Αφηρημένο

Signal Transducer και Activator of Transcription-3 (STAT3) είναι μόνιμα ενεργοποιημένη σε πολλούς καρκίνους όπου προωθεί την ανάπτυξη , φλεγμονή, αγγειογένεση και αναστέλλει την απόπτωση. Δείξαμε ότι STAT3 ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο, και ότι η χρόνια IL-11 καθοδηγείται STAT3 μεταγραφική δραστικότητα επάγει γαστρική ογκογένεσης στην gp130

757FF μοντέλο ποντικού γαστρικού ανάπτυξη καρκίνου. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η αγωγή του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου AGS κυττάρων με την Janus Kinase (JAK) αναστολέα WP1066 τη δόση, και αναστέλλει χρονικά εξαρτώμενο φωσφορυλίωση STAT3, σε συνδυασμό με μειωμένη φωσφορυλίωση JAK2, μειωμένη πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση. Επιπλέον, η εφαρμογή του ενδοπεριτοναϊκή WP1066 για 2 εβδομάδες, η μειωμένη γαστρική όγκο του όγκου κατά 50% στην gp130

757FF ποντίκι συμπίπτει με μειωμένη ενεργοποίηση JAK2 και STAT3 σύγκριση με αγωγή με όχημα, οι έλεγχοι της ίδιας γέννας. Γαστρικών όγκων από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή WP1066- είχαν μειωμένη φλεγμονή πολυμορφοπύρηνα, που συμπίπτει με την αναστολή πολλών προφλεγμονωδών κυτοκινών συμπεριλαμβανομένων των IL-11, IL-6 και IL-1β, καθώς και των αυξητικών παραγόντων Reg1 και αμφιρεγουλίνη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι WP1066 μπορεί να μπλοκάρει τον πολλαπλασιασμό, τη μείωση της φλεγμονής και επάγουν απόπτωση σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα μέσω της αναστολής φωσφορυλίωσης STAT3, και ότι πολλές κυτοκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προωθούν την ανάπτυξη του όγκου του γαστρικού ρυθμίζονται από μηχανισμούς STAT3-εξαρτώμενη. WP1066 μπορεί να αποτελέσει τη βάση για τη μελλοντική θεραπευτική κατά του καρκίνου του στομάχου

Παράθεση:. Judd LM, Menheniott TR, Λινγκ Η, Τζάκσον CB, Howlett Μ, Καλαντζής A, et al. (2014) Αναστολή της JAK2 /STAT3 Διαδρομή μειώνει τις γαστρικές ανάπτυξη του καρκίνου

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10.1371 /journal.pone.0095993

Επιμέλεια: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Ιαν 2014? Αποδεκτές: 1η Απριλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από πόρους? NHMRC έργο Αυστραλία (www.nhmrc.gov.au) επιδότηση # 509165 ΝΙΗ /NCI ΗΠΑ (nih.gov? Www.cancer.gov) μελάνωμα SPORE Ρ50 CA093459-06, ΝΙΗ /NCI ΗΠΑ (nih.gov? Www.cancer. gov) του εγκεφάλου SPORE 2 P50 CA127001-06. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Waldemar Πριέμπε κατέχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας και έχει οικονομικό ενδιαφέρον για την ανάπτυξη της ένωσης WP1066 ως εξής ? W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, Ι Fokt, Α Levitzki Ενώσεις για την θεραπεία των ασθενειών πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ενώνει Ευρεσιτεχνίας μελών WO /2005/058829 12/01/2004. Σημειώστε επίσης ότι οι συγγραφείς έχουν παράσχει μια τροποποιημένη δήλωση των ανταγωνιστικών συμφερόντων σχετικά με ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για WP1066 που πραγματοποιήθηκε από τον W. Πριέμπε. Οι συγγραφείς δηλώνουν, επίσης, ότι «αυτό δεν μεταβάλλει προσήλωση μας στην PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών».

Εισαγωγή

Από τα επτά Signal Transducer και Activator of Transcription (STAT) τα μέλη της οικογένειας , STAT3 έχει εμπλακεί πιο σταθερά σε μια σειρά από κοινούς καρκίνους στον άνθρωπο, συμπεριλαμβανομένων? πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, του προστάτη, του παχέος εντέρου και [1], [2], [3], [4]. Αυτό ισχύει επίσης σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο [5], [6], [7], στην οποία STAT3 ενεργοποίηση από χρόνιες φωσφορυλίωσης τυροσίνης (Υ) κατοικούν 705 έχει συνδεθεί με την αυξημένη ανάπτυξη, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση του πρωτογενούς καρκίνου [ ,,,0],6], [7], [8]. Έτσι, η αναστολή της μεταγραφικής δραστικότητας STAT3 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο μπορεί να παρέχει ένα πιθανό μέσο για τη μείωση της υψηλή νοσηρότητα και να παρατείνει τη ζωή μεταξύ των ασθενών με γαστρικό καρκίνο παγκοσμίως.

Εν απουσία λειτουργικών μεταλλάξεων στο γονίδιο STAT3, ανώμαλη δραστικότητα STAT3 επάγεται από επίμονη δραστηριότητα από ανάντη κινάσες τυροσίνης, και /ή με unscheduled- ή υπερ-έκφραση προσδεμάτων διεγερτικής [9], [10], [11]. Αυτό φαίνεται καθαρά παραδειγματικά στο gp130

757F /F μοντέλο ποντικού γαστρικού ανάπτυξης του καρκίνου, στο οποίο ένα Phe για Tyr υποκατάσταση στη θέση 757 στην ενδοκυτταρική βραχίονα της οικογένειας σηματοδότησης gp130 υποδοχέα της IL-6 αποτρέπει ταυτόχρονα SHP2 και SOCS3 δέσμευσης , με αποτέλεσμα την αναστολή της /MAP μεταγωγής σήματος κινάσης ras, και υπερενεργοποίηση του STAT3 με ιδιοσυστατική φωσφορυλίωση [23], [24], [26]. Πρόσφατα έχουμε και άλλοι έχουν δείξει ότι σε γαστρικών όγκων, σημαντικές αυξήσεις στην μεταγραφή συμπίπτουν με αυξημένη έκφραση του συνδέτη gp130 IL-11 σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο και ποντικού μοντέλα της νόσου αυτής [5], [12], [13]. Στην τελευταία IL-6 είναι περιττό, αλλά IL-11 είναι απολύτως απαραίτητη για ογκογένεση [12], [13]. Επιπροσθέτως, η IL-11 /STAT3 έχει δειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός οδηγός της ατροφικής γαστρίτιδας, η πρώτη προκαρκινικών αλλοιώσεων του στομάχου μετά από χρόνια λοίμωξη από το βακτήριο

Helicobacter pylori

[14].

μέχρι σήμερα, έχουν πολλές κινάσες έχουν αναφερθεί ότι επάγουν δραστικότητα STAT3 εξής δέσμευσης συνδέτη /υποδοχέα, ωστόσο μόνο JAK1 και λογαριασμό JAK2 για φωσφορυλίωση STAT3 κατόπιν σύνδεσης με IL-11 /υποδοχέα gp130 σύμπλοκο [15] και από αυτά τα IL-11 /gp130 προτίμηση δεσμεύει JAK2 [16]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι JAK2 και STAT3 παρούσα υποσχόμενους στόχους για το σχεδιασμό θεραπευτικών ανταγωνιστές να καταστείλει IL-11 /STAT3 σηματοδότησης στον ανθρώπινο καρκίνο του στομάχου.

Πρόσφατα το καφεϊκό οξύ παράγωγο WP1066, δομικά σχετίζεται με αναστολέα χαμηλή δραστικότητα τυροσινικής κινάσης AG490 , έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας πολύ ισχυρός αναστολέας του μονοπατιού JAK2 /STAT3 σε μετασχηματισμένα γλοίωμα του εγκεφάλου [17] και το νεφρικό καρκίνωμα [18] κυτταρικές γραμμές, οδηγώντας σε αναστολή της ανάπτυξης και επαγωγή της κλασικής προ-αποπτωτικών οδών. Επιπλέον, WP1066 είναι αποτελεσματική

in vivo

κατά της υψηλής κακοήθη μελανώματα και λευχαιμίες που είναι θετικά για τη μετάλλαξη JAK2 V617F-+, το οποίο προωθεί την ενεργοποίηση συστατική JAK2 κινάση [19], [20], [21], [22 ]. Αδημοσίευτες μελέτες δείχνουν ότι WP1066 δεν είναι αναστολέας ΑΤΡ-ανταγωνιστική, και μπορεί να εμποδίσει την έκφραση της φωσφορυλιωμένης JAK2 και STAT3? επιπλέον, ρ-STAT3-Y705 μπορεί να ανασταλεί ανεξάρτητα από την κατάσταση JAK2. Έτσι, WP1066 παρουσιάζει μια μοναδική ευκαιρία για να αναστέλλουν τόσο π-JAK και p-STAT3, και στη συνέχεια ισχυρά μπλοκάρει JAK2 /STAT3 μονοπατιού σηματοδότησης και μεταγραφική δραστηριότητα STAT3.

Για να δοκιμαστεί η ιδέα της διπλής αποκλεισμό των JAK2 και ενεργοποίηση STAT3 στο στομάχι και την επακόλουθη ανάπτυξη καρκίνου του στομάχου, έχουμε χρησιμοποιήσει και τα δύο

in vitro

και

in vivo

προσεγγίσεις να εκτιμήσει κατά πόσον WP1066 μπορεί να επιβραδύνει ή να εμποδίσει την ανάπτυξη του όγκου του γαστρικού μέσω αναστολής της δραστηριότητας /STAT3 JAK2, και άλλα στενά σχετιζόμενα μονοπάτια ογκογόνο σηματοδότηση. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι WP1066 αναστέλλει αποτελεσματικά τη φωσφορυλίωση STAT3, και επάγει την απόπτωση σε ένα γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή, και ότι μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου του γαστρικού

in vivo

αναστέλλοντας την επαγωγή γονιδίων κλειδί STAT3 ρυθμιζόμενων.

Υλικά και Μέθοδοι

Προετοιμασία και αποθήκευση των αναστολέων κινάσης

Αναστολέας WP1066 αναπτύχθηκε και συντίθεται από τον Waldemar Πριέμπε και οι συνεργάτες του στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο καρκίνου, και την τρέχουσα χρηματιστηριακή δόθηκαν ευγένεια του Χιούστον Pharmaceuticals Inc, Χιούστον, Τέξας, ΗΠΑ. Αποθέματα επαναιωρήθηκαν σε Hybri-Max DMSO και φυλάχθηκαν στους -20 ° C. Αποθέματα ήταν μόνο χρήση, και όχι εκ νέου κατάψυξη μετά την απόψυξη.

In vitro Πολιτισμού

AGS κύτταρα (ATCC, Manassas VA, USA) κύτταρα διατηρήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) μέσα συμπληρωμένα με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη 50 IU στους 37 ° C σε 5%

2-95% αέρα CO.

Western Blotting

εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν είτε με ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Life Technologies, Vic, Australia) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και τα σφαιρίδια πρωτεΐνης επαναιωρήθηκαν σε 1% δωδεκυλοθειικού νατρίου που περιείχε 2 mmol /l Na

3νο

4 ή RIPA ρυθμιστής. Κλάσματα (30 μg) υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα θειικού /πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλ νάτριο. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν και επωάστηκαν στους 4 ° C για όλη τη νύχτα σε αποβουτυρωμένο γάλα με τα ακόλουθα αντισώματα? STAT3, ρΥ (705) STAT3, ERK1 /2, Pt (202), Υ (204) ERK1 /2, ΑΚΤ, η ps (473) ΑΚΤ, JAK2, ρΥ (1007), Υ (1008) JAK2 (κυτταρική σηματοδότηση, # 9132, # 9134S, # 9131, # 9102 # 4377, # 9272, # 4058, # 3752, # 3751, # 3229, # 3771), GAPDH (Abcam # 9485). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξείδιο (Dako, πολύκλωνα χοίρων αντι-κουνελιού, HRP συζευγμένο, # P0399) και οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham, Buckinghamshire, UK). Για την ανάλυση ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Ποσότητα One software (Biorad) και φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες που εκφράζονται ως ποσοστό του GAPDH από διπλότυπο μεμβράνη. Τουλάχιστον η = 8 δείγματα αξιολογήθηκαν από οποιοδήποτε θεραπεία.

Καταμέτρηση κυττάρων με αιματο

Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5 χ 10

4 κύτταρα /ml σε 24-φρεατίων σε πλήρες μέσο και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε ηρεμία για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την κατάλληλη συγκέντρωση του WP1066 ή DMSO ως έλεγχος για 0-360 λεπτά. Αφού τα κύτταρα αποσπάστηκαν κατεργασία με κατεργασία με τρυψίνη-ΕϋΤΑ 0,25% (Sigma), χρωματίστηκαν με trypan-blue 0,4% (Sigma) σε αραίωση 1:01 για 5 λεπτά στους 4 ° C, και μετρήθηκαν σε ένα αιμοκυτταρόμετρο.

καρβοξυφθορεσκεϊνη ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής εστέρας (CFSE) Χρώση

να επισημαίνουν κύτταρα AGS με CFSE, κύτταρα αποκολλήθηκαν με επεξεργασία με θρυψίνη-ΕϋΤΑ 0,25% (Sigma) και επαναιωρήθηκαν σε προθερμασμένο PBS /0.1% BSA σε πυκνότητα 1 × 10

6 κύτταρα /ml. 10 mM χρωστικής CFSE (Invitrogen) παρασκευάστηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, στη συνέχεια, 5 μl /ml προστέθηκε και αναμίχθηκε πλήρως με αναστροφή για να εξασφαλιστεί ομοιογενής σήμανση των κυττάρων. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 10 λεπτά, σβήστηκε με προσθήκη 5 όγκων παγωμένου μέσων και επωάστηκαν για 5 λεπτά σε πάγο. Τα δείγματα στη συνέχεια πλένονται 5 φορές σε μέσα και επιστρώνονται στα 2 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο (6-φρεατίων). Ένα δείγμα των κυττάρων ελήφθη μετά την επίστρωση και σημάνθηκαν με 100 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για ομοιομορφία και την ένταση της επισήμανσης. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο για 48 ώρες μετά τις οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς την κατάλληλη WP1066 (5 μΜ) στους 37 ° C με 5% CO

2 95% αέρα για 18 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη όπως παραπάνω και επαναιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο, ​​επισημασμένα με 100 μg /ml ΡΙ και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής στα 488 ηΜ. Τα δεδομένα που καταγράφονται με τη χρήση της ντίβα BD FACS (BD Biosiences) πακέτο λογισμικού και αναλύονται από ΜΟϋΡΙΤ LT πακέτο λογισμικού (VSH).

Annexin V χρώσης

AGS κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων με DMSO (έλεγχος φορέα), ή WP1066 (5 μΜ), ή η ετοποσίδη (200 μΜ? θετικός έλεγχος) στους 37 ° C με 5% CO

2 95% αέρα ανενόχλητη για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή ως ακολούθως? πλύθηκαν σε παγωμένο PBS, τρυψινοποιήθηκαν όπως παραπάνω, και η κυτταρική πυκνότητα προσδιορίζεται με αιματο πριν την επαναιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης αννεξίνης έως 1 χ 10

6 κύτταρα /ml. 100 μΙ αυτού του παρασκευάσματος λήφθηκε, και επωάζονται με 5 μΙ του συστατικού Α (αννεξίνη Fluor 488 συνιστώσα V αννεξίνης, 25 mM HEPES, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, ρΗ 7,4, 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού) και 1 μg /ml ΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα δείγματα στη συνέχεια αναμίχθηκαν με 400 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Κατάλληλους ελέγχους +/- συστατικά της αντίδρασης ήταν διατεθειμένοι να προσαρμοστούν για μεροληψία στην περίφραξη. Τα δεδομένα που καταγράφονται με τη χρήση της ντίβα BD FACS (BD Biosiences) πακέτο λογισμικού.

Ηθική Δήλωση

Όλα τα πειράματα σε ζώα πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την αυστραλιανή κώδικα για τη φροντίδα και χρήση ζώων για επιστημονικούς σκοπούς (7

η έκδοση), και μετά από έγκριση από το Ινστιτούτο Έρευνας Επιτροπή Ηθικής Murdoch Childrens ζώων (εφαρμογή # A583). Όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιηθεί η ταλαιπωρία σε αυτές τις ελάχιστα επεμβατικές διαδικασίες.

In vivo

Πειράματα

gp130

έχουν 757F /F ποντίκια που έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [23]. Εν συντομία, διακριτά άντρου όγκοι αναπτύσσονται από την ηλικία των 4 εβδομάδων και να αναπτυχθούν γρήγορα μέχρι περίπου 12 εβδομάδες. Θα ανακεφαλαιώνουν τα αναπτυξιακά χαρακτηριστικά των αδενοκαρκίνωμα στομάχου εντερικού τύπου, συμπεριλαμβανομένων υποβλεννογόνια εισβολή, αλλά δεν μεταστάσεις [24]. Τα ζώα στεγάστηκαν σε μια εγκατάσταση SPF στο Ινστιτούτο Ερευνών του Murdoch Παιδική και επιβεβαίωσε ότι είναι απαλλαγμένα από

Helicobacter pylori

. Τρεις ομάδες ποντικών αξιολογήθηκαν για ανάπτυξη όγκου: 1) ηλικίας 8 εβδομάδων gp130

757F /F ποντικούς που δεν έλαβαν θεραπεία (n = 10)? 2) gp130

757F /F ποντικούς που έλαβαν WP1066 από 8 έως 10 εβδομάδων (η = 10)? και 3) gp130

757F /F ποντικούς που έλαβαν όχημα DMSO από 8 έως 10 εβδομάδων (n = 8). Πριν από τον πειραματισμό όλα τα ζώα αξιολογήθηκαν για την ευημερία, ζυγίζεται και οι όγκοι της θεραπείας υπολογίζεται ανάλογα. Τα ζώα ελέγχου έλαβαν ισοδύναμους όγκους DMSO οχήματος σε ζώα WP1066 φάρμακο. Οι ποντικοί έλαβαν 2 αρχικές ενδο-περιτοναϊκή ενέσεις WP1066 στα 10 mg /kg κάθε 48 ώρες για τους εγκλιματιστεί στις επιδράσεις της θεραπείας, τότε έλαβε 5 ενέσεις WP1066 στα 20 mg /kg κάθε 48 ώρες για να ολοκληρωθεί η αγωγή 2 εβδομάδα. Intra-περιτοναϊκή θέσεις ένεσης εναλλάσσονταν με τέσσερα τεταρτημόρια της κοιλίας των ποντικών. Κατά την ολοκλήρωση του πειράματος, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία και τα στομάχια εκτομή για τη φωτογραφία και τον ιστό της συλλογής.

μακροσκοπική και ιστολογική εκτίμηση των

Οι στόμαχοι γρήγορα τεμαχίζεται κατά μήκος της μικρότερης καμπυλότητα, καρφώθηκε έξω, φωτογραφήθηκαν και σταθερό σε 4% ρυθμισμένη παραφορμαλδεϋδη πριν από την επεξεργασία. Τομές παραφίνης (4 μm) βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε). Μορφομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανοικτού κώδικα λογισμικό ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Για τις μετρήσεις περιοχή, εικόνες του γαστρικού βλεννογόνου χειροκίνητα περιγράφονται με το εργαλείο σχεδίασης λογισμικού και το πρόγραμμα ποσοτικοποίηση χρησιμοποιείται για την παραγωγή των μετρήσεων

In vivo

Ανοσοϊστοχημεία & amp.? Ποσοτικοποίηση

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση εκτελέστηκε με αντισώματα για Ki-67 (Pharmingen # 550609) και ενεργοποιημένου κασπάσης 3 (Cell Technology Σηματοδότηση # 9961). Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με τμήματα βρασμό για 30 λεπτά σε 10 mM κιτρικό οξύ (ρΗ 6.0). Χρώση ολοκληρώθηκε με κατάλληλα είδη-ειδικά βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα (ϋΑΚΟ, Denmark), αβιδίνη και βιοτινυλιωμένη ραφανιδική υπεροξειδάση μακρομοριακό σύμπλεγμα (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Sigma, St Louis, ΜΙ) και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Για Ki-67 ποσοτικοποίησης, με τυφλό παρατηρητή υπολογίζονται αριθμός βαμμένων κυττάρων ανά αδένα σε πολλαπλές τομές ανά ζώο χρησιμοποιώντας ImageJ όπως και πριν. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο αριθμός Ki-67 θετικών κυττάρων ανά αδένα. Για ενεργοποιημένη κασπάση 3 ποσοτικοποίησης, ένα τυφλό παρατηρητή μετρήθηκε ο αριθμός των βαμμένων κυττάρων ανά περιοχή βλεννογόνο σε 4 τυχαία πεδία καλά προσανατολισμένη άντρου ανά ζώο χρησιμοποιώντας ImageJ όπως πριν. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ο αριθμός ενεργοποιημένων κασπάσης 3 θετικά κύτταρα ανά περιοχή βλεννογόνου

ημι-ποσοτική μορφομετρική ανάλυση Φλεγμονή

Φλεγμονή αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία με τυφλό τρόπο για Η &?. Ε-χρώση ενότητες. Antral ιστούς όγκων αναλύθηκαν και τουλάχιστον 3 λωρίδες ανά ζώο (n = 7) δόθηκε ένα ημι-ποσοτική βαθμολογία ανάλογα με τον βαθμό των φλεγμονωδών κυττάρων από ελάχιστο = 0 έως μέγιστο = 3. Lymphoplasmocytic και πολυμορφοπύρηνα διήθηση αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα. Οι μέσες τιμές στη συνέχεια συγκρίνονται για στατιστική ανάλυση.

Real-Time (Q) -PCR Ανάλυση

RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Life Technologies, Vic, Αυστραλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (3 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας Moloney ιός λευχαιμίας ποντικού ανάστροφης μεταγραφάσης (Promega, Madison, WI) που πριμοδοτήθηκαν με 0.3 μg ολιγο (dT). Q-PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer Express (Applied Biosystems) (Πίνακας 1). SYBR πράσινη χημεία (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε με L32 ως normalizer. Οι συνθήκες PCR ήταν 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 sec και 60 ° C για 15 δευτερόλεπτα? οι αντιδράσεις έτρεξαν σε ένα Applied Biosystems AB7500 RT PCR μηχάνημα. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανιχνευτή αλληλουχίας και σχετικές διαφορές φορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΔΔCt όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

Η

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Οι τιμές που λαμβάνονται από ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου ή του αριθμού των χρωματισμένων κυττάρων συγκρίθηκε μεταξύ των δειγμάτων με ANOVA, και όπου μια στατιστικώς σημαντική διαφορά βρέθηκε μεμονωμένων ομάδων αναλύθηκαν περαιτέρω με την κατάλληλη παραμετρικά ή μη παραμετρικά στατιστική χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο Sigmastat. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως p ≤ 0,05.

Αποτελέσματα

WP1066 Καταστέλλει ταχύτατα μέσω φωσφορυλίωσης Υ (705) STAT3 και επάγει φωσφορυλίωση των ERK1 /2 στο AGS κύτταρα

Η JAK- STAT οδού και της οδού της ERK1 /2 είναι οι δύο κύριες οδούς μεταγωγής σήματος κατάντη της gp130. Αυτές οι δύο οδοί έχουν αμοιβαία και αντίστροφη ρυθμιστικά αποτελέσματα επί του άλλου, καλύτερα αποδεικνύεται από την αρνητική ρύθμιση του pSTAT3 μετά από 2 ενεργοποίηση ERK1 /[47].

πειράματα δόσης-απόκρισης WP1066 διεξήχθησαν με κατεργασία κυττάρων με AGS 0 , 1, 2 ή 5 μΜ WP1066 για 60 λεπτά και φωσφορυλίωση μέτρηση του JAK2, STAT3, ERK1 /2 και SHP-2. Όπως ήταν αναμενόμενο, pJAK2 έντονα αναστέλλεται από WP1066 σε όλες τις συγκεντρώσεις δοκιμάστηκαν και με & gt? 80% στα 5 μΜ. 5 μΜ WP1066 έδωσε επίσης η μέγιστη αναστολή της pSTAT3 και αμοιβαία ενεργοποίηση pERK1 /2 (Εικ. 1Α) με μείωση της συνολικής STAT3 στα 5 μΜ, ή υψηλότερες συγκεντρώσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συμπίπτει με την αύξηση των pERK, ενεργοποίηση pSHP2 ήταν δοσοεξαρτώμενο ενισχυμένη μετά τη χορήγηση WP1066 (Εικ. 1Α).

A. Δόσης-απόκρισης: AGS κύτταρα επεξεργάστηκαν με WP1066 στους 0, 1, 2 και 5 μΜ για 60 λεπτά και τα εκχυλίσματα ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα ειδικά για (i) pJAK2 και JAK2? (Ii) pSTAT3 και STAT3? (Iii) pERK1 /2 και ERK1 /2? (Iv) pSHP2 και SHP2. Τα δεδομένα επίσης εκφράζονται ως αναλογία του φωσφορυλιωμένου να συνολικού προϊόντος πρωτεΐνης σε κάθε περίπτωση. Τα αποτελέσματα των 3 πειραμάτων παρουσιάζονται ως μέση τιμή OD αναλογίες ± τυπικό σφάλμα (SE). Η στατιστική σημαντικότητα για κάθε θεραπεία σε σύγκριση με 0 μΜ WP1066 εμφανίζεται αν η p & lt? 0,05. Β Χρονικά πορεία: AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Σχ. 1Α αλλά με 5 μΜ WP1066 για 0, 15, 30, 60, και 180 λεπτά. Δεδομένα υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως και για το Σχ. 1Α.

Η

Για τις μελέτες χρονικής πορείας, AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 0-360 λεπτά με 5 μΜ WP1066 και φωσφορυλίωση της JAK2, STAT3, ERK1 /2 και SHP-2 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western ( Εικ. 1Β). επεξεργασία WP1066 οδήγησε σε ταχεία αναστολή της pJAK2, με πτώση 75% από 30 λεπτά και κατά μέγιστο του 90% πτώση από 60 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα ανακτήθηκαν και επέστρεψε στην βασική JAK2 φωσφορυλίωση από 360 λεπτά. Το μοτίβο της μειωμένη ενεργοποίηση STAT3 αντικατοπτρίζεται ότι φωσφορυλίωσης JAK2. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση ERK1 /2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε απόκριση σε θεραπεία WP1066, με αύξηση 250% κατά 15 λεπτά, και μία μέγιστη αύξηση 460% από 60 λεπτά, πριν από την επιστροφή στα βασικά επίπεδα από 360 λεπτά. ενεργοποίηση SHP2 παρακολούθησε στενά τις αλλαγές στην έκφραση ERK με μέγιστη επαγωγή σε 60 λεπτά.

WP1066 Αναστέλλει AGS Ανάπτυξη μέσω καταστολή του πολλαπλασιασμού και επαγωγή της απόπτωσης

Ενεργός STAT3 είναι μια καθιερωμένη οδηγός του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου των κυττάρων ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [5], και παρατεταμένη ενεργοποίηση των ERK1 /2 επάγει απόπτωση των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων [25]. Έχει αποδείξει ότι WP1066 ρυθμίζει STAT3 και /2 σηματοδότησης ERK1 σε μια αμοιβαία μόδα, ελέγξαμε κατά πόσο μπορεί επίσης να διαταράξει την ανάπτυξη των κυττάρων και να προκαλέσουν απόπτωση των κυττάρων AGS.

Η θεραπεία των κυττάρων AGS με 5 μΜ WP1066 (Σχ. 2Α ) είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων στο DMSO σε σχέση ελέγχους (DMSO? 100% ± 3,14 vs. WP1066? 36,02% ± 3,18, ρ & lt? 0,05). Για να καθοριστεί εάν αυτή η μείωση στον αριθμό κυττάρων οφείλεται σε αλλοιωμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση, ή συνδυασμό και των δύο, CFSE και αννεξίνης V χρώση πραγματοποιήθηκε σε κατεργασία κυττάρων. κύτταρα AGS αγωγή με WP1066 είχαν πιο έντονα σημασμένα με CFSE από εκείνους που αντιμετωπίστηκαν με DMSO, απόδειξη του μειωμένου αριθμού των κυτταρικών διαιρέσεων και επομένως πολλαπλασιασμό (Εικ. 2Β). Επιπλέον, ένα μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων που AGS σε επεξεργασία με WP1066 σημάνθηκαν με αννεξίνη V (Σχήμα 2C) σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO, αποδεικνύοντας ότι η WP1066 επίσης επήγαγε απόπτωση σε κύτταρα AGS (WP1066? 1,3 φορές αύξηση? P = 0,049).

Ο πολλαπλασιασμός: Α κύτταρα AGS υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με WP1066 στα 5 μΜ για 18 ώρες, χρωματίστηκαν με trypan blue και τα βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με το φορέα μόνο. Ν = 3, μέσος όρος ± SE. παρακολούθησης Β CFSE χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση μεταβολών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων AGS μετά την αγωγή με WP 1066. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα φθορισμού συλλέχθηκαν παρουσιάζεται σε σύγκριση με ελέγχους DMSO για ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Απόπτωση: κύτταρα C. AGS θεραπεία για 24 ώρες με DMSO (έλεγχος μέθοδος), WP1066 (5 μΜ) ή ετοποσίδης (200 μΜ? Θετικός έλεγχος) και προσκολλημένα κύτταρα βάφτηκαν με Annexin V, στη συνέχεια μετρήθηκαν με το χέρι. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με DMSO οχήματος από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. * P = 0.047.

Η

WP1066 Μπλοκ γαστρικού όγκου ανάπτυξη στην gp130

757FF ποντίκια από την καταστολή των όγκων κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Ενίσχυση της απόπτωσης

gp130

757FF ποντίκια αναπτύσσουν περιφερικό όγκοι του στομάχου που χαρακτηρίζεται από αυξημένα οδηγείται ενεργοποίηση STAT3 γαστρικό IL-11 [12], [13]. Από pJAK2 και p-STAT3 έχουν αποκλειστεί από WP1066

in vitro

, ελέγξαμε εάν WP1066 θα εμποδίσει επίσης τη γαστρική ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Θεραπεία της gp130

757FF ποντίκια 3 φορές την εβδομάδα για 2 εβδομάδες με /kg WP1066 σημαντικά μειωμένη γαστρική ανάπτυξη του όγκου 10-20 mg κατά 47% από 42,11 ± 3,21 mm

2 να 22,36 ± 3,64 mm

2 ( ρ & lt?. 0.05) (σχήμα 3Α-D). όγκοι αντιμετωπίζονται DMSO δεν ήταν διαφορετικοί σε όγκους παρατηρήθηκε σε ηλικίας 8 εβδομάδων ποντικούς, η ηλικία στην οποία θεραπεία WP1066 άρχισε, επιβεβαιώνοντας ότι η γαστρική η ανάπτυξη του όγκου είναι σχετικά σταθερή από το 8-10 εβδομάδων [27], και ότι η θεραπεία WP1066 πραγματικά προκαλεί υποχώρηση του όγκου και όχι στάση (Εικ. 3A-D).

gp130

757FF ποντίκια (ηλικίας 8 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε θεραπεία ΙΡ με 10 mg /kg του WP1066 ή DMSO δύο φορές με ένα κενό μιας ημέρας μεταξύ των δόσεων, που ακολουθείται από δόσεις των 20 mg /kg κάθε 2 ημέρες για 2 εβδομάδες. Antral όγκοι 8 εβδομάδων χωρίς θεραπεία ποντικούς (Α) και 10 εβδομάδα χειριστηρίων του οχήματος DMSO-αγωγή (Β) δεν ήταν διαφορετικό σε μέση περιοχή, ωστόσο θεραπεία WP1066 κατέληξε σε -50% μικρότερους όγκους (C). Αυτό επιβεβαιώθηκε με ποσοτική μορφομετρία (D) όπου άντρου όγκους ήταν σημαντικά μικρότερες σε ποντίκια WP1066 σε σύγκριση με 10 W.O. έλεγχοι DMSO και 8 W.O. χωρίς θεραπεία ποντικών (η = 7-10? ρ & lt? 0,05). Η επίδραση της WP1066 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε με χρώση τομών με ένα αντίσωμα για Ki-67. Υπήρξε σημαντική μείωση στον αριθμό των Ki-67 θετικά κύτταρα ανά αδένα στα ποντίκια WP1066 αγωγή (F) σε σύγκριση με τους ελέγχους (Ε) και ποσοτικοποιείται γραφικά (G). Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά μετά κασπάσης 3 χρώση άντρου τμήματα ενός ελέγχου DMSO (H) και WP1066 (Ι) ποντικού, και ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας χρωματισμένα κύτταρα /mm

2 του γαστρικού βλεννογόνου (J).

Για να προσδιορίσετε αν ο πολλαπλασιασμός μεταβλήθηκε σε γαστρικών όγκων, Ki-67 θετικών κυττάρων /αδένα ποσοτικά στο επεξεργασμένο ομάδα. θεραπεία WP1066 μείωσε σημαντικά γαστρικού επιθηλίου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (DMSO 62 ± 7.7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 χρωσμένα κύτταρα /αδένα, ρ & lt? 0,05? Σχ. 3Ε-G) καταδεικνύοντας ότι WP1066 μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου με αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της WP1066 επί των κυττάρων του όγκου απόπτωση, τμήματα από το WP1066 ή ομάδες DMSO-αγωγή χρώστηκαν με ένα αντίσωμα κατά διασπασμένης κασπάσης 3, ενός δείκτη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Σχ. 3Η, I). Υπήρξαν σημαντικά περισσότερες αποπτωτικό προφίλ σε όγκους WP1066 έλαβαν από τους ελέγχους, καταδεικνύοντας μια σαφή προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 χρωματισμένα κύτταρα /mm

2 βλεννογόνο, σ & lt? 0,05? Σχ. 3J ).

WP1066 στοχεύει ειδικά JAK2 και STAT3 φωσφορυλίωση για να καταστείλουν τη γαστρική Ογκογένεση στην gp130

757FF ποντίκια

Επειδή gp130

757FF ποντίκια αναπτύσσουν όγκους σε απάντηση συστατική ενεργοποίηση gp130 [20] , ελέγξαμε εάν WP1066 καταστέλλονται κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης

in vivo.

θεραπεία WP1066 για 2 εβδομάδες οδήγησε σε μείωση κατά 25% του σχετική ποσότητα των συνολικών STAT3 στο άντρου βλεννογόνο σε σύγκριση με ομάδες που έλαβαν DMSO (Εικ. 4Α) . Το ποσό της συνολικής JAK2, AKT και ERK1 /2 δεν άλλαξε με επεξεργασία WP1066. Αυτό υποδηλώνει ότι η χρόνια θεραπεία της gp130

757FF ποντίκια με WP1066 καταστέλλει την έκφραση του STAT3.

gp130

757FF ποντίκια (ηλικίας 8 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε θεραπεία όπως στο σχήμα. 3 και άντρου εκχυλίσματα ποσοτικοποιείται με κηλίδωση Western για το σύνολο των JAK2, STAT3, ERK1 /2 και AKT (Α) και pJAK2, pSTAT3, pERK1 /2 και ρΑΚΤ (Β). Οι μεμβράνες ταυτόχρονα υβριδίζονται με ένα αντίσωμα GAPDH ως ένας έλεγχος φόρτωσης. Η ένταση του σήματος ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία και εκφράζεται ως ποσοστό του σήματος σε σχέση με τους ελέγχους τυποποιηθεί με την ένταση του σήματος GAPDH. n = 6-10? * Σημαντικά (ρ & lt? 0,05)

Η

ανάλυση ανοσοστυπώματος της ενεργοποίησης σηματοδότησης κατέδειξε μία σημαντική μείωση σε pJAK2 (80,12% ± 5,70 του ελέγχου DMSO), pY705 STAT3 (26,84% ± 7.2 του ελέγχου DMSO? Σχ. . 4Β) και pERK1 /2 (72,66% έλεγχο ± 5.23.of DMSO? Εικ. 4Β). φωσφορυλίωση ΑΚΤ δεν άλλαξε με επεξεργασία WP1066. Μειωμένη ενεργοποίηση των JAK2 και STAT3 είναι συνεπής με το

in vitro

δεδομένων και γνωστές δράσεις της WP1066.

WP1066 κατέστειλε την φλεγμονώδη απόκριση στον βλεννογόνο του άντρου gp130

757FF Ποντίκια

από μια χρόνια φλεγμονώδης απόκριση του στομάχου είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του όγκου [27], ελέγξαμε εάν μέρος του τρόπου δράσης του WP1066 είναι να καταστείλει την STAT3 με τη μεσολάβηση φλεγμονώδη απόκριση, η οποία συμβάλλει κανονικά μέχρι την εξέλιξη του όγκου. Η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε ότι πολυμορφοπύρηνα διείσδυση μέσα στο άντρο των ποντικών που έλαβαν WP1066 ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι στα ποντίκια ελέγχου (Εικόνα 5Α?. DMSO 2.45 ± 0.24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, ρ & lt? 0,05), ενώ lymphoplasmocytic διηθήματος δεν ήταν διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδες (Σχήμα 5Β?. DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p & gt? 0,05).

gp130

757FF ποντίκια (ηλικίας 8 εβδομάδων) αντιμετωπίζονται όπως και για Σχ. 3, είχε άντρου ιστού στομάχου που λαμβάνονται για ιστολογία και προ-φλεγμονωδών έκφραση γονιδίου με Q-PCR μετά την εκχύλιση mRNA. Θεραπεία της gp130

757FF ποντίκια με WP1066 προκάλεσε μια σημαντική μείωση (p & lt? 0,05) σε πολυμορφοπύρηνα διήθηση (Α) στην άντρου του στομάχου, αλλά lymphoplaysmocytic διήθηση ήταν αμετάβλητη (Β). Gene έκφρασης σε σχέση με την οικονόμο GAPDH για IL-6 (Γ), IL-11 (D), IL-1 α (Ε), IL-1β (F) και COX-2 (G), προσδιορίστηκε ποσοτικά με τη μέθοδο ΔΔCT . Όλα n = 8? * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τους ελέγχους DMSO

Η

Από τη γαστρική φλεγμονή συνήθως διαμεσολαβείται από ένα μικρό αριθμό βασικών προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και ενζύμων, μετρήσαμε την έκφραση του μια επίλεκτη ομάδα από αυτά με Q- PCR σε DMSO και στομάχια WP1066-θεραπεία. Έκφραση όλων των προ-φλεγμονωδών μεσολαβητών με την εξαίρεση των ΙΡΝγ, ΤΝΡα και iNOS ήταν σημαντικά αναστέλλεται με κατεργασία WP1066 ως εξής? IL-6 (Εικ. 5C? 6.0 ± 2.6 φορές), IL-11 (Σχήμα 5D?. 8.7 ± 3.4 φορές), IL-1α (Σχήμα 5Ε?. 10.9 ± 4.3) φορές), IL-1β (Σχ 5F. ? 3 ± 0,9 φορές) και COX2 (Σχήμα 5G?. 2,94 ± 1,05). Ως εκ τούτου, WP1066 αναστολή της δραστηριότητας της STAT3 και την εξέλιξη του όγκου οφείλεται εν μέρει στη μειωμένη διήθηση polymophonuclear και μειωμένη STAT3 εξαρτώμενη μεταγραφή των προ-φλεγμονωδών IL-6, IL-11, IL-1α, IL-1β και COX2 γονίδια.

WP1066 εμπόδισαν την έκφραση αμφιρεγουλίνη στον βλεννογόνο του άντρου gp130

757FF Ποντίκια

το αποτέλεσμα της θεραπείας WP1066 στην έκφραση προσδεμάτων αυξητικού παράγοντα που είναι γνωστό ότι παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση του στομάχου και στην ανάπτυξη της gp130

εκτιμήθηκε επίσης 757FF όγκων. WP1066 ανέστειλε την έκφραση του αμφιρεγουλίνη (1.85 ± 0.60 φορές, ρ & lt? 0,05), αλλά όχι HB-EGF (Εικ. 6) στο άντρου βλεννογόνο ποντικών με αγωγή. Επιπλέον, το στομάχι πολλαπλασιαστική συνδετήρα και γονίδιο STAT3 ρυθμιζόμενη Reg1 έδειξε μια ισχυρή ανασταλτική τάση μετά την αγωγή WP1066 σε σύγκριση με το άντρο ελέγχου DMSO (Εικόνα 6?. P = 0,069).

gp130

757FF ποντίκια ( 8 εβδομάδων) υποβλήθηκαν σε θεραπεία ως προς το Σχ. 5. mRNA για Reg1, αμφιρεγουλίνη και ΗΒ-EGF αναλύθηκαν με ανάλυση Q-PCR και ποσοτικοποιηθεί με τη μέθοδο ΔΔCT. συνδετήρες EGFR ήταν διαφορικά ρυθμίζεται έτσι ώστε το mRNA αμφιρεγουλίνη μειώθηκε σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν WP1066 σύγκριση με τους ελέγχους (ρ & lt? 0,05), ενώ η ΗΒ-ΕΟΡ ήταν αμετάβλητη. Το μη-EGFR συνδέτη REGI έδειξε μια ισχυρή τάση προς την μειωμένη έκφραση (p = 0,069). Όλα n = 8? * Στατιστικά σημαντική διαφορά (p ≤ 0,05).

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι WP1066 αναστέλλει με τρόπο δοσοεξαρτώμενο την JAK2 /STAT3 μονοπάτι σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του στομάχου (AGS) σηματοδότησης , με επακόλουθη μείωση κατά 60% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και μια μικρότερη αύξηση στην απόπτωση. Ο μηχανισμός για αυτό είναι πιθανό να οφείλεται στην διπλή αναστολή των φωσφορυλιωμένων μορφών JAK2 και STAT3 μειώνοντας έτσι STAT3 μεταγραφική δραστηριότητα, όπως έχει αποδειχθεί για αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων γλοιώματος [17], [28], [29], μυελοειδή λευχαιμία [ ,,,0],30], και το μελάνωμα [20]. Από την άλλη πλευρά, η εφαρμογή WP1066 οδήγησε σε αύξηση των αμοιβαίων ERK1 /2 συμπίπτει ενεργοποίηση με αυξημένη pSHP2, την φωσφατάση υπεύθυνος για την ενεργοποίηση της ras /MAP οδού σηματοδότησης κινάσης. Μια παρόμοια παρατήρηση σε σχέση με την ενεργοποίηση της ERK έχει γίνει για άλλες καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνωμα νεφρικών [18], και του γλοιώματος [28]. Ως εκ τούτου, η διασταυρούμενη ρύθμιση της STAT3 και ERK μεσολάβηση σηματοδότησης καθοδικά της IL-6 οικογένειας κυτοκινών φαίνεται να λαμβάνει χώρα συνήθως σε ένα εύρος από ιστούς και κυτταρικές σειρές [31].

WP1066 ήταν επίσης αποτελεσματική όταν χορηγείται

in vivo

, όπου εμποδίζεται η ενεργοποίηση STAT3 (75%) στην gp130

άντρου όγκους 757FF ποντίκι, και επίσης μείωσε συνολικής πρωτεΐνης STAT3, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να μειώσει την έκφραση του

Stat3

γονιδίου στο στομάχια των ποντικών που θεραπεύτηκαν. Αυτό υποστηρίζεται από την ύπαρξη συναίνεσης sites για ενεργού δεσμευτική για το

Stat3

υποστηρικτής STAT3, με την ενεργοποίηση του

Stat3

γονίδιο, όπως καταδεικνύεται χρησιμοποιώντας μεταλλαγμένο

Stat3

προαγωγού-ρεπόρτερ

Η.