X10 και IGF-1, μετρήθηκε η γλυκόζη στο αίμα πριν από τη θεραπεία και 15 λεπτά, 1 ώρα, 2,5 ώρες και 6 ώρες μετά την αγωγή. Συλλέχθηκε αίμα με παρακέντηση της σαφηνούς φλέβας και της γλυκόζης στο αίμα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα OneTouch Ultra Glucometer (LifeScan, Inc., Milpitas, CA, USA).

Τα επίπεδα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c) στο αίμα του DIO- και άπαχο ποντίκια ελέγχου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας την Τίνα-quant κιτ ανάλυσης αιμοσφαιρίνη A1c Gen.3 και Cobas 6000 μέσου (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Γερμανία), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

συλλογή δειγμάτων και Μετρήσεων Plasma του C-πεπτιδίου, ανθρώπινη ινσουλίνη, ινσουλίνη Χ10 και Ανθρωπίνων IGF-1

Πριν ξεκίνησαν πειράματα, τα συστημικά επίπεδα ινσουλίνης ποντικού μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ινσουλίνης αρουραίου /Mouse κιτ ELISA (Millipore Corp., Βίΐεποα, ΜΑ , USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα πλάσματος που συλλέγονται κατά τον τερματισμό των πειραμάτων προσδιορίστηκαν για ποντίκι C-πεπτιδίου, η ανθρώπινη ινσουλίνη, ανάλογο ινσουλίνης X10 ή ανθρώπινο IGF-1. Mouse C-πεπτιδίου προσδιορίστηκε με Αρουραίου /Ποντικού C-πεπτίδιο 2 κιτ ELISA (Millipore), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα του ανθρώπινου IGF-1 μετρήθηκαν με το IDS-ISYS IGF-1 κιτ ELISA (IDS Immunodiagnostics, Fountain Hills, AZ, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν για φυσική ανθρώπινη ινσουλίνη χρησιμοποιώντας ένα Οξυγόνο φωταύγεια Ελεγχόμενη Ανοσο-δοκιμασία (loc-δοκιμασία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Η ινσουλίνη X10 μετρήθηκε σε πλάσμα ποντικού χρησιμοποιώντας δοκιμασία έκπλυσης τόπους, όπως περιγράφεται επίσης πρόσφατα [38]. Δείτε Υλικά S1 για λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με αυτές τις δοκιμασίες.

Πολιτισμός τηλέφωνα

MC38 κύτταρα (κυτταρική γραμμή ποντικού που περιγράφεται από τους Corbett et al. (1975) [39] και γενναιόδωρα από τον Dr. Pnina Brodt , Πανεπιστήμιο McGill, Montreal, QC) και MCF-7 κύτταρα (ATCC, Manassas, VA, USA), καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που περιέχει 4.5 g /l γλυκόζης (Wisent Inc., Montreal, QC, Canada) συμπληρωμένο με 10% ( ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Invitrogen) και 20 μg /ml γενταμυκίνη (Sandoz Καναδάς, Boucherville, QC, Canada) (δηλαδή, μέσο ανάπτυξης). Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα με ζώα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν μία φορά σε PBS και επαναιωρήθηκαν σε PBS (4 ° C) σε συγκέντρωση 5.0 × 10

6 κύτταρα /ml και διατηρήθηκαν επί πάγου μέχρι την υποδόρια ένεση στα ποντίκια. Για πειράματα σήμανσης κύτταρα MC38 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης για δύο ημέρες μέχρι 80-90% συρροής, οι καλλιέργειες κυττάρων στη συνέχεια ξεπλύθηκαν μια φορά σε PBS (θερμοκρασία δωματίου), και μέσο λιμοκτονίας (παρόμοια με μέσο ανάπτυξης, εκτός του ότι περιείχε μόνο 0,25% (v /ν) FBS και όχι ερυθρό φαινόλης) προστέθηκε για 3 ώρες. Αφού τα κύτταρα ασιτία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυσική ανθρώπινη ινσουλίνη, X10 ή IGF-1 σε τελικές συγκεντρώσεις 1 ή 10 ηΜ σε μέσο λιμοκτονίας. Ακριβώς 30 λεπτά μετά την αγωγή, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν μια φορά σε PBS (4 ° C) και λύθηκαν με την προσθήκη ρυθμιστικού λύσης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Κάθε πείραμα περιελάμβανε δύο σηματοδότησης πανομοιότυπα δείγματα ανά επεξεργασία και τρία ανεξάρτητα πειράματα. MC38 κύτταρα που χρησιμοποιούνται για το χαρακτηρισμό των IR και έκφραση του IGF-1 R καλλιεργήθηκαν, συλλέγονται και λύονται όπως περιγράφεται για τα πειράματα σηματοδότηση παραπάνω, εκτός του ότι δεν στερήθηκαν τροφής πριν από την λύση.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Επίδραση των υπό εξέταση ενώσεων επί του πολλαπλασιασμού εκτιμήθηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) δοκιμασίες, ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Εν συντομία, τα κύτταρα MC38 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων (5000 κύτταρα ανά φρεάτιο) σε μέσο ανάπτυξης. Μετά από επώαση για 1 ημέρα, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν σε PBS (θερμοκρασία δωματίου), πεινασμένο για 3 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με ΗΙ, X10 ή IGF-1 σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,001 έως 1000 ηΜ. Δεδομένα για σχετικοί αριθμοί κυττάρων από τις τρεις επαναλαμβανόμενα πειράματα, το καθένα με τέσσερα όμοια δείγματα ανά κατάσταση, χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για να ταιριάζει καμπύλες δόσης-απόκρισης χρησιμοποιώντας GraphPad Prism έκδοση 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Πειράματα κυτταρικού πολλαπλασιασμού έγιναν με κύτταρα MCF-7, όπως περιγράφεται για τα κύτταρα MC38, εκτός του ότι τα 20.000 κύτταρα επιστρώθηκαν ανά φρεάτιο. Δείτε Υλικά S1 και το σχήμα S1 για λεπτομερείς συμπληρωματικές πληροφορίες σχετικά με τα πειράματα του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Προετοιμασία των ιστών και κυτταρικά λύματα και κηλίδωση Western

Η λύση των κατεψυγμένων δειγμάτων ιστού και κυτταρικές καλλιέργειες σε τρυβλία Petri, φυγοκέντρηση λύματα, προσδιορισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης, ανάμειξη του κυττάρου ή ιστού προϊόντα λύσης με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης 2Χ SDS, μετουσίωση, SDS-PAGE σε προ-σχηματισμένα πηκτώματα 4-15% κλίση (BioRad) και μεταφορά σε 0,45 μm μεμβράνες νιτροκυτταρίνης διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],36] Πριν από την κηλίδωση με πρωτεύοντα αντισώματα, οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης μπλοκαρίστηκαν με επώαση σε Τπδ-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με 0,05% (ν /ν) Tween (ΤΒδ-Τ) με 5% (w /v) λευκωματίνη βόειου ορού (BSA) (όταν κηλίδωση με πρωτεύοντα αντισώματα φωσφορυλίωση-ειδική) ή ΤΒδ-Τ με 5% (w /v) αποβουτυρωμένο γάλα (όλες οι άλλες πρωτογενείς αντισώματα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε TBS-T με 5% (w /v) BSA και η επώαση διεξήχθη επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα ακόλουθα αντισώματα κουνελιού, όλες από την Cell σηματοδότηση Technology Inc., Boston, ΜΑ, USA, χρησιμοποιήθηκαν:. Αντι-φωσφο-p70S6K (.. Thr389, Cat Νο 9205), αντι-Ρ-S6 (Ser235 /236, cat ηο . 2211), αντι-φωσφο-Ακί (Ser473, αρ. κατ. 9271), αντι-Akt (αρ. κατ. 9272), αντι-φωσφο-ΜΑΡΚ (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187, αρ. κατ. 4370) , αντι-Ρ-IRS-1 (Ser302, αρ. κατ. 2384), αντι-IRβ (αρ. κατ. 3025), αντι-IGF-1Rβ (αρ. κατ. 3018), αντι-β-ακτίνης (cat. αρ. 4967). Η επώαση με δευτερεύον αντίσωμα (υπεροξειδάση ραδικιού-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, αρ. Κατ 5401) και την απεικόνιση των ζωνών πρωτεΐνης έγινε όπως περιγράφεται προηγουμένως [36]. Η ένταση του ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImagePro (BioRad). σε κάθε κελί πείραμα σηματοδότησης, οι εντάσεις ζώνης κανονικοποιήθηκαν προς τη μέση τιμή των δειγμάτων που υπέστησαν αγωγή με φορέα. IR και IGF-1 R ζώνες στο ήπαρ, μυς του παχέος εντέρου και αλλομοσχευμάτων κυττάρων MC38 ομαλοποιήθηκαν να σημαίνει εντάσεις ζωνών σε δείγματα ήπατος και των μυών, αντίστοιχα.

δοκιμασία ήπατος περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια σε λύμα παρασκευάζεται από δείγματα ήπατος από DIO- και άπαχο ποντικών έγινε χρησιμοποιώντας ένα κιτ τριγλυκεριδίων χρωματομετρική δοκιμασία (Cayman Chemical Company, Αηη Arbor , ΜΙ, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση SAS έκδοση λογισμικού 9.1.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). σε όλες οι αναλύσεις παρατηρήσεις υποτίθεται ότι είναι ανεξάρτητες μεταξύ ζώων ή κυτταρικής καλλιέργειας πειραματικές μονάδες. Επιπλέον, τα δεδομένα υποτίθεται ότι ακολουθούν κανονική κατανομή και να έχουν διακύμανση ομοιογένεια. Για να εκπληρώσει αυτές τις υποθέσεις, τα δεδομένα μετασχηματίστηκαν χρησιμοποιώντας το φυσικό λογάριθμο όταν είναι απαραίτητο. Δεδομένα με αριθμητική τυποποιημένη υπολειμματική αξία & gt?. 3.0 θεωρήθηκαν ως ακραίες τιμές, όπως προτείνεται στο παρελθόν [41], και η στατιστική ανάλυση έγινε με και χωρίς αυτές τις ακραίες τιμές (βλέπε παρακάτω)

In vitro

δεδομένα σηματοδοσίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από κατά ζεύγη συγκρίσεις ανάμεσα σε κάθε τύπο της θεραπείας και ελέγχου με τη χρήση πολλαπλών t-tests με διόρθωση Dunnetts. Επιπλέον, σε κάθε επίπεδο δόσης, μια άμεση σύγκριση της θεραπείας με ΗΙ και X10 και ΗΙ με IGF-1 έγινε χρησιμοποιώντας Student t-τεστ. Δεδομένα που περιγράφουν IR και έκφραση του IGF-1 R σε διάφορους ιστούς ποντικού αναλύθηκαν σε μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ των ιστών με τη χρήση πολλαπλών t-test με διόρθωση Bonferroni.

Το αποτέλεσμα της θεραπείας επί της ανάπτυξης όγκου σε κάθε από τα πέντε πειράματα σε ζώα αναλύθηκαν σε μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από σύγκριση ανά ζεύγος της κάθε θεραπείας με όχημα τη χρήση πολλαπλών t-tests με διόρθωση Dunnetts για καθένα από τα δύο άκρα της ανάπτυξης του όγκου? τέλος όγκο του όγκου και η περιοχή κάτω από τις καμπύλες ανάπτυξης όγκου (όγκων ανάπτυξη AUC). Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης για κάθε πείραμα, δηλαδή, οι μέσες τιμές για κάθε θεραπεία, το 95% διαστήματα εμπιστοσύνης και την πολλαπλή μεταβολή του κάθε θεραπεία σε σχέση με το όχημα, παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.

Η

Για να εξεταστεί θεραπεία -σχετικών επιπτώσεων στην ανάπτυξη του όγκου σε όλα τα πέντε πειράματα σε ζώα, έχουμε για κάθε παράμετρο (τέλος όγκο του όγκου και την ανάπτυξη του όγκου AUC) συγκεντρώνονται όλα τα δεδομένα σε ένα σύνολο δεδομένων και να αναλυθούν σε ένα μεικτό γραμμικό μοντέλο με τη θεραπεία ως σταθερό επεξηγηματική μεταβλητή και το πείραμα ως τυχαίο φαινόμενο. Καμία σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ της θεραπείας και το πείραμα διαπιστώθηκε για οποιοδήποτε από τα δύο αποτελέσματα (τέλος όγκος του όγκου και την ανάπτυξη του όγκου AUC). Για να διερευνηθεί περαιτέρω οι διαφορές μεταξύ θεραπειών, συγκρίσεις κατά ζεύγη των κάθε τύπο θεραπείας έγιναν με τη χρήση πολλαπλών t-test με διόρθωση Bonferonni. Δεν ακραίες τιμές παρατηρήθηκαν μεταξύ των 131 παρατηρήσεων στο τέλος του όγκου του όγκου, ενώ μία ακραία εντοπίστηκε μεταξύ των 131 παρατηρήσεις της AUC της ανάπτυξης του όγκου. Αποκλεισμός αυτού του ακραία ήταν αναγκαία για την εκπλήρωση των υποθέσεων πίσω από τα στατιστικά μοντέλα και δεν άλλαξε το συνολικό αποτέλεσμα της ανάλυσης. Ο μέσος όγκος άκρο του όγκου και του όγκου AUC ανάπτυξης για κάθε θεραπεία σε όλες τις πέντε πειράματα, συμπεριλαμβανομένων διαστήματα εμπιστοσύνης 95% και διπλώστε αλλαγή της κάθε θεραπείας σε σχέση με την ομάδα υπό αγωγή με όχημα φαίνονται στον Πίνακα 3.

Αποτελέσματα

MC38 κύτταρα αποκρίνονται στην ινσουλίνη, X10 και IGF-1

Εξετάσαμε πρώτα πώς η θεραπεία με ΗΙ, X10 και IGF-1 επί 24 ώρες επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MC38 και κύτταρα MCF-7 (περιλαμβάνεται για σύγκριση), βλέπε Σχήμα 1. Η θεραπεία με τις ενώσεις δοκιμής αυξημένο πολλαπλασιασμό σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Σε συμφωνία με προηγούμενες πολλαπλασιασμοί μελέτες σε κύτταρα MCF-7, και ≈ 9 φορές υψηλότερη έκφραση του IGF-1 R σε σχέση με IR σε 7 MCF-κυττάρων [42], η μιτογόνος επίδραση ήταν μεγαλύτερη για τον IGF-1 & gt? X10 & gt? ΗΙ, ενώ στη κύτταρα M38 η κατάταξη για μιτογονικό αποτέλεσμα ήταν X10≥IGF-1 & gt? ΗΙ. Αυτό υποδηλώνει κύτταρα MC38 εκφράζουν συγκρίσιμα επίπεδα IR και IGF-1R.

MCF-7 κύτταρα (Α) και τα κύτταρα MC38 (Β) εκτέθηκαν σε ΗΙ /X10 /IGF για 24 ώρες σε μέσο με χαμηλή περιεκτικότητα σε ορό (MCF-7? 0,1% (ν /ν), MC38? 0,25% (ν /ν)). Στο τέλος της περιόδου θεραπείας σχετικούς αριθμούς κυττάρων αξιολογήθηκαν με μία μέθοδο προσδιορισμού ΜΤΤ. Πάνελ Α και Β δείχνει το μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων, κάθε μία με τέσσερις επαναλήψεις ανά συνθήκη, ράβδοι σφάλματος δείχνουν SEM. HI, X10 και IGF-1 αύξησε πολλαπλασιασμό σε MCF-7 και MC38 κύτταρα. Σε συμφωνία με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα και το προφίλ έκφρασης του υποδοχέα, η κατάταξη των ενώσεων δοκιμής σύμφωνα με την μιτογονική δραστικότητα σε κύτταρα MCF-7 ήταν IGF-1 & gt? X10 & gt? ΗΙ. Στα κύτταρα MC38 η κατάταξη ήταν X10≥IGF-1 & gt? ΗΙ. Αυτό υποδηλώνει IR και IGF-1 R εκφράζεται σε περίπου συγκρίσιμα επίπεδα σε κύτταρα MC38.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε σηματοδότησης έντονα μετά τη θεραπεία με ΗΙ, X10 και IGF-1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α-2G, η θεραπεία με τους επιλεγέντες δόσεις ΗΙ, X10 και IGF-1 ενεργοποιήθηκε σημαντικά IRS-1, Akt, mTOR, p70S6K και S6 σε κύτταρα MC38 στο φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) μονοπατιού, ενώ σημαντικές ενεργοποίηση του ρ44 /42 που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) παρατηρήθηκε μόνο με την υψηλή δόση του IGF-1 σε αυτό το χρονικό σημείο. Μια προηγούμενη μελέτη με κύτταρα MCF-7 βρέθηκε ότι η Ρ-Akt (Ser473) και Ρ-p70S6K (Ser389) ήταν ευαίσθητα τελικά σημεία για την ανίχνευση μιας διαφοράς σηματοδότησης μεταξύ ΗΙ και X10 [42]. Ως εκ τούτου, συγκρίθηκε άμεσα ισομοριακές δόσεις ΗΙ, X10 και IGF-1, υπολογίζοντας το X10 /ΗΙ και IGF-1 /HI αναλογίες για κάθε μια από τις εξεταζόμενες φωσφορυλίωσης της κινάσης θέσεις (Σχήμα 2Η). Σε συμφωνία με την προηγούμενη μελέτη, η θεραπεία με X10 αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της Akt (Ser473) και p70S6K (Ser389) στη χαμηλότερη δόση του 1 ηΜ. Τα δεδομένα σηματοδοσίας ήταν επίσης σε καλή συμφωνία με τα δεδομένα πολλαπλασιασμού, όπως IGF-1 και Χ10 εμφανίστηκε εξίσου πιο ισχυρό από HI στη διέγερση ενεργοποίηση του Akt, p70S6K και IRS-1 σε κύτταρα MC38.

Αντιπροσωπευτικά Western blots είναι δείχνεται στον πίνακα Α τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από θεραπεία για 30 μg της συνολικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν στα πηκτώματα. Κάθε πείραμα περιελάμβανε δύο επαναλήψεις ανά κατάσταση. εντάσεις Band ποσοτικοποιήθηκαν σε σχέση με τη μέση τιμή των δύο δειγμάτων υπό αγωγή με όχημα σε κάθε πείραμα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθη και τα αποτελέσματα από τον ποσοτικό προσδιορισμό των εντάσεων ζώνης από τη Δυτική blottting για Ρ-Akt (Β), Ρ-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (C), Ρ-p70S6K (D), Ρ-S6 (Ε), Ρ-IRS -1 (F) και Ρ-mTOR (G) και β-ακτίνη (έλεγχος φορτίου) συνενώθηκαν και αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από τη σύγκριση των δειγμάτων υπό αγωγή με όχημα με κάθε θεραπεία με χρήση πολλαπλών t-test με διόρθωση Dunetts. Τέλος, μια άμεση σύγκριση της ενεργοποίησης της κινάσης με ΗΙ και X10 και ΗΙ και IGF-1, αντίστοιχα, έγινε σε κάθε επίπεδο δόσης, χρησιμοποιώντας Student t-τεστ (H). Ανοικτό κύκλους: ένα δείγμα επανάληψη, οριζόντιες γραμμές: μέσες τιμές, οι ράβδοι σφάλματος: SEM. * Και *** δείχνουν

P

& lt? 0,05 και

P

& lt?. 0.0001, αντίστοιχα

Η

Ποντίκια με δίαιτα, οδηγούν Η παχυσαρκία είναι υπερινσουλιναιμίας, της γλυκόζης-δυσανεξία και έχουν μειωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη

Επιλεγμένα παραμέτρους του μεταβολισμού μετρήθηκαν σε DIO-ποντίκια και σε σύγκριση με τα ποντίκια ίδιας ηλικίας τρέφονται έλεγχο δίαιτα χαμηλή σε λιπαρά. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, DIO-ποντικοί είχαν περίπου 40% αύξηση του σωματικού βάρους και ήταν υπερινσουλιναιμικοί με περίπου 4-πλάσια αύξηση των επιπέδων της ινσουλίνης. Ωστόσο, DIO-ποντικοί ήταν μόνο οριακά υπεργλυκαιμικά, καθώς τα επίπεδα της HbA1c μόνο αυξήθηκε ελαφρά. Η χρόνια έκθεση στη διατροφή υψηλή σε λιπαρά οδήγησε επίσης σε ηπατική στεάτωση και DIO-ποντίκια είχαν 3 έως 4-πλάσια αύξηση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο ήπαρ. Στο λειτουργικό επίπεδο, DIO-ποντίκια εμφανίζεται επίσης μικρότερη ανοχή γλυκόζης και είχαν μειωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη, όπως καθορίζεται κατά τη διάρκεια μιας δοκιμής ανοχής γλυκόζης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43].

Η θεραπεία με HI, X10 και IGF-1 αποτελέσματα σε βραχυπρόθεσμα, αλλά υψηλή συστηματική έκθεση, Μειωμένη γλυκόζης αίματος και Καταστολής έκκριση της ενδογενούς ινσουλίνης

Όταν τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ισομοριακές υπερ-φαρμακολογικές δόσεις της ΗΙ, X10 ή IGF-1 με υποδόρια ένεση, παρατηρήθηκαν πολύ υψηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα λίγο μετά την ένεση (Σχήμα 3Α). Το C

max ήταν περίπου 1000 ηΜ για HI, X10 και IGF-1. Αυτό είναι περίπου 1000 φορές υψηλότερη από τις συγκεντρώσεις στο πλάσμα της ενδογενούς ινσουλίνης ποντικού σε υπερινσουλιναιμίας DIO-ποντικούς (Πίνακας 2). Με βάση τις συγκεντρώσεις πλάσματος μετρήθηκαν 15 λεπτά, 1 ώρα και 6 ώρες μετά την υποδόρια ένεση του ΗΙ, X10 ή IGF-1 (Σχήμα 3Α), θα μπορούσαμε να υπολογίζουμε ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής (t

½) για ΗΙ και X10 ήταν περίπου 30 λεπτά, ενώ t

½ για IGF-1 ήταν περίπου 70 λεπτά, σε λογική συμφωνία με τα υπάρχοντα δεδομένα της βιβλιογραφίας και το γεγονός ότι η πλειονότητα των IGF-1 στο πλάσμα του αίματος συνδέεται με τις πρωτεΐνες IGF-1 δεσμευτική [ ,,,0],44], [45]

Α:. Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα μετρήθηκαν σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με ΗΙ, X10 ή IGF-1. Τα κατώτερα όρια ανίχνευσης για τα διάφορα δοκιμασίες ήταν: HI? 14:00, X10? 233 ρΜ και IGF-1? 1.3 ηΜ. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή στο χρόνο 0 και δείγματα πλάσματος συλλέχθηκαν μετά από 15 λεπτά, 1 ώρα και 6 ώρες. Μέγιστες συγκεντρώσεις στο πλάσμα μετρήθηκαν 15 λεπτά μετά τη θεραπεία. 6 ώρες μετά οι συγκεντρώσεις του IGF-1 στο πλάσμα θεραπείας ήταν ≈ 100 φορές υψηλότερες από τις συγκεντρώσεις του ΗΙ και X10 πλάσματος. Β: Η μέση γλυκόζη του αίματος μετά από αγωγή με 600 nmol /kg HI /X10 /IGF-1 με sc ένεση. Η γλυκόζη του αίματος επέστρεψε στα βασικά επίπεδα μετά ≈ 3-4 ώρες, η = 8 (HI, X10 και IGF-1) ή η = 6 (όχημα). Διακεκομμένη γραμμή δείχνει μέσης τιμής της γλυκόζης του αίματος σε χρόνο 0. Οι ράβδοι σφάλματος? SEM. C: Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα 0,5 ώρες και & gt? 5 ώρες μετά την αγωγή με ΗΙ ή Χ10, 600 nmol /kg. Πολύ υψηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα παρατηρήθηκαν 0,5 ώρες μετά τη θεραπεία. Ανοικτή κύκλους? παρατηρήσεις από μεμονωμένα ζώα, οριζόντιες γραμμές? μέσες τιμές, οι ράβδοι σφάλματος? SEM. D: Επίπεδα Ο-πεπτιδίου στο πλάσμα 0,5 ώρες και & gt? 5 ώρες μετά την αγωγή με ΗΙ ή Χ10, 600 nmol /kg, στα ίδια ζώα, όπως φαίνεται στον πίνακα C. Τα επίπεδα της Ο-πεπτιδίου ήταν σημαντικά μειωμένη από 0,5 ώρες μετά την αγωγή σε σύγκριση με το C-πεπτιδίου μετρήθηκαν τα επίπεδα & gt? 5 ώρες μετά την υποδόρια ένεση του HI /X10, όταν η γλυκόζη στο αίμα είχαν επιστρέψει στα βασικά επίπεδα και τις συγκεντρώσεις του ΗΙ και Χ10 στο πλάσμα ήταν χαμηλά. Ανοικτή κύκλους? παρατηρήσεις από μεμονωμένα ζώα, οριζόντιες γραμμές? μέσες τιμές, οι ράβδοι σφάλματος? SEM. * Υποδεικνύει

P

& lt?. 0.05

Η

Η θεραπεία με τις επιλεγείσες δόσεις ΗΙ, X10 και IGF-1 μείωσε ταχέως γλυκόζης αίματος στα ποντίκια κατά τρόπο συγκρίσιμο, αλλά περίπου 3 -4 ώρες μετά την ένεση γλυκόζης του αίματος είχαν επιστρέψει στα βασικά επίπεδα (Εικόνα 3Β).

Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα του C-πεπτιδίου ήταν χαμηλά αμέσως μετά τη θεραπεία με ΗΙ /X10, όπου παρατηρήθηκε πολύ υψηλή έκθεση στο πλάσμα ( Σχήμα 3C), αλλά καθώς οι συγκεντρώσεις του ΗΙ /X10 πλάσμα μειώνονται, τα επίπεδα C-πεπτιδίου ταχέως επέστρεψαν στα βασικά επίπεδα & gt? 5 ώρες μετά την ένεση (Σχήμα 3D). Αυτό το πρότυπο της C-πεπτιδίου επίπεδα επίσης συσχετίζονται άριστα με τις αλλαγές στη γλυκόζη του αίματος (Σχήμα 3Β).

Η θεραπεία με HI, X10 και IGF-1 Ενεργοποιεί Σηματοδότηση Κατάντη του IR /IGF-1 R σε MC38 αλλομοσχεύματα κυττάρων

in vivo

η

η έκφραση του IR και IGF-1R σε αλλομοσχεύματα κυττάρων MC38 μετρήθηκε σε σχέση με την αναφορά ιστούς στο ήπαρ και στους σκελετικούς μύες (το γαστροκνήμιο μυ) και φυσιολογικό κόλον. Τόσο IR και IGF-1 R εκφράστηκαν σε αλλομοσχεύματα MC38 και συγκρίσιμες με κύτταρα MC38 καλλιεργημένα

in vitro

, δηλαδή, ο φαινότυπος διατηρήθηκε

in vivo

. Σε MC38 αλλομοσχεύματα IR εκφράστηκε σε χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με το ήπαρ και του παχέος εντέρου, αλλά συγκρίσιμο με σκελετικό μυ. IGF-1 R εκφράστηκε σε επίπεδα συγκρίσιμα με του παχέος εντέρου και σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από ό, τι το ήπαρ και σκελετικό μυ (Σχήματα 4Α-4C). Με την τεχνική αυτή δεν ήταν δυνατόν να συγκριθούν άμεσα τα επίπεδα IR και IGF-1R μεταξύ των ιστών

Α:. Εκπρόσωπος κηλίδες Western για IRβ και IGF-1Rβ στο ήπαρ, MC38 όγκου, του παχέος εντέρου, των μυών και MC38 κύτταρα καλλιεργημένα

in vitro

. Για κάθε δείγμα 20 μg της συνολικής πρωτεΐνης φορτώθηκαν στο πήκτωμα. Β: Η ποσοτικοποίηση των Western blots για IRβ έγινε σε σχέση με τις μέσες εντάσεις ζώνης των δειγμάτων ήπατος. Το σχετικό επίπεδο IR σε αλλομοσχεύματα κυττάρων MC38 ήταν συγκρίσιμη με σκελετικό μυ και σημαντικά χαμηλότερα από το ήπαρ και του παχέος εντέρου. n = 3 ή 4 ανά ιστό, ράβδοι δείχνουν μέση τιμή δύο πειραμάτων, οι ράβδοι σφάλματος? SEM. *** Δείχνουν

P

& lt? 0,0001. C: Η ποσοτικοποίηση των Western blots για IGF-1Rβ έγινε σε σχέση με τις μέσες εντάσεις ζώνης των δειγμάτων μυών. Το σχετικό επίπεδο IGF-1 R ήταν σημαντικά υψηλότερη σε αλλομοσχεύματα κυττάρων MC38 από μυών και του ήπατος και συγκρίσιμα με του παχέος εντέρου. n = 3 ή 4 ανά ιστό, ράβδοι δείχνουν μέση τιμή δύο πειραμάτων, οι ράβδοι σφάλματος? SEM. *** Δείχνουν

P

& lt? 0,0001. D: Αντιπροσωπευτικές κηλίδες Western για Ρ-mTOR, Ρ-p70S6K, Ρ-Akt και β-ακτίνης σε δείγματα αλλομοσχεύματα όγκων που συλλέγονται 1 ώρα μετά την υποδόρια ένεση του ΗΙ, X10 ή IGF-1. Οι συγκεντρώσεις πλάσματος του ΗΙ, X10 και IGF-1 σε αυτά τα ζώα κατά τη στιγμή της ευθανασίας και τη συλλογή των δειγμάτων ιστού που φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Η θεραπεία με HI, X10 ή IGF-1 είχε σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφόρων κινασών στην οδό σηματοδότησης της ΡΙ3Κ.

Η

Επίσης εξετάσαμε τη λειτουργικότητα της IR και IGF-1R στα αλλομοσχεύματα όγκου με κηλίδωση Western για κινάσες στην οδό σηματοδότησης της ΡΙ3Κ σε καρκινικό ιστό που συλλέγονται 1 ώρα μετά τη χορήγηση του sc ΗΙ, X10 ή IGF-1 (Σχήμα 4D). Αυτό το σημείο του χρόνου είναι κοντά στην μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα και το χρόνο της μέγιστης επίδρασης των χορηγούμενων ενώσεων επί της γλυκόζης του αίματος. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η φωσφορυλίωση της Akt σε αλλομοσχεύματα όγκου και φυσιολογικό κόλον μετά την υποδόρια ένεση βλωμού της ΗΙ και Χ10 είναι ισχυρά εξαρτώμενη από τον χρόνο [36]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα αυτά, παρατηρήσαμε έντονη ενεργοποίηση της Akt, p70S6K και mTOR 1 ώρα μετά τη θεραπεία, γεγονός που αποδεικνύει MC38 αλλομοσχεύματα όγκων είναι ευαίσθητοι στην οξεία θεραπεία με HI, X10 και IGF-1.

Η ανάπτυξη της αλλομοσχεύματα όγκων αυξάνεται σημαντικά σε ζώα που έλαβαν X10 και IGF-1

Πέντε πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν. Το μέσο μέγεθος των όγκων σε πειραματική ημέρα 14 και ανάπτυξη του όγκου AUC (πειραματική ημέρα 0 έως 14) για κάθε ομάδα αγωγής σε κάθε πείραμα, συμπεριλαμβανομένων 95% διαστήματα εμπιστοσύνης για αυτές τις μέσες τιμές, παρουσιάζονται στον Πίνακα 3 και όλα τα δεδομένα απεικονίζονται στο Σχήμα 5Α-Β. Εκτός από το πείραμα Α, μία τάση προς την αυξημένη ανάπτυξη του όγκου μετά από αγωγή με ΗΙ, X10 και IGF-1 παρατηρήθηκε σε όλα τα πειράματα, και η πτυχή μεταβολή στην ανάπτυξη του όγκου ήταν γενικά περίπου παρόμοιου μεγέθους για κάθε τύπο θεραπείας.